Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Respirometrie met hoge resolutie om bio-energetica in cellen en weefsels te beoordelen met behulp van respirometers op basis van kamer en platen

Published: October 26, 2021 doi: 10.3791/63000
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

Summary

Het beoordelen van oxidatieve fosforylering met behulp van respirometers met hoge resolutie is een integraal onderdeel geworden van de functionele analyse van mitochondriën en cellulair energiemetabolisme. Hier presenteren we protocollen voor de analyse van cellulair energiemetabolisme met behulp van kamer- en microplaatgebaseerde respirometers met hoge resolutie en bespreken we de belangrijkste voordelen van elk apparaat.

Abstract

Hoge resolutie respirometrie (HRR) maakt het mogelijk om oxidatieve fosforylering in realtime te monitoren voor analyse van individuele cellulaire energietoestanden en beoordeling van ademhalingscomplexen met behulp van gediversifieerde substrate-uncoupler-inhibitor titratie (SUIT) protocollen. Hier wordt het gebruik van twee respirometrie-apparaten met hoge resolutie gedemonstreerd en wordt een basisverzameling protocollen gepresenteerd die van toepassing zijn op de analyse van gekweekte cellen, skelet- en hartspiervezels en zachte weefsels zoals de hersenen en de lever. Protocollen voor gekweekte cellen en weefsels zijn voorzien voor een kamergebaseerde respirometer en gekweekte cellen voor een op microplaten gebaseerde respirometer, beide met standaard ademhalingsprotocollen. Voor vergelijkende doeleinden worden CRISPR-gemanipuleerde HEK293-cellen met een tekort aan mitochondriale translatie die meerdere deficiënties van het ademhalingssysteem veroorzaken, met beide apparaten gebruikt om cellulaire defecten in de ademhaling aan te tonen. Beide respirometers maken een uitgebreide meting van cellulaire ademhaling mogelijk met hun respectieve technische verdiensten en geschiktheid, afhankelijk van de onderzoeksvraag en het model dat wordt bestudeerd.

Introduction

Mitochondriën vervullen de belangrijkste energievoorziening en zijn een gecompartimenteerd organel dat bijdraagt aan essentiële cellulaire bio-energetische en metabole processen zoals anabolisme van nucleotiden, lipiden en aminozuren, ijzer-zwavelclusterbiogenese en zijn betrokken bij signalering zoals gecontroleerde celdood 1,2,3 . Mitochondriale bio-energetica door oxidatieve fosforylering draagt bij aan bijna alle cellulaire processen in de cel, en bijgevolg worden mitochondriale disfuncties van primaire of secundaire oorsprong geassocieerd met een breed spectrum van ziekteomstandigheden 4,5. Mitochondriale disfunctie omvat niet alleen veranderingen in structuur of mitochondriale dichtheid, maar ook in de kwaliteit en regulatie van het ademhalingssysteem6. Dit kwalitatieve element omvat substraatcontrole, koppelingskarakteristieken, posttranslationele modificaties, cristaedynamica en respiratoire supercomplexen 7,8. Daarom is een nauwkeurige analyse van mitochondriale bio-energetica voor experimentele en diagnostische benaderingen om het energiemetabolisme van de cel te beoordelen belangrijk voor gezondheid en ziekte.

Mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) is een opeenvolging van reacties binnen het ademhalingssysteem of elektronenoverdrachtsysteem (ETS) voor de opwekking van cellulaire energie via adenosinetrifosfaat (ATP)9. De multi-enzymatische stap om energie uit elektronenstroom door complexen I en II naar complex IV te benutten, genereert een elektrochemische protongradiënt over het binnenste mitochondriale membraan, vervolgens gebruikt voor fosforylering van adenosinedifosfaat (ADP) naar ATP via complex V (F1FO ATP-synthase) (figuur 1A).

Ten eerste worden twee-elektronendragers gegenereerd tijdens de tricarbonzuurcyclus (TCA), glycolyse en pyruvaatoxidatie: nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) en dihydroflavine adenine dinucleotide (FADH2). NADH wordt geoxideerd bij complex I (NADH-dehydrogenase), waarbij twee elektronen worden overgebracht naar co-enzym Q (chinon wordt gereduceerd tot quinol), terwijl protonen in de intermembraanruimte (IMS) worden gepompt. Ten tweede oxideert complex II (Succinaatdehydrogenase) FADH2 en voedt de elektronen naar co-enzym Q zonder protonen te pompen. Ten derde worden bij complex III (Cytochroom c oxidoreductase) elektronen uit co-enzym Q overgebracht naar cytochroom c, terwijl protonen in het IMS worden gepompt. Ten vierde brengt cytochroom c de elektronen over naar complex IV (Cytochroom c-oxidase), het laatste complex om protonen te pompen, en waar zuurstof functioneert als een elektronenacceptor om protonen te assimileren en uiteindelijk water te vormen. Het is deze zuurstof die mitochondriën verbruiken die kan worden gemeten door een oxygraaf. Ten slotte worden de protonen gegenereerd uit complex I, complex III en complex IV gebruikt om complex V te roteren, waardoor ATP 9 wordtgegenereerd.

Belangrijk is dat elektronenoverdracht niet alleen op een lineaire manier plaatsvindt, anders aangeduid als de elektronentransportketen. In plaats daarvan kunnen elektronen via meerdere ademhalingswegen naar de co-enzym Q-pool worden overgebracht en convergente elektronenstroom vergemakkelijken. NADH-substraten en succinaat kunnen bijvoorbeeld binnenkomen via respectievelijk complex I en complex II. Elektronen uit vetzuuroxidatie kunnen worden gedoneerd via het elektronoverdrachtsflavoproteïnecomplex. Een uitgebreide analyse van OXPHOS vereist inderdaad een holistische benadering met geschikte brandstofsubstraten (figuur 1A).

Figure 1
Figuur 1: Mitochondriale oxidatieve fosforylering en specifieke substraat- en inhibitorprotocollen. (A) Mitochondrion en schema van het elektronenoverdrachtssysteem (CI-CIV) en mitochondriaal F1F0 ATP-synthase (CV). Alle structuren zijn afkomstig van PDB. De cijfers tonen alleen substraten en remmers die in dit onderzoek worden beschreven). (B) Monsterspoor van zuurstofflux in intacte HEK293-cellen met behulp van het standaardprotocol in een mHRR-apparaat. (C) Monsterspoor van zuurstofflux in intacte HEK293-cellen met behulp van een standaardprotocol in een cHRR-apparaat. (D) Monsterspoor van zuurstofflux in gepermeabiliseerde menselijke fibroblasten van een gezonde donor met het respectieve SUIT-protocol. Afkortingen: 1 = Routinematige ademhaling van intacte cellen; 2 = toestand 2; 3 = toestand 3(I); 4 = Toestand 3(I) met cytC; 5 = toestand 3 (I+II); 6 = Lek(OM); 7 = ETS-capaciteit; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenon, AM = Antimycine, ATP = Adenosinetrifosfaat, Az = Azide, OM = Oligomycine, FCCP = Carbonylcyanide p-trifluoro-methoxyfenyl-hydrazone; Asc = Ascorbaat, TMPD = N,N,N′,N′-tetramethyl-p-fenyleendiamine, Succ = Succinaat, M = Malaat, P = Pyruvaat, ADP = Adenosinedifosfaat, NAD = Nicotinamide adenine dinucleotide, IMS = Intermembrane ruimte, FAD = Flavin adenine dinucleotide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Analyse van mitochondriale OXPHOS-capaciteit met behulp van HRR is een instrumentele biochemische methode van diagnostische waarde geworden, niet alleen voor primaire mitochondriale defecten10,11, maar ook uitbreidend naar alle andere gebieden van de biologie, zoals kanker en veroudering12. HRR maakt de bepaling van cellulaire ademhaling mogelijk door de analyse van mitochondriale OXPHOS-capaciteit, die direct individuele of gecombineerde mitochondriale respiratoire complexe deficiëntie weerspiegelt, en indirect geassocieerd is met cellulaire disfunctie en veranderd energiemetabolisme9. Methodologisch worden ademhalingsmetingen uitgevoerd met behulp van cellen, weefsel of geïsoleerde mitochondriën 11,13,14, met bevroren materiaal dat slechts gedeeltelijk geschikt is 15,16. Bevroren weefsel blijkt een intact ETS te hebben met behoud van supercomplexe stabiliteit15. In tegenstelling tot traditionele TCA-tussenproducten worden de respectieve substraten dus rechtstreeks in het ETS ingevoerd. De koppeling tussen de ETS- en ATP-synthese gaat echter verloren omdat de membraanintegriteit wordt aangetast door bevriezingsschade (ijskristalvorming).

Ademhalingsexperimenten vinden normaal gesproken plaats bij een fysiologische temperatuur van 37 °C voor endothermen in niet-permeabiliseerde of permeabiliseerde cellen of weefsel. Terwijl de eerste de cytosolische metabole context beschouwt, levert de laatste de energetische bijdrage van individuele OXPHOS-complexen en de ATPase door de toevoeging van specifieke substraten (en remmers). De sequentie en variatie van substraten en remmers hebben geleid tot de ontwikkeling van een breed scala aan SUIT-protocollen17 en assays18 om verschillende wetenschappelijke vragen over de OXPHOS-functie aan te pakken (beoordeeld onder12). Het basisprotocol van cellulaire ademhaling beoordeelt vier verschillende toestanden: i) routinematige ademhaling - de ademhaling in een respectievelijk ademhalingsmedium zonder toevoeging van substraten of remmers die maar endogene substraten consumeren. Deze toestand kan algemene OXPHOS of secundair geïnduceerde ademhalingsdefecten onthullen die bijvoorbeeld worden veroorzaakt door veranderde metabolietprofielen. Vervolgens onthult de toevoeging van de ATPase-remmer oligomycine de permeabiliteit van het binnenste mitochondriale membraan voor protonen, gedefinieerd als ii) lekademhaling. Daaropvolgende titratie van een protonofoor zoals de ontkoppelaar carbonylcyanide p-trifluor-methoxyfenyl-hydrazone (FCCP) maakt het mogelijk om de toestand te bepalen waarin de ETS-capaciteit maximaal is in een open-transmembraan protoncircuitmodus, gedefinieerd als iii) ontkoppelde ademhaling. Belangrijk is dat een ontkoppelde toestand ook kan optreden door experimentele interventies door overmatige mechanische schade aan de mitochondriale membranen. Omgekeerd verwijst de niet-gekoppelde toestand naar respiratoire ontkoppeling door een intrinsiek mechanisme dat fysiologisch wordt gecontroleerd. Ten slotte bepaalt volledige remming van het ETS door toevoeging van de complexe III-remmer antimycine en complexe I-remmer rotenon het resterende zuurstofverbruik (ROX) van niet-mitochondriale zuurstofverbruikende processen (figuur 1A-C).

Mitochondriale bio-energetica bestaat uit vijf verschillende ademhalingstoestanden19,20. Toestand 1 ademhaling is zonder extra substraten of ADP, behalve wat endogeen beschikbaar is. Na de toevoeging van ADP, maar nog steeds geen substraten, wordt toestand 2 ademhaling bereikt. Wanneer substraten worden toegevoegd, waardoor elektronenoverdracht en ATP-synthese mogelijk zijn, wordt toestand 3-ademhaling bereikt. In deze toestand kan OXPHOS-capaciteit worden gedefinieerd bij verzadigde concentraties van ADP, anorganisch fosfaat, zuurstof, NADH- en succinaatgebonden substraten. Toestand 4 ademhaling of LEAK ademhaling kan worden gedefinieerd als een toestand zonder ADP of chemisch geremde ATP-synthasen met voldoende substraten. Ten slotte, wanneer alle zuurstof is uitgeput (anoxisch) in een gesloten kamer, wordt toestand 5 ademhaling waargenomen.

Er bestaan verschillende methoden om cellulaireenergietoestanden 14 te beoordelen met twee apparaten die de huidige real-time beoordeling van OXPHOS domineren door analyse van het zuurstofverbruik, gemeten als de functie van de afname van zuurstof in de loop van de tijd in een gesloten kamersysteem met verschillende toepasbaarheid afhankelijk van het experimentele model en de onderzoeksvraag: de Oroboros 2k hoge resolutie respirometer en de Seahorse XF extracellulaire flux analyzer. Beide apparaten registreren het zuurstofverbruik als een afname van picomol (pmol) van zuurstof (O2) per seconde als een absolute waarde in de kamer of microplaatput. Het specifieke zuurstofverbruik per massa wordt verkregen door het respectieve zuurstofverbruik te normaliseren in een specifiek bufferrecept per aantal cellen (miljoenen), weefselgewicht (mg) of eiwithoeveelheid.

De O2k (Oroboros Instruments) is een gesloten tweekamersysteem uitgerust met een polarografische zuurstofsensor (afgekort als kamergebaseerde hoge resolutie respirometer: cHRR). Elke experimentele kamer bevat 2 ml vloeistof die homogeen wordt gehouden door magnetische roerders. De polarografische zuurstofsensor maakt gebruik van een amperometrische benadering om de zuurstof te meten: het bevat een gouden kathode, een zilver / zilverchloride-anode en tussendoor een KCI-oplossing die een elektrochemische cel creëert waarop een spanning (0,8 V) wordt toegepast. Zuurstof uit het testmedium diffundeert door een gefluoreerd ethyleenpropyleenmembraan van 25 μm (O 2-permeabel) en ondergaat reductie aan de kathode, waardoor waterstofperoxide wordt geproduceerd. Aan de anode wordt zilver geoxideerd door waterstofperoxide, waardoor een elektrische stroom wordt gegenereerd. Deze elektrische stroom (ampère) is lineair gerelateerd aan de partiële zuurstofdruk. De partiële druk van zuurstof en de zuurstofoplosbaarheidsfactor van het testmedium worden gebruikt om de zuurstofconcentratie te berekenen. Aangezien de partiële zuurstofdruk afhankelijk is van de experimentele temperatuur en polarografische metingen temperatuurgevoelig zijn, moeten temperatuurschommelingen nauwkeurig (±0,002 °C) worden geregeld door een Peltier-verwarmingsblok. De temperatuur kan worden geregeld binnen een bereik van 4 °C en 47 °C.

De Seahorse XF extracellulaire flux analyzer (Agilent) is een op platen gebaseerd systeem met 24- of 96-well microplaatformaat waarin drie fluorescentie-elektroden het zuurstofverbruik in de loop van de tijd in elke put meten (afgekort als microplaatgebaseerde hoge resolutie respirometer: mHRR). Er zijn maximaal vier poorten in de testcartridge beschikbaar voor geautomatiseerde injectie tijdens de test. Een test bevat meerdere cycli, elk met drie fasen: 1) mengen, 2) wachten en 3) meten. Tijdens de meetfase worden sensorsondes in de microplaat neergelaten, waardoor een tijdelijk gesloten kamer ontstaat met een volume van 7-10 μL om het uitgestraalde licht te meten. Dit licht wordt uitgezonden door polymeer-ingebedde fluoroforen op de punt van de sensorsondes, die O2 detecteren op basis van fosforescentie-doven. De intensiteit van het fluorescentiesignaal is evenredig met O2 en wordt beïnvloed door de temperatuur van de sensor en het testmedium. Daarom vereist nauwkeurige zuurstofschatting een relatieve benadering met een achtergrondput zonder monster. Het herstellen van de zuurstofconcentratie vindt plaats tijdens de mengfase wanneer de sensor op en neer beweegt om het volume boven de tijdelijke kamer te mengen. Elke cyclus berekent één zuurstofverbruik. De temperatuur kan worden geregeld binnen een bereik van 16 °C en 42 °C.

HRR is de gouden standaard om cellulaire bio-energetica te beoordelen bij primaire en mitochondriën-geassocieerde ziekten en algemeen cellulair metabolisme. In deze studie worden basisprotocollen voor HRR gegeven om de OXPHOS-functie in cellen en weefsels te beoordelen.

Figure 2
Figuur 2: Workflow voor cel- en weefselpreparaten voor cHRR en celvoorbereiding voor mHRR-respirometrie. (A) Overzicht van verstrekte protocollen. (B) Zoogdiercellen (stap 1.2): HEK293-pellet gelijk aan 3 x 106 cellen (linkerpaneel). Niet-vezelig weefsel (stap 1.3): Bereiding van murine cerebellum lysaat in 2 ml teflon potter (middenpaneel). Saponine-geïnduceerde skeletspierpermeabilisatie (stap 1.4) rechterpaneel) voor cHRR-respirometrie. (C) Standaard lay-out voor het zaaien van microplaten (stap 2.4) en de samenvloeiingscontrole voor de analyse van eukaryote cellen (HEK293) voor mHRR-respirometrie. (D, E) Schema van injectiepoortbelasting voor mHRR-respirometrie (stap 2.4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de National Animal Experiment Review Board en het Regional State Administrative Agency for Southern Finland. Mannelijke C57BL/6JOlaHsd muizen (4-6 maanden oud) werden gebruikt in deze studie. Toestemming voor het gebruik van menselijke cellijnen werd verkregen van de institutionele ethische commissie van de Universiteit van Helsinki.

1. Hoge resolutie respirometrie: Kamer-gebaseerde respirometer (cHRR)

OPMERKING: De experimenten in dit gedeelte van het protocol werden uitgevoerd met behulp van de Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Tabel van Materialen)

