Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Høyoppløselig respirometri for å vurdere bioenergi i celler og vev ved hjelp av kammer- og platebaserte respirometere

Published: October 26, 2021 doi: 10.3791/63000
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

Summary

Vurdering av oksidativ fosforylering ved hjelp av høyoppløselige respirometere har blitt en integrert del av den funksjonelle analysen av mitokondrier og cellulær energimetabolisme. Her presenterer vi protokoller for analyse av cellulær energimetabolisme ved hjelp av kammer- og mikroplatebaserte høyoppløselige respirometere og diskuterer de viktigste fordelene ved hver enhet.

Abstract

Høyoppløselig respirometri (HRR) gjør det mulig å overvåke oksidativ fosforylering i sanntid for analyse av individuelle cellulære energitilstander og vurdering av respiratoriske komplekser ved hjelp av diversifiserte substrat-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protokoller. Her demonstreres bruken av to høyoppløselige respirometrienheter, og en grunnleggende samling av protokoller som gjelder for analyse av dyrkede celler, skjelett- og hjertemuskelfibre og bløtvev som hjernen og leveren presenteres. Protokoller for dyrkede celler og vev er gitt for et kammerbasert respirometer og dyrkede celler for et mikroplatebasert respirometer, som begge omfatter standard åndedrettsprotokoller. For komparative formål brukes CRISPR-konstruerte HEK293-celler som mangler mitokondrieoversettelse, noe som forårsaker flere luftveissystemmangel med begge enhetene for å demonstrere cellulære defekter i åndedrett. Begge respirometerne muliggjør omfattende måling av cellulær respirasjon med sine respektive tekniske fordeler og egnethet avhengig av problemstillingen og modellen som studeres.

Introduction

Mitokondrier oppfyller den viktigste forsyningen av energi og er en inndelt organelle som bidrar til essensielle cellulære bioenergetiske og metabolske prosesser som anabolisme av nukleotider, lipider og aminosyrer, jern-svovelklyngebiogenese og er involvert i signalering som kontrollert celledød 1,2,3 . Mitokondriebioenergetikk gjennom oksidativ fosforylering bidrar til nesten alle cellulære prosesser i cellen, og følgelig er mitokondrie dysfunksjoner av primær eller sekundær opprinnelse forbundet med et bredt spekter av sykdomstilstander 4,5. Mitokondrie dysfunksjon innebærer ikke bare endringer i struktur eller mitokondrietetthet, men også i kvaliteten og reguleringen av luftveiene6. Dette kvalitative elementet omfatter substratkontroll, koblingsegenskaper, post-translasjonelle modifikasjoner, cristae-dynamikk og respiratoriske superkompatibiliteter 7,8. Derfor er nøyaktig analyse av mitokondriebioenergetikk for eksperimentelle og diagnostiske tilnærminger for å vurdere cellens energimetabolisme viktig i helse og sykdom.

Mitokondrie oksidativ fosforylering (OXPHOS) er en sekvens av reaksjoner i luftveiene eller elektronoverføringssystemet (ETS) for generering av cellulær energi gjennom adenosin tripfosfat (ATP)9. Det multi-enzymatiske trinnet for å utnytte energi fra elektronstrøm gjennom komplekser I og II til kompleks IV genererer en elektrokjemisk protongradient over den indre mitokondriemembranen, som deretter brukes til fosforylering av adenosindifosfat (ADP) til ATP via kompleks V (F1FO ATP-syntase) (figur 1A).

For det første genereres to-elektronbærere under trikarboksylsyklusen (TCA), glykolyse og pyruvatoksidasjon: nikotinamid adenin dinukleotid (NADH) og dihydroflavin adenin dinucleotid (FADH2). NADH oksideres ved kompleks I (NADH dehydrogenase), hvor to elektroner overføres til koenzym Q (quinone reduseres til quinol), mens protoner pumpes inn i intermembrane rommet (IMS). For det andre oksiderer komplekse II (Succinat dehydrogenase) FADH2 og mater elektronene til koenzym Q uten å pumpe protoner. For det tredje, ved kompleks III (Cytochrome c oxidoreductase), overføres elektroner fra koenzym Q til cytokrom c mens protoner pumpes inn i IMS. For det fjerde overfører cytokrom c elektronene til kompleks IV (Cytochrome c oxidase), det endelige komplekset for å pumpe protoner, og hvor oksygen fungerer som en elektron akseptor for å assimilere protoner, og til slutt danne vann. Det er dette oksygenet som mitokondrier forbruker som kan måles ved en oksygraf. Til slutt brukes protonene generert fra kompleks I, kompleks III og kompleks IV til å rotere kompleks V, og dermed generere ATP9.

Det er viktig at elektronoverføring ikke bare skjer lineært, ellers betegnet som elektrontransportkjeden. I stedet kan elektroner overføres til koenzym Q-bassenget gjennom flere luftveier og lette konvergent elektronstrøm. NADH-substrater og succinate, for eksempel, kan gå inn via henholdsvis kompleks I og kompleks II. Elektroner fra fettsyreoksidasjon kan doneres via elektronen som overfører flavoproteinkomplekset. Faktisk krever en omfattende analyse av OXPHOS en helhetlig tilnærming med passende drivstoffsubstrater (figur 1A).

Figure 1
Figur 1: Mitokondrie oksidativ fosforylering og spesifikke substrat- og inhibitorprotokoller. (A) Mitokondrion og ordningen med elektronoverføringssystemet (CI-CIV) og mitokondrie F1F0 ATP-syntase (CV). Alle strukturer er fra PDB. Tallene skildrer bare substrater og inhibitorer beskrevet i denne studien). (B) Prøvespor av oksygenfluks i intakte HEK293-celler ved hjelp av standardprotokoll i en mHRR-enhet. (C) Prøve spor av oksygenfluks i intakte HEK293-celler ved hjelp av standardprotokoll i en cHRR-enhet. (D) Prøve spor av oksygenfluks i permeabiliserte humane fibroblaster fra en sunn donor med respektive SUIT-protokoll. Forkortelser: 1 = Rutinemessig åndedrett av intakte celler; 2 = Tilstand 2; 3 = Tilstand 3 (I); 4 = Tilstand 3(I) med cytC; 5 = Tilstand 3 (I+II); 6 = Lekkasje (OM); 7 = ETS-kapasitet; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenone, AM = Antimycin, ATP = Adenosintrifosfat, Az = Azide, OM = Oligomycin, FCCP = Carbonylcyanid p-trifluoro-metoksyfenyl-hydrazon; Asc = Ascorbate, TMPD = N,N,N′,N′-tetrametyl-p-fenylenediamine, Succ = Succinate, M = Malate, P = Pyruvat, ADP = Adenosin difosfat, NAD = Nikotinamid adenineucleotide, IMS = Intermembrane plass, FAD = Flavin adenin dinucleotide. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Analyse av mitokondrie OXPHOS-kapasitet ved bruk av HRR har blitt en instrumentell biokjemisk metode for diagnostisk verdi, ikke bare for primære mitokondriefeil10,11, men strekker seg til alle andre verdener av biologi som kreft ogaldring 12. HRR tillater bestemmelse av cellulær respirasjon ved analyse av mitokondrie OXPHOS kapasitet, som direkte reflekterer individuell eller kombinert mitokondrie respiratorisk kompleks mangel, og indirekte er forbundet med cellulær dysfunksjon og endret energi metabolisme9. Metodologisk utføres respirasjonsmålinger ved hjelp av celler, vev eller isolerte mitokondrier 11,13,14, med frossent materiale bare delvis egnet 15,16. Frossent vev er vist å ha en intakt ETS med opprettholdt supercomplex stabilitet15. Således, i motsetning til tradisjonelle TCA-mellomprodukter, blir respektive substrater direkte matet inn i ETS. Imidlertid går koblingen mellom ETS- og ATP-syntesen tapt da membranintegriteten kompromitteres gjennom fryseskader (iskrystalldannelse).

Respirasjonseksperimenter foregår normalt ved en fysiologisk temperatur på 37 °C for endotermer i enten ikke-permeabiliserte eller permeabiliserte celler eller vev. Mens førstnevnte vurderer den cytosoliske metabolske konteksten, gir sistnevnte det energiske bidraget fra individuelle OXPHOS-komplekser og ATPase gjennom tilsetning av spesifikke substrater (og inhibitorer). Sekvensen og variasjonen av substrater og inhibitorer har ført til utvikling av et mangfoldig utvalg av SUIT-protokoller17 og analysene18 for å ta opp ulike vitenskapelige spørsmål om OXPHOS-funksjonen (gjennomgått under12). Den grunnleggende protokollen for cellulær respirasjon vurderer fire forskjellige tilstander: i) rutinemessig åndedrett - åndedrett i et respektive åndedrettsmedier uten tillegg av substrater eller inhibitorer som bruker, men endogene substrater. Denne tilstanden kan avsløre generelle OXPHOS eller sekundærinduserte respirasjonsfeil forårsaket for eksempel av endrede metabolittprofiler. Deretter avslører tilsetningen av ATPase-hemmeren oligomycin permeabiliteten til den indre mitokondriemembranen til protoner, definert som ii) lekkasje respirasjon. Etterfølgende titrering av en protonofor som uncoupler carbonyl cyanide p-trifluoro-methoxyphenyl-hydrazone (FCCP) gjør det mulig å bestemme tilstanden der ETS-kapasiteten er maksimal i en åpen transmembrane protonkretsmodus, definert som iii) usammenhengende respirasjon. Det er viktig at en usammenhengende tilstand også kan oppstå ved eksperimentelle inngrep gjennom overdreven mekanisk skade på mitokondriemembranene. Omvendt refererer den ikke-koblede tilstanden til respiratorisk frakobling av en iboende mekanisme som er fysiologisk kontrollert. Til slutt bestemmer fullstendig hemming av ETS ved tilsetning av den komplekse III-hemmeren antimycin og kompleks I-hemmer rotenon gjenværende oksygenforbruk (ROX) fra ikke-mitokondrie oksygenkrevende prosesser (figur 1A-C).

Mitokondriebioenergetikk består av fem distinkte respirasjonstilstander19,20. Tilstand 1-åndedrett er uten ekstra substrater eller ADP, bortsett fra det som er endogenet tilgjengelig. Etter tillegg av ADP, men fortsatt ingen substrater, oppnås tilstand 2-åndedrett. Når substrater tilsettes, slik at elektronoverføring og ATP-syntese, oppnås tilstand 3-åndedrett. I denne tilstanden kan OXPHOS-kapasitet defineres ved metning av konsentrasjoner av ADP, uorganisk fosfat, oksygen, NADH- og succinate-tilknyttede substrater. Tilstand 4-åndedrett eller LEKKASJE-åndedrett kan defineres som en tilstand uten ADP eller kjemisk hemmet ATP-synthaser mens de har tilstrekkelige substrater. Til slutt, når alt oksygen er utarmet (anoksisk) i en lukket kammerinnstilling, observeres tilstand 5 respirasjon.

Det finnes flere metoder for å vurdere cellulære energitilstander14 med to enheter som dominerer den nåværende sanntidsvurderingen av OXPHOS gjennom analyse av oksygenforbruk, målt som funksjonen til reduksjonen i oksygen over tid i et lukket kammersystem med forskjellig anvendbarhet avhengig av eksperimentell modell og forskningsspørsmål: Oroboros 2k høyoppløselig respirometer og Seahorse XF ekstracellulær fluxanalysator. Begge enhetene registrerer oksygenforbruket som en reduksjon i picomoles (pmol) oksygen (O2) per sekund som en absolutt verdi i kammeret eller mikroplaten godt. Det spesifikke oksygenforbruket per masse oppnås ved å normalisere det respektive oksygenforbruket i en bestemt bufferoppskrift per antall celler (millioner), vevsvekt (mg) eller proteinmengde.

O2k (Oroboros Instruments) er et lukket tokammersystem utstyrt med en polarografisk oksygensensor (forkortet som kammerbasert høyoppløselig respirometer: cHRR). Hvert eksperimentelt kammer rommer 2 ml væske som holdes homogent av magnetiske omrørere. Den polarografiske oksygensensoren benytter en amperometrisk tilnærming for å måle oksygenet: den inneholder en gullkatod, en sølv / sølvkloridanode, og mellom en KCI-løsning som skaper en elektrokjemisk celle som en spenning (0,8 V) påføres. Oksygen fra analysemediet sprer seg gjennom en 25 μm fluorinert etylenpropylenmembran (O2-gjennomtrengelig) og gjennomgår reduksjon ved katoden, og produserer hydrogenperoksid. Ved anoden oksideres sølv av hydrogenperoksid, og genererer en elektrisk strøm. Denne elektriske strømmen (ampere) er lineært relatert til det delvise oksygentrykket. Det delvise trykket av oksygen og oksygenløselighetsfaktoren til analysemediet brukes til å beregne oksygenkonsentrasjonen. Siden oksygendelt trykk er avhengig av eksperimentell temperatur og polarografiske målinger er temperaturfølsomme, trenger temperatursvingninger presis (±0,002 °C) regulering av en Peltier varmeblokk. Temperaturen kan kontrolleres innenfor et område på 4 °C og 47 °C.

Seahorse XF ekstracellulær fluksanalysator (Agilent) er et platebasert system med 24- eller 96-brønns mikroplateformat der tre fluorescenselektroder måler oksygenforbruket over tid i hver brønn (forkortet som mikroplatebasert høyoppløselig respirometer: mHRR). Maksimalt fire porter i analysepatronen er tilgjengelige for automatisert injeksjon under analysen. En analyse inneholder flere sykluser, hver med tre faser: 1) blanding, 2) venting og 3) måling. Under målefasen senkes sensorsondene ned i mikroplaten og skaper et midlertidig lukket kammer som inneholder 7-10 μL volum for å måle avgitt lys. Dette lyset avgis av polymer-innebygde fluoroforer på spissen av sensorsondene, som sanser O2 basert på fosforescensslukking. Intensiteten til fluorescenssignalet er proporsjonal med O2 og påvirkes av temperaturen på sensoren og analysemediet. Derfor krever nøyaktig oksygenestimering en relativ tilnærming med en bakgrunn godt uten prøve. Gjenoppretting av oksygenkonsentrasjon oppstår under blandefasen når sensoren beveger seg opp og ned for å blande volumet over det midlertidige kammeret. Hver syklus beregner en oksygenforbrukshastighet. Temperaturen kan kontrolleres innenfor et område på 16 °C og 42 °C.

HRR er gullstandarden for å vurdere cellulær bioenergi i primære og mitokondrier-assosierte sykdommer og generell cellulær metabolisme. I denne studien gis grunnleggende protokoller for HRR for å vurdere OXPHOS-funksjonen i celler og vev.

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyt for celle- og vevspreparater for cHRR, og celleforberedelse for mHRR-respirometri. (A) Omriss av angitte protokoller. (B) Pattedyrceller (trinn 1.2): HEK293 pellet tilsvarende 3 x 106 celler (venstre panel). Ikke-fibrøst vev (trinn 1.3): Fremstilling av murine cerebellum lysate i 2 ml Teflon potter (midtpanel). Saponinindusert skjelettmuskelpermeabilisering (trinn 1.4) høyre panel) for cHRR-respirometri. (C) Standard mikroplatesåingsoppsett (trinn 2.4) og samtidighetskontroll for analyse av eukaryote celler (HEK293) for mHRR-respirometri. (D, E) Skjema for injeksjonsportbelastning for mHRR-respirometri (trinn 2.4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All dyreforsøk utføres i samsvar med National Animal Experiment Review Board og Regional State Administrative Agency for Sør-Finland. Mannlige C57BL/6JOlaHsd-mus (4-6 måneder gamle) ble brukt i denne studien. Samtykke til bruk av menneskelige cellelinjer ble innhentet fra den institusjonelle etiske komiteen ved Universitetet i Helsinki.

1. Respirometri med høy oppløsning: Kammerbasert respirometer (cHRR)

MERK: Eksperimentene i denne delen av protokollen ble utført ved hjelp av Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Materialfortegnelser)

  1. Kalibrering av oksygensensorer
    1. Pre-run respirometere ved 37 °C i 2,1 ml mitokondrie respirasjonsmedium (MiR05, tabell 1, løselighetsfaktor: 0,92) i >45 min og utfør oksygenkalibrering som beskrevet21. Fortsett hvis grunnlinjevariasjonen er innenfor ± 16:00/s.
      MERK: Store svingninger i bakgrunnssignalet kan indikere nødvendig vedlikehold av sensormembranen eller spor av inhibitorer som er igjen i kammeret fra tidligere eksperimentering. En instrumentell bakgrunns oksygenflukskorreksjon anbefales før en gruppe eksperimenter25.
    2. Registrer oksygenkalibreringsverdier for å overvåke sensormembranens ytelse over tid.
      MERK: Dette avslører sensorfunksjon, signal-til-støy-stabilitet og når det er nødvendig med vedlikehold av sensormembran. Avhengig av omgivelsestrykk, er mellom 180-200 μmol oksygen solubilisert i MiR05.
    3. Fjern all væske i kammeret før du tilfører en prøve i åndedrettsmediet.
      MERK: Evaluer volumet av åndedrettskamre for å være nøyaktig 2 ml regelmessig.
  2. Forberedelse av celler for høyoppløselig respirometri
    1. Kultur HEK293 celler i 10 cm2 diameter retter i Dulbeccos Modified Eagle medium (DMEM) med høy glukose supplert med 10% varmeinaktivert foster bovint serum (FBS), GlutaMax, Ikke-essensielle aminosyrer, og Na-Pyruvate22 og uridin23 for å støtte OXPHOS-defekt metabolisme i en inkubator ved 37 °C ved 5 % CO2.
      MERK: Alle typer eukaryote celler kan dyrkes. For de fleste celletyper fører dyrking av en 10 cm2 tallerken til tilstrekkelige celler (vanligvis >3 x 106 celler). Kontroller rutinemessig for mykoplasmainfeksjon for å unngå effekter på cellulær metabolisme og åndedrett.
    2. Vokse celler uten å overskride 90 % samløp (figur 2C).
      MERK: Celler med >90 % samløp kan vise vekstavhengige hemmende effekter på respirasjon (hvis ikke synkronisert eller post-mitotisk).
    3. Vask cellene med 1x PBS, løsne med 1 ml varm 0,25% trypsin, deaktiver trypsin ved å legge til varm DMEM (5 ml / 10 cm2 plate) og tell cellene med et hemocytometer.
    4. Sentrifuger celleløsningen forsiktig som tilsvarer 2,5 x 106 celler ved 300 x g i 5 minutter, fjern supernatanten helt og bland i 2,5 ml varm MiR05 (1 x 106 celler/ml) (figur 2A).
    5. For suspensjonsceller teller og fjerner du oppløsning som tilsvarer 2,5 x 106 celler, pellets og fortsetter som nevnt i trinn 1.2.4.
    6. Kjør SUIT-protokollen for optimalisering av permeabilisering (trinn 1.6), permeabilisert celle eller vev (trinn 1.5) eller intakte celler (trinn 1.7)
      MERK: For konsistente resultater anbefales det å holde cellekonsentrasjonen konstant (f.eks. 1 x 106 celler/ml). Selv om åndedrett er uavhengig av celletetthet irespirometeret 24, er substrater og inhibitorer i sammenlignbar konsentrasjon gjennom eksperimenter hvis celletallene holdes konstante.
  3. Fremstilling av ikke-fibrøst vev (f.eks. hjerne, lever) for høyoppløselig respirometri
    1. Sluk et homogent stykke vev, 30-40 mg i vekt, eller bruk hele orgelet (mus cerebellum i dette tilfellet).
      MERK: Hvis vev ikke brukes umiddelbart, må du oppbevare i 2 ml iskald MiR05 slik at det kan bevares i opptil 2 timer for de fleste vev. Individuelle vevslagringstider må vurderes i tidsserier.
    2. Flekk vevet tørt med et Whatman-filterpapir (forsiktig: bløtvevsmateriale har en tendens til å holde seg).
    3. Legg vevsstykket på 30-40 mg i en iskjølt 2 ml polytetrafluoretylen keramiker Elvehjem homogenisator.
    4. Legg til en passende mengde MiR05 for å oppnå 20 mg / ml for å opprettholde vev-til-buffer-forholdet. Hold den totale mengden > 1,5 ml og <2 ml for å unngå utilstrekkelig eller overdreven væske for passende mekanisk permeabilisering.
    5. Sett inn pestle, lyse vevet sakte ved å trekke pestle forsiktig mens du unngår generering av et vakuum forårsaker overdreven vev skade.
    6. Utfør totalt 7 slag (1x definert som ett opp- og nedoverslag) til det lyser (tydelig som en uklar væske uten store rusk) (figur 2B).
      MERK: Antall slag for passende lysis må testes for hvert vev ved å vurdere ytre mitokondriemembranintegritet via cytokrom C-respons (trinn 1.5.11). Bindevev eller kardeler som er vanskelige å lyse, kan forbli.
    7. Dekanter det lysede vevet i et 15 ml sentrifugerør.
    8. Vask innsiden av keramikeren med like mye MiR05 som brukes i lysingstrinn (f.eks. 1,5 ml) og legg til 15 ml-røret som nå inneholder 3-4 ml MiR05 ved 10 mg/ml vevslys.
    9. Tilsett 2 ml vanlig MiR05 per kammer for å varme til 37 °C.
    10. Virvle røret for lik fordeling før pipettering 500 μL (tilsvarende 5 mg) av hvert lysat per kammer sakte for å minimere stresset fra kaldt til 37 °C.
    11. Vent >3 min for at kammerinnholdet skal varmes opp til 37 °C før du lukker kammeret. Fjern overflødig væske på toppen av proppen (mengde per kammer etter lukking: 4 mg).
    12. Kjør SUIT-protokollen for standard permeabilisert (trinn 1.5).
  4. Tilberedning av fibrøst vev (skjelettmuskulatur, hjertemuskel) for høyoppløselig respirometri
    1. Trekk ut det harde vevet, fjern bindevevet og fettet fra musklene ved hjelp av skarpe tang i 2 ml iskald BIOPS (tabell 2) under et disseksjonsmikroskop.
    2. Skill fiberbuntene (~4 mg) langs langsgående akse med skarpe tang. Ert fibrene tilstrekkelig til å oppnå en maskelignende struktur (figur 2B).
      MERK: Riktig mekanisk fiberseparasjon og permeabilisering indikeres ved tap av det røde pigmentet myoglobin og økt gjennomskinnelighet.
    3. Vask og permeabiliser fiberbunten i saponin (50 μg/ml i BIOPS, tilberedt frisk) i 20 minutter ved 4 °C (fibrene blir gjennomskinnelige, noe som indikerer fullstendig permeabilisering, figur 2B).
    4. Vask fibrene to ganger i MiR05 i 5 minutter per vask ved 4 °C.
    5. Flekk tørr med filterpapir og vei før du legger til kammeret fylt med 2,1 ml MiR05.
    6. Introduser stoppere uten helt lukking, og oksygener deretter kamrene med 2 ml ren O2 ved å bruke en 20 ml sprøyte og lukk kamrene ved å vri stopperne i en roterende bevegelse. Hold O2-konsentrasjonen mellom 300-500 μM under eksperimentet for å unngå oksygendiffusjonsbegrensning.
  5. Protokoll for vurdering av rutinemessig respirasjon i celler eller vev
    1. Legg til et utvalg i kammeret som nevnt i trinn 1.5.2-1.5.3.
    2. Tilsett 2,3 ml varm MiR05 cellefjæring (standardinngang: 1 x 106 celler/ml som i trinn 1,2 eller 2 mg vev/ml som i trinn 1.3)
    3. Skjelett- og hjertemuskel (trinn 1.4): Tilsett ~ 4 mg saponin-permeabiliserte fibre til forhåndsvarslet 2,3 ml varm MiR05 med tanke på trinn 1.4.4-1.4.6
    4. Kjør kamre ved 37 °C og en rørehastighet på 700 o/min. Vent til >3 min slik at media kan degas og lukke kamrene ved å vri stopperen i en roterende bevegelse. Peltier blokkstabilisering indikerer å nå den innstilte temperaturen.
    5. (VALGFRITT) Endre rørehastigheten til 300 o/min slik at de resterende boblene slipper ut gjennom proppens kapillær.
    6. Aspirer overflødig væske på toppen av stopperen. Vent i 10 minutter til et stabilt oksygenflukssignal oppnås med en hvilken som helst prøvetype for å registrere rutine/tilstand 1-åndedrett, figur 1B).
    7. For respirasjonsmålinger i permeabiliserte celler og vev, fortsett med trinn 1.6. For intakte celler med trinn 1.8.
  6. Protokoll for OXPHOS-analyse i permeabiliserte celler eller vev
    1. Bruk lys (permeabilisert) vevsprøve eller permeabilisere celler ved å tilsette 1 μL digitonin (8,1 mM digitoninbestand i dimetylsulfoksid (DMSO)) for en endelig konsentrasjon på 5 μg/ml for å permeabilisere celler. Fluxen vil falle og skal stabilisere seg ved >5 min.
      FORSIKTIG: Digitonin er akutt giftig for luftveiene, i kontakt med huden eller ved svelging.
      MERK: Injeksjon av alle kjemikalier utføres med presisjonsglasssprøyter. Bruk sprøyter kun til angitte kjemikalier for å unngå krysskontaminering og vask grundig i vann og EtOH etter bruk. Blokkerte sprøyter kan kreve ultralydbehandling i varm ddH2O eller en rengjøringstråd for å løsne eventuelle kjemiske tresko. Trekk alltid tilbake et overskudd av den respektive lagerløsningen i sprøyten for å unngå å introdusere luft i kamrene. Inspiser innsiden av kamrene for innføring av luft etter hver injeksjon. Registrer hvert trinn til flux platåer.
    2. Legg til rask rekkefølge: 5 μL 0,4 M malate (M) for en endelig konsentrasjon på 1 mM, 5 μL 2,0 M pyruvat (P; tilberedt fersk), for en endelig konsentrasjon på 5 mM, 4 μL 2,5 M glutamat (G) for en endelig konsentrasjon på 5 mM.
    3. Etter tidligere fluks platået, tilsett 5 μL (10 μL for muskelvev) på 0,5 M adenosindifosfat (ADP, aliquots lagret ved -80 °C) for en endelig konsentrasjon på 1,25 mM.
      MERK: Vev som muskler kan trenge en annen konsentrasjon for å nå metning.
    4. Tilsett 5 μL 4 mM cytokrom C (cytC) for en endelig konsentrasjon på 10 μM.
      MERK: Valgfritt for celler for å vurdere kvaliteten på permeabilisering.
    5. Tilsett 16 μL 1,25 M succinate (S) for en endelig konsentrasjon på 10 mM. (VALGFRITT) Tilsett 3 μL 0,5 M ADP for en endelig konsentrasjon på 2 mM for å kontrollere metningen av ADP-konsentrasjonen.
    6. For celler og ikke-fibrøst vev, tilsett 2 μL 1 mg/ml oligomycin (OM) for en endelig konsentrasjon på 1 μg/ml.
      FORSIKTIG: Alle ETS-hemmere som brukes er svært giftige.
      MERK: Oligomycin kan kreve titrering for optimal konsentrasjon, da det kan undertrykke ETS-kapasitet og utelates for muskelvev. Reoksygenat her når muskelvev er analysert og hvis O2 er under 300 μM.
    7. Titrate FCCP fra en 2 mM lager, tilsett 0,6 μL med påfølgende 0,2 μL trinn til ingen økning i åndedrett og åndedrett er maksimalt usammenhengende (teoretisk: ikke-koblet).
    8. Tilsett 1 μL 1 mM rotenon (ROT) for en endelig konsentrasjon på 0,5 μM. Tilsett 2 μL 1 mg/ml antimycin (AM) lager for en sluttkonsentrasjon på 1 μg/ml.
    9. Reoksygenat kamrene for å oppnå et lignende oksygennivå (~ 150 μM) i alle kamre ved å sakte løfte stempelet i vridningsbevegelse.
    10. Tilsett 5 μL 0,8 M ascorbat for en endelig konsentrasjon på 2 mM umiddelbart etterfulgt av 5 μL 0,2 M N,N,N′,N′-tetrametyl-p-fenylenediamin (TMPD) for en endelig konsentrasjon på 0,5 mM for å vurdere kompleks IV-aktivitet (valgfritt).
    11. Tilsett 5 μL 4 M azide for en endelig konsentrasjon på 10 mM umiddelbart når topp O2 flux nås med TMPD. Fortsett kjøringen i >5 min for å analyse automatisk oksidasjon av TMPD for kompleks IV-beregning på basisnivå.
    12. Tell cellene på nytt for å bekrefte forhåndskjøringen av celleantallet, og fortsett med trinn 1.9.
      MERK: Digitonin-permeabilisering (kun for celler) må titreres i forsøkseksperimenter for å nå maksimal flux og ikke påvirke mitokondriemembranintegriteten (se trinn 1.7). Permeabiliserte prøver (spesielt muskelvev) med >10% økning i respirasjonshastighet etter tilsetning av cytokrom c bør utelukkes fra videre analyse på grunn av ytre mitokondriemembranskader. En korttidsdipp i flux etter tilsetning av EtOH-oppløste kjemikalier forventes.
  7. Protokoll for å bestemme optimale permeabiliseringsbetingelser for celler
    1. Legg til celler som beskrevet i trinn 1.2 og 1.5.2.
    2. Ta 10 μL 10 mg/ml digitonin lager og tilsett 10 μL DMSO for å fortynne til 5 mg/ml.
    3. Tilsett 1 μL rotenon (1 mM lager). Tilsett 10 μL succinat (2 mM lager) og 5 μL ADP (0,5 M lager).
    4. Titrat 1 μL digitonin (2,5 mg per trinn) gjentatte ganger til åndedrett ikke øker ytterligere og er maksimal.
      MERK: En reduksjon i åndedrett indikerer en overdreven konsentrasjon av digitonin.
  8. Protokoll for OXPHOS-analyse i intakte celler
    1. Etter rutinemessig åndedrett (trinn 1.6.1-1.6.6), tilsett 2 μL 0,01 mM oligomycin for en endelig konsentrasjon på 10 nM.
    2. Titrate FCCP fra 2 mM lager, tilsett 0,6 μL med påfølgende 0,2 μL trinn til ingen ytterligere økning i åndedrett og åndedrett er maksimalt usammenhengende (teoretisk: ikke-koblet)
    3. Tilsett 1 μL 1 mM rotenon for en endelig konsentrasjon på 0,5 μM. Tilsett 2 μL 1 mg/ml antimycinlager for en sluttkonsentrasjon på 1 μg/ml.
    4. Reoksygenat kammeret til samme oksygennivå (~150 μM) ved å løfte stempelet langsomt i vridningsbevegelse.
    5. Tilsett 5 μL 0,8 M askorbat for endelig konsentrasjon på 2 mM. Tilsett umiddelbart 5 μL 0,2 M TMPD for en endelig konsentrasjon på 0,5 mM for å vurdere kompleks IV-aktivitet.
      MERK: Forbered en ny batch før et større sett med eksperimenter, da TMPD er utsatt for automatisk oksidasjon. Aktiviteten kan avta over tid når den lagres ved -20 °C.
    6. Tilsett 5 μL 4 M azide for en endelig konsentrasjon på 10 mM umiddelbart når topp O2 flux nås med TMPD. Fortsett å kjøre i >5 min for å analyse automatisk oksidasjon av TMPD for kompleks IV-beregning på basisnivå.
    7. Tell celler på nytt for å bekrefte forhåndskjøringen av celleantallet, og fortsett med trinn 1.9.
  9. Eksempelsamling etter kjøring
    1. Samle nøyaktig 1 ml MiR05-suspensjon fra hvert kammer (med omrørere på) i et 1,5 ml rør 1,5 ml rør.
    2. Sentrifuge ved 1000 x g for permeabiliserte celler eller ved 20.000 x g for vevslys. Fjern supernatanten og frys pelletsen ved -80 °C for videre behandling (avsnitt 3).
  10. Analyse av SUIT-protokoller
    1. Analyser oksygenfluks (pmol/s, normalisert til inngang) på hvert platå etter tilsetning av substrat eller hemmer (figur 1C og figur 3A). Eksporter verdiene til et regneark.
    2. Trekk restoksygenforbruket (ROX, figur 1C og figur 3C) fra alle verdier i hvert eksperimentelt løp. Trekk fra azide rest respirasjon fra TMPD for å oppnå kompleks IV-åndedrett.
    3. Tegn inn absoluttverdiene normalisert for celle (figur 3A, B) eller vevsinndata (figur 5A, B). Beregn fluxkontrollforholdene (trinn 1.11) eller normaliser dem til proteininngang (figur 3C).
  11. Beregning av fluxkontrollforhold
    1. Skaff deg en indeks over åndedrettsfunksjon og koblingskontroll ved hjelp av flukskontrollforhold (FCR) 9,26.
      MERK: Dette gjør det mulig å vurdere egen mitokondriekvalitet, uavhengig av mitokondriemengde. I tillegg er fluxkontrollforhold (FCR) sammenlignbare innenfor de samme cellelinjene som tillater reagenskvalitetskontroll (respektive FCR-er oppnås gjennom de angitte nummererte referanseverdiene i figur 1B-D og figur 3C).
    2. Beregn respirasjonskontrollforholdet for kobling av OXPHOS til LEAK ved hjelp av ligning 1.
      Formel 1: FCRADP = 5/6 = Tilstand 3 / Tilstand 4
    3. Beregn FCR for å vurdere NADH-avhengig respirasjon ved hjelp av ligning 2
      Ligning 2: FCRtilstand 3 (I) = 3/5 = Tilstand 3 (I) / Tilstand 3 (I+II)
    4. Beregn FCR for å vurdere Succinate-avhengig åndedrett ved hjelp av ligning 3.
      Ligning 3: FCRtilstand 3 (II) = 8/7 = Srot / ETSkapasitet
    5. Beregn FCR for å vurdere koblet til frakobling ved hjelp av Formel 4.
      Ligning 4: FCRkoblet /uten kobling = 5/7 = Tilstand 3 (I+II) /ETS-kapasitet
    6. For å teste mitokondrie ytre membranintegritet, bruk ligning 5.
      Ligning 5: % mitokondrie ytre membranskade = 3/4 = Tilstand 3 (I) / Tilstand 3 (I) med cyt c

2. Respirometri med høy oppløsning: Mikroplatebasert respirometer (mHRR)

MERK: Eksperimentene i denne delen av protokollen ble utført ved hjelp av Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer (Materialfortegner)

  1. Cellekultur
    1. Kultur alle typer celler. Tilhengere (f.eks. kollagen, laminin) kan brukes til å lette cellevedlegg. Her dyrkes HEK293-celler som før (trinn 1.3).
    2. Dagen før eksperimentet løsner du cellene og overfører dem til en utpekt mHRR 96-brønns mikroplate for å oppnå ideell samløp på eksperimentets dag (80% -100%) (figur 2C).
      MERK: For mHRR er mikroplatecelletetthet kritisk. Individuelle vekstegenskaper for cellelinjer eller behandlinger som påvirker veksten, må redegjøres for for å sikre sammenlignbar samløp på eksperimentets dag.
  2. Forberedelse av celler for høyoppløselig respirometri
    1. Høst og resuspender cellene tilstrekkelig før sådd
      MERK: Det anbefales å frøceller fra samme fortynning for replikeringer.
    2. Frø cellene i henhold til vekstrater for individuelle cellelinjer eller vekstegenskaper under behandling.
      MERK: Optimaliser på en standard mikroplate på 96 brønner og ekstrapoler celletettheten til en 96-brønns analysespesifikk mikroplate. I dette oppsettet ble 7 x 104 HEK293 WT-celler sådd per brønn av en 96-brønn. Den første og siste kolonnen i 96-brønnsplaten brukes til proteinbestemmelse (figur 2C). De fire hjørnebrønnene skal ikke inneholde noen celler og brukes til eksperimentell bakgrunnskorrigering. Ideelt sett er brønner nær kantene tomme for å minimere kanteffekten (f.eks. celler viser endrede vekstrater forårsaket av temperatureffekter) (figur 2C, D).
  3. Forberedelse av sensorplater, lasting av inhibitorer
    1. På analysedagen supplerer du 38,8 ml middels med 0,4 ml 1 M glukose, 0,4 ml 200 ml glutamin og 0,4 ml 100 mM Na-Pyruvate.
      MERK: mHRR-åndedrett krever et spesialisert ikke-bufret DMEM-medium ved pH 7.4. Generelt bør 40 ml være tilstrekkelig for ett eksperiment med en 96-brønns mikroplate.
    2. Varm respirasjonsanalysemediet til 37 °C og bytt cellekulturmediet mot respirasjonsanalysemediet ved å vaske to ganger med 80 μL per brønn.
    3. Sett platen med cellene i en 37 °C inkubator uten CO2 i 60 minutter før analysen.
      MERK: Dette trinnet er viktig for å avfette platen, da CO2 kan påvirke respirasjonsresultatene, og serum i mediet kan produsere bobler under analysen.
    4. Prewarm inhibitor aliquots for OM, FCCP, ROT og AM til 37 °C og ta sensorplaten ut av inkubatoren.
    5. Fortynn OM, FCCP, ROT og AM i 3 ml analysemedium til en endelig brønnkonsentrasjon på henholdsvis 1,5 μM, 1,125 μM og 1 μM. Fyll på separate porter som angitt i figur 2E.
      MERK: En flerkanals pipette anbefales å fylle sensorpatronen. Siden trykkluft brukes til å injisere forbindelser, må alle porter fylles med like mye flytende volum når en port er fylt med en forbindelse. ROT og AM kan kombineres i én port. Inhibitorer kan oppløses i EtOH eller DMSO.
    6. Kontroller injeksjonsportene og kontroller et jevnt lastevolum for hver port.
      MERK: Alle porter inneholder et hull nederst for injeksjon. Vær forsiktig når du flytter sensorplaten. Luftbobler kan fjernes ved hjelp av en nål.
  4. Protokoll for oksygenvurdering i intakte celler
    1. Dagen før analysen utfører du trinn 2.4.2-2.4.7.
    2. Aliquot 20 ml av kalibrantoppløsningen i et 50 ml konisk rør.
    3. Åpne Extracellular Flux Assay Kit og fjern innholdet.
    4. Plasser sensorpatronen invertert ved siden av strømplaten. Pipette 200 μL kalibrantoppløsning i hver brønn på bruksplaten.
    5. Fest sensorpatronen på strømplaten, og vær oppmerksom på at alle sensorer er nedsenket.
    6. Sett platen i en 37 °C inkubator uten CO2 over natten eller minst 12 timer. Kontroller at fuktigheten inne i inkubatoren er tilstrekkelig til å forhindre fordampning av kalibratoren.
    7. Slå på det mikroplatebaserte systemet og datamaskinen for å være klar til bruk neste dag (maskinen krever minimum 3 timer for å likevekte til 37 °C før du utfører en analyse).
      MERK: For signalstabilitet øker du målepunktene til 6 i stedet for 3 målesykluser per respirasjonstilstand. Hver syklus består av 3 min blanding og 3 min måling.
    8. På dagen for XF-analysen utfører du trinn 2.4.9-2.4.20.
    9. Kontroller sammenløpet av cellekulturplaten, morfologien til cellene og at bakgrunnsbrønnene er tomme.
    10. Vask cellene med det tilberedte åndedrettsmediet som nevnt i trinn 2.4.11-2.4.12.
    11. Fjern alle unntatt 20 μL av kulturmediet fra hver brønn. Fjern 55 μL hvis kulturmediet var 80 μL på grunn av fordampning over natten (ca. 5 μL).
    12. Vask celler to ganger med 90 μL analysemedium. Til slutt legger du til 100 μL analysemedium. Sluttvolumet skal være 120 μL.
      MERK: En flerkanals pipette anbefales for dette trinnet for å sikre at samme vaskeprosedyre er brukt på hver eksperimentell tilstand (avhenger av plateoppsettet). Når du aspirerer, vipp platen til en 45° vinkel og plasser pipettespissene i hjørnet av brønnene for aspirasjon og injeksjon av væsker. Det er viktig å ta vare på under vasken, da visse celler lett kan løsne fra bunnen av cellekulturplaten.
    13. Sett platen i en 37 °C inkubator uten CO2 i 60 minutter før analysen.
    14. Hent den hydrerte sensorpatronplaten fra CO2-fri inkubator.
    15. Kast den gamle kalibrantoppløsningen og erstatt den med fersk kalibrantoppløsning, forhåndsvarmt til 37 °C.
    16. Forbered hemmere og analysemedium (3 ml per hemmer for totalt 12 ml analysemedium) og bruk et pipettereservoar for hemmeren som laster inn i havner.
    17. Åpne programvaren og kjør en forhåndsutformet eller ny mal. Fyll platekartet, juster titrerings- og målesyklusene, og trykk deretter på Start for å starte kalibreringen av de optiske sensorene.
    18. Fjern lokket fra den ladde patronen og plasser det i sporet som automatisk glir ut av maskinen, og kontroller at markeringene nederst til høyre på platen er på linje med trekanten nederst til høyre i sporet.
    19. Klikk på Fortsett for å utføre automatisk kalibrering, som varer ca. 20 min.
    20. Etter kalibrering fjerner du verktøyplaten som inneholder kalibren.
    21. Fjern lokket fra mikroplaten som inneholder cellene, og plasser platen i sporet når maskinen ber om det. Klikk fortsett for å starte kjøringen.
  5. Eksempelsamling etter kjøring
    1. Ta platen ut av maskinen, fjern forsiktig de resterende analysemediene uten å forstyrre cellene og frys hele platen ved -80 °C for videre behandling (avsnitt 3).

3. Bestemmelse av protein ved bruk av bicinkoninsyreanalysen (BCA-analyse)

  1. Forbered fortynnet bovint serumalbumin (BSA) i buffer som brukes til proteinutvinning og kompatibel med BCA: 2 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml og 0 mg/ml for standardkurve i duplikater.
  2. Trekk ut proteiner ved å resuspendere i en passende lysisbuffer (f.eks. RIPA) med 20 μL per brønn for mHRR eller 100 μL per pellets som finnes i et 1,5 ml rør for cHRR.
  3. Inkuber mHRR-platen eller 1,5 ml-røret som inneholder proteinlysater i 30 minutter på is.
  4. Sentrifuger 1,5 ml-røret som inneholder proteinlyset ved 4 °C ved 20 000 x g i 20 minutter og overfør det resulterende supernatanten til et nytt rent 1,5 ml rør.
  5. Bruk 10 μL per prøve i duplikater og standarder i en mikrotiterplate. Tilsett 200 μL BCA arbeidsreagens og inkuber i >15 min.
  6. Les platen i et standard spektrofotometer med en bølgelengde på 562 nm og beregn proteinkonsentrasjonene ved hjelp av en BSA-standardkurve.
  7. Normaliser respirasjonsresultatene til proteinkonsentrasjonen.
    MERK: Normalisering til proteinmengde gjør det mulig å bekrefte cellesåingstetthet eller våtvektsinngang. De ekstraherte proteinene er egnet for etterfølgende immunoblotting mot for eksempel underenheter av ETS, men representerer ikke fullt ut den opprinnelige prøven (f.eks. tap av fosforyleringssteder).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her tilbyr vi protokoller for å bestemme mitokondriebioenergetikken i eukaryote celler, ikke-fibrøst vev (f.eks. cerebellum) og fibrøst vev (f.eks. skjelettmuskulatur). For eukaryote celler ble HEK293 med CRISPR-konstruert knockout av to forskjellige proteiner assosiert med mitokondrieoversettelse som resulterte i flere (CRISPRKO1) og alvorlig/fullstendig OXPHOS-mangel (CRISPRKO2) målt med enten cHRR (figur 3A-C) eller mHRR (figur 3A-D).

For cHRR ble HEK293-celler digitaloninpermeabilisert, og respirasjonsforsøk utført etter standardprotokollen (trinn 1.5-1.6) og ble registrert (figur 3A). CRISPRKO1 viser svekket og CRISPRKO2 ingen åndedrett sammenlignet med WT når normalisert til celleinndatamengde (figur 3B). Proteinmengden ble bestemt fra innsamlede prøver (avsnitt 3), og verdier av rutinemessig respirasjon ble normalisert til proteinmengde for å beregne absolutte verdier og respektive FCRs (figur 3C, betydningen av hver FCR er detaljert i diskusjonen). Optimale prøvemengder produserer fluxer på 80-160 pmol/s per ml. Ideelt sett er mengden celler eller vev tilstrekkelig til å generere en betydelig flux (20 pmol / s for cHRR) for å redusere bakgrunnsstøy mens du unngår overdreven reoksygenering under et eksperiment. Ved lav respirasjon (f.eks. hvitt fett, hvite blodlegemer) eller prøver som er vanskelige å få tak i (f.eks. iPS-differensierte nevronale avledninger), er fluxer på 20 pmol/s per ml tilstrekkelig under ideelle arbeidsforhold.

Figure 3
Figur 3: Representativt standard oksygenforbruksspor fra cHRR ved bruk av HEK293-celler med kombinert OXPHOS-mangel. (A) Spor av rå oksygenforbruk av WT HEK293-celler og HEK293-celler med CRISPR-medierte mitokondrieoversettelsesfeil som forårsaker flere OXPHOS-mangel (CRISPRKO1,2). (B) Overlagt celle-input-normalisert oksygenforbruk spor fra (A). (C) Protein-normalisert kvantifisering av to uavhengige eksperimenter (gjennomsnitt og SD) og respektive FCRs. Sammenligninger mellom forhold ble gjort av ANOVA og en posteriori Tukeys test eller en Student t-test. Betydninger: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Deretter brukte vi mHRR med de samme cellene i en standardprotokoll (2.1-2.5), som bekrefter OXPHOS-manglene (figur 4A). I tillegg ble ECAR-verdiene økt for alvorlig/fullstendig OXPHOS-mangel (CRISPRKO2), noe som tyder på kompensasjon av mitokondrieoksidativ fosforyleringsmangel i HEK293-celler med spesifikk mitokondrieoversettelsesmangel gjennom økt glykolyse som resulterer i laktatproduksjon (figur 4A). Proteinmengden ble bestemt fra mikrowellplaten (avsnitt 3), og oppnådde verdier ble normalisert til proteinmengde (figur 4B) og kvantifisert (figur 4C). Mikroplatebaserte systemer er beryktet for høy variasjon i intrabrønner. Høy variasjon mellom replikeringer kan oppstå når den optimale såddtettheten ikke er oppnådd; celler løsnes under vasketrinnene for å erstatte cellekulturmediet med analysemedium, eller feil pipetteringsteknikk som innføring av luftbobler eller aspirasjon av varierende volum. Utvidede måletider (6 målesykluser) anbefales med mHRR for å muliggjøre stabilisering av fluks i medier (figur 1B og figur 4A). Lave fluxer forårsaker høy variasjon, og avhengig av celletype kan flux være for nær bakgrunnsstøy (opptil 10-15 pmol / s). Lav-respiring (f.eks. fibroblaster) eller eksepsjonelt store celler kan gi utilstrekkelig oksygenfluks over bakgrunnsstøynivået i 96-brønns mikroplateformatet selv ved 90% samløp. I så fall bør 24-brønns mHRR eller cHRR vurderes. Minimale endringer i oksygenfluks kan også indikere feil håndtering av lasting av inhibitorene, for eksempel tomme, feil eller variably fylte porter. Bruk av spesifikke pipettespisser som kommer tilstrekkelig inn i portene under lasting av kjemikaliene, anbefales for å tillate kjemikalier å nå den enkelte porten (figur 2E).

Figure 4
Figur 4: Representativt standard oksygenforbruksspor fra mHRR ved bruk av HEK293-celler med kombinert OXPHOS-mangel. (A) Spor av rå oksygenforbruk av WT HEK293-celler og HEK293-celler med CRISPR-medierte mitokondrieoversettelsesfeil som forårsaker flere OXPHOS-mangel (CRISPRKO1,2). (B) Respektive ekstracellulære forsuringsrater (ECAR) fra (A). (C) Protein-normalisert oksygenforbruk spor av WT HEK293 celler og HEK293 celler med CRISPR-mediert mitokondrie oversettelse mangel forårsaker flere OXPHOS mangel (CRISPRKO1,2). (D) Protein-normalisert kvantifisering av brønner (n = 8 per genotype, gjennomsnitt og SD). Sammenligninger mellom forholdene ble gjort av ANOVA og en posteriori Tukeys test. Betydninger: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Forkortelser: se figur 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Et eksempeleksperiment for ikke-fibrøst vevspreparat (trinn 1,3 og 1,5-1,6) ved hjelp av mus cerebellum (figur 5A) og fibrøst vevspreparat (trinn 1,4 og 1,5-1,6) ved hjelp av musens skjelettmuskulatur (soleus) vises (figur 5B). Generelt overgår ikke usammenhengende respirasjon OXPHOS-kapasiteten i museprøver. For mus cerebellum ble OXPHOS-kapasiteten redusert ved sammenligning med maksimal ETS-kapasitet. LEKKASJE respirasjon økte under fysiologisk kontrollerte omstendigheter versus kjemisk indusert (oligomycin). Dette kan skyldes det faktum at endogen tilgjengelig ADP fortsatt er fosforilert til ATP, mens med kjemisk induksjon er protonlekkasje maksimal, noe som resulterer i en overestimering av LEAK-respirasjon. I motsetning til cerebellum ble sålen testet ved hyperoksiske forhold for å unngå oksygendiffusjonsbegrensning og viser tre ganger høyere OXPHOS-kapasitet. NADH-avhengig åndedrett er annerledes når man analyserer bestemte typer vev, med soleus som har mer kapasitet til å puste gjennom tilsetning av succinat enn cerebellum. Begge typer vev viser minimal ROX.

Figure 5
Figur 5: Representative spor av oksygenforbruk for ikke-fibrøst (A) og fibrøst (B) vev for cHRR. (A) Våtvektvevs normalisert oksygenforbruk spor av mus cerebellum fremstilt som beskrevet (trinn 1.3). (B) Våtvekt-vev-normalisert oksygenforbruk spor av mus soleus muskel som beskrevet (trinn 1.4). Blå linje viser respektive oksygenkonsentrasjon og injeksjonspunkter. Forkortelser: se figur 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Kjemisk Konsentrasjon
BSA, fettsyrefri 1 g/l
D-sukrose 110 mM
EGTA 0,5 mM
HEPES 20 mM
KH2Po4 10 mM
Laktobionsyre 60 mM
MgCl2·6H2O 3 mM
Taurine 20 mM

Tabell 1: Mitokondrie respirasjonsmedium MiR05 sammensetning justert til pH 7.127.

Kjemisk Konsentrasjon
CaK2EGTA vannfri 2,77 mM
Dithiothreitol (DTT) 0,5 mM
Imidazol 20 mM
K2EGTA, vannfri 7,23 mM
MES hydrat 50 mM
MgCl2-6H 2O 6,56 mM
Na2ATP 5,77 mM
Na2Fosfokreatin 15 mM
Taurine 20 mM

Tabell 2: Avslappende og biopsibevaringsløsning (BIOPS) sammensetning justert til pH 7.128.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tradisjonelt har mitokondriebioenergetikk blitt studert med Clark-type oksygenelektroder. Mangel på oppløsning og gjennomstrømning berettiget imidlertid for teknologisk utvikling. Til dags dato har O2k (referert til som cHRR) og Seahorse XF96 Flux Analyzer (referert til som mHRR) blitt mye vedtatt innen cellulær bioenergi. Her presenterer vi en forståelig samling av protokoller for analyse av cellulær energimetabolisme via vurdering av mitokondrie respirasjon ved hjelp av enten cHRR eller mHRR, diskutere viktige fordeler ved hver enhet og gi praktisk veiledning. Protokollene som tilbys her omfatter pattedyrceller, fibrøst (hardt) vev som skjelett- og hjertemuskel, og ikke-fibrøst (mykt) vev som hjerne og lever og gjelder for lignende typer prøvemateriale.

Mens begge HRR-metodene resulterer i sammenlignbare data for pattedyrceller som eksemplifisert med HEK293 med flere OXPHOS-mangel, gjør generelle arbeidsprinsipper og teknisk oppsett av enhetene dem egnet for forskjellige applikasjoner. mHRR-oppsettet tillater automatisert datainnsamling og har høy gjennomstrømningskapasitet med et oppsett med 24 eller 96 brønner som krever minimalt med prøvemengder. Det lave eksperimentelle volumet og brønnoverflaten, i tillegg til bruk av oksygengjennomtrengelige polymerer (polystyren), kan imidlertid forårsake høy variasjon i intrabrønnen (spesielt i 96-brønnsplateoppsettet), noe som fremmer bruken av ≥6 brønner per tilstand for reproduserbare resultater. I motsetning til den cHRR-baserte polarografiske oksygensensoren forbrukes ikke oksygen av sensorsondene til mHRR, som benytter slokket fosforoscens O2 sensing. Siden mHRR er et semi-lukket system, kan omgivelses-O2 spre seg inn i åndedrettsmediet, og utsette prøven og sonden for oksygen. Når den stempellignende sensorsonden senkes, opprettes et midlertidig forseglet og isolert kammer for å forsterke endringer i O2-konsentrasjonen og måle oksygenforbruket. Deretter brukes en matematikkmodell for å beregne oksygenforbrukshastigheten nøyaktig ved å estimere ryggdiffusjonen av O2. Ulempen er imidlertid at algoritmen også forsterker støy29. Mikroplateoppsettet benytter ikke-gjenbrukbare spesialiserte porter og plater som krever optimal cellesåingstetthet. MHRR-oksygensensorsondene måler lateral O 2-diffusjon i tre forskjellige områder per brønn som tilsvarer sondens størrelse (~1 mm); Derfor er en jevnt fordelt cellemonolayer avgjørende for å bestemme nøyaktige oksygenforbrukshastigheter. Hvis det er betydelige hull ved overholdelse av cellefordelingen, vil feil oksygenforbruk beregnes, noe som resulterer i en høy varians for brønnreplekter. Med tanke på dette er mHRR halvautomatisk og ideelt tilpasningsdyktig for høygjennomstrømningscelle eller småorganismebaserte studier (f.eks . C. elegans) med tilbakevendende screeninger.

CHRR-respirometeroppsettet er basert på et tokammersystem med polarimetrisk måling av oksygen. I det lukkede systemet kan ikke omgivelses-O2 spre seg inn i åndedrettsmediet; Dermed reflekterer en nedgang i O 2-konsentrasjonen oksygenforbruket i den biologiske prøven. Ettersom cHRR polarografisk oksygensensor bruker oksygen, er diffusjon av fri O2 viktig, noe som gjør det vanskelig å minimere kammervolumet (2 ml, nye cHRR-enheter 0,5 ml) og krever konstant omrøring for å sikre homogenitet i åndedrettsmediet. Følgelig er det nødvendig med større prøvevolumer for å generere tilstrekkelig oksygenfluks. På grunn av direkte tilgang til kamrene og manuell titrering, er enhver åndedrettsprotokoll tilpasningsdyktig og basert på allment kommersielt tilgjengelige kjemikalier resulterer i eksepsjonelt lave driftskostnader. I tillegg gjør ad hoc-operabilitet det mulig å tilpasse en SUIT-protokoll ved titrering under et eksperiment og er viktig i engangs pasientavledede prøver. Delvis automatisering er mulig ved hjelp av en titreringsinjeksjonsmikropumpe, som muliggjør programmerbare SUIT-protokoller. Selv om de er begrenset til to prøver per cHRR-enhet, vil erfarne brukere kjøre flere enheter parallelt. Fordelen med allsidigheten til analyseutvikling og programvaremiljø kommer med behovet for mer spesifikk opplæring for å betjene disse enhetene og brukeravhengig vedlikehold (f.eks. kalibrering av polarografiske oksygensensorer) for å skaffe reproduserbare data. For avanserte bruksområder kan tilleggsmoduler festes til cHRR-enhetene for å registrere pH, fluorescerende modul til analysemembranpotensial via safranin30, H2O2 via AMPLEX rød24 og kalsiumnivåer31.

Begge enhetene krever spesialiserte åndedrettsmedier. mHRR bruker et kommersielt tilgjengelig serumfritt vekstmedium, og unngår bruk av bikarbonat, som degasses under lave CO2-forhold og er avgjørende hvis ekstracellulær forsuringsrate (ECAR) er av betydning. Under glykolyse omdannes pyruvat til laktat, som dissosierer til melkesyre og protoner. Denne økte protonkonsentrasjonen fører til at pH-en reduseres, som registreres som ECAR. En mer forseggjort analyse av ECAR er mulig med glykolyse stress test. Denne analysen består først av å legge til mettende glukosenivåer for å måle basal glykolytisk hastighet. Etter hemming av ATP-syntasekomplekset med oligomycin, avsløres maksimal glykolytisk hastighet. Det siste trinnet er å måle ikke-glykolytisk forsuring ved å injisere 2-deoksy-glukose, som hemmer glykolyse via konkurransedyktig binding til hexokinase og fosfoglukose isomerase32. Andre kit-baserte protokoller tilgjengelig omfatter glykolyse, fettsyreoksidasjon og glutaminoksidasjon. Her brukte vi standardprotokollen til å måle basal respirasjon, ATP-koblet åndedrett, protonlekkasje, maksimal åndedrettsvern, ledig åndedrettskapasitet og ikke-mitokondrie-åndedrett (figur 4A-C). En tilnærming til å bruke både standard åndedrettsprotokoll i forbindelse med glykolysestresstesten ville gi innsikt i aerobe og anaerobe energiveier som gir en oversikt over cellulær respirasjon.

Cellulær bioenergi er vanligvis tilgjengelig i adherentceller med mikroplate mHRR-oppsettet. Avhengig av celletype, kan spesialisert belegg for overholdelse (f.eks. poly-D-lysin, gelatin, etc.) være nødvendig (for suspensjonsceller) samt for løst tilfølgende celler, da de kan løsne fra bunnen av brønnmålingssyklusene33. I motsetning krever cHRR-målinger konstant omrøring, slik at respiratorisk måling for enhver biologisk prøve. For hver enhet er optimalisering som titrering av inhibitorer (og substrater) for vev og cellelinjer for å vurdere inhibitor-følsomhet (doseresponskurver) nødvendig. Inhibitorkonsentrasjoner bør prøves ut i en eksperimentell modell for å bruke de laveste fullt hemmende konsentrasjonene og for å forhindre uspesifisert hemming samt unødvendig kammerforurensning. Generelt er 0,25 μM rotenon, 0,5 μg / ml oligomycin, 0,5 μg / ml antimycin tilstrekkelig for de fleste bruksområder og prøvemengder. For reproduserbarhet, forberede engangsmedisiner i tilstrekkelige mengder for hele planlagte eksperimenter (f.eks. musegrupper) og hold prøveinngang konstant innenfor et bestemt vev eller cellelinje. I cHRR vil spor av inhibitorer som er igjen i kamrene endre flux uten noen indikasjon til operatøren. Spesielt rotenonspor er vanskelige å unngå og krever tilstrekkelig vasking med et minimumskammer (og stopper) rengjøring, som omfatter vasking 4x med ddH2O, 2x 70% EtOH (96% renhet tilstrekkelig), 1x 100% EtOH, 1x 70% EtOH. Vasking krever å snu rørere og holde EtOH-trinn i > 5 minutter hver. For å forhindre bakteriell forurensning, holdes 70% EtOH i alle kamre når maskiner ikke er i bruk. Potensielle gjenværende kontaminer kan slukkes ved tilsetning av ubrukt vevslys. I et mHRR-eksperiment kan visse kjemikalier samhandle med det essensielleengangsplasttøyet 34.

Åndedrettsdata innhentet via en permeabilisert protokoll gir innsikt i ETS, mens en intakt protokoll gir innsikt i mitokondrieegenskaper som mitokondriekoblingseffektivitet. Faktisk kan generelle mitokondrieenergiegenskaper gi samme utfall, men underliggende elektronoverføring mellom komplekser kan endres. Dette vil gjenspeile endret mitokondrieenergimetabolisme og krever en permeabiliseringsprotokoll for å få tilgang til luftveiene. På samme måte viser forskjellige vev og celler endret substratavhengighet ved vurdering av respiratoriske egenskaper. For eksempel er glykolytiske muskelfibre kjent for å stole primært på glyserol-3-fosfat for energilevering, mens oksidative muskelfibre har en to ganger høyere elektronoverføringskapasitet fra NADH oksidasjon35,36. På samme notat kan hjerte mitokondrier, lever, brunt fettvev bruke fettsyrer for å syntetisere ATP, og i sin tur kan hjernen bruke ketonlegemer, hovedsakelig dannet av fettsyreoksidasjon 36,37,38. Derfor krever det å bestemme mitokondrieegenskaper en helhetlig tilnærming i motsetning til standard glukoseavhengig åndedrett. mHRR omfatter vanligvis vurdering av intakte adherentceller, selv om permeabilisering er oppnåelig (f.eks. mutant rekombinant perfringolysin O som selektivt gjennomsyrer cellemembranen39). Imidlertid kommer disse metodene med økt kompleksitet på grunn av begrensningen av fire injeksjonsporter. I motsetning, riktig lysed ikke-fibrøst vev lysater og noen celle type er vanligvis problemfri for cHRR. Normalt er det ikke mulig å analyse av vev med mHRR; Imidlertid har tilnærminger ved hjelp av isolerte mitokondrier fra et vev blitt etablert40,41.

Viktig å merke seg er at normalisering til hele proteininnhold forsømmer absolutte mitokondriemengder. Sammenligning av eksperimentelle grupper under ulike behandlinger kan variere betydelig (f.eks. 30 dager høyprotein diettfôret rotter viste en 2,5 ganger økning i mitokondrieinnhold ileveren 42), spesielt i vev utsatt for intracellulær lipidakkumulering som brunt fettvev, lever og skjelettmuskulatur. I disse situasjonene anbefales det også å vurdere flere mitokondriemarkører som en tilnærming for mitokondriemasse, for eksempel mtDNA kopi nummer43, sitratsyntaseaktivitet10 og allestedsnærværende mitokondrieproteiner (f.eks. VDAC1, TOM20). I kombinasjon gjør dette det mulig å destillere om en endret åndedrettsfunksjon tilskrives mitokondriemengde, kvalitet, integritet eller en kombinasjon av disse. En annen komplementær metode for dette er implementeringen av FCRs. FCRs gir innsikt i forskjellige respiratoriske tilstander uavhengig av mitokondrieinnhold. FCRADP utleder om endret LEKKASJE eller OXPHOS endrer effektiviteten til mitokondriene til fosforylat ADP. FCRtilstand 3 (I) gjenspeiler i hvilken grad prøven er avhengig av kompleks I som en sammenligning med kompleks II. FCRstate 3 (II) sammenligner kortfattet avhengig åndedrett med ETS og gir en indeks for mitokondrie respirasjon avledet fra kompleks II. FCRkoblet / usammenhengende er et forhold som gir koblingskontrollen mellom OXPHOS og ETS, med et forhold på 1 som ikke har ledig åndedrettskapasitet igjen. Mitokondrie ytre membranintegritet kan vurderes ved tilsetning av eksogen cytokrom c. Cytokrom c er lokalisert i intermembrane rommet, hvor det letter overføringen av elektroner mellom kompleks III og kompleks IV. Hvis den ytre mitokondriemembranen er skadet, lekker cytokrom c ut av mitokondriene, og bidrar ikke til åndedrett lenger. Gjenoppretting av denne ubalansen kan oppnås ved tilsetning av eksogen cytokrom c, og dermed øke respirasjonen (figur 1A, D; 5B). Kompleks IV-aktivitet måles individuelt med TMPD etter fullstendig hemming av OXPHOS. Baseline O2-fluks vil avta etter hvert som O2-konsentrasjonen faller fordi TMPD-oksidasjon er O2 konsentrasjonsavhengig. Etter ROX-vurdering oksygeneres derfor alle kamre til lik oksygennivå (150 μM). Lineær regresjon av datapunkter fra signal etter tilsetning av azid kan brukes til å interpolere kjemisk og O2-avhengig bakgrunn av kompleks IV-aktivitetsanalyse. ROX-verdier bør trekkes fra alle respirasjonsverdier for å korrigere for ikke-mitokondrie oksygenforbruk.

Biologisk kan ROX ved isolert mitokondrier være lavere enn med permeabiliserte eller intakte celler/vev. Generelt er gjenværende respirasjon forårsaket av aktiviteten til oksidaseenzymer, med celler og vev som har mer autoksidizable stoffer enn isolert mitokondrier44. Videre, med intracellulære membranstrukturer fortsatt intakt, øker vanskeligheten med oksygen for å gjennomsyre gjennom cellemembraner på grunn av den negative ladningen. Følgelig kan diffusjon gjennom cellulære membraner og intracellulær tilgjengelighet av oksygen påvirkes, noe som resulterer i ROX. Imidlertid har isolasjon av mitokondrier vist seg å forstyrre mitokondriemorfologi, øke mitokondrie hydrogenperoksidproduksjonen, sammen med endret mitokondrie respiratorisk funksjon45. Mens isolasjon av funksjonelle mitokondrier tillater spesifikk normalisering og kan være nødvendig under visse forhold, er isolasjonsprosessen tidkrevende, krever vanligvis mer materiale, og kan ikke bevare mitokondrie heterogenitet. Av denne grunn har vi avstått fra å inkludere mitokondrieisolasjon i denne studien. For skjelett- eller hjertemuskel er imidlertid isolering av mitokondrier eller saponinbehandling av fibre avgjørende for respirasjonsmålinger. Ettersom autolytiske prosesser oppstår veldig raskt etter eutanasi, anbefales rask vevsutvinning og overholder sammenlignbar timing for preparater mellom individuelle eksperimenter.

I våre eksperimenter førte vurdering av mitokondrie-åndedrettsfunksjonen til pattedyrceller til sammenlignbare resultater med begge HRR-enhetene. Basal respirasjon var imidlertid høyere for cHRR sammenlignet med mHRR. Bortsett fra mange tekniske aspekter (kammervolum, omrøring og forskjellig signalintegrasjon), kan biologiske årsaker som endret åndedrettsmedium, tidspunkt for cellehøsting og ikke-vedlagte celler som forårsaker tap av cellekontakt føre til de observerte forskjellene. Følgelig er respirasjonsprotokoller generelt og individuelle substrat- og inhibitorkonsentrasjoner ikke utskiftbare mellom systemer av de presenterte grunnene, noe som kan være teknisk av natur (f.eks. titrering) og generelt forskjellige analysereagenser (f.eks. respirasjonsmedier, kjemiske absorbanser av glass eller polymerer). For å sikre høyest mulig reproduserbarhet, flere tekniske hensyn og anbefalinger omfatter (i) bruk av engangs aliquots for å minimere krysskontaminering eller fryse-tine sykluser, (ii) passende lagring av alle kjemikalier (f.eks. ADP ved -80 °C for langvarig stabilitet, pyruvat tilberedt ferskt og lysfølsomt kjemikalier i mørket), (iii) regelmessig og streng re-testing av kjemikalier for effekt (f.eks. fordampning lagringsindusert TMPD-aktivitetstap) og (iv) omfattende rengjøring for å fjerne eventuelle sporkjemikalier. Hensyn til reproduserbarheten av langsgående studier (over flere år) ville kreve overvåking av enhetens ytelse og sikre stabiliteten til reagenser over tid.

Til slutt kan ny teknologi basert på kombinerte potensiometriske (pH) og amperometriske (O2) målinger gjennom rutheniumoksidbaserte elektroder katalysere et paradigmeskifte i dagens verktøy, slik at man kan studere cellulær metabolisme i kultur og in vivo46. Selv om dagens metoder tillater overveiende ex vivo - og in vitro-vurdering av cellulær metabolisme, muliggjør forsinket fluorescens in vivo-analyse av mitokondrieoksygen som et mål på mitokondriefunksjon47. På samme måte viser mikrofluidikkbasert respirometri løfter i høyere følsomhet, og krever bare noen få hundre celler48. Mens nye metoder er i horisonten, til dags dato, er høyoppløselig respirometri fortsatt gullstandarden for å vurdere cellulær respirasjonskapasitet som kvintessensielle protokoller er gitt her, som gjelder for de fleste celler, vev og organismer for å studere mitokondrie respirasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikt å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av midler fra Finlands akademi (C.B.J), Magnus Ehrnroot Foundation (C.B.J) og et doktorgradsstipend ved Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer Omni International 07-358029
95% O2, 5% CO2 medical gas mixture Potter for tissue grinding
ADP Sigma A 4386
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical
Ascorbate Merck PHR1279-1G Chemical, dissolve in ethanol
BSA (fatty accid free) Sigma A 6003 Chemical
CaCO3 Sigma C 4830 Chemical
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical
Dithiothreitol Sigma D 0632 Chemical, dissolve in DMSO
D-Sucrose Roth 4621.1 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (High glucose) Fisher Scientific 41965-039 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (No Glucose) Fisher Scientific A14430-01
EGTA Sigma E 4378
Etomoxir Sigma E1905 Chemical
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12500 Chemical
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12501
FCCP Sigma C 2920
Glucose Sigma G7021 Chemical, dissolve in ethanol
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Fisher Scientific 35050061 Chemical
HEK293 cells ATTC CRL-1573
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B Instrument for cell counting
Hepes Sigma H 7523 Chemical
Imidazole Fluka 56750 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
L-carnitine Sigma C0283 Chemical
Malate Sigma M 1000 Chemical
MES hydrate Sigma M8250 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Na2ATP Sigma A 2383 Chemical
Na2Phosphocreatine Sigma P 7936 Chemical
Na-pyruvate (100 mM) (100x) Fisher Scientific 11360070
NEAA (Non-essential amino acids) 100x Fisher Scientific 11140035
Normal FBS (10x) Fisher Scientific 10500064
O2k-Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
O2k-Titration Set Oroboros Instruments 20820-03 Hamilton syringes for chemical injections
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Palmitoylcarnitine Sigma P 4509 Chemical
Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15140122
Pierce BCA Protein Assay Kit Fisher Scientific 23227
Pyruvate Sigma P 2256 Chemical
RIPA-Buffer Fisher Scientific 89900 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Saponin Sigma S7900 Chemical

Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4
Agilent, Santa Clara, CA		 103680-100
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer
Agilent, Santa Clara, CA		 High-throughput respirometry instrument
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent, Santa Clara, CA
Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Small scissors Fisher Scientific 08-951-20
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypan Blue solution Merck 72-57-1 Chemical
Trypsin 0.25% EDTA Fisher Scientific 25200056
Two thin-edged forceps Fisher Scientific 12-000-122
Uridine stock (500x) Sigma U3750 Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
  2. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
  3. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  4. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  5. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 1-23 (2016).
  6. Boushel, R., Gnaiger, E., Schjerling, P., Skovbro, M., Kraunsøe, R., Dela, F. Patients with type 2 diabetes have normal mitochondrial function in skeletal muscle. Diabetologia. 50 (4), 790-796 (2007).
  7. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  8. Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biology. 13, 1-11 (2015).
  9. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and Respiratory control. An introduction to OXPHOS analysis. Bioenergetics communications. 5th ed. , Steiger Druck GmbH. Axams, Austria. (2020).
  10. Jackson, C. B., et al. Mutations in SDHD lead to autosomal recessive encephalomyopathy and isolated mitochondrial complex II deficiency. Journal of Medical Genetics. 51 (3), 170-175 (2014).
  11. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, Clifton, N.J. 25-58 (2012).
  12. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  13. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and oxphos protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, Clifton, N.J. 31-70 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  15. García-Roche, M., Casal, A., Carriquiry, M., Radi, R., Quijano, C., Cassina, A. Respiratory analysis of coupled mitochondria in cryopreserved liver biopsies. Redox Biology. 17, 207-212 (2018).
  16. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 1-18 (2020).
  17. SUITBrowserWeb. , Available from: http://suitbrowser.oroboros.at/ (2021).
  18. Cell metabolism assay kits. Seahorse assay kits and media. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-lits-reagents-cell-assay-media (2021).
  19. Chance, B., Williams, G. R. A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation. Nature. 176 (4475), 250-254 (1955).
  20. Gnaiger, E., et al. Mitochondrial respiratory states and rates. MitoFit Preprint Arch. , (2019).
  21. Gnaiger, E. O2k-procedures: SOP O2k quality control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Section Page. Oroboros. 03 (18), http://wiki.oroboros.at/index.php/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP 1-21 (2020).
  22. Robinson, B. H., Petrova-Benedict, R., Buncic, J. R., Wallace, D. C. Nonviability of cells with oxidative defects in galactose medium: A screening test for affected patient fibroblasts. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 48 (2), 122-126 (1992).
  23. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  24. Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  25. Fasching, M., Gnaiger, E. O2k quality control 2: Instrumental oxygen background correction and accuracy of oxygen flux. Mitochondrial Physiology Network. 14 (06), 1-14 (2016).
  26. Gnaiger, E., Lassnig, B., Kuznetsov, A., Rieger, G., Margreiter, R. Excess capacity of cytochrome c oxidase. Journal of Experimental Biology. 1139, 1129-1139 (1998).
  27. Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  28. Fontana-Ayoub,, Fasching, M., Gnaiger, E. Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondrial Physiology Network. 02 (17), 1-9 (2014).
  29. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  30. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 163-181 (2014).
  31. Nászai, A., Terhes, E., Kaszaki, J., Boros, M., Juhász, L. Ca(2+)N it be measured? Detection of extramitochondrial calcium movement with high-resolution fluorespirometry. Scientific Reports. 9 (1), 1-13 (2019).
  32. Pajak, B., et al. 2-Deoxy-d-Glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 234 (2019).
  33. Mercier-Letondal, P., Marton, C., Godet, Y., Galaine, J. Validation of a method evaluating T cell metabolic potential in compliance with ICH Q2 (R1). Journal of Translational Medicine. 19 (1), 1-15 (2021).
  34. Sauerbeck, A., et al. Analysis of regional brain mitochondrial bioenergetics and susceptibility to mitochondrial inhibition utilizing a microplate based system. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 36-43 (2011).
  35. Jackman, M. R., Willis, W. T. Characteristics of mitochondria isolated from type I and type IIb skeletal muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 270 (2), 673-678 (1996).
  36. Ponsot, E., et al. Mitochondrial tissue specificity of substrates utilization in rat cardiac and skeletal muscles. Journal of Cellular Physiology. 203 (3), 479-486 (2005).
  37. Schönfeld, P., Reiser, G. Why does brain metabolism not favor burning of fatty acids to provide energy-Reflections on disadvantages of the use of free fatty acids as fuel for brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (10), 1493-1499 (2013).
  38. Calderon-Dominguez, M., Mir, J. F., Fucho, R., Weber, M., Serra, D., Herrero, L. Fatty acid metabolism and the basis of brown adipose tissue function. Adipocyte. 5 (2), 98-118 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 2014, 1-16 (2014).
  40. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  41. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), 21746 (2011).
  42. Jordá, A., Zaragozá, R., Portolés, M., Báguena-Cervellera, R., Renau-Piqueras, J. Long-term high-protein diet induces biochemical and ultrastructural changes in rat liver mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 265 (2), 241-248 (1988).
  43. Jackson, C. B., Gallati, S., Schaller, A. QPCR-based mitochondrial DNA quantification: Influence of template DNA fragmentation on accuracy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (3), 441-447 (2012).
  44. Hirsch, H. M. Tissue autoxidation inhibitors: II. The presence of inhibitor in intact cells; Assay of liver and hepatoma effect on radio-oxidations. Cancer Research. 16 (11), 1076-1082 (1956).
  45. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), 18317 (2011).
  46. Tanumihardja, E., Slaats, R. H., Van Der Meer, A. D., Passier, R., Olthuis, W., Van Den Berg, A. Measuring both pH and O2 with a single On-Chip sensor in cultures of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to track induced changes in cellular metabolism. ACS Sensors. 6 (1), 267-274 (2021).
  47. Harms, F., Stolker, R. J., Mik, E. Cutaneous respirometry as novel technique to monitor mitochondrial function: A feasibility study in healthy volunteers. PLoS ONE. 11 (7), 159544 (2016).
  48. Levitsky, Y., et al. Micro-respirometry of whole cells and isolated mitochondria. RSC Advances. 9 (57), 33257-33267 (2019).

Tags

Biologi Utgave 176 mitokondriebioenergetikk åndedrettskjede mitokondriesykdom oksidativ fosforylering Flux Analyzer ekstracellulær flux HEK293 oksygenforbruk mitokondrieoversettelse
Høyoppløselig respirometri for å vurdere bioenergi i celler og vev ved hjelp av kammer- og platebaserte respirometere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Awadhpersad, R., Jackson, C. B.… More

Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers. J. Vis. Exp. (176), e63000, doi:10.3791/63000 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter