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Biology

Respirometría de alta resolución para evaluar la bioenergética en células y tejidos utilizando respirómetros basados en cámaras y placas

Published: October 26, 2021 doi: 10.3791/63000
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

Summary

La evaluación de la fosforilación oxidativa utilizando respirómetros de alta resolución se ha convertido en una parte integral del análisis funcional de las mitocondrias y el metabolismo energético celular. Aquí, presentamos protocolos para el análisis del metabolismo energético celular utilizando respirómetros de alta resolución basados en cámaras y microplacas y discutimos los beneficios clave de cada dispositivo.

Abstract

La respirometría de alta resolución (HRR) permite monitorear la fosforilación oxidativa en tiempo real para el análisis de estados de energía celular individuales y la evaluación de complejos respiratorios utilizando protocolos diversificados de titulación de sustrato-desacoplador-inhibidor (SUIT). Aquí, se demuestra el uso de dos dispositivos de respirometría de alta resolución, y se presenta una colección básica de protocolos aplicables para el análisis de células cultivadas, fibras esqueléticas y del músculo cardíaco, y tejidos blandos como el cerebro y el hígado. Se proporcionan protocolos para células y tejidos cultivados para un respirómetro basado en cámara y células cultivadas para un respirómetro basado en microplacas, ambos que abarcan protocolos de respiración estándar. Para fines comparativos, las células HEK293 diseñadas por CRISPR deficientes en la traducción mitocondrial que causan deficiencia múltiple del sistema respiratorio se utilizan con ambos dispositivos para demostrar defectos celulares en la respiración. Ambos respirómetros permiten una medición integral de la respiración celular con sus respectivos méritos técnicos e idoneidad dependiendo de la pregunta de investigación y el modelo en estudio.

Introduction

Las mitocondrias cumplen con la provisión clave de energía y son un orgánulo compartimentado que contribuye a procesos bioenergéticos y metabólicos celulares esenciales como el anabolismo de nucleótidos, lípidos y aminoácidos, la biogénesis del grupo hierro-azufre y están implicadas en la señalización como la muerte celular controlada 1,2,3 . La bioenergética mitocondrial a través de la fosforilación oxidativa contribuye a casi todos los procesos celulares dentro de la célula, y en consecuencia, las disfunciones mitocondriales de origen primario o secundario se asocian con un amplio espectro de condiciones de enfermedad 4,5. La disfunción mitocondrial no sólo implica alteraciones en la estructura o densidad mitocondrial sino también en la calidad y regulación del sistema respiratorio6. Este elemento cualitativo abarca el control del sustrato, las características de acoplamiento, las modificaciones post-traduccionales, la dinámica cristae y los supercomplejos respiratorios 7,8. Por lo tanto, el análisis preciso de la bioenergética mitocondrial para enfoques experimentales y diagnósticos para evaluar el metabolismo energético de la célula es importante en la salud y la enfermedad.

La fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) es una secuencia de reacciones dentro del sistema respiratorio o sistema de transferencia de electrones (ETS) para la generación de energía celular a través del trifosfato de adenosina (ATP)9. El paso multienzimático para aprovechar la energía del flujo de electrones a través de los complejos I y II al complejo IV genera un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana mitocondrial interna, posteriormente utilizado para la fosforilación de adenosina difosfato (ADP) a ATP a través del complejo V (F1FO ATP sintasa) (Figura 1A).

En primer lugar, se generan portadores de dos electrones durante el ciclo tricarboxílico (TCA), la glucólisis y la oxidación de piruvatos: nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y dihidroflavina adenina dinucleótido (FADH2). El NADH se oxida en el complejo I (NADH deshidrogenasa), durante el cual dos electrones se transfieren a la coenzima Q (la quinona se reduce a quinol), mientras que los protones se bombean al espacio intermembrana (IMS). En segundo lugar, el complejo II (succinato deshidrogenasa) oxida FADH2 y alimenta los electrones a la coenzima Q sin bombear protones. En tercer lugar, en el complejo III (citocromo c oxidorreductasa), los electrones de la coenzima Q se transfieren al citocromo c, mientras que los protones se bombean al IMS. Cuarto, el citocromo c transfiere los electrones al complejo IV (citocromo c oxidasa), el complejo final para bombear protones, y donde el oxígeno funciona como un aceptor de electrones para asimilar protones, formando finalmente agua. Es este oxígeno el que consumen las mitocondrias el que se puede medir mediante un oxígrafo. Finalmente, los protones generados a partir de los complejos I, III y IV se utilizan para rotar el complejo V, generando así ATP9.

Es importante destacar que la transferencia de electrones ocurre no solo de manera lineal, también denotada como la cadena de transporte de electrones. En cambio, los electrones se pueden transferir al grupo de coenzima Q a través de múltiples vías respiratorias y facilitar el flujo convergente de electrones. Los sustratos de NADH y succinato, por ejemplo, pueden entrar a través del complejo I y el complejo II, respectivamente. Los electrones de la oxidación de ácidos grasos se pueden donar a través del complejo de flavoproteína de transferencia de electrones. De hecho, un análisis exhaustivo de OXPHOS requiere un enfoque holístico con sustratos de combustible apropiados (Figura 1A).

Figure 1
Figura 1: Fosforilación oxidativa mitocondrial y sustrato específico y protocolos inhibidores. (A) Mitocondria y esquema del sistema de transferencia de electrones (CI-CIV) y mitocondrial F1F0 ATP sintasa (CV). Todas las estructuras son de PDB. Las figuras solo representan sustratos e inhibidores descritos en este estudio). (B) Traza de muestra de flujo de oxígeno en células HEK293 intactas utilizando el protocolo estándar en un dispositivo mHRR. (C) Traza de muestra de flujo de oxígeno en células HEK293 intactas utilizando el protocolo estándar en un dispositivo cHRR. (D) Muestra de rastro de flujo de oxígeno en fibroblastos humanos permeabilizados de un donante sano con el protocolo SUIT respectivo. Abreviaturas: 1 = Respiración rutinaria de células intactas; 2 = Estado 2; 3 = Estado 3(I); 4 = Estado 3(I) con cytC; 5 = Estado 3 (I+II); 6 = Fuga (OM); 7 = capacidad del RCDE; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenona, AM = Antimicina, ATP = Trifosfato de adenosina, Az = Azida, OM = Oligomicina, FCCP = Cianuro de carbonilo p-trifluoro-metoxifenil-hidrazona; Asc = Ascorbato, TMPD = N,N,N′,N′-tetrametil-p-fenilendiamina, Succ = Succinato, M = Malato, P = Piruvato, ADP = Adenosina difosfato, NAD = Nicotinamida adenina dinucleótido, IMS = Espacio intermembrana, FAD = Flavina adenina dinucleótido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El análisis de la capacidad mitocondrial de OXPHOS utilizando HRR se ha convertido en un método bioquímico instrumental de valor diagnóstico no solo para defectos mitocondriales primarios10,11, sino que se extiende a todos los demás ámbitos de la biología, como el cáncer y el envejecimiento12. La HRR permite la determinación de la respiración celular mediante el análisis de la capacidad mitocondrial de OXPHOS, que refleja directamente la deficiencia del complejo respiratorio mitocondrial individual o combinada, e indirectamente se asocia con disfunción celular y metabolismo energético alterado9. Metodológicamente, las mediciones de la respiración se realizan utilizando células, tejidos o mitocondrias aisladas 11,13,14, con material congelado solo parcialmente adecuado15,16. Se ha demostrado que el tejido congelado tiene un ETS intacto con una estabilidad supercompleja mantenida15. Por lo tanto, a diferencia de los intermedios tradicionales de TCA, los sustratos respectivos se introducen directamente en el ETS. Sin embargo, el acoplamiento entre el ETS y la síntesis de ATP se pierde a medida que la integridad de la membrana se ve comprometida por el daño por congelación (formación de cristales de hielo).

Los experimentos de respiración normalmente tienen lugar a una temperatura fisiológica de 37 °C para endotermas en células o tejidos no permeabilizados o permeabilizados. Mientras que el primero considera el contexto metabólico citosólico, el segundo proporciona la contribución energética de los complejos OXPHOS individuales y la ATPasa a través de la adición de sustratos específicos (e inhibidores). La secuencia y la variación de sustratos e inhibidores han llevado al desarrollo de una amplia gama de protocolos SUIT17 y ensayos18 para abordar diversas cuestiones científicas de la función oxphos (revisados bajo12). El protocolo básico de la respiración celular evalúa cuatro estados diferentes: i) respiración de rutina: la respiración en un medio respiratorio respectivo sin ninguna adición de sustratos o inhibidores que consuman sino sustratos endógenos. Este estado puede revelar OXPHOS general o defectos respiratorios inducidos secundariamente causados, por ejemplo, por perfiles de metabolitos alterados. A continuación, la adición del inhibidor de la ATPasa oligomicina revela la permeabilidad de la membrana mitocondrial interna a los protones, definida como ii) respiración por fuga. La titulación posterior de un protonóforo como el cianuro de carbonilo no acoplado p-trifluoro-metoxifenil-hidrazona (FCCP) permite determinar el estado en el que la capacidad de ETS es máxima en un modo de circuito de protones transmembrana abierta, definido como iii) respiración desacoplada. Es importante destacar que un estado desacoplado también puede ocurrir por intervenciones experimentales a través de un daño mecánico excesivo a las membranas mitocondriales. Por el contrario, el estado no acoplado se refiere al desacoplamiento respiratorio por un mecanismo intrínseco que está fisiológicamente controlado. Finalmente, la inhibición completa del ETS mediante la adición del inhibidor del complejo III antimicina y el inhibidor del complejo I rotenona determina el consumo residual de oxígeno (ROX) de procesos no mitocondriales que consumen oxígeno (Figura 1A-C).