  1. Kalibratie van zuurstofsensoren
    1. Voer respirometers vooraf uit bij 37 °C in 2,1 ml mitochondriaal ademhalingsmedium (MiR05, tabel 1, oplosbaarheidsfactor: 0,92) gedurende >45 min en voer zuurstofkalibratie uit zoals beschreven21. Ga verder als de basislijnvariatie binnen ± 4 pmol/s ligt.
      OPMERKING: Grote fluctuaties in het achtergrondsignaal kunnen wijzen op vereist onderhoud van het sensormembraan of sporen van remmers die in de kamer achterblijven van eerdere experimenten. Een instrumentele correctie van de zuurstofflux op de achtergrond wordt aanbevolen voorafgaand aan een reeks experimenten25.
    2. Noteer zuurstofkalibratiewaarden om de prestaties van het sensormembraan in de loop van de tijd te controleren.
      OPMERKING: Dit onthult de sensorfunctie, signaal-ruisstabiliteit en wanneer sensormembraanonderhoud vereist is. Afhankelijk van de omgevingsdruk wordt tussen de 180-200 μmol zuurstof opgelost in MiR05.
    3. Verwijder alle vloeistof in de kamer voordat een monster in het ademhalingsmedium wordt toegevoegd.
      OPMERKING: Evalueer het volume van de ademhalingskamers om regelmatig precies 2 ml te zijn.
  2. Voorbereiding van cellen voor respirometrie met hoge resolutie
    1. Kweek HEK293 cellen in 10 cm2 diameter schotels in Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) met hoge glucose aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), GlutaMax, Niet-essentiële aminozuren en Na-Pyruvaat22 en uridine23 ter ondersteuning van OXPHOS-defect metabolisme in een incubator bij 37 °C bij 5% CO2.
      OPMERKING: Elk type eukaryote cel kan worden gekweekt. Voor de meeste celtypen leidt het kweken van een schaal van 10 cm2 tot voldoende cellen (meestal >3 x 106 cellen). Controleer routinematig op mycoplasma-infectie om effecten op het cellulaire metabolisme en de ademhaling te voorkomen.
    2. Kweek cellen zonder 90% confluentie te overschrijden (figuur 2C).
      OPMERKING: Cellen met >90% confluency kunnen groeiafhankelijke remmende effecten op de ademhaling vertonen (indien niet gesynchroniseerd of post-mitotisch).
    3. Was de cellen met 1x PBS, maak ze los met 1 ml warm 0,25% trypsine, deactiveer trypsine door warme DMEM (5 ml/10 cm2 plaat) toe te voegen en tel de cellen met een hemocytometer.
    4. Centrifugeer de celoplossing voorzichtig gelijk aan 2,5 x 106 cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant volledig en resuspensieer in 2,5 ml warme MiR05 (1 x 106 cellen / ml) (figuur 2A).
    5. Voor suspensiecellen, tel en verwijder oplossing gelijk aan 2,5 x 106 cellen, pellet en ga verder zoals vermeld in stap 1.2.4.
    6. Voer het SUIT-protocol uit voor permeabilisatieoptimalisatie (stap 1.6), permeabiliseerde cellen of weefsels (stap 1.5) of intacte cellen (stap 1.7)
      OPMERKING: Voor consistente resultaten wordt aanbevolen om de celconcentratie constant te houden (bijv. 1 x 106 cellen / ml). Hoewel de ademhaling onafhankelijk is van de celdichtheid in de respirometer24, bevinden substraten en remmers zich in vergelijkbare concentraties tijdens experimenten als het aantal cellen constant wordt gehouden.
  3. Voorbereiding van niet-vezelig weefsel (bijv. Hersenen, lever) voor respirometrie met hoge resolutie
    1. Snijd een homogeen stuk weefsel weg, 30-40 mg in gewicht, of gebruik het hele orgaan (muis cerebellum in dit geval).
      OPMERKING: Als weefsel niet onmiddellijk wordt gebruikt, houd dan 2 ml ijskoude MiR05 in waardoor conservering tot 2 uur voor de meeste weefsels mogelijk is. Individuele weefselopslagtijden moeten in tijdreeksen worden beoordeeld.
    2. Dep het zakje droog met een Whatman-filterpapier (let op: zacht weefselmateriaal heeft de neiging om te plakken).
    3. Doe het stukje van 30-40 mg in een ijsgekoelde 2 ml polytetrafluorethyleen potter Elvehjem homogenisator.
    4. Voeg een geschikte hoeveelheid MiR05 toe om 20 mg / ml te verkrijgen om de weefsel-bufferverhouding te behouden. Houd de totale hoeveelheid >1,5 ml en <2 ml om onvoldoende of overmatige vloeistof voor een geschikte mechanische permeabilisatie te voorkomen.
    5. Breng de stamper in, lyseer het weefsel langzaam door de stamper voorzichtig in te trekken en vermijd het genereren van een vacuüm dat overmatige weefselschade veroorzaakt.
    6. Voer in totaal 7 slagen uit (1x gedefinieerd als één op- en neergaande slag) totdat ze worden gelyseerd (zichtbaar als een troebele vloeistof zonder groot vuil) (figuur 2B).
      OPMERKING: Het aantal slagen voor geschikte lysis moet voor elk weefsel worden getest door de integriteit van het buitenste mitochondriale membraan te beoordelen via cytochroom C-respons (stap 1.5.11). Hard-to-lyse bindweefsel of vaatdelen kunnen achterblijven.
    7. Decanteer het gelyseerde weefsel in een centrifugebuis van 15 ml.
    8. Was de binnenkant van de pottenbakker met een gelijke hoeveelheid MiR05 die wordt gebruikt in de lyseerstap (bijv. 1,5 ml) en voeg toe aan de buis van 15 ml die nu 3-4 ml MiR05 bevat bij 10 mg / ml weefsellysaat.
    9. Voeg 2 ml gewone MiR05 per kamer toe om op te warmen tot 37 °C.
    10. Draai de buis voor een gelijke verdeling voordat u 500 μL (gelijk aan 5 mg) van elk lysaat per kamer langzaam pipetteert om de spanning van koud tot 37 °C te minimaliseren.
    11. Wacht >3 minuten tot de inhoud van de kamer is opgewarmd tot 37 °C voordat u de kamer sluit. Verwijder overtollig vocht bovenop de stop (hoeveelheid per kamer na sluiting: 4 mg).
    12. Voer het SUIT-protocol uit voor standaard permeabilized (stap 1.5).
  4. Voorbereiding van vezelig weefsel (skeletspieren, hartspier) voor respirometrie met hoge resolutie
    1. Extraheer het harde weefsel, verwijder het bindweefsel en vet uit de spieren met een scherpe tang in 2 ml ijskoude BIOPS (tabel 2) onder een dissectiemicroscoop.
    2. Scheid de vezelbundels (~ 4 mg) langs de lengteas met een scherpe tang. Plaag de vezels voldoende uit om een mesh-achtige structuur te verkrijgen (figuur 2B).
      OPMERKING: Een goede mechanische vezelscheiding en permeabilisatie wordt aangegeven door het verlies van het rode pigment myoglobine en verhoogde doorschijnendheid.
    3. Was en permeabiliseer de vezelbundel in saponine (50 μg/ml in BIOPS, vers bereid) gedurende 20 minuten bij 4 °C (vezels worden doorschijnend, wat duidt op volledige permeabilisatie, figuur 2B).
    4. Was de vezels twee keer in MiR05 gedurende 5 minuten per wasbeurt op 4 °C.
    5. Dep droog met filtreerpapier en weeg voordat u het toevoegt aan de kamer gevuld met 2,1 ml MiR05.
    6. Introduceer stoppers zonder volledig te sluiten, oxygeneer vervolgens de kamers met 2 ml pure O2 met behulp van een spuit van 20 ml en sluit de kamers door de stoppen in een roterende beweging te draaien. Houd de O2-concentratie tijdens het experiment tussen 300-500 μM om zuurstofdiffusiebeperking te voorkomen.
  5. Protocol voor het beoordelen van routinematige ademhaling in cellen of weefsels
    1. Voeg een monster toe aan de kamer zoals vermeld in stap 1.5.2-1.5.3.
    2. Voeg 2,3 ml warme MiR05-celsuspensie toe (standaardinvoer: 1 x 106 cellen / ml zoals in stap 1,2 of 2 mg weefsel / ml zoals in stap 1.3)
    3. Skelet- en hartspier (stap 1.4): Voeg ~4 mg saponine-permeabilized vezels toe aan voorgewarmde 2,3 ml warme MiR05 met inachtneming van stappen 1.4.4-1.4.6
    4. Draai kamers op 37 °C en een roersnelheid van 700 tpm. Wacht >3 minuten om media te laten ontgassen en sluit de kamers door de stop in een roterende beweging te draaien. Peltier blokstabilisatie geeft aan dat de ingestelde temperatuur wordt bereikt.
    5. (OPTIONEEL) Verander de roersnelheid naar 300 tpm om de resterende bubbels door het capillair van de stop te laten ontsnappen.
    6. Zuig overtollige vloeistof bovenop de stop. Wacht 10 minuten totdat een stabiel zuurstoffluxsignaal is bereikt met elk monstertype om routine/toestand 1 ademhaling te registreren, figuur 1B).
    7. Voor ademhalingsmetingen in gepermeabiliseerde cellen en weefsel, gaat u verder met stap 1.6. Voor intacte cellen met stap 1.8.
  6. Protocol voor OXPHOS-analyse in gepermeabiliseerde cellen of weefsels
    1. Gebruik gelyseerd (gepermeabiliseerd) weefselmonster of permeabiliseer cellen door 1 μL digitonine (8,1 mM digitoninevoorraad in dimethylsulfoxide (DMSO)) toe te voegen voor een uiteindelijke concentratie van 5 μg / ml om cellen te permeabiliseren. De flux zal dalen en zou moeten stabiliseren op >5 min.
      LET OP: Digitonine is acuut toxisch voor de luchtwegen, in contact met de huid, of wanneer het wordt ingeslikt.
      OPMERKING: Injectie van alle chemicaliën wordt uitgevoerd met precisieglasspuiten. Gebruik spuiten alleen voor aangegeven chemicaliën om kruisbesmetting te voorkomen en was grondig in water en EtOH na gebruik. Geblokkeerde spuiten kunnen ultrasone trillingen vereisen in warme ddH2O of een reinigingsdraad om chemische verstoppingen los te maken. Trek altijd een overschot van de betreffende voorraadoplossing in de spuit om te voorkomen dat er lucht in de kamers wordt gebracht. Inspecteer de binnenkant van de kamers voor het inbrengen van lucht na elke injectie. Noteer elke stap totdat de flux plateaus bereikt.
    2. Voeg snel achter elkaar toe: 5 μL 0,4 M malaat (M) voor een eindconcentratie van 1 mM, 5 μL 2,0 M pyruvaat (P; vers bereid), voor een eindconcentratie van 5 mM, 4 μL van 2,5 M glutamaat (G) voor een eindconcentratie van 5 mM.
    3. Voeg na een eerder fluxplateau 5 μL (10 μL voor spierweefsel) van 0,5 M adenosinedifosfaat (ADP, aliquots bewaard bij -80 °C) toe voor een eindconcentratie van 1,25 mM.
      OPMERKING: Weefsel zoals spieren kunnen een andere concentratie nodig hebben om verzadiging te bereiken.
    4. Voeg 5 μL 4 mM cytochroom C (cytC) toe voor een eindconcentratie van 10 μM.
      OPMERKING: Optioneel voor cellen om de kwaliteit van permeabilisatie te beoordelen.
    5. Voeg 16 μL 1,25 M succinaat (S) toe voor een eindconcentratie van 10 mM. (OPTIONEEL) Voeg 3 μL 0,5 M ADP toe voor een eindconcentratie van 2 mM om de verzadiging van de ADP-concentratie te regelen.
    6. Voeg voor cellen en niet-vezelig weefsel 2 μL 1 mg/ml oligomycine (OM) toe voor een eindconcentratie van 1 μg/ml.
      LET OP: Alle gebruikte ETS-remmers zijn zeer giftig.
      OPMERKING: Oligomycine kan titratie vereisen voor optimale concentratie, omdat het de ETS-capaciteit kan onderdrukken en wordt weggelaten voor spierweefsel. Reoxygeneer hier wanneer spierweefsel wordt getest en als O2 lager is dan 300 μM.
    7. Titreer FCCP uit een voorraad van 2 mM, voeg 0,6 μL toe met daaropvolgende stappen van 0,2 μL totdat er geen toename van de ademhaling en ademhaling maximaal is ontkoppeld (theoretisch: niet-gekoppeld).
    8. Voeg 1 μL 1 mM rotenon (ROT) toe voor een eindconcentratie van 0,5 μM. Voeg 2 μL 1 mg/ml antimycine (AM) voorraad toe voor een eindconcentratie van 1 μg/ml.
    9. Reoxygeneer de kamers om een vergelijkbaar zuurstofniveau (~ 150 μM) in alle kamers te bereiken door de zuiger langzaam op te tillen in draaiende beweging.
    10. Voeg 5 μL 0,8 M ascorbaat toe voor een eindconcentratie van 2 mM onmiddellijk gevolgd door 5 μL van 0,2 M N,N,N′,N′-tetramethyl-p-fenyleendiamine (TMPD) voor een eindconcentratie van 0,5 mM om complexe IV-activiteit te beoordelen (optioneel).
    11. Voeg 5 μL 4 M azide toe voor een eindconcentratie van 10 mM onmiddellijk wanneer de piek O2 flux wordt bereikt met TMPD. Ga door met de run gedurende >5 minuten om de automatische oxidatie van TMPD te testen voor complexe IV-basisniveauberekening.
    12. Hertel de cellen om het aantal cellen voorafgaand aan de run te bevestigen en ga verder met stap 1.9.
      OPMERKING: Digitonine-permeabilisatie (alleen voor cellen) moet worden getitreerd in proefexperimenten om maximale flux te bereiken en de mitochondriale membraanintegriteit niet te beïnvloeden (zie stap 1.7). Gepermeabiliseerde monsters (vooral spierweefsel) met >10% toename van de ademhalingsfrequentie na toevoeging van cytochroom c moeten worden uitgesloten van verdere analyse vanwege schade aan het buitenste mitochondriale membraan. Een korte tijdsdip in flux na de toevoeging van EtOH-opgeloste chemicaliën wordt verwacht.
  7. Protocol om optimale permeabilisatiecondities voor cellen te bepalen
    1. Voeg cellen toe zoals beschreven in stap 1.2 en 1.5.2.
    2. Neem 10 μL van 10 mg/ml digitonine en voeg 10 μL DMSO toe om te verdunnen tot 5 mg/ml.
    3. Voeg 1 μL rotenon (1 mM bouillon) toe. Voeg 10 μL succinaat (2 mM bouillon) en 5 μL ADP (0,5 M bouillon) toe.
    4. Titreer herhaaldelijk 1 μL digitonine (2,5 mg per stap) totdat de ademhaling niet verder toeneemt en maximaal is.
      OPMERKING: Een afname van de ademhaling duidt op een overmatige concentratie digitonine.
  8. Protocol voor OXPHOS-analyse in intacte cellen
    1. Voeg na routinematige ademhaling (stap 1.6.1-1.6.6) 2 μL 0,01 mM oligomycine toe voor een eindconcentratie van 10 nM.
    2. Titreer FCCP uit 2 mM voorraad, voeg 0,6 μL toe met daaropvolgende stappen van 0,2 μL totdat er geen verdere toename van de ademhaling en ademhaling maximaal is ontkoppeld (theoretisch: niet-gekoppeld)
    3. Voeg 1 μL 1 mM rotenon toe voor een eindconcentratie van 0,5 μM. Voeg 2 μL 1 mg/ml antimycinebouillon toe voor een eindconcentratie van 1 μg/ml.
    4. Reoxygeneer de kamer tot hetzelfde zuurstofniveau (~ 150 μM) door de zuiger langzaam in draaiende beweging op te tillen.
    5. Voeg 5 μL 0,8 M ascorbaat toe voor een uiteindelijke concentratie van 2 mM. Voeg onmiddellijk 5 μL van 0,2 M TMPD toe voor een eindconcentratie van 0,5 mM om complexe IV-activiteit te beoordelen.
      OPMERKING: Bereid een nieuwe batch voor voor een grotere reeks experimenten, omdat TMPD gevoelig is voor automatische oxidatie. De activiteit kan in de loop van de tijd afnemen wanneer deze bij -20 °C wordt bewaard.
    6. Voeg 5 μL 4 M azide toe voor een eindconcentratie van 10 mM onmiddellijk wanneer de piek O2 flux wordt bereikt met TMPD. Ga >5 minuten door om de automatische oxidatie van TMPD te testen voor complexe IV-basisniveauberekening.
    7. Cellen opnieuw tellen om het aantal cellen voorafgaand aan de uitvoering te bevestigen en ga verder met stap 1.9.
  9. Post-run monsterverzameling
    1. Verzamel precies 1 ml MiR05-suspensie uit elke kamer (met roerders aan) in een buis van 1,5 ml met 1,5 ml.
    2. Centrifugeer bij 1000 x g voor gepermeabiliseerde cellen of bij 20.000 x g voor weefsellysaat. Verwijder het supernatant en vries de pellet in bij -80 °C voor verdere verwerking (punt 3).
  10. Analyse van SUIT-protocollen
    1. Analyseer de zuurstofflux (pmol/s, genormaliseerd tot input) op elk plateau na toevoeging van een substraat of remmer (figuur 1C en figuur 3A). Exporteer de waarden naar een spreadsheet.
    2. Trek de waarde van het resterende zuurstofverbruik (ROX, figuur 1C en figuur 3C) af van alle waarden van elke experimentele run. Trek azide resterende ademhaling af van TMPD om complexe IV-ademhaling te verkrijgen.
    3. Zet de absolute waarden uit die zijn genormaliseerd voor cel (figuur 3A, B) of weefselinvoer (figuur 5A, B). Bereken de fluxcontroleverhoudingen (stap 1.11) of normaliseer ze naar eiwitinvoer (figuur 3C).
  11. Berekening van de fluxregelverhouding
    1. Verkrijg een index van ademhalingsfunctie en koppelingscontrole met behulp van fluxcontroleverhoudingen (FCR)9,26.
      OPMERKING: Dit maakt het mogelijk om de intrinsieke mitochondriale kwaliteit te beoordelen, onafhankelijk van mitochondriale kwantiteit. Bovendien zijn fluxcontroleverhoudingen (FCR) vergelijkbaar binnen dezelfde cellijnen die reagenskwaliteitscontrole mogelijk maken (de respectieve FCR's worden verkregen door de aangegeven genummerde referentiewaarden in figuur 1B-D en figuur 3C).
    2. Bereken de respiratoire controleverhouding voor de koppeling van OXPHOS aan LEAK met behulp van vergelijking 1.
      Vergelijking 1: FCRADP = 5/6 = Toestand 3 / Toestand 4
    3. Bereken de FCR om nadh-afhankelijke ademhaling te beoordelen met behulp van vergelijking 2
      Vergelijking 2:FCR-toestand 3 (I) = 3/5 = toestand 3 (I) / toestand 3 (I+II)
    4. Bereken de FCR om de Succinaatafhankelijke ademhaling te beoordelen met behulp van vergelijking 3.
      Vergelijking 3:FCR-toestand 3 (II) = 8/7 = Srot /ETS-capaciteit
    5. Bereken de FCR die gekoppeld aan ontkoppeld moet worden beoordeeld met behulp van vergelijking 4.
      Vergelijking 4: FCRgekoppeld/ontkoppeld = 5/7 = toestand 3 (I+II) /ETS-capaciteit
    6. Om de mitochondriale buitenmembraanintegriteit te testen, gebruikt u vergelijking 5.
      Vergelijking 5: % mitochondriale buitenmembraanschade = 3/4 = toestand 3 (I) / toestand 3 (I) met cyt c

2. Hoge resolutie respirometrie: Microplaat-gebaseerde respirometer (mHRR)

OPMERKING: De experimenten in dit gedeelte van het protocol werden uitgevoerd met behulp van de Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer (Materiaaltabel)

  1. Celkweek
    1. Kweek elk type cel. Adherenten (bijv. Collageen, laminine) kunnen worden gebruikt om de celaanhechting te vergemakkelijken. Hier worden HEK293-cellen gekweekt zoals voorheen (stap 1.3).
    2. De dag voor het experiment maakt u de cellen los en brengt u ze over in een aangewezen mHRR 96-well microplaat om ideale samenvloeiing te verkrijgen op de dag van het experiment (80% -100%) (figuur 2C).
      OPMERKING: Voor mHRR zijn de dichtheden van microplaatcellen van cruciaal belang. Individuele groei-eigenschappen van cellijnen of behandelingen die de groei beïnvloeden, moeten worden verantwoord om vergelijkbare samenloop op de dag van het experiment te garanderen.
  2. Voorbereiding van cellen voor respirometrie met hoge resolutie
    1. Oogst en resuspendeer de cellen voldoende voorafgaand aan het zaaien
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om cellen uit dezelfde verdunning te zaaien voor replicaties.
    2. Zaai de cellen volgens groeisnelheden van individuele cellijnen of groei-eigenschappen onder behandeling.
      OPMERKING: Optimaliseer op een standaard 96-well microplaat en extrapoleer de celdichtheid naar een 96-well assay-specifieke microplaat. In deze opstelling werden 7 x 104 HEK293 WT-cellen gezaaid per put van een 96-put. De eerste en laatste kolommen van de 96-well plaat worden gebruikt voor eiwitbepaling (figuur 2C). De vier hoekputten mogen geen cellen bevatten en worden gebruikt voor experimentele achtergrondcorrectie. Idealiter zijn putten dicht bij de randen leeg om het randeffect te minimaliseren (cellen vertonen bijvoorbeeld veranderde groeisnelheden veroorzaakt door temperatuureffecten) (figuur 2C, D).
  3. Bereiding van sensorplaten, laden van remmers
    1. Op de dag van de test, supplement 38,8 ml medium met 0,4 ml 1 M glucose, 0,4 ml glutamine en 0,4 ml na-pyruvaat.
      OPMERKING: mHRR-ademhaling vereist een gespecialiseerd niet-gebufferd DMEM-medium bij pH 7,4. Over het algemeen zou 40 ml voldoende moeten zijn voor één experiment met één 96-well microplaat.
    2. Verwarm het ademhalingstestmedium tot 37 °C en wissel het celkweekmedium in voor het ademhalingstestmedium door tweemaal te wassen met 80 μL per putje.
    3. Zet de plaat met de cellen in een incubator van 37 °C zonder CO2 gedurende 60 minuten voorafgaand aan de test.
      OPMERKING: Deze stap is essentieel om de plaat te ontgassen, omdat CO2 de ademhalingsresultaten kan beïnvloeden en serum in het medium bubbels kan produceren tijdens de test.
    4. Prewarmremmer aliquots voor OM, FCCP, ROT en AM tot 37 °C en haal de sensorplaat uit de incubator.
    5. Verdun OM, FCCP, ROT en AM in 3 ml testmedium tot een uiteindelijke putconcentratie van respectievelijk 1,5 μM, 1,125 μM en 1 μM. Vul afzonderlijke poorten in zoals aangegeven in figuur 2E.
      OPMERKING: Een meerkanaals pipet wordt aanbevolen om de sensorcartridge te vullen. Aangezien lucht onder druk wordt gebruikt om verbindingen te injecteren, moeten alle poorten worden gevuld met een gelijke hoeveelheid vloeistofvolume wanneer een poort wordt gevuld met een verbinding. ROT en AM kunnen in één poort worden gecombineerd. Remmers kunnen worden opgelost in EtOH of DMSO.
    6. Inspecteer de injectiepoorten en controleer een gelijkmatig laadvolume voor elke poort.
      OPMERKING: Alle poorten bevatten een gat aan de onderkant voor injectie. Voorzichtigheid is geboden bij het verplaatsen van de sensorplaat. Luchtbellen kunnen worden verwijderd met behulp van een naald.
  4. Protocol voor zuurstofbeoordeling in intacte cellen
    1. Voer op de dag voor de test stappen 2.4.2-2.4.7 uit.
    2. Aliquot 20 ml van de kalibrantoplossing in een conische buis van 50 ml.
    3. Open de Extracellular Flux Assay Kit en verwijder de inhoud.
    4. Plaats de omgekeerde sensorcartridge naast de gebruiksplaat. Pipetteer 200 μL kalibrantoplossing in elk putje van de nutsplaat.
    5. Bevestig de sensorcartridge op de nutsplaat en let erop dat alle sensoren onder water staan.
    6. Zet de plaat in een incubator van 37 °C zonder CO2 gedurende een nacht of minimaal 12 uur. Controleer of de vochtigheid in de incubator voldoende is om verdamping van het kalibrant te voorkomen.
    7. Schakel het op microplaten gebaseerde systeem en de computer in om de volgende dag klaar te zijn voor gebruik (de machine heeft minimaal 3 uur nodig om tot 37 °C te balanceren voordat een test wordt uitgevoerd).
      OPMERKING: Verhoog voor signaalstabiliteit de meetpunten tot 6 in plaats van 3 meetcycli per ademhalingstoestand. Elke cyclus bestaat uit 3 minuten mengen en 3 minuten meten.
    8. Voer op de dag van de XF-test stappen 2.4.9-2.4.20 uit.
    9. Controleer de samenvloeiing van de celkweekplaat, de morfologie van de cellen en of de achtergrondputten leeg zijn.
    10. Was de cellen met het voorbereide ademhalingsmedium zoals vermeld in stap 2.4.11-2.4.12.
    11. Verwijder op 20 μL na alle kweekmedium uit elke put. Verwijder 55 μL als het kweekmedium 80 μL was als gevolg van verdamping 's nachts (ongeveer 5 μL).
    12. Wascellen tweemaal met 90 μL testmedium. Voeg ten slotte 100 μL assaymedium toe. Het eindvolume moet 120 μL zijn.
      OPMERKING: Een meerkanaals pipet wordt aanbevolen voor deze stap om ervoor te zorgen dat dezelfde wasprocedure is toegepast op elke experimentele toestand (afhankelijk van de plaatopstelling). Kantel bij het zuigen de plaat in een hoek van 45° en plaats de pipetpunten in de hoek van de putten voor aspiratie en injectie van vloeistoffen. Het is noodzakelijk om voorzichtig te zijn tijdens het wassen, omdat bepaalde cellen gemakkelijk los kunnen komen van de onderkant van de celkweekplaat.
    13. Zet de plaat in een incubator van 37 °C zonder CO2 gedurende 60 minuten voorafgaand aan de test.
    14. Haal de gehydrateerde sensorpatroonplaat uit de CO2-vrije incubator.
    15. Gooi de oude kalibrantoplossing weg en vervang deze door verse kalibrantoplossing, voorbewarmd tot 37 °C.
    16. Bereid remmers en testmedium voor (3 ml per remmer voor een totaal van 12 ml testmedium) en gebruik een pipetreservoir voor het laden van de remmer in havens.
    17. Open de software en voer een vooraf ontworpen of nieuwe sjabloon uit. Vul de plaatkaart, pas de titraties en meetcycli aan en druk op Start om de kalibratie van de optische sensoren te starten.
    18. Verwijder het deksel van de geladen cartridge en plaats deze in de sleuf die automatisch uit het apparaat schuift, waarbij u controleert of de markeringen in de rechterbenedenhoek van de plaat overeenkomen met de driehoek in de rechterbenedenhoek van de sleuf.
    19. Klik op Doorgaan om automatische kalibratie uit te voeren, die ongeveer 20 minuten duurt.
    20. Verwijder na kalibratie de gebruiksplaat met het kalibrant.
    21. Verwijder het deksel van de microplaat met de cellen en plaats de plaat in de sleuf wanneer de machine daarom vraagt. Klik op Doorgaan om de run te starten.
  5. Post-run monsterverzameling
    1. Haal de plaat uit de machine, verwijder voorzichtig de resterende testmedia zonder de cellen te storen en vries de hele plaat in bij -80 °C voor verdere verwerking (rubriek 3).

