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Biology

Disección e inmunotinción de glándulas salivales larvales de mosquitos Anopheles gambiae

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62989
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Department of Cell Biology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Tufts School of Medicine, 3Department of Biomedical Sciences, Idaho College of Osteopathic Medicine

Summary

La glándula salival del mosquito adulto (SG) es necesaria para la transmisión de todos los patógenos transmitidos por mosquitos a sus huéspedes humanos, incluidos los virus y parásitos. Este video demuestra el aislamiento eficiente de los SG de los mosquitos Anopheles gambiae en etapa larval (L4) y la preparación de los SG L4 para su posterior análisis.

Abstract

Las glándulas salivales de los mosquitos (SG) son un órgano de entrada necesario para la transmisión de patógenos transmitidos por insectos. Los agentes causantes de enfermedades, incluidos los virus y los parásitos Plasmodium que causan la malaria, se acumulan en las cavidades secretoras de las células SG. Aquí, están preparados para la transmisión a sus huéspedes vertebrados durante una comida de sangre posterior. A medida que las glándulas adultas se forman como una elaboración de restos de brotes larvales del conducto SG que persisten más allá de la histólisis temprana del SG pupal, el SG larvario es un objetivo ideal para las intervenciones que limitan la transmisión de la enfermedad. Comprender el desarrollo larvario de SG puede ayudar a desarrollar una mejor comprensión de su morfología y adaptaciones funcionales y ayudar en la evaluación de nuevas intervenciones que se dirigen a este órgano. Este protocolo de video demuestra una técnica eficiente para aislar, fijar y teñir larvales de mosquitos Anopheles gambiae. Las glándulas diseccionadas de larvas en una solución de etanol al 25% se fijan en una mezcla de metanol y ácido acético glacial, seguida de un lavado de acetona en frío. Después de algunos enjuagues en solución salina tamponada con fosfato (PBS), los SG se pueden teñir con una amplia gama de colorantes marcadores y / o antisueros contra las proteínas expresadas en SG. Este método para el aislamiento de LARVAS SG también podría usarse para recolectar tejido para análisis de hibridación in situ, otras aplicaciones transcriptómicas y estudios proteómicos.

Introduction

La malaria es una importante amenaza para la salud pública que causa casi 230 millones de infecciones y un estimado de 409,000 muertes en 20191. La mayoría de las muertes se producen en el África subsahariana y son causadas por el parásito Plasmodium falciparum,cuyo insecto vector es Anopheles gambiae,objeto de esta demostración en vídeo. Aunque las cifras indican una caída significativa en la tasa de mortalidad anual desde el cambio de siglo (>300.000 muertes anuales menos), las disminuciones prometedoras en las tasas de enfermedad observadas de 2000 a 2015 están disminuyendo, lo que sugiere la necesidad de nuevos enfoques para limitar la transmisión de enfermedades2. Entre las estrategias adicionales prometedoras para controlar y posiblemente eliminar la malaria se encuentra apuntar a la capacidad de los mosquitos vectores utilizando la edición de genes basada en CRISPR / Cas9 y el impulsogenético 3,4,5. De hecho, es la focalización del mosquito vector (a través del uso ampliado de mosquiteros tratados con insecticida de larga duración) lo que ha tenido el mayor impacto en la reducción de la transmisión de enfermedades6.

Los mosquitos hembra adquieren gametocitos Plasmodium de un humano infectado durante una comida de sangre. Después de la fertilización, la maduración, el recorrido del epitelio del intestino medio, la expansión de la población y la navegación del hemocoel en sus huéspedes mosquitos obligados, cientos a decenas de miles de esporozoítos de Plasmodium invaden los SG del mosquito y llenan las cavidades secretoras de las células secretoras constituyentes. Una vez dentro de las cavidades secretoras, los parásitos tienen acceso directo al conducto salival y, por lo tanto, están preparados para la transmisión a un nuevo huésped vertebrado en la próxima comida de sangre. Debido a que los SG son críticos para la transmisión de esporozoítos causantes de malaria a sus huéspedes humanos, y los estudios de laboratorio sugieren que los SG no son esenciales para la alimentación de la sangre, la supervivencia de los mosquitos o la fecundidad7,8,9,representan un objetivo ideal para las medidas de bloqueo de la transmisión. Los SG de mosquitos adultos se forman como una elaboración de restos de "brotes de conducto" en los SG larvales que persisten más allá de la histólisis temprana de SG pupal10,lo que hace que el SG larvario sea un objetivo ideal para las intervenciones para limitar la transmisión de enfermedades en etapa adulta.