La bioenergética mitocondrial consta de cinco estados respiratorios distintos19,20. La respiración de estado 1 es sin sustratos adicionales o ADP, excepto por lo que está disponible endógenamente. Después de la adición de ADP, pero aún así, sin sustratos, se logra la respiración del estado 2. Cuando se agregan sustratos, lo que permite la transferencia de electrones y la síntesis de ATP, se alcanza la respiración del estado 3. En este estado, la capacidad de OXPHOS se puede definir a concentraciones saturadoras de ADP, fosfato inorgánico, oxígeno, sustratos ligados a NADH y succinato. La respiración de estado 4 o respiración LEAK se puede definir como un estado sin ADP o ATP sintasas inhibidas químicamente mientras que tiene sustratos suficientes. Por último, cuando todo el oxígeno se agota (anóxico) en un entorno de cámara cerrada, se observa la respiración de estado 5.

Existen varios métodos para evaluar los estados de energía celular14 con dos dispositivos que dominan la evaluación actual en tiempo real de OXPHOS a través del análisis del consumo de oxígeno, medido como la función de la disminución de oxígeno a lo largo del tiempo en un sistema de cámara cerrada con diferente aplicabilidad dependiendo del modelo experimental y la pregunta de investigación: el respirómetro de alta resolución Oroboros 2k y el analizador de flujo extracelular Seahorse XF. Ambos dispositivos registran las tasas de consumo de oxígeno como una disminución en picomoles (pmol) de oxígeno (O2) por segundo como un valor absoluto dentro de la cámara o microplaca del pozo. El consumo específico de oxígeno por masa se obtiene normalizando el consumo de oxígeno respectivo en una receta tampón específica por número de células (millones), peso tisular (mg) o cantidad de proteína.

El O2k (Oroboros Instruments) es un sistema cerrado de dos cámaras equipado con un sensor polarográfico de oxígeno (abreviado como respirómetro de alta resolución basado en cámara: cHRR). Cada cámara experimental contiene 2 ml de líquido que se mantiene homogéneo por agitadores magnéticos. El sensor polarográfico de oxígeno utiliza un enfoque amperométrico para medir el oxígeno: contiene un cátodo de oro, un ánodo de cloruro de plata / plata y, entre una solución KCI, crea una celda electroquímica sobre la cual se aplica un voltaje (0.8 V). El oxígeno del medio de ensayo se difunde a través de una membrana de etileno propileno fluorado de 25 μm (O 2-permeable) y sufre una reducción en el cátodo, produciendo peróxido de hidrógeno. En el ánodo, la plata es oxidada por peróxido de hidrógeno, generando una corriente eléctrica. Esta corriente eléctrica (amperio) está linealmente relacionada con la presión parcial de oxígeno. La presión parcial de oxígeno y el factor de solubilidad de oxígeno del medio de ensayo se utilizan para calcular la concentración de oxígeno. Dado que la presión parcial de oxígeno depende de la temperatura experimental y las mediciones polarográficas son sensibles a la temperatura, las fluctuaciones de temperatura necesitan una regulación precisa (±0,002 °C) mediante un bloque de calentamiento Peltier. La temperatura se puede controlar dentro de un rango de 4 ° C y 47 ° C.

El analizador de flujo extracelular Seahorse XF (Agilent) es un sistema basado en placas con formato de microplaca de 24 o 96 pocillos en el que tres electrodos de fluorescencia miden el consumo de oxígeno a lo largo del tiempo en cada pozo (abreviado como respirómetro de alta resolución basado en microplacas: mHRR). Un máximo de cuatro puertos en el cartucho de ensayo están disponibles para la inyección automatizada durante el ensayo. Un ensayo contiene múltiples ciclos, cada uno con tres fases: 1) mezcla, 2) espera y 3) medición. Durante la fase de medición, las sondas del sensor se bajan a la microplaca creando una cámara temporalmente cerrada que contiene un volumen de 7-10 μL para medir la luz emitida. Esta luz es emitida por fluoróforos incrustados en polímeros en la punta de las sondas del sensor, que detectan O2 en función del enfriamiento de fosforescencia. La intensidad de la señal de fluorescencia es proporcional a O2 e influenciada por la temperatura del sensor y el medio de ensayo. Por lo tanto, la estimación precisa del oxígeno requiere un enfoque relativo con un pozo de fondo sin ninguna muestra. La restauración de la concentración de oxígeno ocurre durante la fase de mezcla cuando el sensor se mueve hacia arriba y hacia abajo para mezclar el volumen por encima de la cámara temporal. Cada ciclo calcula una tasa de consumo de oxígeno. La temperatura se puede controlar dentro de un rango de 16 ° C y 42 ° C.

HrR es el estándar de oro para evaluar la bioenergética celular en enfermedades primarias y asociadas a las mitocondrias y el metabolismo celular general. En este estudio, se proporcionan protocolos básicos para la HRR para evaluar la función de OXPHOS en células y tejidos.

Figure 2
Figura 2: Flujo de trabajo para preparaciones celulares y tisulares para la RCH, y preparación celular para la respirometría de RMH. (A) Esquema de los protocolos proporcionados. (B) Células de mamíferos (paso 1.2): pellet HEK293 igual a 3 x 106 celdas (panel izquierdo). Tejido no fibroso (paso 1.3): Preparación de lisado de cerebelo murino en alfarero de teflón de 2 ml (panel medio). Permeabilización del músculo esquelético inducida por saponina (paso 1.4) panel derecho) para la respirometría de RCH. (C) Diseño estándar de siembra de microplacas (paso 2.4) y verificación de confluencia para el análisis de células eucariotas (HEK293) para la respirometría mHRR. (D, E) Esquema de carga del puerto de inyección para respirometría mHRR (paso 2.4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

Toda la experimentación con animales se realiza de acuerdo con la Junta Nacional de Revisión de Experimentos con Animales y la Agencia Administrativa Estatal Regional para el Sur de Finlandia. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6JOlaHsd (4-6 meses de edad). El consentimiento para el uso de líneas celulares humanas se obtuvo del comité de ética institucional de la Universidad de Helsinki.

1. Respirometría de alta resolución: respirómetro basado en cámara (cHRR)

NOTA: Los experimentos en esta sección del protocolo se realizaron utilizando el Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Tabla de Materiales)