3. Bepaling van het eiwit met behulp van de bicinchonininezuurtest (BCA-assay)

  1. Bereid verdund runderserumalbumine (BSA) in buffer die wordt gebruikt voor eiwitextractie en compatibel is met BCA: 2 mg / ml, 1, 1 mg / ml, 1 mg / ml, 0, 5 mg / ml, 0, 25 mg / ml en 0 mg / ml voor standaardcurve in duplicaten.
  2. Extraheer eiwitten door resuspendatie in een geschikte lysisbuffer (bijv. RIPA) met 20 μL per put voor mHRR of 100 μL per pellet in een buis van 1,5 ml voor cHRR.
  3. Incubeer de mHRR-plaat of 1,5 ml buis met eiwitlysaten gedurende 30 minuten op ijs.
  4. Centrifugeer de buis van 1,5 ml met het eiwitlysaat bij 4 °C bij 20.000 x g gedurende 20 minuten en breng het resulterende supernatant over in een nieuwe schone buis van 1,5 ml.
  5. Gebruik 10 μL per monster in duplicaten en standaarden in een microtiterplaat. Voeg 200 μL BCA-werkreagens toe en incubeer gedurende >15 min.
  6. Lees de plaat in een standaard spectrofotometer op een golflengte van 562 nm en bereken de eiwitconcentraties met behulp van een BSA-standaardcurve.
  7. Normaliseer de ademhalingsresultaten naar de eiwitconcentratie.
    OPMERKING: Normalisatie naar eiwithoeveelheid maakt het mogelijk om celzaaidichtheden of invoer van nat gewicht te bevestigen. De geëxtraheerde eiwitten zijn geschikt voor latere immunoblotting tegen subeenheden van het ETS bijvoorbeeld, maar vertegenwoordigen niet volledig het oorspronkelijke monster (bijv. verlies van fosforyleringsplaatsen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier bieden we protocollen om de mitochondriale bio-energetica in eukaryote cellen, niet-vezelig weefsel (bijv. Cerebellum) en vezelig weefsel (bijv. skeletspieren) te bepalen. Voor eukaryote cellen werden HEK293 met CRISPR-engineered knock-out van twee verschillende eiwitten geassocieerd met mitochondriale translatie resulterend in meervoudige (CRISPRKO1) en ernstige / volledige OXPHOS-deficiëntie (CRISPRKO2) gemeten met cHRR (figuur 3A-C) of mHRR (figuur 3A-D).

Voor cHRR werden HEK293-cellen digitonine-permeabiliseerd en werden ademhalingsexperimenten uitgevoerd volgens het standaardprotocol (stap 1.5-1.6) en met succes geregistreerd (figuur 3A). CRISPRKO1 vertoont een verminderde en CRISPRKO2 geen ademhaling in vergelijking met WT wanneer genormaliseerd naar celinvoerhoeveelheid (figuur 3B). De eiwithoeveelheid werd bepaald aan de hand van verzamelde monsters (sectie 3) en de waarden van routinematige ademhaling werden genormaliseerd tot eiwithoeveelheden om absolute waarden en respectieve FCR's te berekenen (figuur 3C, de betekenis van elke FCR wordt in discussie gedetailleerd beschreven). Optimale monsterhoeveelheden produceren fluxen van 80-160 pmol/s per ml. Idealiter is de hoeveelheid cellen of weefsel voldoende om een significante flux te genereren (20 pmol /s voor cHRR) om achtergrondgeluid te verminderen en tegelijkertijd overmatige reoxygenatie tijdens een experiment te ontwijken. In lage respiratoire (bijv. Wit vetvet, witte bloedcellen) of moeilijk te verkrijgen monsters (bijv. iPS-gedifferentieerde neuronale afstammingslijnen), zijn fluxen van 20 pmol / s per ml voldoende in ideale werkomstandigheden.

Figure 3
Figuur 3: Representatieve standaardprotocolzuurverbruikssporen van cHRR met behulp van HEK293-cellen met gecombineerde OXPHOS-deficiëntie. (A) Sporen van ruw zuurstofverbruik van WT HEK293-cellen en HEK293-cellen met CRISPR-gemedieerde mitochondriale translatiedefecten die meerdere OXPHOS-deficiëntie veroorzaken (CRISPRKO1,2). (B) Overlayd cell-input-normalized oxygen consumption sporen van (A). (C) Eiwit-genormaliseerde kwantificering van twee onafhankelijke experimenten (gemiddelde en SD) en respectievelijke FCR's. Vergelijkingen tussen omstandigheden werden gedaan door ANOVA en a posteriori Tukey's test of een Student's t-test. Betekenissen: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vervolgens gebruikten we mHRR met dezelfde cellen in een standaardprotocol (2.1-2.5), wat de OXPHOS-tekortkomingen bevestigt (figuur 4A). Bovendien werden de ECAR-waarden verhoogd voor ernstige /volledige OXPHOS-deficiëntie (CRISPRKO2), wat wijst op compensatie van mitochondriale oxidatieve fosforyleringsdeficiëntie in HEK293-cellen met specifieke mitochondriale translatiedeficiëntie door verhoogde glycolyse resulterend in lactaatproductie (figuur 4A). De eiwithoeveelheid werd bepaald uit de microwellplaat (sectie 3) en de verkregen waarden werden genormaliseerd naar eiwithoeveelheid (figuur 4B) en gekwantificeerd (figuur 4C). Op microplaten gebaseerde systemen zijn berucht om hun hoge intra-well variatie. Hoge variabiliteit tussen replicaties kan optreden wanneer de optimale zaaidichtheid niet is bereikt; cellen raken los tijdens de wasstappen van het vervangen van het celkweekmedium door testmedium, of onjuiste pipetteertechniek zoals de introductie van luchtbellen of aspiratie van verschillende volumes. Langere meettijden (6 meetcycli) worden aanbevolen met mHRR om stabilisatie van de flux in media mogelijk te maken (figuur 1B en figuur 4A). Lage fluxen veroorzaken een hoge variatie en afhankelijk van het celtype kan flux te dicht bij achtergrondgeluid liggen (tot 10-15 pmol / s). Laag-respiraterende (bijv. fibroblasten) of uitzonderlijk grote cellen kunnen onvoldoende zuurstofflux boven het achtergrondgeluidsniveau produceren in het 96-well microplaatformaat, zelfs bij 90% samenvloeiing. In dat geval moet de 24-well mHRR of cHRR worden overwogen. Minimale veranderingen in de zuurstofflux kunnen ook wijzen op een verkeerde hantering van het laden van de remmers, zoals lege, onjuist of variabel gevulde poorten. Het gebruik van specifieke pipetpunten die tijdens het laden van de chemicaliën voldoende in havens terechtkomen, wordt aanbevolen om chemicaliën de individuele poort te laten bereiken (figuur 2E).

Figure 4
Figuur 4: Representatieve standaardprotocolzuurverbruikssporen van mHRR met behulp van HEK293-cellen met gecombineerde OXPHOS-deficiëntie. (A) Sporen van ruw zuurstofverbruik van WT HEK293-cellen en HEK293-cellen met CRISPR-gemedieerde mitochondriale translatiedefecten die meerdere OXPHOS-deficiëntie veroorzaken (CRISPRKO1,2). (B) Respectieve extracellulaire verzuringssnelheden (ECAR) vanaf (A). (C) Eiwitgenormaliseerde zuurstofverbruikssporen van WT HEK293-cellen en HEK293-cellen met CRISPR-gemedieerde mitochondriale translatiedeficiëntie die meerdere OXPHOS-deficiëntie veroorzaakt (CRISPRKO1,2). (D) Eiwitgenormaliseerde kwantificering van putten (n = 8 per genotype; gemiddelde en SD). Vergelijkingen tussen omstandigheden werden gedaan door ANOVA en a posteriori Tukey's test. Betekenissen: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Afkortingen: zie figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een voorbeeldexperiment voor niet-vezelige weefselpreparaat (stap 1.3 en 1.5-1.6) met behulp van muis cerebellum (figuur 5A) en vezelig weefselpreparaat (stap 1.4 en 1.5-1.6) met behulp van muizenskeletspieren (soleus) wordt getoond (figuur 5B). Over het algemeen overschrijdt de ontkoppelde ademhaling de OXPHOS-capaciteit in muismonsters niet. Voor het cerebellum van muizen nam de OXPHOS-capaciteit af in vergelijking met de maximale ETS-capaciteit. LEAK-ademhaling nam toe onder fysiologisch gecontroleerde omstandigheden versus chemisch geïnduceerde (oligomycine). Dit kan te wijten zijn aan het feit dat endogene beschikbare ADP nog steeds wordt gefosforyleerd tot ATP, terwijl bij chemische inductie protonlekkage maximaal is, wat resulteert in een overschatting van LEAK-ademhaling. In tegenstelling tot het cerebellum werd de soleus getest bij hyperoxische omstandigheden om zuurstofdiffusiebeperking te voorkomen en vertoont hij een drie keer hogere OXPHOS-capaciteit. NADH-afhankelijke ademhaling is anders bij het analyseren van specifieke soorten weefsel, waarbij de soleus meer capaciteit heeft om te ademen door de toevoeging van succinaat dan het cerebellum. Beide soorten weefsel vertonen minimale ROX.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve sporen van zuurstofverbruik voor niet-vezelige (A) en vezelige (B) weefsels voor cHRR. (A) Nat gewicht weefsel-genormaliseerd zuurstofverbruik spoor van muis cerebellum bereid zoals beschreven (stap 1.3). (B) Nat gewicht-weefsel-genormaliseerd zuurstofverbruik spoor van muis soleus spier zoals beschreven (stap 1.4). Blauwe lijn toont respectievelijke zuurstofconcentratie en injectiepunten. Afkortingen: zie figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Chemisch Concentratie
BSA, vetzuurvrij 1 g/l
D-sacharose 110mM
EGTA 0,5 mM
Hepes 20m
KH2PO4 10m
Lactobionic zuur 60m
MgCl2·6H2O 3mM
Taurine 20m

Tabel 1: Mitochondriale ademhalingsmedium MiR05 samenstelling aangepast aan pH 7,127.

Chemisch Concentratie
CaK2EGTA watervrij 2,77 mM
Dithiothreitol (DTT) 0,5 mM
Imidazool 20m
K2EGTA, watervrij 7,23 mM
MES-hydratatie 50m
MgCl2-6H 2O 6,56 mM
Na2ATP 5,77 mM
Na2Fosfocreatine 15m
Taurine 20m

Tabel 2: Samenstelling van de ontspannende en biopsieconserveringsoplossing (BIOPS) aangepast aan pH 7,128.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Traditioneel is mitochondriale bio-energetica bestudeerd met Clark-type zuurstofelektroden. Een gebrek aan resolutie en doorvoer rechtvaardigde echter technologische vooruitgang. Tot op heden zijn de O2k (aangeduid als cHRR) en Seahorse XF96 Flux Analyzer (aangeduid als mHRR) op grote schaal toegepast op het gebied van cellulaire bio-energetica. Hier presenteren we een begrijpelijke verzameling protocollen voor de analyse van cellulair energiemetabolisme via beoordeling van mitochondriale ademhaling met behulp van cHRR of mHRR, bespreken we de belangrijkste voordelen van elk apparaat en bieden we praktische richtlijnen. De protocollen die hier worden verstrekt, omvatten zoogdiercellen, vezelige (harde) weefsels zoals skelet- en hartspier en niet-vezelige (zachte) weefsels zoals hersenen en lever en zijn van toepassing op vergelijkbare soorten monstermateriaal.

Hoewel beide HRR-methoden resulteren in vergelijkbare gegevens voor zoogdiercellen zoals geïllustreerd met HEK293 met meerdere OXPHOS-deficiëntie, maken algemene werkingsprincipes en technische opstelling van de apparaten ze geschikt voor verschillende toepassingen. De mHRR-installatie maakt geautomatiseerde gegevensverzameling mogelijk en heeft een hoge doorvoercapaciteit met een 24- of 96 multi-well-opstelling die minimale monsterhoeveelheden vereist. Het lage experimentele volume en het putoppervlak, naast het gebruik van zuurstofdoorlatende polymeren (polystyreen), kunnen echter een hoge intra-putvariatie veroorzaken (vooral in de 96-well plaatopstelling), waardoor het gebruik van ≥6 putten per conditie voor reproduceerbare resultaten wordt bevorderd. In tegenstelling tot de op cHRR gebaseerde polarografische zuurstofsensor wordt er geen zuurstof verbruikt door de sensorsondes van de mHRR, die gebruik maakt van gebluste fosforescentie O2-detectie . Omdat de mHRR een semi-gesloten systeem is, kan omgevings-O2 diffunderen in het ademhalingsmedium, waardoor het monster en de sonde worden blootgesteld aan zuurstof. Wanneer de zuigerachtige sensorsonde daalt, wordt een tijdelijk afgesloten en geïsoleerde kamer gecreëerd om veranderingen in de O2-concentratie te versterken en het zuurstofverbruik te meten. Vervolgens wordt een wiskundig model gebruikt om het zuurstofverbruik nauwkeurig te berekenen door de achterdiffusie van O2 te schatten. Het nadeel is echter dat het algoritme ook ruisversterkt 29. De microplaatopstelling maakt gebruik van niet-herbruikbare gespecialiseerde poorten en platen die een optimale celzaaidichtheid vereisen. De mHRR-zuurstofsensorsondes meten laterale O 2-diffusie in drie verschillende gebieden per put die overeenkomen met de grootte van de sonde (~ 1 mm); daarom is een gelijkmatig verdeelde celmonolaag cruciaal om nauwkeurige zuurstofverbruikssnelheden te bepalen. Als er significante hiaten aanwezig zijn bij het observeren van de celverdeling, zullen onjuiste zuurstofverbruikssnelheden worden berekend, wat resulteert in een hoge variantie van putreplicaties. Rekening houdend met dit, is mHRR semi-geautomatiseerd en ideaal aanpasbaar voor high-throughput cel- of kleine organismen-gebaseerde studies (bijv . C. elegans) met terugkerende screenings.

De opstelling van de cHRR respirometers is gebaseerd op een tweekamersysteem met polarimetrische meting van zuurstof. In het gesloten systeem kan omgevings-O2 niet diffunderen in het ademhalingsmedium; een daling van de O2-concentratie weerspiegelt dus het zuurstofverbruik van het biologische monster. Omdat de cHRR-polarografische zuurstofsensor zuurstof verbruikt, is diffusie van vrije O2 essentieel, waardoor het moeilijk is om het kamervolume te minimaliseren (2 ml, nieuwe cHRR-apparaten 0,5 ml) en constant roeren vereist om homogeniteit van het ademhalingsmedium te garanderen. Bijgevolg zijn grotere monstervolumes nodig om voldoende zuurstofflux te genereren. Door directe toegang tot de kamers en handmatige titratie is elk ademhalingsprotocol aanpasbaar en gebaseerd op algemeen in de handel verkrijgbare chemicaliën resulteert in uitzonderlijk lage bedrijfskosten. Bovendien maakt ad hoc operabiliteit het mogelijk om een SUIT-protocol aan te passen door titratie tijdens een experiment en is het belangrijk in eenmalige patiënt-afgeleide monsters. Gedeeltelijke automatisering is mogelijk met behulp van een titratie-injectie micropomp, die programmeerbare SUIT-protocollen mogelijk maakt. Hoewel beperkt tot twee monsters per cHRR-apparaat, zullen ervaren gebruikers verschillende apparaten parallel uitvoeren. Het voordeel van de veelzijdigheid van testontwikkeling en softwareomgeving komt met de behoefte aan meer specifieke training om deze apparaten te bedienen en gebruikersafhankelijk onderhoud (bijv. Kalibratie van polarografische zuurstofsensoren) om reproduceerbare gegevens te verkrijgen. Voor geavanceerde toepassingen kunnen extra modules aan de cHRR-apparaten worden bevestigd om de pH te registreren, de fluorescentiemodule om de membraanpotentiaal te testen via safranine30, H2O2 via AMPLEX red24 en calciumspiegels31.

Beide apparaten vereisen gespecialiseerde ademhalingsmedia. mHRR maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar serumvrij groeimedium, waarbij het gebruik van bicarbonaat wordt vermeden, dat ontgast onder lage CO2-omstandigheden en essentieel is als extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van belang is. Tijdens glycolyse wordt pyruvaat omgezet in lactaat, dat dissocieert in melkzuur en protonen. Deze verhoogde protonconcentratie zorgt ervoor dat de pH daalt, wat wordt geregistreerd als ECAR. Een uitgebreidere analyse van ECAR is mogelijk met de glycolyse stresstest. Deze test bestaat eerst uit het toevoegen van verzadigde glucosespiegels om de basale glycolytische snelheid te meten. Na remming van het ATP-synthasecomplex met oligomycine wordt de maximale glycolytische snelheid onthuld. De laatste stap is het meten van niet-glycolytische verzuring door het injecteren van 2-deoxy-glucose, dat glycolyse remt via competitieve binding aan hexokinase en fosfosoglucose isomerase32. Andere kit-gebaseerde protocollen beschikbaar omvatten glycolyse, vetzuuroxidatie en glutamine-oxidatie. Hier gebruikten we het standaardprotocol om basale ademhaling, ATP-gekoppelde ademhaling, protonlek, maximale ademhaling, reserve ademhalingscapaciteit en niet-mitochondriale ademhaling te meten (figuur 4A-C). Een benadering van het gebruik van zowel het standaard ademhalingsprotocol in combinatie met de glycolysestresstest zou inzicht geven in aerobe en anaerobe energieroutes die een overzicht geven van cellulaire ademhaling.