Caracterizar la etapa larvaria del desarrollo de SG puede ayudar a desarrollar no solo una mejor comprensión de su morfología y adaptaciones funcionales, sino que también puede ayudar a evaluar nuevas intervenciones que se dirijan a este órgano a través de la edición de genes de reguladores clave de SG. Debido a que todos los estudios previos de arquitectura de las glándulas salivales larvales son anteriores a la inmunotinción y a las técnicas modernas de imagen10,11,hemos desarrollado un protocolo para aislar y teñir las glándulas salivales con una variedad de anticuerpos y marcadores celulares12. Este video demuestra este enfoque para la extracción, fijación y tinción de larvas de SG de larvas de larvas de Anopheles gambiae L4 larvas para imágenes confocales.

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Protocol

1. Preparación de soluciones y herramientas

  1. Preparación de la solución de disección
    1. Para preparar la solución de disección, agregue 2.5 ml de etanol al 100% a 7.5 ml de H2O destilado en un tubo de plástico de 15. Invierta el tubo 3 veces para mezclar.
      NOTA: Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente durante varias semanas.
  2. Preparación de 10 cepas de solución salina tamponada con fosfato (PBS)
    1. Para preparar 10x PBS stock, agregue 17.8 g Na2HPO4• 2H2O, 2.4 g KH2PO4, 80 g NaCl y 2 g KCl a 800 mL de agua desionizada. Mezcle con una barra de agitación en una placa de agitación hasta que los sólidos se hayan disuelto por completo. Ajuste el volumen final a 1 L con agua purificada.
      NOTA: Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente durante varios meses.
  3. Preparación de 1x PBS
    1. Agregue 10 ml de 10 pbs a 90 ml de H2O en una botella de vidrio estéril. Cierre bien la tapa e invierta 3x para mezclar.
      NOTA: La solución se puede almacenar a 4 °C durante varias semanas.
  4. Preparación de fijador.
    1. Añadir 600 μL de metanol a 200 μL de ácido acético glacial. Haga que la solución sea fresca cada vez.
  5. Construcción de una placa de masilla (un plato de cultivo de tejidos lleno de caucho de silicona)
    1. Mezclar los componentes (1:50) de epoxi (1 g) y agua (50 ml) y verter la mezcla en una placa de Petri. Espere a que los componentes se sequen antes de usar.
      NOTA: Una vez construida, la placa de masilla se puede utilizar durante años.

2. Disección de glándulas (Figura 1A)

  1. Recolectar larvas L4 en etapa tardía (~ 10 días después de la eclosión; Figura 2) de bandejas de alimentación utilizando una pipeta de transferencia de plástico.
    NOTA: Consulte este útil manual en línea para la cría estándar de mosquitos y el cultivolarvario 13.
    1. Coloque una placa de masilla en el escenario de un microscopio de disección y transfiera las larvas a la placa de masilla.
      NOTA: Al alícuotas larvas para la disección inicial, es útil transferir ~ 10 larvas al portaobjetos a la vez usando una pipeta de transferencia de plástico.
  2. Coloque una gota de solución de disección (1:3 EtOH:H2O) sobre la placa de masilla, separada de las 10 larvas.
  3. Use una pipeta de transferencia de plástico o una pipeta de vidrio desechable para colocar una larva L4 en la gota de EtOH al 25%.
  4. Tome fórceps (# 5), uno en cada mano, y con la mano no dominante, agarre la cabeza de la larva. Usando la mano dominante, agarre la larva con fórceps justo debajo de la cabeza y tire suavemente con una fuerza constante mínima, de modo que la cabeza se separe del resto del cuerpo y las glándulas permanezcan unidas a la cabeza. Deseche la porción del cuerpo de la carcasa de la larva.
    NOTA: Al diseccionar, coloque una toalla de papel cerca para recoger los cadáveres de las larvas.
  5. Recoja la cabeza/glándulas en 1 ml de 1x PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Use 1 ml de PBS para ~ 40 glándulas disecadas con sus cabezas unidas. Espere a que los cabezales/SG se hundan en el fondo del búfer.

3. Fijación para la tinción de anticuerpos (Figura 1B)

  1. Drene el PBS comenzando desde la parte superior del tubo de la microcentrífuga usando una pipeta de transferencia de vidrio, evitando los tejidos pegajosos del mosquito y eliminando la mayor cantidad posible de la solución de PBS sin dañar los tejidos. Reemplace la solución con 800 μL de una mezcla 3:1 de metanol a ácido acético glacial. Coloque el tubo a 4 °C durante la noche (se recomiendan 12-24 h; se prefieren 19 h).
  2. Al día siguiente, escurrir la solución y reemplazarla con 1 ml de acetona fría al 100%. Dejar para 90 s.
  3. Retire la acetona y enjuague suavemente los tejidos tres veces con 1 ml de 1x PBS cada vez.
    NOTA: Las muestras deben flotar lentamente hacia arriba con el flujo, luego caer de nuevo a la parte inferior del tubo para cuando se complete cada adición de PBS.

4. Inmunotinción (Figura 1B)

  1. Añadir anticuerpo primario (p. ej., Rab11) en la dilución adecuada (1:100) en 200 μL del volumen total de 1x PBS. Gire el contenido del tubo suavemente con una punta de pipeta. Incubar durante la noche a 4 °C.
  2. Retire la solución primaria de anticuerpos y lávela tres veces con 1 ml de 1 pbS (pipeteando suavemente la solución dentro y fuera de la pipeta).
  3. Añadir anticuerpo secundario (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) a la dilución adecuada (1:200) en 200 μL de volumen total. Gire el contenido del tubo suavemente con una punta de pipeta. Incubar a temperatura ambiente durante 90 min.
  4. Agregue colorantes, como rojo del Nilo (lípidos, 5 μL de 1 μg/μL) y/o Hoechst (ADN, 3 μL de 1 μg/μL), en 200 μL de PBS en esta etapa. Incubar a temperatura ambiente durante 60 min adicionales. Lavar suavemente tres veces con 1x PBS.

5. Montaje de glándulas teñidas para microscopía (Figura 1C)

  1. Pipetear 200 μL de glicerol al 100% en un portaobjetos de microscopio.
    NOTA: Como el glicerol es viscoso, deje la punta de la pipeta en el líquido hasta que alcance el volumen apropiado. No se observó encogimiento del tejido al pasar directamente al glicerol al 100%. Sin embargo, los investigadores pueden pasar por lavados de glicerol al 30% y 50% en los tubos antes de mover las muestras al 100% de glicerol.
  2. Transfiera las cabezas teñidas (hasta 20 por diapositiva) con las glándulas unidas (junto con otras estructuras internas) al portaobjetos del microscopio con un cepillo suave(Figura 3A). Extienda las muestras para que se distribuyan uniformemente a lo largo del portaobjetos de vidrio.
    NOTA: Al depositar glándulas en una cubierta deslizante con un cepillo, se pueden usar fórceps para orientar suavemente los SG para que todos estén orientados en la misma dirección.
  3. Viendo bajo un microscopio de disección, separe la cabeza larval de las glándulas usando dos pares de fórceps y tirando cuidadosamente de los dos tejidos en direcciones opuestas.
    NOTA: Como es difícil aislar completamente los SG, simplemente retire las cabezas, dejando los SG y las estructuras internas asociadas. Incluso si los SG permanecen asociados con otros tejidos, se reconocen fácilmente cuando se tiñen con Hoechst y otros marcadores(Figura 3B,C).
  4. Retire y deseche los cabezales y repita el proceso de separación para cada SG.
    NOTA: Al quitar cabezas, coloque una toalla de papel cerca para recogerlas.
  5. Coloque suavemente una funda de 1,5 mm de grosor en la parte superior (evitando burbujas de aire) y selle con esmalte de uñas transparente.
  6. Conservar a 4 °C en un recipiente a prueba de luz.
    NOTA: Las diapositivas preparadas de glándulas teñidas se pueden mantener a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de seis meses a un año sin ningún cambio notable en la calidad. Si el glicerol comienza a gotear a medida que pasan los meses, levante suavemente la cubierta y la pipeta en más glicerol para llenar los agujeros.

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Representative Results

Las glándulas salivales son relativamente fáciles de diseccionar de todas las larvas en etapa 4. Las larvas masculinas y femeninas se pueden distinguir en la etapa larvaria L4 tardía por una franja roja a lo largo del tórax dorsal de las hembras pero no de los machos (Figura 2). También observamos que la morfología antenal es mucho más elaborada en larvas L4 macho que en hembra(Figura 2),similar a las diferencias observadas en esta estructura en mosquitos adultos. Junto con el considerable crecimiento general durante la etapa L4, las glándulas salivales también forman un lumen durante L412. Las glándulas salivales aisladas de larvas de estadio L4 temprano teñidas con Hoechst revelan los lóbulos proximal y distal separados por una estrecha constricción(Figura 3B,C). La luz formadora se extenderá desde el conducto salival en el extremo más proximal (no se muestra) a través del lóbulo distal. La luz formadora se puede ver en la glándula salival distal inmunoteñida de una larva L4 de mediados a finales(Figura 4). Los dominios apicales de las células secretoras que rodean la luz formadora tienen una intensa tinción roja del Nilo(Figura 4B,C)que sugiere estructuras similares a microvellosidades. También se observa cerca de la superficie apical la tinción de Rab11(Figura 4C,D,flechas). Rab11 se localiza en endosomas de reciclaje apical. La tinción de Rab11 que también se acumula a lo largo de la superficie basal de la glándula es un artefacto debido a la pegajosidad de la membrana basal. La tinción de fondo similar es común con la inmunotinción de las glándulas salivales larvales y adultas y se ha confundido con una señal de buena fe.

Figure 1
Figura 1: Visualización de dibujos animados del proceso de inmunotinción desde la disección de glándulas hasta la preparación de diapositivas. Abreviaturas: SG = glándulas salivales; PBS = solución salina tamponada con fosfato; MeOH = metanol; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; Abs = anticuerpos; LH = mano izquierda; RH = mano derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Larvas macho y hembra de Anopheles gambaie en estadio L4. (A, B) Larvas L4 tempranas. (C, D) Larvas L4 tardías. Hay un crecimiento considerable durante la etapa L4. Se ha descrito que las hembras(A, C)tienen una franja roja distintiva en el tórax dorsal(C;flecha negra) que no está presente en los machos(B, D),pero también sus antenas son mucho menos elaboradas (frívolas) que las de las larvas masculinas de L4 temprana y tardía (flechas blancas en imágenes ampliadas). Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Glándulas salivales L4 tempranas. (A) Cabeza larvaria femenina L4 temprana con glándulas salivales y otros órganos internos aún unidos. Se delinea la glándula salival. Barra de escamas = 50 μm. (B, C) Glándulas larvales aisladas teñidas con Hoechst. (B) Fusión de imágenes fluorescentes y de Nomarski que muestran la forma de los lóbulos proximal y distal y la tinción azul de Hoechst en los núcleos. (C) La imagen fluorescente de Hoechst resalta solo los núcleos. Barra de escala en los paneles inferiores = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Glándula salival L4 distal inmunoteñida. (A) La glándula se ha teñido con Hoechst (ADN nuclear, azul) y (B) Rojo del Nilo (marcador de membrana, rojo); inmunoteñido para Rab11 (vesículas de reciclaje apical, verde) (C). (D) La imagen combinada. Tenga en cuenta que un lumen está presente en la etapa mostrada (B-D). Las flechas en C y D apuntan a la esperada tinción Rab11 de vesículas cerca de la superficie apical que se superpone a la tinción vesicular roja positiva del Nilo en la fusión (flechas blancas). También se observa tinción de fondo inespecífica alrededor de la superficie basal (asteriscos), un tipo común de fondo observado en las glándulas salivales larvales y adultas. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo descrito aquí fue adaptado de un protocolo de disección de Drosophila SG y un protocolo de disección de mosquitosadultos 14,15,16. Sin embargo, la mayoría de los marcadores no penetraron en la membrana basal (datos no mostrados) cuando se utilizaron los métodos de disección en adultos y tinción de SG. Las adaptaciones del protocolo para adultos incluyeron diseccionar las glándulas en una solución de EtOH al 25%, lavar las glándulas con una combinación de MeOH y ácido acético glacial, y tener un lavado de acetona de 90 s. En el protocolo original para adultos, los SG adultos se diseccionaron en 1x PBS14,15,16. La disección en una solución de EtOH al 25% ayudó a preservar los SG y evitó daños durante los períodos de tinción. Al realizar la disección inicial, fue más fácil orientar los SG larvales con la cabeza mirando hacia la mano no dominante y haciendo que la mano dominante tire suavemente hacia afuera (porque las larvas se mueven muy activamente). La penetración tisular mejorada lograda al lavar las glándulas con una solución de ácido acético glacial MeOH: sugiere que el contenido de lípidos en la membrana basal larvaria sg y / o membranas plasmáticas celulares es distinto del del SG adulto. El lavado de acetona de los años 90 mejoró la claridad de las glándulas para la obtención de imágenes. Aunque se recomendó que el período de fijación fuera de al menos 19 h (durante la noche), los períodos más largos funcionaron con la misma eficacia.

La morfología de los SG puede variar ampliamente dependiendo de cuándo se diseccionan las larvas en la etapa L4 de 2 días de duración. En las primeras disecciones L4 (día 1), la luz parece mucho más pequeña12. En las disecciones L4 tardías (segunda mitad del día 2), la luz es grande y las células son alargadas. Encontramos que el período óptimo para trabajar con larvas fue el L4; Los SG L1-L3 son simplemente demasiado pequeños para las disecciones manuales. En los resultados de las imágenes, las glándulas diseccionadas a mediados y finales de L4 mostraron células más pequeñas mezcladas con células más grandes y alargadas lateralmente, particularmente en el saco distal.

Los informes anteriores sobre el desarrollo de Anopheles SG han proporcionado mucha orientación para los estudios actuales. Estos informes han incluido ilustraciones de SG embrionarias y larvales disecadas17,18,análisis microscópico detallado de glándulas disecadas19,20y estudios transcriptómicos20,21,22. Las características del Anopheles stephensi SG fueron reportadas durante la década de 1950 por dos grupos diferentes10,11. Se describieron muchas de las características morfológicas de las glándulas larvarias, incluida la organización general del SG, las posiciones relativas de distintos tipos de células dentro del órgano (conducto, precursores adultos de SG y los sacos secretores proximales y distales larvales)10,11. Ambos grupos también reportaron datos morfométricos adicionales, incluyendo el número y distribución de células secretoras dentro de cada saco y su tamaño nuclear10,11. Rishikesh demostró que, al igual que los SG larvales de Drosophila, los cromosomas SG larvales de Anopheles stephensi están politenizados10. Estos importantes resúmenes fundamentales describieron amplios aspectos biológicos de las LARVAS de Anopheles SG.

El método descrito en este documento debe ser útil para estudiar no solo las LARVAS de An. gambiae, sino que también puede aplicarse a aquellos que estudian otras especies de mosquitos. De hecho, el mismo protocolo se ha utilizado con éxito (inédito) con An. stephensi,una especie frecuentemente estudiada en el laboratorio. Una limitación del protocolo es el número limitado de anticuerpos que se han generado específicamente contra las proteínas de los mosquitos. Aunque el uso de anticuerpos de Drosophila para proteínas altamente conservadas ha circunnavegado esta limitación12,el campo podría beneficiarse de más anticuerpos específicos de proteínas de mosquitos. La comprensión de la biología celular y molecular de las larvas de SG puede contribuir a nuevas estrategias de control o objetivo y permitir el descubrimiento de nuevos genes diana candidatos para la interrupción de SG.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer al Instituto de Investigación de la Malaria de Johns Hopkins por el acceso y la cría de larvas de An. gambiae.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 KH2PO4 Millipore Sigma P9791
 Na2HPO4 • 2H2O Millipore Sigma 71643
 NaCl Millipore Sigma S7653
Acetone Millipore Sigma 179124
Brush with soft bristles Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set B08LH63D89
Cover slips (22 x 50 mm) VWR 48393-195
DAPI (DNA) ThermoFisher Scientific D1306
Ethyl alcohol 200 proof Millipore Sigma EX0276
Gilson Pipetman P200 Pipette Gilson P200
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich 695092
Jewelers forceps, Dumont No. 5 Millipore Sigma F6521
KCl Millipore Sigma 58221
Methanol Millipore Sigma 1414209
Nail polish Amazon (Sally Hansen) B08148YH9M
Nile Red (lipid) ThermoFisher Scientific N1142
Paper towels/wipes ULINE S-7128
Petri plate (to make putty plate) ThermoFisher Scientific FB0875712
Pipette Tips Gilson Tips E200ST
Plastic Transfer Pipette Fisher Scientific S304671
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) ThermoFisher Scientific A11008
Silicone resin and curing agent for putty plate Dow Chemicals - Ximeter Silicone PMX-200
Slides, frosted on one end for labelling VWR  20 X 50 mm 48393-195
Wheat Germ Agglutinin ThermoFisher Scientific W834

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References

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Biología Número 175
Disección e inmunotinción de glándulas salivales larvales de mosquitos <em>Anopheles gambiae</em>
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