  1. Calibración de sensores de oxígeno
    1. Los respirómetros pre-run a 37 °C en 2,1 mL de medio de respiración mitocondrial (MiR05, Tabla 1, factor de solubilidad: 0,92) durante >45 min y realizan la calibración de oxígeno como se describe21. Proceda si la variación basal está dentro de ± 4 pmol/s.
      NOTA: Grandes fluctuaciones en la señal de fondo podrían indicar el mantenimiento requerido de la membrana del sensor o rastros de inhibidores que permanecen en la cámara de la experimentación previa. Se recomienda una corrección instrumental del flujo de oxígeno de fondo antes de un lote de experimentos25.
    2. Registre los valores de calibración de oxígeno para monitorear el rendimiento de la membrana del sensor a lo largo del tiempo.
      NOTA: Esto revela la función del sensor, la estabilidad de la señal al ruido y cuándo se requiere el mantenimiento de la membrana del sensor. Dependiendo de la presión ambiental, entre 180-200 μmol de oxígeno se solubiliza en MiR05.
    3. Retire todo el líquido de la cámara antes de agregar cualquier muestra en el medio de respiración.
      NOTA: Evalúe el volumen de las cámaras respiratorias para que sea exactamente de 2 ml regularmente.
  2. Preparación de células para respirometría de alta resolución
    1. Cultive células HEK293 en platos de 10 cmy 2 diámetros en el medio modified Eagle (DMEM) de Dulbecco con alta glucosa suplementado con suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 10%, GlutaMax, aminoácidos no esenciales y Na-Piruvato22 y uridina23 para apoyar el metabolismo defectuoso de OXPHOS en una incubadora a 37 ° C al 5% de CO2.
      NOTA: Se puede cultivar cualquier tipo de célula eucariota. Para la mayoría de los tipos de células, cultivar un plato de 10 cm2 conduce a suficientes células (generalmente >3 x 106 células). Verifique rutinariamente si hay infección por micoplasma para evitar efectos sobre el metabolismo celular y la respiración.
    2. Cultivar células sin exceder el 90% de confluencia (Figura 2C).
      NOTA: Las células con >90% de confluencia pueden mostrar efectos inhibitorios dependientes del crecimiento sobre la respiración (si no están sincronizados o post-mitóticos).
    3. Lavar las células con 1x PBS, separar con 1 mL de tripsina tibia al 0,25%, desactivar la tripsina añadiendo DMEM caliente (placa de 5 mL/10 cm2 ) y contar las células con un hemocitómetro.
    4. Centrifuga suavemente la solución celular que equivale a 2,5 x 106 células a 300 x g durante 5 min, retira el sobrenadante por completo y vuelve a suspender en 2,5 mL de MiR05 caliente (1 x 106 celdas/mL) (Figura 2A).
    5. Para las celdas de suspensión, cuente y retire la solución que equivale a 2.5 x 106 celdas, ghole y continúe como se menciona en el paso 1.2.4.
    6. Ejecute el protocolo SUIT para la optimización de la permeabilización (paso 1.6), células o tejidos permeabilizados (paso 1.5) o células intactas (paso 1.7)
      NOTA: Para obtener resultados consistentes, se recomienda mantener constante la concentración celular (por ejemplo, 1 x 106 células/ml). Aunque la respiración es independiente de la densidad celular en el respirómetro24, los sustratos e inhibidores están en concentración comparable a lo largo de los experimentos si el número de células se mantiene constante.
  3. Preparación de tejido no fibroso (por ejemplo, cerebro, hígado) para la respirometría de alta resolución
    1. Extirpar un pedazo homogéneo de tejido, 30-40 mg de peso, o usar todo el órgano (cerebelo de ratón en este caso).
      NOTA: Si el tejido no se usa inmediatamente, mantenga en 2 ml de MiR05 helado que permita la preservación hasta 2 h para la mayoría de los tejidos. Los tiempos de almacenamiento de tejido individual deben evaluarse en series temporales.
    2. Seque el tejido con un papel de filtro Whatman (cuidado: la materia de tejido blando tiende a pegarse).
    3. Coloque la pieza de tejido de 30-40 mg en un homogeneizador Elvehjem de alfarero de politetrafluoroetileno refrigerado por hielo de 2 ml.
    4. Agregue una cantidad adecuada de MiR05 para obtener 20 mg / ml para mantener la relación tejido-tampón. Mantenga la cantidad total >1.5 ml y <2 ml para evitar un líquido insuficiente o excesivo para una permeabilización mecánica adecuada.
    5. Inserte el mortero, lise el tejido lentamente retrayendo el mortero con cuidado mientras evita la generación de un vacío que cause un daño tisular excesivo.
    6. Realizar 7 golpes en total (1x definido como un trazo hacia arriba y hacia abajo) hasta que se lisifique (aparente como un líquido turbio sin grandes residuos) (Figura 2B).
      NOTA: El número de accidentes cerebrovasculares para la lisis adecuada debe analizarse para cada tejido mediante la evaluación de la integridad de la membrana mitocondrial externa a través de la respuesta del citocromo C (paso 1.5.11). Es posible que queden partes del tejido conectivo o de los vasos difíciles de lisar.
    7. Decantar el tejido lisado en un tubo centrífugo de 15 ml.
    8. Lave el interior del alfarero con una cantidad igual de MiR05 utilizado en la etapa de lisado (por ejemplo, 1.5 ml) y agregue al tubo de 15 ml que ahora contiene 3-4 ml de MiR05 a 10 mg / ml de lisado tisular.
    9. Añadir 2 ml de MiR05 simple por cámara para calentar a 37 °C.
    10. Gire el tubo para una distribución equitativa antes de pipetear 500 μL (lo que equivale a 5 mg) de cada lisado por cámara lentamente para minimizar el estrés del frío a 37 ° C.
    11. Espere >3 min para que el contenido de la cámara se caliente a 37 °C antes de cerrar la cámara. Retire el exceso de líquido en la parte superior del tapón (cantidad por cámara después del cierre: 4 mg).
    12. Ejecute el protocolo SUIT para permeabilizado estándar (paso 1.5).
  4. Preparación de tejido fibroso (músculo esquelético, músculo cardíaco) para respirometría de alta resolución
    1. Extraiga el tejido duro, elimine el tejido conectivo y la grasa de los músculos utilizando fórceps afilados en 2 ml de BIOPS helado (Tabla 2) bajo un microscopio de disección.
    2. Separe los haces de fibra (~ 4 mg) a lo largo del eje longitudinal con pinzas afiladas. Desentrañar las fibras lo suficiente como para obtener una estructura similar a una malla (Figura 2B).
      NOTA: La separación y permeabilización adecuada de la fibra mecánica está indicada por la pérdida del pigmento rojo mioglobina y el aumento de la translucidez.
    3. Lavar y permeabilizar el haz de fibra en saponina (50 μg/ml en BIOPS, preparado fresco) durante 20 min a 4 °C (las fibras se vuelven translúcidas, lo que indica una permeabilización completa, Figura 2B).
    4. Lave las fibras dos veces en MiR05 durante 5 min por lavado a 4 °C.
    5. Seque con papel de filtro y pese antes de agregar a la cámara llena de 2.1 mL MiR05.
    6. Introduzca tapones sin cerrar completamente, luego oxigene las cámaras con 2 ml de O2 puro utilizando una jeringa de 20 ml y cierre las cámaras girando los tapones en un movimiento giratorio. Mantenga la concentración de O2 entre 300-500 μM durante el experimento para evitar la limitación de difusión de oxígeno.
  5. Protocolo para evaluar la respiración de rutina en células o tejidos
    1. Agregue la muestra a la cámara como se menciona en los pasos 1.5.2-1.5.3.
    2. Añadir 2,3 ml de suspensión de células MiR05 calientes (entrada estándar: 1 x 106 células/ml como en el paso 1,2 o 2 mg de tejido/ml como en el paso 1.3)
    3. Músculo esquelético y cardíaco (paso 1.4): Agregue ~ 4 mg de fibras permeabilizadas con saponina a 2.3 ml precalentados de MiR05 caliente considerando los pasos 1.4.4-1.4.6
    4. Cámaras de funcionamiento a 37 °C y una velocidad de agitación de 700 rpm. Espere >3 min para permitir que los medios se desgasifiquen y cierren las cámaras girando el tapón en un movimiento giratorio. La estabilización del bloque Peltier indica alcanzar la temperatura establecida.
    5. (OPCIONAL) Cambie la velocidad del agitador a 300 rpm para permitir que las burbujas restantes escapen a través del capilar del tapón.
    6. Aspire cualquier exceso de líquido en la parte superior del tapón. Espere 10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable con cualquier tipo de muestra para registrar la respiración de rutina / estado 1, Figura 1B).
    7. Para las mediciones de la respiración en células y tejidos permeabilizados, continúe con el paso 1.6. Para celdas intactas con el paso 1.8.
  6. Protocolo para el análisis OXPHOS en células o tejidos permeabilizados
    1. Utilice una muestra de tejido lisado (permeabilizado) o permeabilice células agregando 1 μL de digitonina (8,1 mM de digitonina en dimetilsulfóxido (DMSO)) para una concentración final de 5 μg/mL para permeabilizar las células. El flujo disminuirá y debe estabilizarse a >5 min.
      PRECAUCIÓN: La digitonina es agudamente tóxica para el tracto respiratorio, en contacto con la piel o cuando se ingiere.
      NOTA: La inyección de todos los productos químicos se realiza con jeringas de vidrio de precisión. Use jeringas solo para los productos químicos indicados para evitar la contaminación cruzada y lávese bien en agua y EtOH después de su uso. Las jeringas bloqueadas pueden requerir ultrasonidos en ddH2O caliente o un cable de limpieza para desalojar cualquier obstrucción química. Siempre retraiga un excedente de la solución madre respectiva en la jeringa para evitar la introducción de aire en las cámaras. Inspeccione el interior de las cámaras para detectar la introducción de aire después de cada inyección. Registre cada paso hasta que el flujo se estabilice.
    2. Añadir en rápida sucesión: 5 μL de 0,4 M de malato (M) para una concentración final de 1 mM, 5 μL de piruvato de 2,0 M (P; preparado fresco), para una concentración final de 5 mM, 4 μL de 2,5 M de glutamato (G) para una concentración final de 5 mM.
    3. Después de que el flujo anterior se estabilizó, agregue 5 μL (10 μL para el tejido muscular) de 0,5 M de difosfato de adenosina (ADP, alícuotas almacenadas a -80 °C) para una concentración final de 1,25 mM.
      NOTA: El tejido como el músculo puede necesitar una concentración diferente para alcanzar la saturación.
    4. Añadir 5 μL de 4 mM de citocromo C (cytC) para una concentración final de 10 μM.
      NOTA: Opcional para que las células evalúen la calidad de la permeabilización.
    5. Añadir 16 μL de succinato (S) de 1,25 M para una concentración final de 10 mM. (OPCIONAL) Añadir 3 μL de 0,5 M de ADP para una concentración final de 2 mM para controlar la saturación de la concentración de ADP.
    6. Para las células y el tejido no fibroso, añadir 2 μL de 1 mg/ml de oligomicina (OM) para una concentración final de 1 μg/ml.
      PRECAUCIÓN: Todos los inhibidores del ETS utilizados son altamente tóxicos.
      NOTA: La oligomicina puede requerir titulación para una concentración óptima, ya que puede reprimir la capacidad de ETS y se omite para el tejido muscular. Reoxigenar aquí cuando se ensaya el tejido muscular y si O2 está por debajo de 300 μM.
    7. Valore FCCP a partir de un stock de 2 mM, agregue 0.6 μL con pasos posteriores de 0.2 μL hasta que no se desacople al máximo ningún aumento en la respiración y la respiración (teórico: no acoplado).
    8. Añadir 1 μL de 1 mM de rotenona (ROT) para una concentración final de 0,5 μM. Añadir 2 μL de 1 mg/ml de antimicina (AM) para una concentración final de 1 μg/ml.
    9. Reoxigene las cámaras para lograr un nivel de oxígeno similar (~ 150 μM) en todas las cámaras levantando lentamente el émbolo en movimiento de torsión.
    10. Añadir 5 μL de ascorbato de 0,8 M para una concentración final de 2 mM seguida inmediatamente de 5 μL de 0,2 M N,N,N′,N′-tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD) para una concentración final de 0,5 mM para evaluar la actividad del complejo IV (opcional).
    11. Añadir 5 μL de azida de 4 M para una concentración final de 10 mM inmediatamente cuando se alcance el flujo máximo de O2 con TMPD. Continúe la ejecución durante >5 minutos para evaluar la autooxidación de TMPD para el cálculo del nivel de base IV complejo.
    12. Vuelva a contar las celdas para confirmar la preejecución del recuento de celdas y continúe con el paso 1.9.
      NOTA: La permeabilización de digitoninas (solo para células) debe titularse en experimentos de ensayo para alcanzar el flujo máximo y no afectar la integridad de la membrana mitocondrial (ver paso 1.7). Las muestras permeabilizadas (especialmente el tejido muscular) con un aumento del >10% en la frecuencia respiratoria después de la adición del citocromo c deben excluirse de un análisis adicional debido al daño de la membrana mitocondrial externa. Se espera una caída de flujo de corto tiempo después de la adición de productos químicos disueltos en EtOH.
  7. Protocolo para determinar las condiciones óptimas de permeabilización de las células
    1. Agregue celdas como se describe en los pasos 1.2 y 1.5.2.
    2. Tomar 10 μL de 10 mg/ml de digitonina y añadir 10 μL de DMSO para diluir a 5 mg/ml.
    3. Añadir 1 μL de rotenona (1 mM de caldo). Añadir 10 μL de succinato (stock de 2 mM) y 5 μL de ADP (stock de 0,5 M).
    4. Valore 1 μL de digitonina (2,5 mg por paso) repetidamente hasta que la respiración no aumente más y sea máxima.
      NOTA: Una disminución en la respiración indica una concentración excesiva de digitonina.
  8. Protocolo para el análisis OXPHOS en células intactas
    1. Después de la respiración de rutina (paso 1.6.1-1.6.6), agregue 2 μL de oligomicina de 0.01 mM para una concentración final de 10 nM.
    2. Valore FCCP a partir de 2 mM de stock, agregue 0.6 μL con pasos posteriores de 0.2 μL hasta que no se desacople al máximo ningún aumento adicional en la respiración y la respiración (teórico: no acoplado)
    3. Añadir 1 μL de 1 mM de rotenona para una concentración final de 0,5 μM. Añadir 2 μL de 1 mg/ml de antimicina para una concentración final de 1 μg/ml.
    4. Reoxigene la cámara al mismo nivel de oxígeno (~ 150 μM) levantando lentamente el émbolo en movimiento de torsión.
    5. Añadir 5 μL de ascorbato de 0,8 M para una concentración final de 2 mM. Agregue inmediatamente 5 μL de 0,2 M TMPD para una concentración final de 0,5 mM para evaluar la actividad IV compleja.
      NOTA: Prepare un lote nuevo antes de cualquier conjunto más grande de experimentos, ya que TMPD es propenso a la autooxidación. La actividad puede disminuir con el tiempo cuando se almacena a -20 °C.
    6. Añadir 5 μL de azida de 4 M para una concentración final de 10 mM inmediatamente cuando se alcance el flujo máximo de O2 con TMPD. Continúe la ejecución durante >5 minutos para evaluar la autooxidación de TMPD para el cálculo del nivel de base IV complejo.
    7. Vuelva a contar las celdas para confirmar la ejecución previa del recuento de celdas y continúe con el paso 1.9.
  9. Recopilación de muestras posterior a la ejecución
    1. Recolecte exactamente 1 ml de suspensión MiR05 de cada cámara (con agitadores encendidos) en un tubo de 1,5 ml y 1,5 ml.
    2. Centrifugar a 1000 x g para células permeabilizadas o a 20.000 x g para lisado tisular. Retire el sobrenadante y congele el pellet a -80 °C para su posterior procesamiento (sección 3).
  10. Análisis de protocolos SUIT
    1. Analizar el flujo de oxígeno (pmol/s, normalizado a la entrada) en cada meseta después de agregar un sustrato o inhibidor (Figura 1C y Figura 3A). Exporte los valores a una hoja de cálculo.
    2. Reste el valor del consumo de oxígeno residual (ROX, Figura 1C y Figura 3C) de todos los valores de cada ejecución experimental. Reste la respiración residual de azida de TMPD para obtener una respiración IV compleja.
    3. Trazar los valores absolutos normalizados para la entrada de células (Figura 3A, B) o tejidos (Figura 5A, B). Calcule las relaciones de control de flujo (paso 1.11) o normalícelas a la entrada de proteínas (Figura 3C).
  11. Cálculo de la relación de control de flujo
    1. Adquirir un índice de control de la función respiratoria y del acoplamiento mediante ratios de control de flujo (FCR)9,26.
      NOTA: Esto permite evaluar la calidad mitocondrial intrínseca, independientemente de la cantidad mitocondrial. Además, las relaciones de control de flujo (FCR) son comparables dentro de las mismas líneas celulares, lo que permite el control de calidad de los reactivos (los FCR respectivos se obtienen a través de los valores de referencia numerados indicados en la Figura 1B-D y la Figura 3C).
    2. Calcule la relación de control respiratorio para el acoplamiento de OXPHOS a LEAK utilizando la Ecuación 1.
      Ecuación 1: FCRADP = 5/6 = Estado 3 / Estado 4
    3. Calcular el FCR para evaluar la respiración dependiente de NADH usando la Ecuación 2
      Ecuación 2: Estado FCR3 (I) = 3/5 = Estado 3 (I) / Estado 3 (I+II)
    4. Calcule el FCR para evaluar la respiración dependiente de succinato utilizando la Ecuación 3.
      Ecuación 3: Estado FCR3 (II) = 8/7 = Spodredumbre /capacidad ETS
    5. Calcule el FCR para evaluar acoplado a desacoplado usando la Ecuación 4.
      Ecuación 4: FCRacoplado/desacoplado = 5/7 = Estado 3 (I+II) /Capacidad ETS
    6. Para probar la integridad de la membrana externa mitocondrial, use la Ecuación 5.
      Ecuación 5: % de daño de la membrana externa mitocondrial = 3/4 = Estado 3 (I) / Estado 3 (I) con cyt c