Cellulaire bio-energetica is meestal toegankelijk in hechte cellen met de microplaat mHRR-opstelling. Afhankelijk van het celtype kan een gespecialiseerde coating voor hechting (bijv. poly-D-lysine, gelatine, enz.) nodig zijn (voor suspensiecellen) en voor losklevende cellen, omdat ze los kunnen komen van de bodem van de putmeetcycli33. CHRR-metingen vereisen daarentegen constant roeren, waardoor ademhalingsmeting voor elk biologisch monster mogelijk is. Voor elk apparaat is optimalisatie vereist, zoals titratie van remmers (en substraten) voor weefsel- en cellijnen om de remmergevoeligheid (dosis-responscurven) te beoordelen. Remmerconcentraties moeten in elk experimenteel model worden getest om de laagste volledig remmende concentraties te gebruiken en om niet-specifieke remming en onnodige kamerverontreiniging te voorkomen. Over het algemeen zijn 0,25 μM rotenon, 0,5 μg / ml oligomycine, 0,5 μg / ml antimycine voldoende voor de meeste toepassingen en monsterhoeveelheden. Bereid voor reproduceerbaarheid geneesmiddelen voor eenmalig gebruik in voldoende hoeveelheden voor de gehele geplande experimenten (bijv. Muisgroepen) en houd de monsterinvoer constant binnen een specifiek weefsel of cellijn. In cHRR zullen sporen van remmers die in de kamers achterblijven de flux veranderen zonder enige indicatie aan de operator. Vooral rotenonsporen zijn moeilijk te ontwijken en vereisen voldoende wassing met een minimale kamer (en stop) reiniging, waaronder 4x wassen met ddH2O, 2x 70% EtOH (96% zuiverheid voldoende), 1x 100% EtOH, 1x 70% EtOH. Wassen vereist het draaien van roerstaafjes en het bewaren van EtOH-stappen gedurende > elk 5 minuten. Om bacteriële besmetting te voorkomen, wordt 70% EtOH in alle kamers bewaard wanneer machines niet in gebruik zijn. Potentiële restverontreinigingen kunnen worden geblust door de toevoeging van ongebruikt weefsellysaat. In een mHRR-experiment kunnen bepaalde chemicaliën interageren met het essentiële plastic voor eenmalig gebruik34.

Respiratoire gegevens verkregen via een permeabilized protocol geven inzicht in het ETS, terwijl een intact protocol inzicht geeft in mitochondriale eigenschappen zoals mitochondriale koppelingsefficiëntie. Inderdaad, algemene mitochondriale energie-eigenschappen kunnen hetzelfde resultaat geven, maar de onderliggende elektronenoverdracht tussen complexen kan worden gewijzigd. Dit zou een veranderd mitochondriaal energiemetabolisme weerspiegelen en vereist een permeabilisatieprotocol om toegang te krijgen tot de ademhalingscomplexen. Evenzo vertonen verschillende weefsels en cellen een veranderde substraatafhankelijkheid bij het beoordelen van ademhalingskenmerken. Van glycolytische spiervezels is bijvoorbeeld bekend dat ze voornamelijk afhankelijk zijn van glycerol-3-fosfaat voor energielevering, terwijl oxidatieve spiervezels een tweevoudig hogere elektronenoverdrachtscapaciteit bezitten van NADH-oxidatie35,36. Op dezelfde manier kunnen hartmitochondriën, lever, bruin vetweefsel vetzuren gebruiken om ATP te synthetiseren, en op hun beurt kunnen de hersenen ketonlichamen gebruiken, voornamelijk gevormd door vetzuuroxidatie 36,37,38. Daarom vereist het bepalen van mitochondriale kenmerken een holistische benadering in tegenstelling tot de standaard glucoseafhankelijke ademhaling. mHRR omvat meestal het beoordelen van intacte adherente cellen, hoewel permeabilisatie haalbaar is (bijv. Mutant recombinant perfringolysine O dat selectief het celmembraan permeabiliseert39). Deze methoden hebben echter een verhoogde complexiteit vanwege de beperking van vier injectiepoorten. Daarentegen zijn correct gelyseerde niet-vezelige weefsellysaten en elk celtype meestal probleemloos voor cHRR. Normaal gesproken is het testen van weefsel met de mHRR niet haalbaar; echter, benaderingen met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit een weefsel zijn vastgesteld40,41.

Belangrijk om op te merken is dat normalisatie naar het hele eiwitgehalte absolute mitochondriale hoeveelheden verwaarloost. Vergelijking van experimentele groepen onder verschillende behandelingen kan aanzienlijk verschillen (bijv. 30 dagen eiwitrijke dieet-gevoede ratten toonden een 2,5-voudige toename van het mitochondriale gehalte in lever42), met name in weefsel dat vatbaar is voor intracellulaire lipide accumulatie zoals bruin vetweefsel, lever en skeletspieren. In deze situaties wordt het ook aanbevolen om verschillende mitochondriale markers te beoordelen als een benadering voor mitochondriale massa, zoals mtDNA-kopie nummer43, citraatsynthaseactiviteit10 en alomtegenwoordige mitochondriale eiwitten (bijv. VDAC1, TOM20). In combinatie maakt dit het mogelijk om te destilleren of een veranderde ademhalingsfunctie wordt toegeschreven aan mitochondriale kwantiteit, kwaliteit, integriteit of een combinatie daarvan. Een andere aanvullende methode hierop is de implementatie van FCR's. FCR's geven inzicht in verschillende ademhalingstoestanden onafhankelijk van mitochondriale inhoud. FCRADP leidt af of veranderd LEAK of OXPHOS de efficiëntie van de mitochondriën om ADP te fosforyleren verandert. FCR-toestand 3 (I) geeft aan in welke mate de steekproef afhankelijk is van complex I als vergelijking met complex II. FCR-toestand 3 (II) vergelijkt succinaatafhankelijke ademhaling met ETS en biedt een index voor mitochondriale ademhaling afgeleid van complex II. FCRgekoppeld/ontkoppeld is een verhouding die de koppelingscontrole tussen OXPHOS en ETS verzorgt, met een verhouding van 1 die geen reserve ademhalingscapaciteit meer heeft. De mitochondriale buitenmembraanintegriteit kan worden beoordeeld door de toevoeging van exogene cytochroom c. Cytochroom c is gelokaliseerd in de intermembraanruimte, waar het de overdracht van elektronen tussen complex III en complex IV vergemakkelijkt. Als het buitenste mitochondriale membraan beschadigd is, lekt cytochroom c uit de mitochondriën, wat niet meer bijdraagt aan de ademhaling. Herstel van deze onbalans kan worden bereikt door de toevoeging van exogene cytochroom c, waardoor de ademhaling toeneemt (figuur 1A, D; 5B). Complexe IV-activiteit wordt individueel gemeten met TMPD na volledige remming van OXPHOS. Baseline O2 flux zal afnemen naarmate de O2-concentratie daalt omdat TMPD-oxidatie afhankelijk is van O2-concentratie . Na ROX-beoordeling worden alle kamers dus geoxygeneerd tot een gelijk zuurstofgehalte (150 μM). Lineaire regressie van datapunten van signaal na toevoeging van azide kan worden gebruikt om chemische en O2-afhankelijke achtergrond van complexe IV-activiteitstest te interpoleren. ROX-waarden moeten worden afgetrokken van alle ademhalingswaarden om te corrigeren voor niet-mitochondriaal zuurstofverbruik.

Biologisch gezien kan ROX in het geval van geïsoleerde mitochondriën lager zijn dan bij permeabiliseerde of intacte cellen / weefsel. Over het algemeen wordt resterende ademhaling veroorzaakt door de activiteit van oxidase-enzymen, waarbij cellen en weefsel meer autoxineerbare stoffen hebben dan geïsoleerde mitochondriën44. Bovendien, met intracellulaire membraanstructuren die nog intact zijn, neemt de moeilijkheid van zuurstof om door celmembranen te dringen toe vanwege de negatieve lading. Bijgevolg kan diffusie door cellulaire membranen en intracellulaire beschikbaarheid van zuurstof worden beïnvloed, wat resulteert in ROX. Van isolatie van mitochondriën is echter aangetoond dat het de mitochondriale morfologie verstoort, de mitochondriale waterstofperoxideproductie verhoogt, samen met een veranderde mitochondriale ademhalingsfunctie45. Hoewel isolatie van functionele mitochondriën specifieke normalisatie mogelijk maakt en in bepaalde omstandigheden nodig kan zijn, is het isolatieproces tijdrovend, vereist het meestal meer materiaal en behoudt het mogelijk geen mitochondriale heterogeniteit. Om deze reden hebben we afgezien van het opnemen van mitochondriale isolatie in deze studie. Voor skelet- of hartspier is isolatie van mitochondriën of saponine-behandeling van vezels echter essentieel voor ademhalingsmetingen. Aangezien autolytische processen zeer snel na euthanasie plaatsvinden, wordt een snelle weefselextractie en het naleven van een vergelijkbare timing voor voorbereidingen tussen individuele experimenten aanbevolen.

In onze experimenten leidde de beoordeling van de mitochondriale ademhalingsfunctie van zoogdiercellen tot vergelijkbare resultaten met beide HRR-apparaten. De basale ademhaling was echter hoger voor cHRR in vergelijking met mHRR. Afgezien van tal van technische aspecten (kamervolume, roeren en verschillende signaalintegratie), kunnen biologische redenen zoals veranderd ademhalingsmedium, timing van celoogst en niet-gehechte cellen die verlies van celcontact veroorzaken, de waargenomen verschillen veroorzaken. Bijgevolg zijn ademhalingsprotocollen in het algemeen en individuele substraat- en inhibitorconcentraties niet uitwisselbaar tussen systemen om de gepresenteerde redenen, die technisch van aard kunnen zijn (bijv. titratie) en in het algemeen verschillende testreagentia (bijv. ademhalingsmedia, chemische absorptie van glas of polymeren). Om de hoogste reproduceerbaarheid te garanderen, omvatten verschillende technische overwegingen en aanbevelingen (i) het gebruik van aliquots voor eenmalig gebruik om kruisbesmetting of vriesdooicycli tot een minimum te beperken, ii) passende opslag van alle chemische stoffen (bv. ADP bij -80 °C voor langdurige stabiliteit, pyruvaat bereid vers en lichtgevoelige chemicaliën in het donker), iii) regelmatige en rigoureuze hertest van chemische stoffen op werkzaamheid (bv. door verdamping veroorzaakte concentratieveranderingen; opslag-geïnduceerd TMPD-activiteitsverlies) en (iv) uitgebreide reiniging om sporenchemicaliën te verwijderen. Overwegingen met betrekking tot de reproduceerbaarheid van longitudinale studies (over meerdere jaren) vereisen dat de prestaties van het apparaat worden gecontroleerd en dat de stabiliteit van reagentia in de loop van de tijd wordt gewaarborgd.

Ten slotte zou nieuwe technologie op basis van gecombineerde potentiometrische (pH) en amperometrische (O2) metingen door middel van op rutheniumoxide gebaseerde elektroden een paradigmaverschuiving in de huidige hulpmiddelen kunnen katalyseren, waardoor het cellulaire metabolisme in cultuur en in vivo kan worden bestudeerd 46. Hoewel de huidige methoden voornamelijk ex vivo en in vitro beoordeling van het cellulaire metabolisme mogelijk maken, maakt vertraagde fluorescentie in vivo analyse van mitochondriale zuurstof mogelijk als een maat voor mitochondriale functie47. Evenzo toont op microfluïdica gebaseerde respirometrie veelbelovend in een hogere gevoeligheid, waarvoor slechts een paar honderd cellen nodig zijn48. Hoewel nieuwe methodologieën aan de horizon liggen, blijft respirometrie met hoge resolutie tot op heden de gouden standaard om de cellulaire ademhalingscapaciteit te beoordelen waarvoor hier typische protocollen worden verstrekt, die van toepassing zijn op de meeste cellen, weefsels en organismen om mitochondriale ademhaling te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflict bekend te maken.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door financiering van de Academy of Finland (C.B.J),de Magnus Ehrnroot Foundation (C.B.J.) en een doctoraatsbeurs van de Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer Omni International 07-358029
95% O2, 5% CO2 medical gas mixture Potter for tissue grinding
ADP Sigma A 4386
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical
Ascorbate Merck PHR1279-1G Chemical, dissolve in ethanol
BSA (fatty accid free) Sigma A 6003 Chemical
CaCO3 Sigma C 4830 Chemical
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical
Dithiothreitol Sigma D 0632 Chemical, dissolve in DMSO
D-Sucrose Roth 4621.1 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (High glucose) Fisher Scientific 41965-039 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (No Glucose) Fisher Scientific A14430-01
EGTA Sigma E 4378
Etomoxir Sigma E1905 Chemical
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12500 Chemical
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12501
FCCP Sigma C 2920
Glucose Sigma G7021 Chemical, dissolve in ethanol
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Fisher Scientific 35050061 Chemical
HEK293 cells ATTC CRL-1573
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B Instrument for cell counting
Hepes Sigma H 7523 Chemical
Imidazole Fluka 56750 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
L-carnitine Sigma C0283 Chemical
Malate Sigma M 1000 Chemical
MES hydrate Sigma M8250 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Na2ATP Sigma A 2383 Chemical
Na2Phosphocreatine Sigma P 7936 Chemical
Na-pyruvate (100 mM) (100x) Fisher Scientific 11360070
NEAA (Non-essential amino acids) 100x Fisher Scientific 11140035
Normal FBS (10x) Fisher Scientific 10500064
O2k-Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
O2k-Titration Set Oroboros Instruments 20820-03 Hamilton syringes for chemical injections
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Palmitoylcarnitine Sigma P 4509 Chemical
Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15140122
Pierce BCA Protein Assay Kit Fisher Scientific 23227
Pyruvate Sigma P 2256 Chemical
RIPA-Buffer Fisher Scientific 89900 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Saponin Sigma S7900 Chemical

Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4
Agilent, Santa Clara, CA		 103680-100
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer
Agilent, Santa Clara, CA		 High-throughput respirometry instrument
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent, Santa Clara, CA
Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Small scissors Fisher Scientific 08-951-20
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypan Blue solution Merck 72-57-1 Chemical
Trypsin 0.25% EDTA Fisher Scientific 25200056
Two thin-edged forceps Fisher Scientific 12-000-122
Uridine stock (500x) Sigma U3750 Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
  2. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
  3. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  4. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  5. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 1-23 (2016).
  6. Boushel, R., Gnaiger, E., Schjerling, P., Skovbro, M., Kraunsøe, R., Dela, F. Patients with type 2 diabetes have normal mitochondrial function in skeletal muscle. Diabetologia. 50 (4), 790-796 (2007).
  7. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  8. Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biology. 13, 1-11 (2015).
  9. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and Respiratory control. An introduction to OXPHOS analysis. Bioenergetics communications. 5th ed. , Steiger Druck GmbH. Axams, Austria. (2020).
  10. Jackson, C. B., et al. Mutations in SDHD lead to autosomal recessive encephalomyopathy and isolated mitochondrial complex II deficiency. Journal of Medical Genetics. 51 (3), 170-175 (2014).
  11. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, Clifton, N.J. 25-58 (2012).
  12. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  13. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and oxphos protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, Clifton, N.J. 31-70 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  15. García-Roche, M., Casal, A., Carriquiry, M., Radi, R., Quijano, C., Cassina, A. Respiratory analysis of coupled mitochondria in cryopreserved liver biopsies. Redox Biology. 17, 207-212 (2018).
  16. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 1-18 (2020).
  17. SUITBrowserWeb. , Available from: http://suitbrowser.oroboros.at/ (2021).
  18. Cell metabolism assay kits. Seahorse assay kits and media. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-lits-reagents-cell-assay-media (2021).
  19. Chance, B., Williams, G. R. A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation. Nature. 176 (4475), 250-254 (1955).
  20. Gnaiger, E., et al. Mitochondrial respiratory states and rates. MitoFit Preprint Arch. , (2019).
  21. Gnaiger, E. O2k-procedures: SOP O2k quality control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Section Page. Oroboros. 03 (18), http://wiki.oroboros.at/index.php/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP 1-21 (2020).
  22. Robinson, B. H., Petrova-Benedict, R., Buncic, J. R., Wallace, D. C. Nonviability of cells with oxidative defects in galactose medium: A screening test for affected patient fibroblasts. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 48 (2), 122-126 (1992).
  23. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  24. Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  25. Fasching, M., Gnaiger, E. O2k quality control 2: Instrumental oxygen background correction and accuracy of oxygen flux. Mitochondrial Physiology Network. 14 (06), 1-14 (2016).
  26. Gnaiger, E., Lassnig, B., Kuznetsov, A., Rieger, G., Margreiter, R. Excess capacity of cytochrome c oxidase. Journal of Experimental Biology. 1139, 1129-1139 (1998).
  27. Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  28. Fontana-Ayoub,, Fasching, M., Gnaiger, E. Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondrial Physiology Network. 02 (17), 1-9 (2014).
  29. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  30. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 163-181 (2014).
  31. Nászai, A., Terhes, E., Kaszaki, J., Boros, M., Juhász, L. Ca(2+)N it be measured? Detection of extramitochondrial calcium movement with high-resolution fluorespirometry. Scientific Reports. 9 (1), 1-13 (2019).
  32. Pajak, B., et al. 2-Deoxy-d-Glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 234 (2019).
  33. Mercier-Letondal, P., Marton, C., Godet, Y., Galaine, J. Validation of a method evaluating T cell metabolic potential in compliance with ICH Q2 (R1). Journal of Translational Medicine. 19 (1), 1-15 (2021).
  34. Sauerbeck, A., et al. Analysis of regional brain mitochondrial bioenergetics and susceptibility to mitochondrial inhibition utilizing a microplate based system. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 36-43 (2011).
  35. Jackman, M. R., Willis, W. T. Characteristics of mitochondria isolated from type I and type IIb skeletal muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 270 (2), 673-678 (1996).
  36. Ponsot, E., et al. Mitochondrial tissue specificity of substrates utilization in rat cardiac and skeletal muscles. Journal of Cellular Physiology. 203 (3), 479-486 (2005).
  37. Schönfeld, P., Reiser, G. Why does brain metabolism not favor burning of fatty acids to provide energy-Reflections on disadvantages of the use of free fatty acids as fuel for brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (10), 1493-1499 (2013).
  38. Calderon-Dominguez, M., Mir, J. F., Fucho, R., Weber, M., Serra, D., Herrero, L. Fatty acid metabolism and the basis of brown adipose tissue function. Adipocyte. 5 (2), 98-118 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 2014, 1-16 (2014).
  40. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  41. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), 21746 (2011).
  42. Jordá, A., Zaragozá, R., Portolés, M., Báguena-Cervellera, R., Renau-Piqueras, J. Long-term high-protein diet induces biochemical and ultrastructural changes in rat liver mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 265 (2), 241-248 (1988).
  43. Jackson, C. B., Gallati, S., Schaller, A. QPCR-based mitochondrial DNA quantification: Influence of template DNA fragmentation on accuracy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (3), 441-447 (2012).
  44. Hirsch, H. M. Tissue autoxidation inhibitors: II. The presence of inhibitor in intact cells; Assay of liver and hepatoma effect on radio-oxidations. Cancer Research. 16 (11), 1076-1082 (1956).
  45. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), 18317 (2011).
  46. Tanumihardja, E., Slaats, R. H., Van Der Meer, A. D., Passier, R., Olthuis, W., Van Den Berg, A. Measuring both pH and O2 with a single On-Chip sensor in cultures of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to track induced changes in cellular metabolism. ACS Sensors. 6 (1), 267-274 (2021).
  47. Harms, F., Stolker, R. J., Mik, E. Cutaneous respirometry as novel technique to monitor mitochondrial function: A feasibility study in healthy volunteers. PLoS ONE. 11 (7), 159544 (2016).
  48. Levitsky, Y., et al. Micro-respirometry of whole cells and isolated mitochondria. RSC Advances. 9 (57), 33257-33267 (2019).

Tags

Biologie Uitgave 176 mitochondriale bio-energetica ademhalingsketen mitochondriale ziekte oxidatieve fosforylering Flux Analyzer extracellulaire flux HEK293 zuurstofverbruik mitochondriale translatie
Respirometrie met hoge resolutie om bio-energetica in cellen en weefsels te beoordelen met behulp van respirometers op basis van kamer en platen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Awadhpersad, R., Jackson, C. B.… More

Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers. J. Vis. Exp. (176), e63000, doi:10.3791/63000 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter