Summary
يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام مضيف النبات للكشف عن البروتينات اللعابية لنطاط الأوراق والبروتينات الفيروسية النباتية التي تطلقها ناقلات نطاط الأوراق.
Abstract
تنقل ناقلات الحشرات أفقيا العديد من الفيروسات النباتية ذات الأهمية الزراعية. ينتقل أكثر من نصف فيروسات النبات عن طريق الحشرات النصفية التي لها أجزاء فم خارقة مصة. أثناء انتقال الفيروس ، يربط لعاب الحشرات مضيف الفيروس الناقل لأن اللعاب ينقل الفيروسات ، وبروتينات الحشرات ، تحفز أو تثبط الاستجابة المناعية للنباتات من الحشرات إلى مضيفات النباتات. أصبح تحديد البروتينات اللعابية وتحليلها وظيفيا مجالا جديدا للتركيز في مجال البحث في تفاعلات الفيروسات المنقولة بالمفصليات مع المضيف. يوفر هذا البروتوكول نظاما للكشف عن البروتينات في لعاب نطاطات الأوراق باستخدام مضيف النبات. ومن الأمثلة على ذلك ناقل نطاط الأوراق Nephotettix cincticeps المصاب بفيروس قزم الأرز (RDV). يمكن الكشف عن vitellogenin وبروتين القفيصة الخارجي الرئيسي P8 من RDV المتجه بواسطة لعاب N. cincticeps في وقت واحد في نبات الأرز الذي يتغذى عليه N. cincticeps. هذه الطريقة قابلة للتطبيق لاختبار البروتينات اللعابية التي يتم الاحتفاظ بها بشكل عابر في مضيف النبات بعد تغذية الحشرات. ويعتقد أن نظام الكشف هذا سيفيد دراسة تفاعلات فيروس نصف الدم أو النبات النصفي.
Introduction
إن طريقة انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات ذات النواقل والمضيف ، وهي مشكلة أساسية ، هي في حدود العلوم البيولوجية. تنتقل العديد من الفيروسات النباتية ذات الأهمية الزراعية أفقيا عن طريق ناقلات الحشرات1. يتم نقل أكثر من نصف فيروسات النبات بواسطة الحشرات النصفية ، بما في ذلك حشرات المن ، والذباب الأبيض ، ونطاطات الأوراق ، ونطاطات النبات ، والتريبس. هذه الحشرات لها سمات مميزة تمكنها من نقل فيروسات النبات بكفاءة1. لديهم أجزاء فم مص خارقة ويتغذون على النسغ من اللحاء ونسيج الخشب ، ويفرزون لعابهم1،2،3،4. مع تطوير وتحسين التقنيات ، أصبح تحديد المكونات اللعابية وتحليلها وظيفيا محورا جديدا للبحث المكثف. تشمل البروتينات اللعابية المعروفة في اللعاب العديد من الإنزيمات ، مثل البكتينستيراز ، السليولاز ، البيروكسيديز ، الفوسفاتيز القلوي ، أوكسيديز البوليفينول ، والسكراز ، من بين أمور أخرى5،6،7،8،9،10،11،12،13. تشتمل البروتينات الموجودة في اللعاب أيضا على المحفزات التي تؤدي إلى استجابة دفاع المضيف ، وبالتالي تغيير أداء الحشرات ، والمستجيبات التي تثبط دفاع المضيف ، مما يعزز لياقة الحشرات والمكونات التي تحفز الاستجابات المرضية للمضيف14،15،16،17. لذلك ، تعتبر بروتينات اللعاب مواد حيوية للتواصل بين الحشرات والمضيفين. أثناء انتقال الفيروسات ، يحتوي اللعاب الذي تفرزه الغدد اللعابية للحشرات الخبيثة الماصة للثقب أيضا على بروتينات فيروسية. تستخدم المكونات الفيروسية تدفق اللعاب لإطلاقها من الحشرة إلى مضيف النبات. لذلك ، فإن لعاب الحشرات يسد التفاعل الثلاثي التغذية بين الفيروس والناقل والمضيف. يساعد التحقيق في الوظيفة البيولوجية لبروتينات اللعاب التي تفرزها الحشرات الخبيثة على فهم العلاقة بين الفيروس والناقل والمضيف.
بالنسبة للفيروسات الحيوانية ، أفيد أن لعاب البعوض يتوسط في انتقال وإمراض فيروس غرب النيل (WNV) وفيروس حمى الضنك (DENV). يعزز بروتين اللعاب AaSG34 تكاثر فيروس حمى الضنك -2 وانتقاله ، بينما يعزز بروتين اللعاب AaVA-1 انتقال فيروس حمى الضنك وفيروس زيكا (ZIKV) عن طريق تنشيط الالتهام الذاتي18,19. يمكن لبروتين اللعاب D7 من البعوض أن يثبط عدوى فيروس حمى الضنك في المختبر وفي الجسم الحي عن طريق التفاعل المباشر مع فيروسات DENV وبروتين غلاف DENVالمؤتلف 20. في الفيروسات النباتية ، يحفز فيروس تجعد الأوراق الصفراء للطماطم (TYLCV) بروتين لعابية الذبابة البيضاء Bsp9 ، الذي يثبط مناعة مضيف النبات بوساطة WRKY33 ، لزيادة تفضيل وأداء الذباب الأبيض ، مما يؤدي في النهاية إلى زيادة انتقال الفيروسات21. نظرا لأن الدراسات حول الدور الذي تلعبه البروتينات اللعابية الحشرية في المضيفين النباتيين قد تخلفت عن دراسات المضيفين من الحيوانات ، فإن هناك حاجة ماسة إلى نظام مستقر وموثوق للكشف عن البروتينات اللعابية في المضيفين النباتيين.
ينتقل فيروس النبات المعروف باسم فيروس قزم الأرز (RDV) بواسطة نطاط الأوراق Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) بكفاءة عالية وبطريقة إكثارية مستمرة22,23. تم الإبلاغ لأول مرة عن انتقال RDV عن طريق ناقل الحشرات ويسبب مرضا شديدا للأرز في آسيا24,25. الفيريون هو كروي ثنائي السطوح ومزدوج الطبقات ، وتحتوي الطبقة الخارجية على بروتين القفيصة الخارجي P822. فترة انتقال الدورة الدموية ل RDV في N. cincticeps هي 14 يوما26،27،28،29،30. عندما يصل RDV إلى الغدد اللعابية ، يتم إطلاق الفيروسات في تجاويف مخزنة في اللعاب في الغدد اللعابية عبر آلية تشبه الإخراجالخلوي 23. فيتلوجينين (Vg) هو سلائف بروتين الصفار الضرورية لتطور البويضات في الحشراتالأنثوية 31،32،33. تحتوي معظم أنواع الحشرات على نسخة Vg واحدة على الأقل من 6-7 كيلو بايت ، والتي تشفر بروتين سلائف يبلغ حوالي 220 كيلو دالتون. يمكن عادة شق سلائف البروتين في Vg إلى شظايا كبيرة (140 إلى 190 كيلو دالتون) وشظايا صغيرة (<50 كيلو دالتون) قبل دخول المبيض18,19. كشف التحليل البروتيني السابق عن وجود الببتيدات المشتقة من Vg في اللعاب المفرز لنطاط الأوراق Recilia dorsalis ، على الرغم من أن وظيفتها غير معروفة (بيانات غير منشورة). تم الإبلاغ حديثا عن أن Vg ، الذي يفرز عن طريق الفم من نطاطات النبات ، يعمل كمستجيب لإتلاف دفاعات النباتات34. من غير المعروف ما إذا كان يمكن أيضا إطلاق Vg of N. cincticeps إلى مضيف النبات مع تدفق اللعاب ، ومن ثم يمكن أن يلعب دورا في النبات للتداخل مع دفاعات النبات. لمعالجة ما إذا كانت N. cincticeps تستغل البروتينات اللعابية ، مثل Vg ، لتثبيط أو تنشيط دفاعات النبات ، فإن الخطوة الأولى هي تحديد البروتينات التي يتم إطلاقها للنبات أثناء التغذية. من المحتمل أن يكون فهم طريقة تحديد البروتينات اللعابية الموجودة في النبات ضروريا لشرح وظيفة بروتينات اللعاب والتفاعلات بين Hemiptera والنباتات.
في البروتوكول المقدم هنا ، يتم استخدام N. cincticeps كمثال لتوفير طريقة لفحص وجود البروتينات اللعابية في مضيف النبات الذي يتم إدخاله من خلال تغذية الحشرات. يفصل البروتوكول في المقام الأول جمع واكتشاف البروتينات اللعابية وهو مفيد لمزيد من التحقيق في معظم hemipterans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم نشر نطاطات الأوراق البالغة غير الخبيثة في مركز أبحاث الفيروسات المنقولة بالنواقل في جامعة فوجيان للزراعة والغابات ، الصين.
1. تربية الحشرات غير المميتة
- قم بتربية البالغين على شتلات الأرز في قفص مكعب بحجم 40 سم × 35 سم × 20 سم (الطول × العرض × الارتفاع). احتفظ بجانب واحد من القفص مغطى بشبكة مقاومة للحشرات للتهوية.
- احتفظ بالأقفاص مع نطاطات الأوراق في حاضنة تحتوي على وحدة تحكم مدمجة في الرطوبة عند 26 درجة مئوية مع رطوبة نسبية تتراوح بين 60-75٪ تحت فترة ضوئية تبلغ 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات مظلمة.
- استخدم شفاطا لنقل جميع البالغين برفق من قفصهم إلى قفص جديد يحتوي على شتلات الأرز الطازجة كل أسبوع.
- دع أكثر من 200 شخص بالغ يتزاوجون ويضعون البيض في الأرز.
- احتفظ بشتلات الأرز القديمة حتى تظهر الحوريات. قم برفع هذه الحوريات غير الخبيثة الجديدة إلى مرحلة 2-instar.
2. اكتساب الفيروسات وجمع الحشرات الخبيثة
- انقل بعناية الحوريات غير الخبيثة ثنائية النجوم إلى أنبوب مزرعة زجاجي (قطره 2.5 سم وارتفاعه 15 سم) لمدة 1-2 ساعة للتجويع باستخدام الشفاط.
- حرر الحوريات في قفص يحتوي على نبات أرز مصاب ب RDV يزرع في أصيص.
- السماح للحوريات لتتغذى على نبات الأرز المصاب لمدة 2 أيام.
ملاحظة: سقي نبات الأرز بعناية وتجنب غسل الحوريات. يبلغ طول الحوريات ذات النجمين حوالي 1.6-2 مم.
- انقل هذه الحوريات بعناية إلى قفص جديد يحتوي على شتلات أرز طازجة خالية من الفيروسات مع رطوبة نسبية تتراوح بين 60 و 75٪ تحت فترة ضوئية تبلغ 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات مظلمة. اسمح للحوريات بالتغذي على نبات الأرز المصاب لمدة 12 يوما لإكمال فترة انتقال الدورة الدموية ل RDV.
3. جمع البروتينات اللعابية باستخدام قفص التغذية
- قم بإعداد خمسة أقفاص تغذية صغيرة تشبه الأنابيب (قطرها 2.5 سم وارتفاعها 4 سم) حيث يتم تغطية أحد طرفيها بشبكة مقاومة للحشرات.
- احصر 15-20 نطاط أوراق في كل قفص تغذية ، ثم قم بتغطية الطرف الآخر من القفص بسجادة رغوية رقيقة.
- ثبت شتلة أرز واحدة (ارتفاع 5-6 سم) بين نهاية القفص وحصيرة رغوية بأشرطة. تأكد من أن نطاطات الأوراق في قفص التغذية يمكن أن تتغذى على شتلات الأرز المعرضة للداخل من القفص.
- اغمر جذور الشتلات في الماء حتى يبقى نبات الأرز على قيد الحياة. السماح لنطاطات الأوراق لتتغذى عليها لمدة 2 أيام.
- أخرج نطاطات الأوراق من أقفاص التغذية الخاصة بها واجمع شتلات الأرز التي تتغذى عليها. قطع أجزاء الشتلات خارج القفص واستعادة مناطق تغذية الشتلات.
ملاحظة: يمكن تخزين هذه العينة في -80 درجة مئوية لمدة 3 أشهر على الأكثر ، إذا لم يتم استخدامها على الفور للكشف.
4. إعداد الكاشف
- قم بإذابة 15.1 جم من قاعدة تريس ، و 94 جم من الجلايسين ، و 5 جم من SDS في 1 لتر من الماء المعقم لتحضير 5xTris-glycine buffer. قم بتخفيف 200 مل من المخزن المؤقت 5xTris-glycine مع 800 مل من الماء المعقم لتحضير 1xTris-glycine buffer (انظر الجدول 1 لتكوين المخزن المؤقت).
- قم بإذابة 80 جم من كلوريد الصوديوم ، و 30 جم من قاعدة تريس ، و 2 جم من KCl في 1 لتر من الماء المعقم لتحضير محلول ملحي مخزن 10xTris (TBS). الأوتوكلاف الحل على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- قم بإذابة 8 جم من SDS ، و 4 مل من ß-mercaptoethanol ، و 0.02 جم من بروموفينول أزرق ، و 40 مل من الجلسرين في 40 مل من 0.1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8) لتحضير 4x من المخزن المؤقت لعينة البروتين.
- امزج 800 مل من محلول Tris-glycine مع 200 مل من الميثانول لتحضير المخزن المؤقت للنقل.
- أضف 100 مل محلول 10xTBS و 3 مل توين 20 إلى 900 مل ماء معقم لتحضير المخزن المؤقت TBS بمحلول Tween 20 (TBST).
5. النشاف الغربي للكشف عن اللعاب والبروتينات الفيروسية
- طحن 0.1 غرام من عينات الأرز مع النيتروجين السائل حتى يصبح النسيج مسحوق. أضف 200 ميكرولتر من محلول عينة البروتين 4x إلى العينة واغليها لمدة 10 دقائق. أجهزة الطرد المركزي العينات في 12000 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أخرج المادة الطافية وضعها في قارورة جديدة. قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة في هلام SDS-PAGE ، وقم بتشغيلها في مخزن مؤقت Tris-glycine عند 150 فولت لمدة 45-60 دقيقة.
ملاحظة: يمكن التخلص من البقايا بعد الطرد المركزي.
- أخرج المادة الطافية وضعها في قارورة جديدة. قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة في هلام SDS-PAGE ، وقم بتشغيلها في مخزن مؤقت Tris-glycine عند 150 فولت لمدة 45-60 دقيقة.
- ضع غشاء نيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر ومستلزمات شطيرة أخرى في مخزن النقل المؤقت لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: يمكن القيام بهذه الخطوة قبل أن يكمل الجل تشغيله. - شطيرة الجل وانقله لمدة 90-120 دقيقة عند 100 فولت في المخزن المؤقت للنقل.
- خذ الغشاء وضعه في محلول مانع للحليب الجاف الخالي من الدسم بنسبة 7٪ في محلول TBST لمدة 20 دقيقة. أضف الجسم المضاد المحدد ضد RDV P8 أو Vg إلى محلول 7٪ من الحليب الجاف الخالي من الدسم في TBST. احتضان مع الجسم المضاد لتلطيخ الغشاء لمدة 2 ساعة أو بين عشية وضحاها.
- اغسل الغشاء بمحلول TBST ثلاث مرات ، مع غسل 5 دقائق في كل مرة.
- أضف الماعز المضاد للأرانب IgG كجسم مضاد ثانوي إلى 7٪ حليب جاف منزوع الدسم مع TBST. احتضان مع الجسم المضاد لمدة 60-90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الغشاء بمحلول TBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- استخدم مجموعة ECL Western لطريقة التلألؤ الكيميائي. امزج كواشف الكشف 1 و 2 في المجموعة بنسبة 1: 1 في أنبوب. ضع الكاشف المختلط على الغشاء واحتضان اللطخة لمدة 5 دقائق.
- استنزاف الكاشف الزائد والتقاط صورة لونية للصورة الكيميائية. الجمع بينهما لرؤية السلم مع عصابات البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 جميع الخطوات في هذا البروتوكول: تربية الحشرات ، واكتساب الفيروسات ، وجمع البروتينات اللعابية عن طريق تغذية الأرز ، واللطخة الغربية. أظهرت نتائج البقع الغربية أنه لوحظت نطاقات محددة ومتوقعة تبلغ حوالي 220 كيلو دالتون في عينات تغذية الأرز والغدد اللعابية للحشرات على الغشاء المحتضن بالأجسام المضادة ضد Vg. في المقابل ، لم يلاحظ أي شريط في عينة الأرز غير المغذية. تشير النتيجة في الشكل 2 إلى أن Vg تم إطلاقه إلى مضيف النبات باعتباره بروتينا لعابيا. على الغشاء المحتضن بالأجسام المضادة ضد RDV P8 ، لوحظ أيضا شريط محدد ومتوقع يبلغ حوالي 46 كيلو دالتون في عينات الأرز التي تعرضت للتغذية وأجسام أجسام الحشرات الخبيثة. في المقابل، لم يلاحظ أي شريط في عينة الأرز غير المغذية وأجسام نطاطات الأوراق غير المميتة، كما هو موضح في الشكل 3. أثبتت هذه النتيجة أنه يمكن أيضا اكتشاف البروتينات الفيروسية في نباتات التغذية.
الشكل 1: نظرة عامة على خطوات الكشف عن البروتينات اللعابية. تشمل الخطوات تربية الحشرات ، واكتساب الفيروسات ، وجمع البروتينات اللعابية عن طريق تغذية النبات ، والنشاف الغربي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقايسة اللطخة الغربية ل Vg في عينات النبات والحشرات. حارة 1 ، النباتات غير التغذية ؛ الحارة 2 ، نباتات تغذية نطاط الأوراق الخبيثة ؛ حارة 3 ، الغدد اللعابية نطاط الأوراق الخبيثة. لين م ، علامة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقايسة اللطخة الغربية ل P8 في عينات النبات والحشرات. حارة 1 ، النباتات غير التغذية ؛ الحارة 2 ، نباتات تغذية نطاط الأوراق الخبيثة ؛ حارة 3 ، أجسام نطاط الأوراق الخبيثة ؛ الممر 4 ، أجسام نطاط الأوراق غير الخبيثة ؛ م ، علامة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مخزن مؤقت | تكوين | التعليقات / الوصف |
| 5x عازلة تريس جليكاين | 15.1 غ قاعدة تريس 94 غرام جلايسين 5 جم SDS في 1 لتر ماء معقم |
حل الأسهم |
| 1x تريس جليكاين عازلة | 200 مل من 5x عازلة تريس جليكاين 800 مل ماء معقم |
حل العمل ، ل SDS-PAGE |
| 10x محلول ملحي مخزن مؤقتا (TBS) | 80 غ كلوريد الصوديوم 30 جرام قاعدة تريس 2 غرام كيلو كلوريد في 1 لتر ماء معقم |
حل الأسهم |
| TBS مع حل توين 20 (TBST) | 100 مل 10x TBS الحل 3 مل توين 20 900 مل ماء معقم |
حل العمل |
| 4x عازلة عينة البروتين | 8 غرام SDS 4 مل β-ميركابتوإيثانول 0.02 غرام بروموفينول أزرق 40 مل من الجلسرين في 40 مل 0.1 م Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8) |
لاستخراج البروتين |
| نقل المخزن المؤقت | 800 مل عازلة تريس جليكاين 200 مل ميثانول |
لنقل البروتين |
الجدول 1: المخازن المؤقتة والمحاليل والكواشف المستخدمة في الدراسة. يتم سرد تكوين المخازن المؤقتة والحلول ، جنبا إلى جنب مع استخدامها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يلعب اللعاب الذي تفرزه الغدد اللعابية مباشرة للحشرات الماصة للثقب دورا محوريا لأنه يهضم ويزيل السموم من الأنسجة المضيفة والعوامل البيولوجية عبر المملكة في المضيفين1،3،4. العوامل البيولوجية عبر المملكة ، بما في ذلك المستنبطات والمستجيبات والحمض النووي الريبي الصغير ، ضرورية للتواصل بين الحشراتالمضيفة 14،15،16. لذلك ، فإن الكشف عن المزيد من أنواع ووظائف مكونات اللعاب سيعزز فهم العلاقة بين الحشرات والمضيفين. هنا ، تم توفير نظام للكشف عن البروتينات اللعابية في مضيف النبات ، مما سيمكن من إجراء مزيد من التحقيق في وظيفة البروتين اللعابي في العوائل النباتية.
يوفر هذا البروتوكول تقنيات للكشف عن البروتينات اللعابية لنطاطات الأوراق مع أجزاء الفم الماصة للثقب عن طريق جمع نباتات التغذية. تجدر الإشارة إلى بعض النقاط الرائعة للحصول على أفضل النتائج الموثوقة. (1) التحميل الفيروسي في نباتات الأرز المصابة أمر بالغ الأهمية. يؤثر التتر الفيروسي في نباتات الأرز بشكل مباشر على اكتساب الحشرات. عندما تكون مستعمرة الحشرات شديدة الضراوة ، سيزداد احتمال جمع البروتينات الفيروسية في اللعاب في المختبر . لذلك ، سيكون اكتشاف البروتينات الفيروسية المنبعثة من اللعاب إلى مضيف النبات أسهل بكثير. يوصى باختيار النباتات المصابة التي تظهر عليها أعراض كبيرة لتكون بمثابة مصدر للفيروسات. (2) توقيت الكشف. يعتقد أن بعض البروتينات اللعابية عابرة في مضيف النبات لأنها تتعرض للتحلل من قبل مضيف النبات أو مخففة في النبات. يوصى بالكشف الفوري عن نباتات التغذية بعد التغذية لمدة 2 يوم. يفترض أيضا أن وقت الاحتفاظ الأطول سيكون أفضل لبعض البروتينات اللعابية المحددة في النبات. لذلك ، يمكن تحديد توقيت الكشف عن بعض البروتينات اللعابية في مزيد من الدراسات. (3) تأكد من وجود ما يكفي من النسخ المتماثلة. سينخفض عدد الحشرات التي تنجو لأن الحشرات المحصورة في قفص التغذية لها نشاط محدود وقدرة على التغذية. سيساعد استخدام ما يكفي من النسخ المتماثلة على إثراء البروتينات اللعابية. عادة ما تكون ثلاث إلى خمس نسخ متماثلة كافية. إذا كان هناك نسخة واحدة فقط ، فمن الأفضل حصر 15-20 نطاط أوراق لتتغذى على شتلة أرز واحدة.
أظهرت هذه النتائج التمثيلية وجود البروتين الفيروسي P8 في مصنع تغذية نطاطات الأوراق الخبيثة. تم الكشف عن أن الفيروس الممزوج بتدفق اللعاب يتم إطلاقه من الغدد اللعابية. ثم تم إطلاقه من الحشرة إلى مضيف النبات ، مما أدى في النهاية إلى إنهاء الانتقال الأفقي الفيروسي. ومع ذلك ، لا يزال من غير المعروف ما إذا كان Vg يلعب دور المستنبط أو المستجيب في عملية تغذية الحشرات وما إذا كان يحفز أو يثبط الاستجابة المناعية لمضيف النبات أم لا. في السابق ، تم جمع لعاب أكثر من 10000 R. dorsalis عن طريق التغذية الغشائية وتحليلها باستخدام LC-MS / MS (بيانات غير منشورة). تم التحقق من وجود Vg في اللعاب ، على الرغم من أن وظيفته غير معروفة. هنا ، ثبت أن Vg موجود أيضا في لعاب N. cincticeps ويتم إطلاقه حتى في النبات. جنبا إلى جنب مع الدراسات على planthoppers16 ، يفترض أن وجود Vg في لعاب hemipteran عالمي. تشير نتائج جديدة إلى أن Vg من لعاب نطاط النبات هو مستجيب لإتلاف نظام الدفاع النباتي34. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لمعالجة ما إذا كان Vg في معظم لعاب نصفي يعمل كمستجيب. ويعتقد أن هذا البروتوكول يوفر منهجية مستقرة وموثوقة لفحص وجود البروتينات اللعابية التي تفرزها نطاطات الأوراق في النباتات. من المتوقع أن يكون هذا البروتوكول قابلا للتطبيق للكشف عن البروتينات اللعابية لمعظم النصف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31772124 و 31972239) وجامعة فوجيان للزراعة والغابات (Grant KSYLX014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amsterdam. (2003).
- Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Wei, T., Li, Y.
- Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps. Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).
- Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae). Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).
- Miles, P. W. Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds. Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).
- Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).
- Miles, P. W., Peng, Z. Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids. Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).
- Will, T., van Bel, A. Physical and chemical interactions between aphids and plants. Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).
- Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments. Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).
- Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).
- Funk, C. J. Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva. Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant-insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment. Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. , (2018).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant--insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Sun, P., et al. A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy. Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).
- Sri-In, C., et al. A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).
- Conway, M. J., et al. Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection. Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).
- Wang, N., et al. A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).
- Omura, T., Yan, J. Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors. Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).
- Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus. Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).
- Fukushi, T. Further studies on the dwarf disease of rice plant. Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).
- Miyazaki, N., et al. The functional organization of the internal components of rice dwarf virus. Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).
- Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes. Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).
- Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector. Virology Journal. 12, 211 (2015).
- Chen, Q., et al. Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector. Virus Research. 210, 54-61 (2015).
- Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector. Scientific Reports. 7, 38563 (2017).
- Wei, T., et al. The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures. Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).
- Mao, Q., et al. Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development. mBio. 11 (6), 01142 (2020).
- Tufail, M., Takeda, M.
- Sappington, T. W., Raikhel, A. S. Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).
- Ji, R., et al. Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses. New Phytologist. , (2021).
