Summary
Этот протокол демонстрирует, как использовать растение-хозяина для обнаружения белков слюны цикадки и вирусных белков растений, высвобождаемых векторами цикадки.
Abstract
Насекомые-переносчики горизонтально переносят многие вирусы растений, имеющие сельскохозяйственное значение. Более половины вирусов растений передаются полужесткокрылыми насекомыми, имеющими колюще-сосущий ротовой аппарат. Во время передачи вируса слюна насекомого соединяет вирус-вектор-хозяина, потому что вирусы-переносчики слюны и белки насекомых запускают или подавляют иммунный ответ растений от насекомых к растениям-хозяевам. Идентификация и функциональный анализ белков слюны становятся новым направлением в области исследований взаимодействий арбовируса и хозяина. Этот протокол предоставляет систему для обнаружения белков в слюне цикадок с использованием растения-хозяина. В качестве примера можно привести переносчик цикадок Nephotettix cincticeps, зараженный вирусом рисовой карликовости (RDV). Вителлогенин и основной наружный капсидный белок P8 RDV, векторизуемые слюной N. cincticeps, могут быть обнаружены одновременно в рисовом растении, которым питается N. cincticeps. Этот метод применим для тестирования белков слюны, которые временно сохраняются в растении-хозяине после кормления насекомыми. Считается, что эта система обнаружения будет полезна для изучения взаимодействий между полужесткокрылыми и растениями или полужесткокрылыми и растениями.
Introduction
Способ передачи арбовирусов от вектора-хозяина, фундаментальная проблема, находится на переднем крае биологической науки. Многие вирусы растений, имеющие сельскохозяйственное значение, передаются по горизонтали насекомыми-переносчиками1. Более половины вирусов растений являются переносчиками полужесткокрылых насекомых, включая тлю, белокрылку, цикадку, кузнечиков и трипсов. Эти насекомые обладают отличительными особенностями, которые позволяют им эффективно передавать вирусы растений1. Они обладают колюще-сосущим ротовым аппаратом и питаются соком из флоэмы и ксилемы, а также выделяют свою слюну 1,2,3,4. С развитием и совершенствованием методов идентификация и функциональный анализ компонентов слюны становятся новым направлением интенсивных исследований. Известные белки слюны в слюне включают многочисленные ферменты, такие как пектинэстераза, целлюлаза, пероксидаза, щелочная фосфатаза, полифенолоксидаза и сахараза, среди прочего 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Белки в слюне также включают элиситоры, которые запускают защитную реакцию хозяина, тем самым изменяя производительность насекомых, и эффекторы, которые подавляют защиту хозяина, что повышает приспособленность насекомых и компоненты, которые вызывают патологические реакции хозяина14,15,16,17. Таким образом, белки слюны являются жизненно важными материалами для общения между насекомыми и хозяевами. При передаче вирусов слюна, выделяемая слюнными железами колюще-сосущих, вируленосных насекомых, также содержит вирусные белки. Вирусные компоненты используют поток слюны, чтобы выпустить их от насекомого к растению-хозяину. Таким образом, слюна насекомого соединяет тритрофическое взаимодействие вирус-вектор-хозяин. Изучение биологической функции белков слюны, выделяемых вирующими насекомыми, помогает понять взаимосвязь вирус-вектор-хозяин.
Что касается вирусов животных, то, как сообщается, слюна комаров опосредует передачу и патогенность вируса Западного Нила (ВЗН) и вируса денге (DENV). Белок слюны AaSG34 способствует репликации и передаче вируса денге-2, в то время как белок слюны AaVA-1 способствует передаче DENV и вируса Зика (ZIKV), активируя аутофагию18,19. Белок слюны D7 комаров может ингибировать инфекцию DENV in vitro и in vivo посредством прямого взаимодействия с вирионами DENV и рекомбинантным белком оболочки DENV20. В вирусах растений вирус бегомовируса желтой курчавости листьев томатов (TYLCV) индуцирует белокрылку белокрылки слюнный белокрылка Bsp9, который подавляет WRKY33-опосредованный иммунитет растения-хозяина, чтобы увеличить предпочтение и производительность белокрылки, в конечном итоге увеличивая передачу вирусов21. Поскольку исследования роли, которую белки слюны насекомых играют в растениях-хозяевах, отстают от таковых у животных-хозяев, срочно требуется стабильная и надежная система для обнаружения белков слюны в растениях-хозяевах.
