고분해능 호흡계를 사용하여 산화 인산화를 평가하는 것은 미토콘드리아와 세포 에너지 대사의 기능 분석의 필수적인 부분이되었습니다. 여기에서는 챔버 및 마이크로 플레이트 기반 고해상도 호흡계를 사용하여 세포 에너지 대사를 분석하기위한 프로토콜을 제시하고 각 장치의 주요 이점에 대해 논의합니다.
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방법 논문
챔버 및 플레이트 기반 호흡계를 사용하여 세포 및 조직의 생물 에너지를 평가하기위한 고해상도 호흡 측정법
이 논문에서
요약
초록
고분해능 호흡측정법(HRR)을 통해 개별 세포 에너지 상태 분석 및 다양한 기질-언커플러-억제제 적정(SUIT) 프로토콜을 사용하여 호흡기 복합체를 평가하기 위해 산화적 인산화를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 여기에서는 두 개의 고해상도 호흡 측정 장치의 용도가 입증되며, 배양 된 세포, 골격 및 심장 근육 섬유, 뇌 및 간과 같은 연조직의 분석에 적용 할 수있는 프로토콜의 기본 모음이 제시됩니다. 배양된 세포 및 조직을 위한 프로토콜은 표준 호흡 프로토콜을 포괄하는 마이크로플레이트 기반 호흡계를 위한 챔버 기반 호흡계 및 배양된 세포를 위해 제공된다. 비교 목적을 위해, 다수의 호흡기 시스템 결핍을 야기하는 미토콘드리아 번역이 결핍된 CRISPR 조작된 HEK293 세포는 호흡에서 세포 결함을 입증하기 위해 두 장치와 함께 사용된다. 두 호흡계는 연구중인 연구 질문 및 모델에 따라 각각의 기술적 장점과 적합성으로 세포 호흡을 포괄적으로 측정 할 수 있습니다.
서론
미토콘드리아는 에너지의 주요 공급을 충족하고 뉴클레오티드, 지질 및 아미노산의 동화 작용, 철 - 황 클러스터 생물 발생과 같은 필수 세포 생물 에너지 및 대사 과정에 기여하는 구획화 된 소기관이며 통제 된 세포 사멸과 같은 신호 전달에 연루되어 있습니다 1,2,3 . 산화적 인산화를 통한 미토콘드리아 생물에너지학은 세포 내의 거의 모든 세포 과정에 기여하며, 결과적으로, 일차 또는 이차 기원의 미토콘드리아 기능장애는 광범위한 질병 상태 4,5와 연관된다. 미토콘드리아 기능 장애는 구조 또는 미토콘드리아 밀도의 변화뿐만 아니라 호흡기의 질과 조절을 포함합니다6. 이 정성적 요소는 기질 제어, 결합 특성, 번역 후 변형, 크리스타 역학 및 호흡 초복합체 7,8을 포함합니다. 따라서, 세포의 에너지 대사를 평가하기 위한 실험 및 진단 접근법을 위한 미토콘드리아 생물에너지학의 정확한....
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프로토콜
모든 동물 실험은 핀란드 남부의 국가 동물 실험 검토위원회 및 지역 국가 행정 기관에 따라 수행됩니다. 수컷 C57BL/6JOlaHsd 마우스(4-6개월령)를 본 연구에 사용하였다. 인간 세포주의 사용에 대한 동의는 헬싱키 대학의 제도적 윤리위원회로부터 입수하였다.
1. 고해상도 호흡 측정법 : 챔버 기반 호흡계 (cHRR)
참고: 프로토콜의 이 섹션에 있는 실험은 Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k(Table of Materials)를 사용하여 수행되었습니다.
- 산소 센서의 교정
- 2.1 mL의 미토콘드리아 호흡 배지 (MiR05, 표 1, 용해도 계수: 0.92)에서 37°C에서 >45분 동안 호흡계를 사전 실행하고21에 기재된 바와 같이 산소 교정을 수행한다. 기준선 변동이 ± 4pmol/s 이내인 경우 진행하십시오.
참고: 배경 신호의 큰 변동은 센서 멤브레인의 유지 보수가 필요하거나 이전 실험에서 챔버에 남아있는 억제제의 흔적을 나타낼 수 있습니다. 도구 배경 산소 플럭스 보정은 실험
- 2.1 mL의 미토콘드리아 호흡 배지 (MiR05, 표 1, 용해도 계수: 0.92)에서 37°C에서 >45분 동안 호흡계를 사전 실행하고21에 기재된 바와 같이 산소 교정을 수행한다. 기준선 변동이 ± 4pmol/s 이내인 경우 진행하십시오.
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결과
여기서, 우리는 진핵 세포, 비섬유성 조직(예를 들어, 소뇌), 및 섬유성 조직(예를 들어, 골격근)에서 미토콘드리아 생물에너지를 결정하기 위한 프로토콜을 제공한다. 진핵 세포의 경우, 미토콘드리아 번역과 관련된 두 개의 상이한 단백질의 CRISPR 조작된 녹아웃을 갖는 HEK293을 다중 (CRISPR KO1) 및 심각한/완전한 OXPHOS 결핍 (CRISPRKO2)으로 cHRR (도 3A-C) 또는 mHRR (도 3A-D) 중 하나로 측정하였다.
cHRR의 경우, HEK293 세포를 디지토닌-투과화시키고, 표준 프로토콜에 따라 호흡 실험을 수행하고(단계 1.5-1.6) 성공적으로 기록하였다(
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토론
전통적으로 미토콘드리아 생물에너지학은 클락형 산소전극으로 연구되어 왔다. 그러나 해상도와 처리량의 부족은 기술 발전을 보장합니다. 현재까지 O2k (cHRR이라고 함) 및 Seahorse XF96 Flux Analyzer (mHRR이라고 함)는 세포 생물 에너지 분야에서 널리 채택되었습니다. 여기에서는 cHRR 또는 mHRR을 사용하여 미토콘드리아 호흡 평가를 통해 세포 에너지 대사를 분석하기위한 이해할 수있는 프로토콜 모음을 제시하고 각 장치의 주요 이점에 대해 논의하며 실질적인 지침을 제공합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 포유동물 세포, 골격 및 심장 근육과 같은 섬유질(경질) 조직, 뇌 및 간과 같은 비섬유성(soft) 조직을 포괄하며 유사한 유형의 샘플 물질에 적용 가능하다.
두 HRR 방법 모두 여러 OXPHOS 결핍이있는 HEK293으로 예시 된 것처럼 포유류 세포에 대한 비교 가능한 데이터를 생성하지만, 장치의 일반적인 작동 원리 및 기술적 설정은 서로 다른 응용 분.......
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공개 사항
공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 핀란드 아카데미 (C.B.J), Magnus Ehrnroot Foundation (C.B.J) 및 통합 생명 과학 대학원 (R.A.)의 박사 학위 펠로우십의 기금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2 mL Potter-Elvehjem 유리/PTFE 티슈 그라인더/균질화기 | Omni International | 07-358029 | |
| 95% O2, 5% CO2 티 | 슈 그라인딩용 포터 | ||
| ADP | Sigma | A 4386 | |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical |
| Ascorbate | Merck | PHR1279-1G | Chemical, 에탄올 |
| BSA (fatty accid free) | Sigma | A 6003 | 화학 |
| CaCO3 | Sigma | C 4830 | 화학 |
| 사이토크롬 c | Sigma | C 7752 | 화학 |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | 화학 |
| Dithiothreitol | Sigma | D 0632 | 화학, DMSO |
| D-Sucrose | Roth | 4621.1 | Chemical |
| Dulbecco에 용해 s 변형 된 독수리' Fisher | Scientific | 41965-039 | Chemical |
| Dulbecco' s 변형 된 독수리' S 미디엄 (포도당 없음) | Fisher Scientific | A14430-01 | |
| EGTA | Sigma | E 4378 | |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | Chemical |
| Falcon 15ml 원추형 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | AM12500 | Chemical |
| Falcon 50ml 원추형 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | AM12501 | |
| FCCP | Sigma | C 2920 | |
| 포도당 | 시그마 | G7021 | 화학, 에탄올에 용해 |
| 글루타메이트 | 시그마 | G 1626 | 화학 물질 |
| GlutaMax ( 100배) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)Fisher | Scientific | 35050061 | Chemical |
| HEK293 세포 | ATTC | CRL-1573 | |
| 혈구계 | Fisher Scientific | 0267151B | 세포 계수용 기기 |
| Hepes | Sigma | H 7523 | 화학 |
| 이미다졸 | Fluka | 56750 | 화학 |
| KCl | Merck | 1.04936 | 화학 L |
| -카르니틴 | 시그마 | C0283 | 화학 |
| 말레이트 | 시그마 | M 1000 | 화학 |
| MES 수화물 | 시그마 | M8250 | 화학 |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | 화학 |
| Na2ATP | Sigma | A 2383 | 화학 |
| Na2Phosphocreatine | Sigma | P 7936 | 화학 |
| Na-pyruvate ( 100 mM) (100배) | 피셔 사이언티픽 | 11360070 | |
| NEAA ( 비필수 아미노산) 100x | Fisher Scientific | 11140035 | |
| Normal FBS ( 10x) | Fisher Scientific | 10500064 | |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | 고해상도 호흡계 기기 |
| O2k-Titration Set | Oroboros Instruments | 20820-03 | Hamilton syringes for chemical injections |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | Chemical, dissolve in ethanol |
| 팔미토일카르니틴 | 시그마 | P 4509 | 화학 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 피셔 사이언티픽 15140122 | ||
| 피어스 BCA 단백질 분석 키트 | 피셔 사이언티픽 | 23227 | |
| 피루브산 | 시그마 | P 2256 | 화학 RIPA |
| -버퍼 | 피셔 사이언티픽 | 89900 | 케미컬 |
| 로테논 | Sigma | R 8875 | Chemical, 에탄 |
| 올 사포닌 | Sigma | S7900 | Chemical |
Seahorse XF DMEM 분석 중형 팩, pH 7.4 | Agilent, Santa Clara, CA | 103680-100 | |
| Seahorse XFe96 세포외 플럭스 분석기 | Agilent, Santa Clara, CA | 고처리량 호흡 측정 기기 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent, Santa Clara, CA | 분석 플레이트, 카트리지, 화합물을 분석 카트리지로 이동시키기 위한 로딩 가이드 및 캘리브런트 용액이 포함되어 있습니다. | |
| 작은 가위 | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| 아지드 나트륨 | 시그마 | S2002 | 화학 |
| 석시 네이 | 시그마 | S 2378 | 화학 |
| 타우린 | 시그마 | T 8691 | 화학 TMPD |
| 시그마 | T 3134 | 화학 | |
| 트리판 블루 솔루션 | Merck | 72-57-1 | 화학 물질 |
| 트립신 0.25% EDTA | Fisher Scientific | 25200056 | |
| 두 개의 얇은 모서리 겸자 | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| 우리딘 스톡(500x) | Sigma | U3750 | 화학 |
참고문헌
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
- Spi....
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