2. Respirometría de alta resolución: respirómetro basado en microplacas (mHRR)

NOTA: Los experimentos en esta sección del protocolo se realizaron utilizando el analizador de flujo extracelular Seahorse XFe96 (Tabla de materiales)

  1. Cultivo celular
    1. Cultiva cualquier tipo de célula. Los adherentes (por ejemplo, colágeno, laminina) se pueden usar para facilitar la unión celular. Aquí, las células HEK293 se cultivan como antes (paso 1.3).
    2. El día antes del experimento, separe las células y transfiéralas a una microplaca mHRR de 96 pocillos designada para obtener la confluencia ideal el día del experimento (80%-100%) (Figura 2C).
      NOTA: Para la RMHm, las densidades celulares de microplacas son críticas. Las propiedades de crecimiento individuales de las líneas celulares o los tratamientos que afectan el crecimiento deben tenerse en cuenta para garantizar una confluencia comparable el día del experimento.
  2. Preparación de células para respirometría de alta resolución
    1. Cosechar y resuspendir las células lo suficiente antes de la siembra
      NOTA: Se recomienda sembrar células de la misma dilución para réplicas.
    2. Sembrar las células de acuerdo con las tasas de crecimiento de las líneas celulares individuales o las propiedades de crecimiento bajo tratamiento.
      NOTA: Optimice en una microplaca estándar de 96 pocillos y extrapole la densidad celular a una microplaca específica de ensayo de 96 pocillos. En esta configuración, se sembraron 7 x 104 células HEK293 WT por pozo de un pocillo de 96. La primera y la última columna de la placa de 96 pocillos se utilizan para la determinación de proteínas (Figura 2C). Los cuatro pozos de esquina no deben contener ninguna celda y se utilizan para la corrección experimental de fondo. Idealmente, los pozos cerca de los bordes están vacíos para minimizar el efecto del borde (por ejemplo, las células muestran tasas de crecimiento alteradas causadas por los efectos de la temperatura) (Figura 2C, D).
  3. Preparación de placas de sensores, carga de inhibidores
    1. El día del ensayo, complemente 38.8 mL de medio con 0.4 mL de 1 M de glucosa, 0.4 mL de 200 mM de glutamina y 0.4 mL de Na-piruvato de 100 mM.
      NOTA: La respiración mHRR requiere un medio DMEM especializado no tamponado a pH 7.4. En general, 40 ml deberían ser suficientes para un experimento con una microplaca de 96 pocillos.
    2. Caliente el medio de ensayo de respiración a 37 °C e intercambie el medio de cultivo celular por el medio de ensayo de respiración lavando dos veces con 80 μL por pozo.
    3. Coloque la placa con las células en una incubadora de 37 °C sin CO2 durante 60 minutos antes del ensayo.
      NOTA: Este paso es esencial para desgasificar la placa, ya que el CO2 puede afectar los resultados de la respiración, y el suero en el medio puede producir burbujas durante el ensayo.
    4. Alícuotas inhibidoras precalentadas para OM, FCCP, ROT y AM a 37 °C y saca la placa del sensor de la incubadora.
    5. Diluya OM, FCCP, ROT y AM en 3 ml de medio de ensayo hasta una concentración final de pozo de 1,5 μM, 1,125 μM y 1 μM, respectivamente. Rellene en puertos separados como se indica en la Figura 2E.
      NOTA: Se recomienda una pipeta multicanal para llenar el cartucho del sensor. Dado que el aire a presión se utiliza para inyectar compuestos, todos los puertos deben llenarse con una cantidad igual de volumen de líquido cada vez que un puerto se llena con un compuesto. ROT y AM se pueden combinar en un solo puerto. Los inhibidores se pueden disolver en EtOH o DMSO.
    6. Inspeccione los puertos de inyección y verifique un volumen de carga uniforme para cada puerto.
      NOTA: Todos los puertos contienen un orificio en la parte inferior para la inyección. Se debe tener cuidado al mover la placa del sensor. Las burbujas de aire se pueden eliminar con una aguja.
  4. Protocolo para la evaluación del oxígeno en células intactas
    1. El día antes del ensayo, realice los pasos 2.4.2-2.4.7.
    2. Alícuota 20 ml de la solución calibrante en un tubo cónico de 50 ml.
    3. Abra el kit de ensayo de flujo extracelular y retire el contenido.
    4. Coloque el cartucho del sensor invertido junto a la placa de utilidad. Pipetear 200 μL de solución calibrante en cada pocillo de la placa de utilidad.
    5. Coloque el cartucho del sensor en la placa de utilidad prestando atención a que todos los sensores estén sumergidos.
    6. Coloque la placa en una incubadora de 37 °C sin CO2 durante la noche o un mínimo de 12 h. Verifique que la humedad dentro de la incubadora sea suficiente para evitar la evaporación del calibrante.
    7. Encienda el sistema basado en microplacas y la computadora para estar listo para usar al día siguiente (la máquina requiere un mínimo de 3 h para equilibrarse a 37 ° C antes de realizar un ensayo).
      NOTA: Para la estabilidad de la señal, aumente los puntos de medición a 6 en lugar de 3 ciclos de medición por estado respiratorio. Cada ciclo consta de 3 min de mezcla y 3 min de medición.
    8. El día del ensayo XF, realice los pasos 2.4.9-2.4.20.
    9. Verificar la confluencia de la placa de cultivo celular, la morfología de las células y que los pozos de fondo estén vacíos.
    10. Lave las células con el medio de respiración preparado como se menciona en los pasos 2.4.11-2.4.12.
    11. Retire todos menos 20 μL del medio de cultivo de cada pozo. Retirar 55 μL si el medio de cultivo fue de 80 μL debido a la evaporación durante la noche (aproximadamente 5 μL).
    12. Lavar las células dos veces con 90 μL de medio de ensayo. Finalmente, agregue 100 μL de medio de ensayo. El volumen final debe ser de 120 μL.
      NOTA: Se recomienda una pipeta multicanal para este paso para garantizar que se haya aplicado el mismo procedimiento de lavado a cada condición experimental (depende de la configuración de la placa). Al aspirar, incline la placa a un ángulo de 45° y coloque las puntas de la pipeta en la esquina de los pozos para la aspiración e inyección de líquidos. Es imperativo tener cuidado durante el lavado, ya que ciertas células pueden desprenderse fácilmente del fondo de la placa de cultivo celular.
    13. Coloque la placa en una incubadora de 37 °C sin CO2 durante 60 minutos antes del ensayo.
    14. Recupere la placa del cartucho del sensor hidratado de la incubadora libre de CO2.
    15. Deseche la solución de calibrante vieja y reemplácela por una solución de calibrante nueva, precalentada a 37 °C.
    16. Preparar inhibidores y medio de ensayo (3 ml por inhibidor para un total de 12 ml de medio de ensayo) y utilizar un depósito de pipeta para la carga del inhibidor en los puertos.
    17. Abra el software y ejecute una plantilla prediseñada o nueva. Llene el mapa de la placa, ajuste las valoraciones y los ciclos de medición y, a continuación, pulse Iniciar para iniciar la calibración de los sensores ópticos.
    18. Retire la tapa del cartucho cargado y colóquela en la ranura que se desliza automáticamente fuera de la máquina, verificando que las marcas en la esquina inferior derecha de la placa se alineen con el triángulo en la esquina inferior derecha de la ranura.
    19. Haga clic en Continuar para realizar la calibración automática, con una duración aproximada de 20 minutos.
    20. Después de la calibración, retire la placa de utilidad que contiene el calibrante.
    21. Retire la tapa de la microplaca que contiene las celdas y coloque la placa en la ranura cuando la máquina se lo solicite. Haga clic en Continuar para iniciar la ejecución.
  5. Recopilación de muestras posterior a la ejecución
    1. Saque la placa de la máquina, retire cuidadosamente los medios de ensayo restantes sin perturbar las células y congele toda la placa a -80 °C para su posterior procesamiento (sección 3).