Вирус растений, известный как вирус рисовой карликовости (RDV), передается цикадкой Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) с высокой эффективностью и настойчивым размножением22,23. Впервые сообщалось, что RDV передается насекомым-переносчиком и вызывает тяжелое заболевание риса в Азии24,25. Вирион икосаэдрический и двухслойный сферический, а внешний слой содержит белок внешнего капсидаP8 22. Период циркуляционной передачи РДВ при N. cincticeps составляет 14 дней 26,27,28,29,30. Когда RDV достигает слюнных желез, вирионы высвобождаются в слюнные полости в слюнных железах с помощью экзоцитозоподобного механизма23. Вителлогенин (Vg) является предшественником белка желтка, необходимого для развития ооцитов у самок насекомых31,32,33. Большинство видов насекомых имеют, по крайней мере, один транскрипт Vg размером 6-7 кб, который кодирует белок-предшественник примерно 220 кДа. Белковые предшественники Vg обычно могут быть расщеплены на крупные (от 140 до 190 кДа) и мелкие (<50 кДа) фрагменты перед попаданием в яичник18,19. Предыдущий протеомный анализ выявил присутствие пептидов, полученных из Vg, в секретируемой слюне цикадки Recilia dorsalis, хотя их функция неизвестна (неопубликованные данные). Недавно сообщалось, что Vg, который перорально секретируется из кузнечиков, функционирует как эффектор, повреждая защитные силы растений34. Неизвестно, может ли Vg N. cincticeps также высвобождаться в растение-хозяина с потоком слюны, а затем может играть роль в растении, мешая защите растений. Чтобы выяснить, использует ли N. cincticeps белки слюны, такие как Vg, для ингибирования или активации защиты растений, первым шагом является идентификация белков, высвобождаемых растению во время кормления. Понимание метода идентификации белков слюны, присутствующих в растении, потенциально необходимо для объяснения функции белков слюны и взаимодействия между полужесткокрылыми и растениями.
В протоколе, представленном здесь, N. cincticeps используется в качестве примера для обеспечения метода изучения присутствия белков слюны в растении-хозяине, введенном через кормление насекомыми. Протокол в первую очередь детализирует сбор и обнаружение белков слюны и полезен для дальнейшего исследования большинства полужесткокрылых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Невирусоносные взрослые цикадки были размножены в Исследовательском центре трансмиссивных вирусов в Фуцзяньском университете сельского и лесного хозяйства, Китай.
1. Выращивание невирулиферных насекомых
- Выращивайте взрослых особей на рассаде риса в кубической клетке размером 40 см x 35 см x 20 см (длина x ширина x высота). Держите одну сторону клетки закрытой сеткой от насекомых для вентиляции.
- Клетки с цикадками хранят в инкубаторе, содержащем встроенный регулятор влажности, при температуре 26 °C с относительной влажностью 60-75% при фотопериоде 16 часов света и 8 часов темноты.
- Используйте аспиратор, чтобы аккуратно перенести всех взрослых особей из клетки в новую клетку, в которой каждую неделю растут свежие саженцы риса.
- Пусть более 200 взрослых спариваются и откладывают яйца в рис.
- Сохраните старые рассады риса, чтобы нимфы не появились. Вырастите этих новых невирулиферных нимф до стадии 2-летнего возраста.
2. Заражение вирусом и сбор вируленосных насекомых
- Осторожно перенесите невирулиферных нимф 2-летнего возраста в стеклянную культуральную трубку (диаметром 2,5 см и высотой 15 см) на 1-2 часа для голодания с помощью аспиратора.
- Отпустите нимф в клетку, в которой находится зараженное RDV рисовое растение, выращенное в горшке.
- Дайте нимфам питаться зараженным рисовым растением в течение 2 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно поливайте рисовое растение и избегайте смывания нимф. Нимфы 2-летнего возраста имеют длину примерно 1,6-2 мм.
- Осторожно перенесите этих нимф в новую клетку, в которой содержатся свежие безвирусные проростки риса с относительной влажностью воздуха 60-75% при фотопериоде 16 ч света и 8 ч темноты. Позвольте нимфам питаться зараженным рисовым растением в течение 12 дней, чтобы завершить период циркуляционной передачи RDV.
3. Сбор белков слюны с помощью клетки для кормления
- Подготовьте пять небольших трубчатых кормовых клеток (2,5 см в диаметре и 4 см в высоту), один конец которых накрыт сеткой, защищающей от насекомых.
- В каждой кормовой клетке разместите по 15-20 цикадок, а затем накройте другой конец клетки тонким поролоновым ковриком.
- Закрепите один саженец риса (высотой 5-6 см) между концом клетки и поролоновым ковриком с помощью лент. Убедитесь, что цикадки в кормовой клетке могут питаться проростками риса, находящимися внутри клетки.
- Погрузите корни саженца в воду, чтобы рисовое растение осталось живым. Дайте цикадкам питаться ими в течение 2 дней.
- Выньте цикадок из кормовых клеток и соберите рассаду риса, которой они питались. Вырежьте части рассады за пределы клетки и восстановите места питания рассады.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот образец можно хранить при температуре -80 °C не более 3 месяцев, если он не используется мгновенно для обнаружения.
4. Приготовление реагентов
- Растворите 15,1 г трис-основания, 94 г глицина и 5 г SDS в 1 л стерильной воды для приготовления 5xTris-глицинового буфера. Разбавьте 200 мл буфера 5xTris-глицина 800 мл стерильной воды для приготовления буфера 1xTris-глицина (см. Таблицу 1 для буферного состава).
- Растворите 80 г NaCl, 30 г трис-основания и 2 г KCl в 1 л стерильной воды для приготовления 10xTris-буферного физиологического раствора (TBS). Автоклавируют раствор при 121 °С в течение 15 мин.
- Растворите 8 г SDS, 4 мл ß-меркаптоэтанола, 0,02 г бромфенольного синего и 40 мл глицерина в 40 мл 0,1 М трис-HCl (рН 6,8) для приготовления 4-кратного буфера для образца белка.
- Смешайте 800 мл трис-глицинового буфера с 200 мл метанола для приготовления трансферного буфера.
- Добавьте 100 мл раствора 10xTBS и 3 мл Tween 20–900 мл стерильной воды, чтобы приготовить буфер TBS с раствором Tween 20 (TBST).
5. Вестерн-блоттинг для обнаружения слюны и вирусных белков
- Измельчите 0,1 г образцов риса с жидким азотом до тех пор, пока ткань не превратится в порошок. Добавьте 200 мкл 4-кратного буфера для образца белка и прокипятите его в течение 10 минут. Центрифугируют образцы при 12 000 x g в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Извлеките надосадочную жидкость и поместите ее в новый флакон. Загрузите 10 мкл образца в гель SDS-PAGE и запустите его в трис-глициновом буфере при 150 В в течение 45-60 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остаток после центрифугирования можно выбросить.
- Извлеките надосадочную жидкость и поместите ее в новый флакон. Загрузите 10 мкл образца в гель SDS-PAGE и запустите его в трис-глициновом буфере при 150 В в течение 45-60 мин.
- Поместите нитроцеллюлозную мембрану 0,45 мкм и другие сэндвич-материалы в буфер для переноса на 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно выполнить до того, как гель завершит свое действие. - Сэндвич гель и переносите его в течение 90-120 мин при 100 В в буфер переноса.
- Возьмите мембрану и поместите ее в 7% обезжиренный сухой молочный раствор в растворе TBST на 20 мин. Добавьте специфическое антитело против RDV P8 или Vg в 7% раствор обезжиренного сухого молока в TBST. Инкубировать с антителом для окрашивания мембраны в течение 2 ч или на ночь.
- Промойте мембрану раствором TBST три раза, каждый раз промывая по 5 минут.
- Добавьте козий антикроличий IgG в качестве вторичного антитела к 7% обезжиренному сухому молоку с TBST. Инкубировать с антителом в течение 60-90 мин при комнатной температуре.
- Промойте мембрану раствором TBST три раза в течение 5 минут каждый раз.
- Используйте набор ECL Western для хемилюминесцентного метода. Смешайте реагенты 1 и 2 в наборе в соотношении 1:1 в пробирке. Нанесите смешанный реагент на мембрану и инкубируйте блоттинг в течение 5 минут.
- Слейте излишки реагента и сделайте колориметрический снимок хемилюминесцентного снимка. Объедините их, чтобы увидеть лестницу с белковыми полосами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показаны все этапы этого протокола: выращивание насекомых, приобретение вируса, сбор белков слюны посредством кормления рисом и вестерн-блоттинг. Результаты вестерн-блоттинга показали, что специфические и ожидаемые полосы примерно 220 кДа наблюдались в образцах кормового риса и слюнных желез насекомых на мембране, инкубированной с антителами против Vg. Напротив, в образце риса, не подкармливаемом, полосы не наблюдалось. Результат на рисунке 2 указывает на то, что Vg был высвобожден к растению-хозяину в виде белка слюны. На мембране, инкубированной с антителами против RDV P8, специфическая и ожидаемая полоса приблизительно 46 кДа также наблюдалась в образцах риса, которые были подвергнуты кормлению, и телах вирулентных тел насекомых. Напротив, в образце риса, не питавшегося, и в невирулентных телах цикадок полос не наблюдалось, как показано на рисунке 3. Этот результат доказал, что вирусные белки также могут быть обнаружены в питающихся растениях.
Рисунок 1: Обзор этапов обнаружения белков слюны. Этапы включают выращивание насекомых, приобретение вирусов, сбор белков слюны с помощью подкормки растений и вестерн-блоттинг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Вестерн-блоттинг Vg в образцах растений и насекомых. Переулок 1, неподкармливающие растения; Полоса 2, вирулиплодные растения, питающиеся цикадкой; Полоса 3, вируленосные слюнные железы цикадки; Переулок М, маркер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Вестерн-блоттинг P8 в образцах растений и насекомых. Переулок 1, неподкармливающие растения; Полоса 2, вирулиплодные растения, питающиеся цикадкой; Полоса 3, вируленосные тела цикадки; Полоса 4, невирулиферные тела цикадки; М, маркер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Буфер | Состав | Комментарии/Описание |
| 5x трис-глициновый буфер | 15,1 г Трис-основа 94 г глицина 5 г SDS в 1 л стерильной воды |
Стоковое решение |
| 1x трис-глициновый буфер | 200 мл 5x трис-глицинового буфера 800 мл стерильной воды |
Рабочее решение для SDS-PAGE |
| 10-кратный буфер с трис-буфером (TBS) | 80 г NaCl 30 г основы Tris 2 г KCl в 1 л стерильной воды |
Стоковое решение |
| TBS с решением Tween 20 (TBST) | 100 мл раствора 10x TBS 3 мл Твин 20 900 мл стерильной воды |
Решение для работы |
| 4-кратный буфер для образцов белка | 8 г паспорта безопасности 4 мл β-меркаптоэтанол 0,02 г бромфенола синего 40 мл глицерина в 40 мл 0,1 М трис-HCl (рН 6,8) |
Для экстракции белка |
| Буфер передачи | 800 мл трис-глицинового буфера 200 мл метанола |
Для пересадки белка |
Таблица 1: Буферы, растворы и реагенты, использованные в исследовании. Перечислены состав буферов и растворов, а также их использование.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Слюна, непосредственно выделяемая слюнными железами колюще-сосущих, играет ключевую роль, поскольку она предварительно переваривает и детоксифицирует ткани хозяина и межцарственные биологические факторы переносчиков в хозяев 1,3,4. Биологические факторы между царствами, включая элиситоры, эффекторы и малую РНК, имеют решающее значение для коммуникации между насекомым и хозяином14,15,16. Таким образом, раскрытие большего количества разновидностей и функций компонентов слюны будет способствовать пониманию отношений между насекомыми и хозяевами. Здесь была предоставлена система обнаружения белков слюны в растении-хозяине, которая позволит продолжить исследование функции белка слюны в растениях-хозяевах.
Этот протокол предоставляет методы обнаружения белков слюны цикадок с колюще-сосущим ротовым аппаратом путем сбора кормовых растений. Для получения наилучших и надежных результатов следует отметить некоторые примечательные моменты. (1) Вирусная нагрузка в зараженных растениях риса имеет решающее значение. Титры вируса в растениях риса напрямую влияют на приобретение насекомых. Когда колония насекомых высоковирулентная, вероятность сбора вирусных белков в слюне in vitro будет увеличена. Поэтому вирусные белки, высвобождаемые из слюны к растению-хозяину, будет намного легче обнаружить. Рекомендуется выбирать зараженные растения, которые проявляют значительные симптомы, чтобы они служили источником вирусов. (2) Время обнаружения. Считается, что некоторые белки слюны являются преходящими в растении-хозяине, потому что они подвергаются деградации растением-хозяином или разбавляются в растении. Рекомендуется мгновенное обнаружение питающихся растений после 2-дневного кормления. Также предполагается, что более длительное время удержания было бы лучше для некоторых специфических белков слюны в растении. Таким образом, время обнаружения некоторых белков слюны может быть определено в дальнейших исследованиях. (3) Убедитесь, что имеется достаточное количество реплик. Количество выживших насекомых уменьшится, потому что насекомые, находящиеся в клетке для кормления, имеют ограниченную активность и способность питаться. Использование достаточного количества репликатов поможет обогатить белки слюны. Обычно достаточно трех-пяти повторений. Если есть только одна реплика, лучше будет ограничиться 15-20 цикадками, чтобы питаться одним саженцем риса.
Эти репрезентативные результаты показали наличие вирусного белка P8 в кормовом растении вирулиферных цикадок. Было выявлено, что вирус, смешанный с потоком слюны, выделяется из слюнных желез. Затем он был высвобожден от насекомого к растению-хозяину, что в конечном итоге завершило вирусную горизонтальную передачу. Однако до сих пор неизвестно, играет ли Vg роль элиситора или эффектора в процессе питания насекомых и запускает или подавляет иммунный ответ растения-хозяина. Ранее слюна более 10 000 R. dorsalis была собрана с помощью мембранного питания и проанализирована с использованием ЖХ-МС / МС (неопубликованные данные). Наличие Vg в слюне было подтверждено, хотя его функция неизвестна. Здесь было доказано, что Vg также существует в слюне N. cincticeps и даже высвобождается в растение. В сочетании с исследованиями на кузнечиках16 предполагается, что присутствие Vg в слюне полужесткокрылых является универсальным. Новое открытие сообщает, что Vg слюны кузнечика является эффектором, повреждающим систему защиты растений34. Необходимы дополнительные исследования, чтобы выяснить, функционирует ли Vg в слюне большинства полужесткокрылых в качестве эффектора. Считается, что этот протокол обеспечивает стабильную и надежную методологию для изучения присутствия белков слюны, секретируемых цикадками в растениях. Ожидается, что этот протокол будет применим для обнаружения белков слюны большинства полужесткокрылых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (31772124 и 31972239) и Фуцзяньского университета сельского и лесного хозяйства (грант KSYLX014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amsterdam. (2003).
- Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Wei, T., Li, Y.
- Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps. Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).
- Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae). Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).
- Miles, P. W. Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds. Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).
- Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).
- Miles, P. W., Peng, Z. Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids. Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).
- Will, T., van Bel, A. Physical and chemical interactions between aphids and plants. Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).
- Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments. Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).
- Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).
- Funk, C. J. Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva. Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant-insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment. Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. , (2018).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant--insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Sun, P., et al. A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy. Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).
- Sri-In, C., et al. A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).
- Conway, M. J., et al. Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection. Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).
- Wang, N., et al. A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).
- Omura, T., Yan, J. Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors. Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).
- Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus. Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).
- Fukushi, T. Further studies on the dwarf disease of rice plant. Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).
- Miyazaki, N., et al. The functional organization of the internal components of rice dwarf virus. Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).
- Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes. Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).
- Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector. Virology Journal. 12, 211 (2015).
- Chen, Q., et al. Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector. Virus Research. 210, 54-61 (2015).
- Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector. Scientific Reports. 7, 38563 (2017).
- Wei, T., et al. The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures. Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).
- Mao, Q., et al. Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development. mBio. 11 (6), 01142 (2020).
- Tufail, M., Takeda, M.
- Sappington, T. W., Raikhel, A. S. Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).
- Ji, R., et al. Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses. New Phytologist. , (2021).