3. Determinación de proteínas mediante el ensayo de ácido bicinconónico (ensayo BCA)

  1. Preparar albúmina sérica bovina diluida (BSA) en tampón utilizado para la extracción de proteínas y compatible con BCA: 2 mg/mL, 1,5 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL y 0 mg/mL para la curva estándar en duplicados.
  2. Extraer proteínas mediante resusped en un tampón de lisis apropiado (por ejemplo, RIPA) con 20 μL por pocillo para mHRR o 100 μL por pellet contenido dentro de un tubo de 1,5 mL para cHRR.
  3. Incubar la placa mHRR o el tubo de 1,5 ml que contiene lisados de proteínas durante 30 minutos en hielo.
  4. Centrifugar el tubo de 1,5 ml que contiene el lisado de proteína a 4 °C a 20.000 x g durante 20 min y transferir el sobrenadante resultante a un nuevo tubo limpio de 1,5 ml.
  5. Utilice 10 μL por muestra en duplicados y estándares en una placa de microtitulación. Añadir 200 μL de reactivo de trabajo BCA e incubar durante >15 min.
  6. Lea la placa en un espectrofotómetro estándar a una longitud de onda de 562 nm y calcule las concentraciones de proteínas utilizando una curva estándar BSA.
  7. Normalizar los resultados de la respiración a la concentración de proteínas.
    NOTA: La normalización a la cantidad de proteína permite corroborar las densidades de siembra celular o la entrada de peso húmedo. Las proteínas extraídas son adecuadas para la inmunoblotting posterior contra subunidades del ETS, por ejemplo, pero no representan completamente la muestra nativa (por ejemplo, pérdida de sitios de fosforilación).

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Representative Results

Aquí, proporcionamos protocolos para determinar la bioenergética mitocondrial en células eucariotas, tejido no fibroso (por ejemplo, cerebelo) y tejido fibroso (por ejemplo, músculo esquelético). Para las células eucariotas, HEK293 con knockout diseñado por CRISPR de dos proteínas diferentes asociadas con la traducción mitocondrial que resultan en deficiencia múltiple (CRISPRKO1) y severa / completa de OXPHOS (CRISPRKO2) se midieron con cHRR (Figura 3A-C) o mHRR (Figura 3A-D).

Para la RCH, las células HEK293 se digitalizaron con permeabilización y los experimentos de respiración se realizaron siguiendo el protocolo estándar (paso 1.5-1.6) y se registraron con éxito (Figura 3A). CRISPRKO1 muestra alteración y CRISPRKO2 sin respiración en comparación con WT cuando se normaliza a la cantidad de entrada celular (Figura 3B). La cantidad de proteína se determinó a partir de muestras recolectadas (sección 3), y los valores de respiración de rutina se normalizaron a la cantidad de proteína para calcular los valores absolutos y los FCR respectivos (Figura 3C, el significado de cada FCR se detalla en la discusión). Las cantidades óptimas de muestra producen flujos de 80-160 pmol/s por ml. Idealmente, la cantidad de células o tejidos es suficiente para generar un flujo significativo (20 pmol / s para cHRR) para reducir el ruido de fondo mientras se evade la reoxigenación excesiva durante un experimento. En muestras de baja respiración (por ejemplo, grasa adiposa blanca, glóbulos blancos) o difíciles de obtener (por ejemplo, linajes neuronales diferenciados por iPS), los flujos de 20 pmol/s por ml son suficientes en condiciones de trabajo ideales.

Figure 3
Figura 3: Trazas representativas de consumo de oxígeno en protocolo estándar de cHRR utilizando células HEK293 con deficiencia combinada de OXPHOS. (A) Trazas de consumo de oxígeno en bruto de células WT HEK293 y células HEK293 con defectos de traducción mitocondrial mediados por CRISPR que causan deficiencia múltiple de OXPHOS (CRISPRKO1,2). (B) Trazas superpuestas de consumo de oxígeno normalizado de entrada celular de (A). (C) Cuantificación normalizada de proteínas de dos experimentos independientes (media y SD) y FCR respectivos. Las comparaciones entre condiciones se realizaron mediante ANOVA y la prueba de Tukey a posteriori o una prueba t de Student. Significancias: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A continuación, utilizamos mHRR con las mismas células en un protocolo estándar (2.1-2.5), confirmando las deficiencias de OXPHOS (Figura 4A). Además, los valores de ECAR se incrementaron para la deficiencia grave/completa de OXPHOS (CRISPRKO2), lo que sugiere una compensación de la deficiencia de fosforilación oxidativa mitocondrial en células HEK293 con deficiencia específica de traducción mitocondrial a través de una mayor glucólisis que resulta en la producción de lactato (Figura 4A). La cantidad de proteína se determinó a partir de la placa de micropocillos (sección 3), y los valores obtenidos se normalizaron a la cantidad de proteína (Figura 4B) y se cuantificaron (Figura 4C). Los sistemas basados en microplacas son conocidos por su alta variación dentro del pozo. La alta variabilidad entre réplicas puede ocurrir cuando no se ha logrado la densidad de siembra óptima; las células se desprenden durante los pasos de lavado de la sustitución del medio de cultivo celular por un medio de ensayo, o una técnica de pipeteo inadecuada, como la introducción de burbujas de aire o la aspiración de volúmenes variables. Se recomiendan tiempos de medición extendidos (6 ciclos de medición) con mHRR para permitir la estabilización del flujo en los medios (Figura 1B y Figura 4A). Los flujos bajos causan una alta variación, y dependiendo del tipo de célula, el flujo puede estar demasiado cerca del ruido de fondo (hasta 10-15 pmol / s). Las células de baja respiración (por ejemplo, fibroblastos) o excepcionalmente grandes pueden producir un flujo de oxígeno insuficiente por encima del nivel de ruido de fondo en el formato de microplaca de 96 pocillos, incluso con una confluencia del 90%. En ese caso, se debe considerar la RMSm de 24 pocillos o la RRHH. Los cambios mínimos en el flujo de oxígeno también pueden indicar un manejo defectuoso de la carga de los inhibidores, como puertos vacíos, incorrectos o llenos de forma variable. Se recomienda el uso de puntas de pipeta específicas que entren en los puertos lo suficiente durante la carga de los productos químicos para permitir que los productos químicos lleguen al puerto individual (Figura 2E).

Figure 4
Figura 4: Trazas representativas de consumo de oxígeno en protocolo estándar de mHRR utilizando células HEK293 con deficiencia combinada de OXPHOS. (A) Trazas de consumo de oxígeno en bruto de células WT HEK293 y células HEK293 con defectos de traducción mitocondrial mediados por CRISPR que causan deficiencia múltiple de OXPHOS (CRISPRKO1,2). (B) Respectivas tasas de acidificación extracelular (ECAR) de (A). (C) Trazas de consumo de oxígeno normalizado por proteínas de células WT HEK293 y células HEK293 con deficiencia de traducción mitocondrial mediada por CRISPR que causa deficiencia múltiple de OXPHOS (CRISPRKO1,2). (D) Cuantificación normalizada de proteínas de pocillos (n = 8 por genotipo; media y DE). Las comparaciones entre las condiciones se realizaron mediante ANOVA y la prueba de Tukey a posteriori. Significancias: **** p < 0,0001; p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Abreviaturas: véase la Figura 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se muestra un experimento de ejemplo para la preparación de tejidos no fibrosos (pasos 1.3 y 1.5-1.6) utilizando cerebelo de ratón (Figura 5A) y preparación de tejido fibroso (pasos 1.4 y 1.5-1.6) utilizando músculo esquelético de ratón (sóleo) (Figura 5B). En general, la respiración desacoplada no excede la capacidad de OXPHOS en muestras de ratón. Para el cerebelo de ratón, la capacidad de OXPHOS disminuyó en comparación con la capacidad máxima de ETS. La respiración por FUGA aumentó en circunstancias fisiológicamente controladas versus inducida químicamente (oligomicina). Esto podría deberse al hecho de que el ADP endógeno disponible todavía está fosforilado a ATP, mientras que con la inducción química, la fuga de protones es máxima, lo que resulta en una sobreestimación de la respiración por FUGA. En contraste con el cerebelo, el sóleo se probó en condiciones hiperóxicas para evitar la limitación de difusión de oxígeno y muestra una capacidad OXPHOS tres veces mayor. La respiración dependiente de NADH es diferente cuando se analizan tipos específicos de tejido, y el sóleo tiene más capacidad para respirar a través de la adición de succinato que el cerebelo. Ambos tipos de tejido muestran un ROX mínimo.

Figure 5
Figura 5: Trazas representativas del consumo de oxígeno para tejidos no fibrosos (A) y fibrosos (B) para la RCH. (A) Traza de consumo de oxígeno normalizado en tejido de peso húmedo del cerebelo de ratón preparado como se describe (paso 1.3). (B) Traza de consumo de oxígeno normalizado de peso húmedo del músculo sóleo de ratón como se describe (paso 1.4). La línea azul muestra los puntos de concentración e inyección de oxígeno respectivos. Abreviaturas: véase la Figura 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Químico Concentración
BSA, libre de ácidos grasos 1 g/L
D-sacarosa 110 metros
EGTA 0,5 mM
HEPES 20 metros
KH2PO4 10 mM
Ácido lactobiónico 60 metros
MgCl2·6H2O 3 mM
Taurina 20 metros

Tabla 1: Medio de respiración mitocondrial Composición MiR05 ajustada a pH 7.127.

Químico Concentración
CaK2EGTA anhidro 2,77 mM
Ditiotreitol (TDT) 0,5 mM
Imidazol 20 metros
K2EGTA, anhidro 7,23 mM
Hidrato MES 50 metros
MgCl2-6H 2O 6,56 mM
Na2ATP 5,77 mM
Na2Fosfocreatina 15 mM
Taurina 20 metros

Tabla 2: Composición de la solución relajante y de preservación de biopsia (BIOPS) ajustada a pH 7.128.

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Discussion

Tradicionalmente, la bioenergética mitocondrial se ha estudiado con electrodos de oxígeno tipo Clark. Sin embargo, la falta de resolución y rendimiento justificaba el avance tecnológico. Hasta la fecha, el O2k (conocido como cHRR) y el seahorse XF96 Flux Analyzer (conocido como mHRR) han sido ampliamente adoptados en el campo de la bioenergética celular. Aquí, presentamos una colección comprensible de protocolos para el análisis del metabolismo energético celular a través de la evaluación de la respiración mitocondrial utilizando cHRR o mHRR, discutimos los beneficios clave de cada dispositivo y proporcionamos orientación práctica. Los protocolos proporcionados aquí abarcan células de mamíferos, tejidos fibrosos (duros) como el músculo esquelético y cardíaco, y tejidos no fibrosos (blandos) como el cerebro y el hígado y son aplicables a tipos similares de material de muestra.

Si bien ambos métodos HRR dan como resultado datos comparables para las células de mamíferos, como se ejemplifica con HEK293 con deficiencia múltiple de OXPHOS, los principios generales de funcionamiento y la configuración técnica de los dispositivos los hacen adecuados para diferentes aplicaciones. La configuración de mHRR permite la adquisición automatizada de datos y tiene una capacidad de alto rendimiento con una configuración de múltiples pocillos de 24 o 96 que requiere cantidades mínimas de muestra. Sin embargo, el bajo volumen experimental y la superficie del pozo, además del uso de polímeros permeables al oxígeno (poliestireno), pueden causar una alta variación intra-pozo (especialmente en la configuración de la placa de 96 pocillos), promoviendo el uso de ≥6 pozos por condición para obtener resultados reproducibles. A diferencia del sensor de oxígeno polarográfico basado en cHRR, las sondas del sensor del mHRR, que utiliza la detección de fosforescencia O2 apagada, no consumen oxígeno. Como el mHRR es un sistema semicerrado, el O2 ambiental puede difundirse en el medio de respiración, exponiendo la muestra y la sonda al oxígeno. Cuando la sonda del sensor similar a un pistón baja, se crea una cámara temporalmente sellada y aislada para amplificar los cambios en la concentración de O2 y medir el consumo de oxígeno. Posteriormente, se emplea un modelo matemático para calcular con precisión las tasas de consumo de oxígeno mediante la estimación de la difusión posterior de O2. Sin embargo, el inconveniente es que el algoritmo también amplifica el ruido29. La configuración de microplacas utiliza puertos y placas especializadas no reutilizables que requieren una densidad óptima de siembra de células. Las sondas del sensor de oxígeno mHRR miden la difusión lateral de O2 en tres áreas distintas por pozo equivalentes al tamaño de la sonda (~1 mm); por lo tanto, una monocapa celular distribuida uniformemente es crucial para determinar las tasas precisas de consumo de oxígeno. Si hay brechas significativas al observar la distribución celular, se calcularán tasas incorrectas de consumo de oxígeno, lo que resultará en una alta varianza de réplicas de pozos. Teniendo esto en cuenta, la RMH es semiautomatizada e idealmente adaptable para estudios de células de alto rendimiento o basados en organismos pequeños (por ejemplo, C. elegans) con exámenes recurrentes.

La configuración de los respirómetros cHRR se basa en un sistema de dos cámaras con medición polarimétrica de oxígeno. En el sistema de base cerrada, el O2 ambiental no puede difundirse en el medio de respiración; por lo tanto, una disminución en la concentración de O2 refleja el consumo de oxígeno de la muestra biológica. Como el sensor polarográfico de oxígeno cHRR consume oxígeno, la difusión de O2 libre es esencial, lo que dificulta minimizar el volumen de la cámara (2 ml, nuevos dispositivos cHRR 0,5 ml) y requiere agitación constante para garantizar la homogeneidad del medio de respiración. En consecuencia, se requieren volúmenes de muestra más grandes para generar suficiente flujo de oxígeno. Debido al acceso directo a las cámaras y la titulación manual, cualquier protocolo de respiración es adaptable y se basa en productos químicos ampliamente disponibles comercialmente, lo que resulta en costos de funcionamiento excepcionalmente bajos. Además, la operatividad ad hoc permite adaptar un protocolo SUIT por titulación durante un experimento y es importante en muestras derivadas de pacientes de una sola vez. La automatización parcial es factible utilizando una microbomba de titulación-inyección, que permite protocolos SUIT programables. Aunque restringido a dos muestras por dispositivo cHRR, los usuarios experimentados ejecutarán varios dispositivos en paralelo. El beneficio de la versatilidad del desarrollo de ensayos y el entorno de software viene con la necesidad de una capacitación más específica para operar estos dispositivos y un mantenimiento dependiente del usuario (por ejemplo, calibración de sensores polarográficos de oxígeno) para adquirir datos reproducibles. Para aplicaciones avanzadas, se pueden conectar módulos adicionales a los dispositivos cHRR para registrar el pH, módulo fluorescente para evaluar el potencial de la membrana a través de safranina30, H2O2 a través de AMPLEX red24 y nivelesde calcio 31.

Ambos dispositivos requieren medios respiratorios especializados. mHRR utiliza un medio de crecimiento libre de suero disponible comercialmente, evitando el uso de bicarbonato, que se desgasifica en condiciones bajas de CO2 y es esencial si la tasa de acidificación extracelular (ECAR) es importante. Durante la glucólisis, el piruvato se convierte en lactato, que se disocia en ácido láctico y protones. Este aumento de la concentración de protones hace que el pH disminuya, lo que se registra como ECAR. Un análisis más elaborado de ECAR es posible con la prueba de esfuerzo de glucólisis. Este ensayo consiste primero en agregar niveles de glucosa saturante para medir la tasa glucolítica basal. Después de la inhibición del complejo ATP sintasa con oligomicina, se revela la tasa glucolítica máxima. El paso final es medir la acidificación no glicolítica mediante la inyección de 2-desoxi-glucosa, que inhibe la glucólisis a través de la unión competitiva a la hexoquinasa y la fosfoglucosa isomerasa32. Otros protocolos basados en kits disponibles abarcan la glucólisis, la oxidación de ácidos grasos y la oxidación de glutamina. Aquí, utilizamos el protocolo estándar para medir la respiración basal, la respiración ligada a ATP, la fuga de protones, la respiración máxima, la capacidad respiratoria sobrante y la respiración no mitocondrial (Figura 4A-C). Un enfoque de utilizar tanto el protocolo de respiración estándar junto con la prueba de esfuerzo de glucólisis daría una idea de las vías de energía aeróbica y anaeróbica que proporciona una visión general de la respiración celular.

Por lo general, se accede a la bioenergética celular en células adherentes con la configuración de microplaca mHRR. Dependiendo del tipo de célula, es posible que se requiera un recubrimiento especializado para la adherencia (por ejemplo, poli-D-lisina, gelatina, etc.) (para las células de suspensión), así como para las células poco adherentes, ya que pueden desprenderse de la parte inferior de los ciclos de medición del pozo33. Por el contrario, las mediciones de RCH requieren una agitación constante, lo que permite la medición respiratoria para cualquier muestra biológica. Para cada dispositivo, se requiere una optimización como la titulación de inhibidores (y sustratos) para tejidos y líneas celulares para evaluar la susceptibilidad a los inhibidores (curvas dosis-respuesta). Las concentraciones de inhibidores deben probarse en cualquier modelo experimental para utilizar las concentraciones más bajas de inhibición total y para evitar la inhibición inespecífica, así como la contaminación innecesaria de la cámara. En general, 0,25 μM de rotenona, 0,5 μg / ml de oligomicina, 0,5 μg / ml de antimicina son suficientes para la mayoría de las aplicaciones y cantidades de muestra. Para la reproducibilidad, prepare medicamentos de un solo uso en cantidades suficientes para todos los experimentos planificados (por ejemplo, grupos de ratones) y mantenga constante la entrada de muestras dentro de un tejido específico o línea celular. En la RRHH, los rastros de inhibidores que permanecen en las cámaras alterarán el flujo sin ninguna indicación para el operador. Particularmente los rastros de rotenona son difíciles de evadir y requieren un lavado suficiente con una limpieza mínima de la cámara (y el tapón), que abarca el lavado 4x con ddH2O, 2x 70% EtOH (96% de pureza suficiente), 1x 100% EtOH, 1x 70% EtOH. El lavado requiere girar los agitadores y mantener los pasos de EtOH durante > 5 minutos cada uno. Para evitar la contaminación bacteriana, el 70% de EtOH se mantiene en todas las cámaras cuando las máquinas no están en uso. Los posibles contaminantes residuales pueden ser saciados por la adición de lisado tisular no utilizado. En un experimento de mHRR, ciertos productos químicos pueden interactuar con los artículos de plástico esenciales de un solo uso34.

Los datos respiratorios obtenidos a través de un protocolo permeabilizado dan una idea del ETS, mientras que un protocolo intacto proporciona información sobre las propiedades mitocondriales, como la eficiencia del acoplamiento mitocondrial. De hecho, las propiedades generales de la energía mitocondrial pueden dar el mismo resultado, pero la transferencia de electrones subyacente entre complejos puede verse alterada. Esto reflejaría un metabolismo energético mitocondrial alterado y requiere un protocolo de permeabilización para acceder a los complejos respiratorios. Del mismo modo, diferentes tejidos y células muestran una dependencia alterada del sustrato al evaluar las características respiratorias. Por ejemplo, se sabe que las fibras musculares glicolíticas dependen principalmente del glicerol-3-fosfato para el suministro de energía, mientras que las fibras musculares oxidativas poseen una capacidad de transferencia de electrones dos veces mayor de la oxidación nadH35,36. En la misma nota, las mitocondrias del corazón, el hígado, el tejido adiposo marrón pueden utilizar ácidos grasos para sintetizar ATP, y a su vez, el cerebro puede usar cuerpos cetónicos, predominantemente formados por la oxidación de ácidos grasos 36,37,38. Por lo tanto, la determinación de las características mitocondriales requiere un enfoque holístico en lugar de la respiración estándar dependiente de la glucosa. La RMH generalmente abarca la evaluación de células adherentes intactas, aunque la permeabilización es alcanzable (por ejemplo, perfringolisina O recombinante mutante que permeabiliza selectivamente la membrana celular39). Sin embargo, estos métodos vienen con una mayor complejidad debido a la limitación de cuatro puertos de inyección. Por el contrario, los lisados de tejido no fibroso correctamente lisados y cualquier tipo de célula generalmente no tienen problemas para la RCH. Normalmente, el ensayo de tejido con la RMH no es factible; sin embargo, se han establecido abordajes utilizando mitocondrias aisladas de un tejido40,41.

Es importante tener en cuenta que la normalización al contenido de proteínas enteras descuida las cantidades mitocondriales absolutas. La comparación de grupos experimentales bajo diversos tratamientos puede diferir significativamente (por ejemplo, 30 días de ratas alimentadas con dieta alta en proteínas mostró un aumento de 2,5 veces en el contenido mitocondrial en el hígado42), particularmente en el tejido susceptible a la acumulación de lípidos intracelulares, como el tejido adiposo marrón, el hígado y el músculo esquelético. En estas situaciones, también se recomienda evaluar varios marcadores mitocondriales como una aproximación para la masa mitocondrial, como la copia número43 del ADNmt, la actividad de la citrato sintasa10 y las proteínas mitocondriales ubicuas (por ejemplo, VDAC1, TOM20). En combinación, esto permite destilar si una función respiratoria alterada se atribuye a la cantidad mitocondrial, calidad, integridad o una combinación de las mismas. Otro método complementario a esto es la implementación de FCRs. FCRs dan una idea de diferentes estados respiratorios independientes del contenido mitocondrial. FCRADP deriva si LEAK alterado u OXPHOS cambian la eficiencia de las mitocondrias a fosforilato ADP. El estado FCR3 (I) refleja hasta qué punto la muestra depende del complejo I como comparación con el complejo II. El estado FCR3 (II) compara la respiración dependiente de succinato con ETS y proporciona un índice de respiración mitocondrial derivado del complejo II. FCRacoplado/desacoplado es una relación que proporciona el control de acoplamiento entre OXPHOS y ETS, con una relación de 1 que no queda capacidad respiratoria sobrante. La integridad de la membrana externa mitocondrial se puede evaluar mediante la adición de citocromo c exógeno. El citocromo c se localiza en el espacio intermembrana, donde facilita la transferencia de electrones entre el complejo III y el complejo IV. Si la membrana mitocondrial externa está dañada, el citocromo c se escapa de las mitocondrias, ya no contribuye a la respiración. La restauración de este desequilibrio se puede lograr mediante la adición de citocromo c exógeno, lo que aumenta la respiración (Figura 1A, D; 5B). La actividad del complejo IV se mide individualmente con TMPD después de la inhibición completa de OXPHOS. El flujo basal de O2 disminuirá a medida que la concentración de O2 disminuya porque la oxidación de TMPD depende de la concentración de O2 . Por lo tanto, después de la evaluación ROX, todas las cámaras se oxigenan a un nivel igual de oxígeno (150 μM). La regresión lineal de los puntos de datos de la señal después de la adición de azida se puede utilizar para interpolar el fondo químico y dependiente de O2 del ensayo de actividad IV complejo. Los valores de ROX deben restarse de todos los valores de respiración para corregir el consumo de oxígeno no mitocondrial.

Biológicamente, el ROX en el caso de mitocondrias aisladas puede ser menor que con células/tejidos permeabilizados o intactos. En general, la respiración residual es causada por la actividad de las enzimas oxidasas, con células y tejidos que tienen más sustancias autoxidizables que las mitocondrias aisladas44. Además, con las estructuras de la membrana intracelular aún intactas, la dificultad del oxígeno para penetrar a través de las membranas celulares aumenta debido a su carga negativa. En consecuencia, la difusión a través de las membranas celulares y la disponibilidad intracelular de oxígeno pueden verse afectadas, lo que resulta en ROX. Sin embargo, se ha demostrado que el aislamiento de las mitocondrias altera la morfología mitocondrial, aumenta la producción de peróxido de hidrógeno mitocondrial, junto con la función respiratoria mitocondrial alterada45. Si bien el aislamiento de las mitocondrias funcionales permite una normalización específica y puede ser necesario en ciertas condiciones, el proceso de aislamiento lleva mucho tiempo, generalmente requiere más material y podría no preservar la heterogeneidad mitocondrial. Por esta razón, nos hemos abstenido de incluir el aislamiento mitocondrial en este estudio. Sin embargo, para el músculo esquelético o cardíaco, el aislamiento de las mitocondrias o el tratamiento con saponina de las fibras es esencial para las mediciones de la respiración. Como los procesos autolíticos ocurren muy rápidamente después de la eutanasia, se recomienda la extracción rápida de tejidos y el cumplimiento de un tiempo comparable para las preparaciones entre experimentos individuales.

En nuestros experimentos, la evaluación de la función respiratoria mitocondrial de las células de mamíferos condujo a resultados comparables con ambos dispositivos HRR. Sin embargo, la respiración basal fue mayor para la RCH en comparación con la RMH. Aparte de numerosos aspectos técnicos (volumen de la cámara, agitación e integración de señales diferentes), razones biológicas como el medio de respiración alterado, el momento de la recolección celular y las células no unidas que causan la pérdida de contacto celular podrían infligir las diferencias observadas. En consecuencia, los protocolos de respiración en general y las concentraciones individuales de sustratos e inhibidores no son intercambiables entre sistemas por las razones presentadas, que podrían ser de naturaleza técnica (por ejemplo, titulación) y reactivos de ensayo generalmente diferentes (por ejemplo, medios de respiración, absorbancias químicas de vidrio o polímeros). Para garantizar la máxima reproducibilidad, varias consideraciones y recomendaciones técnicas abarcan (i) el uso de alícuotas de un solo uso para minimizar la contaminación cruzada o los ciclos de congelación-descongelación, (ii) el almacenamiento adecuado de todos los productos químicos (por ejemplo, ADP a -80 °C para una estabilidad prolongada, piruvato preparado fresco y productos químicos sensibles a la luz en la oscuridad), (iii) re-pruebas regulares y rigurosas de productos químicos para determinar su eficacia (por ejemplo, cambios de concentración infligidos por evaporación, pérdida de actividad de TMPD inducida por el almacenamiento) y (iv) limpieza exhaustiva para eliminar cualquier oligoproducto químico. Las consideraciones sobre la reproducibilidad de los estudios longitudinales (durante varios años) requerirían monitorear el rendimiento del dispositivo y garantizar la estabilidad de los reactivos a lo largo del tiempo.

Finalmente, una nueva tecnología basada en mediciones potenciométricas (pH) y amperométricas combinadas (O2) a través de electrodos a base de óxido de rutenio podría catalizar un cambio de paradigma en las herramientas actuales, permitiendo estudiar el metabolismo celular en cultivo e in vivo46. Aunque los métodos actuales permiten predominantemente la evaluación ex vivo e in vitro del metabolismo celular, la fluorescencia retardada permite el análisis in vivo del oxígeno mitocondrial como medida de la función mitocondrial47. Del mismo modo, la respirometría basada en microfluídica se muestra prometedora en una mayor sensibilidad, requiriendo solo unos pocos cientos de células48. Si bien hay nuevas metodologías en el horizonte, hasta la fecha, la respirometría de alta resolución sigue siendo el estándar de oro para evaluar la capacidad de respiración celular para la cual se proporcionan protocolos por excelencia aquí, aplicables a la mayoría de las células, tejidos y organismos para estudiar la respiración mitocondrial.

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Disclosures

No hay conflicto de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por fondos de la Academia de Finlandia (C.B.J), la Fundación Magnus Ehrnroot (C.B.J)), y una beca de doctorado de la Escuela de Graduados de Ciencias de la Vida Integrada (R.A.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer Omni International 07-358029
95% O2, 5% CO2 medical gas mixture Potter for tissue grinding
ADP Sigma A 4386
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical
Ascorbate Merck PHR1279-1G Chemical, dissolve in ethanol
BSA (fatty accid free) Sigma A 6003 Chemical
CaCO3 Sigma C 4830 Chemical
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical
Dithiothreitol Sigma D 0632 Chemical, dissolve in DMSO
D-Sucrose Roth 4621.1 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (High glucose) Fisher Scientific 41965-039 Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (No Glucose) Fisher Scientific A14430-01
EGTA Sigma E 4378
Etomoxir Sigma E1905 Chemical
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12500 Chemical
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific AM12501
FCCP Sigma C 2920
Glucose Sigma G7021 Chemical, dissolve in ethanol
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Fisher Scientific 35050061 Chemical
HEK293 cells ATTC CRL-1573
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B Instrument for cell counting
Hepes Sigma H 7523 Chemical
Imidazole Fluka 56750 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
L-carnitine Sigma C0283 Chemical
Malate Sigma M 1000 Chemical
MES hydrate Sigma M8250 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Na2ATP Sigma A 2383 Chemical
Na2Phosphocreatine Sigma P 7936 Chemical
Na-pyruvate (100 mM) (100x) Fisher Scientific 11360070
NEAA (Non-essential amino acids) 100x Fisher Scientific 11140035
Normal FBS (10x) Fisher Scientific 10500064
O2k-Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
O2k-Titration Set Oroboros Instruments 20820-03 Hamilton syringes for chemical injections
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Palmitoylcarnitine Sigma P 4509 Chemical
Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15140122
Pierce BCA Protein Assay Kit Fisher Scientific 23227
Pyruvate Sigma P 2256 Chemical
RIPA-Buffer Fisher Scientific 89900 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Saponin Sigma S7900 Chemical

Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4
Agilent, Santa Clara, CA		 103680-100
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer
Agilent, Santa Clara, CA		 High-throughput respirometry instrument
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent, Santa Clara, CA
Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Small scissors Fisher Scientific 08-951-20
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypan Blue solution Merck 72-57-1 Chemical
Trypsin 0.25% EDTA Fisher Scientific 25200056
Two thin-edged forceps Fisher Scientific 12-000-122
Uridine stock (500x) Sigma U3750 Chemical

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References

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
  2. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
  3. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  4. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  5. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 1-23 (2016).
  6. Boushel, R., Gnaiger, E., Schjerling, P., Skovbro, M., Kraunsøe, R., Dela, F. Patients with type 2 diabetes have normal mitochondrial function in skeletal muscle. Diabetologia. 50 (4), 790-796 (2007).
  7. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  8. Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biology. 13, 1-11 (2015).
  9. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and Respiratory control. An introduction to OXPHOS analysis. Bioenergetics communications. 5th ed. , Steiger Druck GmbH. Axams, Austria. (2020).
  10. Jackson, C. B., et al. Mutations in SDHD lead to autosomal recessive encephalomyopathy and isolated mitochondrial complex II deficiency. Journal of Medical Genetics. 51 (3), 170-175 (2014).
  11. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, Clifton, N.J. 25-58 (2012).
  12. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  13. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and oxphos protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, Clifton, N.J. 31-70 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  15. García-Roche, M., Casal, A., Carriquiry, M., Radi, R., Quijano, C., Cassina, A. Respiratory analysis of coupled mitochondria in cryopreserved liver biopsies. Redox Biology. 17, 207-212 (2018).
  16. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 1-18 (2020).
  17. SUITBrowserWeb. , Available from: http://suitbrowser.oroboros.at/ (2021).
  18. Cell metabolism assay kits. Seahorse assay kits and media. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-lits-reagents-cell-assay-media (2021).
  19. Chance, B., Williams, G. R. A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation. Nature. 176 (4475), 250-254 (1955).
  20. Gnaiger, E., et al. Mitochondrial respiratory states and rates. MitoFit Preprint Arch. , (2019).
  21. Gnaiger, E. O2k-procedures: SOP O2k quality control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Section Page. Oroboros. 03 (18), http://wiki.oroboros.at/index.php/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP 1-21 (2020).
  22. Robinson, B. H., Petrova-Benedict, R., Buncic, J. R., Wallace, D. C. Nonviability of cells with oxidative defects in galactose medium: A screening test for affected patient fibroblasts. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 48 (2), 122-126 (1992).
  23. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  24. Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  25. Fasching, M., Gnaiger, E. O2k quality control 2: Instrumental oxygen background correction and accuracy of oxygen flux. Mitochondrial Physiology Network. 14 (06), 1-14 (2016).
  26. Gnaiger, E., Lassnig, B., Kuznetsov, A., Rieger, G., Margreiter, R. Excess capacity of cytochrome c oxidase. Journal of Experimental Biology. 1139, 1129-1139 (1998).
  27. Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  28. Fontana-Ayoub,, Fasching, M., Gnaiger, E. Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondrial Physiology Network. 02 (17), 1-9 (2014).
  29. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  30. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 163-181 (2014).
  31. Nászai, A., Terhes, E., Kaszaki, J., Boros, M., Juhász, L. Ca(2+)N it be measured? Detection of extramitochondrial calcium movement with high-resolution fluorespirometry. Scientific Reports. 9 (1), 1-13 (2019).
  32. Pajak, B., et al. 2-Deoxy-d-Glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 234 (2019).
  33. Mercier-Letondal, P., Marton, C., Godet, Y., Galaine, J. Validation of a method evaluating T cell metabolic potential in compliance with ICH Q2 (R1). Journal of Translational Medicine. 19 (1), 1-15 (2021).
  34. Sauerbeck, A., et al. Analysis of regional brain mitochondrial bioenergetics and susceptibility to mitochondrial inhibition utilizing a microplate based system. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 36-43 (2011).
  35. Jackman, M. R., Willis, W. T. Characteristics of mitochondria isolated from type I and type IIb skeletal muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 270 (2), 673-678 (1996).
  36. Ponsot, E., et al. Mitochondrial tissue specificity of substrates utilization in rat cardiac and skeletal muscles. Journal of Cellular Physiology. 203 (3), 479-486 (2005).
  37. Schönfeld, P., Reiser, G. Why does brain metabolism not favor burning of fatty acids to provide energy-Reflections on disadvantages of the use of free fatty acids as fuel for brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (10), 1493-1499 (2013).
  38. Calderon-Dominguez, M., Mir, J. F., Fucho, R., Weber, M., Serra, D., Herrero, L. Fatty acid metabolism and the basis of brown adipose tissue function. Adipocyte. 5 (2), 98-118 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 2014, 1-16 (2014).
  40. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  41. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), 21746 (2011).
  42. Jordá, A., Zaragozá, R., Portolés, M., Báguena-Cervellera, R., Renau-Piqueras, J. Long-term high-protein diet induces biochemical and ultrastructural changes in rat liver mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 265 (2), 241-248 (1988).
  43. Jackson, C. B., Gallati, S., Schaller, A. QPCR-based mitochondrial DNA quantification: Influence of template DNA fragmentation on accuracy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (3), 441-447 (2012).
  44. Hirsch, H. M. Tissue autoxidation inhibitors: II. The presence of inhibitor in intact cells; Assay of liver and hepatoma effect on radio-oxidations. Cancer Research. 16 (11), 1076-1082 (1956).
  45. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), 18317 (2011).
  46. Tanumihardja, E., Slaats, R. H., Van Der Meer, A. D., Passier, R., Olthuis, W., Van Den Berg, A. Measuring both pH and O2 with a single On-Chip sensor in cultures of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to track induced changes in cellular metabolism. ACS Sensors. 6 (1), 267-274 (2021).
  47. Harms, F., Stolker, R. J., Mik, E. Cutaneous respirometry as novel technique to monitor mitochondrial function: A feasibility study in healthy volunteers. PLoS ONE. 11 (7), 159544 (2016).
  48. Levitsky, Y., et al. Micro-respirometry of whole cells and isolated mitochondria. RSC Advances. 9 (57), 33257-33267 (2019).

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