Summary
Detta protokoll visar hur man använder växtvärden för att detektera salivproteiner från bladhoppare och växtvirusproteiner som frigörs av bladhopparvektorer.
Abstract
Insektsvektorer överför horisontellt många växtvirus av jordbruksbetydelse. Mer än hälften av växtvirus överförs av hemipteraninsekter som har piercing-sugande mundelar. Under virusöverföring överbryggar insektsaliven virusvektorvärden eftersom salivvektorerna virus och insektsproteinerna utlöser eller undertrycker immunsvaret hos växter från insekter till växtvärdar. Identifiering och funktionella analyser av salivproteiner blir ett nytt fokusområde inom forskningsområdet arbovirus-värdinteraktioner. Detta protokoll tillhandahåller ett system för att detektera proteiner i saliv av bladhoppare med hjälp av växtvärden. Bladhoppvektorn Nephotettix cincticeps infekterad med risdvärgvirus (RDV) fungerar som ett exempel. Vitellogenin och det stora yttre kapsidproteinet P8 av RDV som vektoriseras av saliven av N. cincticeps kan detekteras samtidigt i risplantan som N. cincticeps matar på . Denna metod är tillämplig för att testa salivproteinerna som tillfälligt hålls kvar i växtvärden efter insektsmatning. Man tror att detta detekteringssystem kommer att gynna studien av hemipteran-virus-växt eller hemipteran-växtinteraktioner.
Introduction
Vektor-värdöverföringsläget för arbovirus, ett grundläggande problem, ligger vid gränsen för biologisk vetenskap. Många växtvirus av jordbruksbetydelse överförs horisontellt av insektsvektorer1. Mer än hälften av växtvirus vektoriseras av hemipteraninsekter, inklusive bladlöss, vitflugor, bladhoppare, växthoppare och thrips. Dessa insekter har distinkta egenskaper som gör det möjligt för dem att effektivt överföra växtvirus1. De har piercing-sugande munstycken och matar på saften från floem och xylem och utsöndrar sin saliv 1,2,3,4. Med utveckling och förbättring av tekniker blir identifiering och funktionella analyser av salivkomponenter ett nytt fokus för intensiv forskning. De kända salivproteinerna i saliv inkluderar många enzymer, såsom pektinesteras, cellulas, peroxidas, alkaliskt fosfatas, polyfenoloxidas och sukras, bland annat 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Proteinerna i saliv inkluderar också elicitorer som utlöser värdförsvarssvaret, vilket förändrar insekternas prestanda och effektorer som undertrycker värdförsvaret, vilket förbättrar insektskondition och komponenter som inducerar värdpatologiska svar14,15,16,17. Därför är salivproteiner viktiga material för kommunikation mellan insekter och värdar. Under överföringen av virus innehåller salivet som utsöndras av spytkörtlarna hos piercing-sugande viruliferösa insekter också virala proteiner. Virala komponenter utnyttjar salivflödet för att frigöra dem från insekten till växtvärden. Därför överbryggar insektsaliven virus-vektor-värdens tritrofiska interaktion. Att undersöka den biologiska funktionen hos salivproteiner som utsöndras av viruliferösa insekter hjälper till att förstå förhållandet mellan virus-vektor-värd.
För djurvirus rapporteras att saliv från myggor förmedlar överföring och patogenicitet av West Nile-virus (WNV) och Dengue-virus (DENV). Salivproteinet AaSG34 främjar replikation och överföring av dengue-2-virus, medan salivproteinet AaVA-1 främjar överföring av DENV- och Zika-virus (ZIKV) genom att aktivera autofagi18,19. Salivproteinet D7 från myggor kan hämma DENV-infektion in vitro och in vivo via direkt interaktion med DENV-virionerna och rekombinant DENV-höljeprotein20. I växtvirus inducerar begomovirus tomat yellow leaf curl virus (TYLCV) whitefly salivproteinet Bsp9, som undertrycker WRKY33-medierad immunitet hos växtvärden, för att öka preferensen och prestandan hos vitflugor, vilket så småningom ökar överföringen av virus21. Eftersom studier av den roll som insektssalivproteiner spelar i växtvärdar har släpat efter djurvärdarnas, krävs ett stabilt och pålitligt system för att detektera salivproteinerna i växtvärdar.
Det växtvirus som kallas risdvärgvirus (RDV) överförs av bladhopparen Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) med hög effektivitet och på ett ihållande förökningssätt22,23. RDV rapporterades först överföras av en insektsvektor och orsakar en allvarlig sjukdom av ris i Asien24,25. Virionen är ikosaedrisk och dubbelskiktad sfärisk, och det yttre skiktet innehåller P8 yttre kapsidprotein22. Den cirkulerande överföringsperioden för RDV i N. cincticeps är 14 dagar 26,27,28,29,30. När RDV anländer till spottkörtlarna släpps virioner ut i salivlagrade håligheter i spottkörtlarna via en exocytosliknande mekanism23. Vitellogenin (Vg) är den äggulaproteinprekursor som är väsentlig för äggcellsutveckling hos kvinnliga insekter31,32,33. De flesta insektsarter har minst ett Vg-transkript på 6-7 kb, vilket kodar för ett prekursorprotein på cirka 220 kDa. Proteinprekursorerna till Vg kan vanligtvis klyvas i stora (140 till 190 kDa) och små (<50 kDa) fragment innan de kommer in i äggstocken18,19. Tidigare proteomisk analys avslöjade närvaron av peptiderna härledda från Vg i den utsöndrade saliven från bladhopparen Recilia dorsalis, även om deras funktion är okänd (opublicerade data). Det rapporteras nyligen att Vg, som utsöndras oralt från växthoppare, fungerar som en effektor för att skada växternas försvar34. Det är okänt om Vg av N. cincticeps också kan släppas till växtvärden med salivflöde och sedan kan spela en roll i växten för att störa växtförsvaret. För att ta itu med huruvida N. cincticeps utnyttjar salivproteiner, såsom Vg, för att hämma eller aktivera växtförsvar, är det första steget att identifiera proteiner som frigörs till växten under utfodring. Att förstå metoden för att identifiera salivproteinerna som finns i växten är potentiellt avgörande för att förklara funktionen av salivproteiner och interaktionerna mellan Hemiptera och växter.
I protokollet som presenteras här används N. cincticeps som ett exempel för att tillhandahålla en metod för att undersöka närvaron av salivproteiner i växtvärden som introduceras genom insektsfoder. Protokollet beskriver främst insamling och detektion av salivproteiner och är till hjälp för vidare undersökning på de flesta hemipteraner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De icke-viruliferösa vuxna bladhopparna förökades i Vector-borne Virus Research Center i Fujian Agriculture and Forestry University, Kina.
1. Icke-viruliferös insektsuppfödning
- Föd upp de vuxna på risplantor i en kubbur som är 40 cm x 35 cm x 20 cm (längd x bredd x höjd). Håll ena sidan av buret täckt med ett insektssäkert nät för ventilation.
- Förvara burarna med lövhoppare i en inkubator som innehåller en inbyggd fuktighetsregulator vid 26 °C med en relativ luftfuktighet på 60-75% under en fotoperiod på 16 h ljus och 8 h mörk.
- Använd en sugare för att försiktigt överföra alla vuxna från buren till en ny bur som innehåller färska risplantor varje vecka.
- Låt mer än 200 vuxna para sig och lägga ägg i riset.
- Behåll de gamla risplantorna för att nymferna ska dyka upp. Rear dessa nya nonviruliferous nymfers till 2-instar scenen.
2. Virusförvärv och insamling av viruliferösa insekter
- Överför försiktigt de 2-stjärniga icke-viruliferösa nymferna till ett glasodlingsrör (2,5 cm i diameter och 15 cm högt) i 1-2 timmar för svält med hjälp av aspiratorn.
- Släpp nymferna till en bur som innehåller en RDV-infekterad risplanta odlad i en kruka.
- Låt nymferna mata på den infekterade risplantan i 2 dagar.
OBS: Vattna försiktigt risplantan och undvik att tvätta bort nymferna. De 2-stjärniga nymferna är ungefär 1,6-2 mm långa.
- Överför försiktigt dessa nymfer till en ny bur som innehåller färska virusfria risplantor med en relativ fuktighet på 60-75% under en fotoperiod på 16 h ljus och 8 h mörk. Låt nymferna mata på den infekterade risplantan i 12 dagar för att slutföra den cirkulerande överföringsperioden för RDV.
3. Insamling av salivproteiner med hjälp av en matningsbur
- Förbered fem små rörliknande matningsburar (2,5 cm i diameter och 4 cm höga) där ena änden är täckt med insektssäkert nät.
- Begränsa 15-20 bladhoppare i varje matningsbur och täck sedan den andra änden av buret med en tunn skummatta.
- Fixa en risplanta (5-6 cm hög) mellan slutet av buret och en skummatta med band. Se till att bladhopparna i matningsburet kan mata på risplantorna som utsätts för burets inre.
- Sänk ner plantans rötter i vatten så att risplantan förblir levande. Låt bladhopparna mata på dem i 2 dagar.
- Ta bort bladhopparna från sina matningsburar och samla risplantorna som de matade på. Skär delarna av plantor utanför buret och återställ utfodringsregionerna av plantor.
OBS: Detta prov kan förvaras vid -80 ° C i högst 3 månader, om det inte omedelbart används för detektion.
4. Beredning av reagens
- Lös 15,1 g Tris-bas, 94 g glycin och 5 g SDS i 1 liter sterilt vatten för att förbereda 5xTris-glycinbuffert. Späd 200 ml 5xTris-glycinbuffert med 800 ml sterilt vatten för att förbereda 1xTris-glycinbuffert (se tabell 1 för buffertsammansättning).
- Lös 80 g NaCl, 30 g Tris-bas och 2 g KCl i 1 liter sterilt vatten för att förbereda 10xTris-buffrad saltlösning (TBS) buffert. Autoklavera lösningen vid 121 °C i 15 min.
- Lös 8 g SDS, 4 ml ß-merkaptoetanol, 0,02 g bromfenolblått och 40 ml glycerol i 40 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) för att bereda 4x proteinprovbuffert.
- Blanda 800 ml Tris-glycinbuffert med 200 ml metanol för att förbereda överföringsbufferten.
- Tillsätt 100 ml 10xTBS-lösning och 3 ml interpolering 20 till 900 ml sterilt vatten för att bereda TBS-bufferten med TBST-lösning (Tween 20).
5. Västerländsk blotting för att upptäcka saliv och virala proteiner
- Mal 0,1 g av risproverna med flytande kväve tills vävnaden blir ett pulver. Tillsätt 200 μL 4x proteinprovbuffert till provet och koka det i 10 minuter. Centrifugera proverna vid 12 000 x g i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten och placera den i en ny injektionsflaska. Fyll 10 μL av provet i en SDS-PAGE-gel och kör det i Tris-glycinbuffert vid 150 V i 45-60 minuter.
OBS: Återstoden efter centrifugering kan kasseras.
- Ta bort supernatanten och placera den i en ny injektionsflaska. Fyll 10 μL av provet i en SDS-PAGE-gel och kör det i Tris-glycinbuffert vid 150 V i 45-60 minuter.
- Lägg ett 0,45 μm nitrocellulosamembran och andra smörgåstillbehör i överföringsbufferten i 30 minuter.
OBS: Detta steg kan göras innan gelén har avslutat sin körning. - Smörj gelen och överför den i 90-120 min vid 100 V i överföringsbufferten.
- Ta membranet och placera det i 7% fettfri torrmjölksblockerande lösning i TBST-lösning i 20 minuter. Tillsätt den specifika antikroppen mot RDV P8 eller Vg till en 7% lösning av fettfri torrmjölk i TBST. Inkubera med antikroppen för färgning av membranet i 2 timmar eller över natten.
- Tvätta membranet med TBST-lösning tre gånger, med 5 min tvätt varje gång.
- Tillsätt getantikanin IgG som en sekundär antikropp till 7% fettfri torrmjölk med TBST. Inkubera med antikroppen i 60-90 min vid rumstemperatur.
- Tvätta membranet med TBST-lösning tre gånger i 5 minuter varje gång.
- Använd ECL Western-satsen för kemiluminescerande metod. Blanda detektionsreagens 1 och 2 i satsen i förhållandet 1: 1 i ett rör. Sätt det blandade reagenset på membranet och inkubera fläcken i 5 minuter.
- Töm överskottsreagenset och ta en kolorimetrisk bild av den kemiluminescerande bilden. Kombinera dem för att se stegen med proteinband.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerar alla steg i detta protokoll: insektsuppfödning, virusförvärv, insamling av salivproteiner via rismatning och western blot. Resultaten från western blots visade att specifika och förväntade band på cirka 220 kDa observerades i proverna för utfodring av ris och spottkörtlar av insekter på membranet inkuberade med antikroppar mot Vg. Däremot observerades inget band i det icke-matande risprovet. Resultatet i figur 2 indikerar att Vg släpptes till växtvärden som ett salivprotein. På membranet inkuberat med antikroppar mot RDV P8 observerades också ett specifikt och förväntat band på cirka 46 kDa i proverna från ris som hade utsatts för utfodring och kropparna av viruliferösa insektskroppar. Däremot observerades inget band i det icke-matande risprovet och de icke-viruliferösa bladhopparkropparna, som visas i figur 3. Detta resultat visade att virusproteinerna också kunde detekteras i utfodringsanläggningarna.
Figur 1: Översikt över stegen i detektion av salivproteiner. Stegen inkluderar insektsuppfödning, virusförvärv, salivproteininsamling via växtfoder och västerländsk blotting. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Western blot-analys av Vg i växt- och insektsprover. Bana 1, växter som inte föder. Lane 2, viruliferösa bladhopparmatande växter; Lane 3, viruliferous leafhopper spottkörtlar; Lane M, markör. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Western blot-analys av P8 i växt- och insektsprover. Bana 1, växter som inte föder. Lane 2, viruliferösa bladhopparmatande växter; Lane 3, viruliferösa lövhopperkroppar; Lane 4, icke-viruliferösa lövhopparkroppar; M, markör. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Buffert | Sammansättning | Kommentarer/Beskrivning |
| 5x Tris-glycinbuffert | 15,1 g Tris bas 94 g glycin 5 g SDS i 1 liter sterilt vatten |
Stamlösning |
| 1x Tris-glycinbuffert | 200 ml 5x Tris-glycinbuffert 800 ml sterilt vatten |
Arbetslösning, för SDS-PAGE |
| 10x Tris-buffrad saltlösning (TBS) buffert | 80 g NaCl 30 g Tris bas 2 g KCl i 1 liter sterilt vatten |
Stamlösning |
| TBS med TBST-lösning (Tween 20) | 100 ml 10x TBS-lösning 3 ml interpolering 20 900 ml sterilt vatten |
Arbetslösning |
| 4x proteinprovbuffert | 8 g SDS 4 ml β-merkaptoetanol 0.02 g bromfenolblått 40 ml glycerol i 40 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) |
För proteinutvinning |
| Överför buffert | 800 ml Tris-glycinbuffert 200 ml metanol |
För proteinöverföring |
Tabell 1: Buffertar, lösningar och reagenser som använts i studien. Buffertarnas sammansättning och lösningarna, tillsammans med deras användning, listas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Saliven som utsöndras direkt av spottkörtlarna hos de piercing-sugande insekterna spelar en avgörande roll eftersom den försmälter och avgiftar värdvävnaderna och vektorernas biologiska faktorer över riket till värdarna 1,3,4. De biologiska faktorerna mellan riket, inklusive elicitorer, effektorer och små RNA, är kritiska för insekt-värdkommunikation14,15,16. Därför kommer upptäckten av fler sorter och funktioner av salivkomponenter att främja förståelsen av förhållandet mellan insekter och värdar. Här tillhandahölls ett detektionssystem för salivproteiner i växtvärden, vilket möjliggör ytterligare undersökning av salivproteinets funktion hos växtvärdar.
Detta protokoll tillhandahåller tekniker för att detektera salivproteinerna hos bladhoppare med piercing-sugande munstycken genom att samla utfodringsväxterna. Några anmärkningsvärda punkter bör noteras för att få bästa och pålitliga resultat. (1) Virusbelastningen i de infekterade risplantorna är kritisk. De virala titrarna i risväxter påverkar direkt förvärvet av insekter. När insektskolonin är mycket viruliferös ökar sannolikheten för att samla virala proteiner i saliv in vitro . Därför blir de virala proteinerna som frigörs från saliven till växtvärden mycket lättare att upptäcka. Att välja infekterade växter som visar signifikanta symptom rekommenderas att fungera som källa till virus. (2) Tidpunkt för detektering. Man tror att några av salivproteinerna är övergående i växtvärden eftersom de utsätts för nedbrytning av växtvärden eller späds ut i växten. Omedelbar detektering av utfodringsanläggningarna efter 2-dagars utfodring rekommenderas. Det antas också att en längre retentionstid skulle vara bättre för vissa specifika salivproteiner i växten. Därför kunde detektionstidpunkten för vissa salivproteiner bestämmas i ytterligare studier. (3) Se till att det finns tillräckligt med replikat. Antalet insekter som överlever kommer att minska eftersom de begränsade insekterna i foderburet har begränsad aktivitet och förmåga att mata. Användning av tillräckligt med replikat hjälper till att berika salivproteinerna. Tre till fem replikat räcker vanligtvis. Om det bara finns en replikat, skulle det vara bättre att begränsa 15-20 bladhoppare för att mata på en risplanta.
Dessa representativa resultat visade närvaron av viralt protein P8 i utfodringsanläggningen hos viruliferösa bladhoppare. Det avslöjades att viruset blandat med salivflödet frigörs från spytkörtlarna. Det släpptes sedan från insekten till växtvärden, vilket slutligen avslutade den virala horisontella överföringen. Det är emellertid fortfarande okänt om Vg spelar rollen som elicitor eller effektor i processen med insektsmatning och huruvida det utlöser eller undertrycker växtvärdens immunsvar. Tidigare samlades saliven från mer än 10 000 R. dorsalis in via membranmatning och analyserades med LC-MS/MS (opublicerade data). Närvaron av Vg i saliven verifierades, även om dess funktion är okänd. Här har det visat sig att Vg också finns i saliv av N. cincticeps och till och med släpps ut till växten. I kombination med studierna på planthoppers16 antas det att närvaron av Vg i hemipteran saliv är universell. Ett nytt fynd rapporterar att Vg av planthoppersaliv är en effektor för att skada växtförsvarssystemet34. Fler studier krävs för att ta itu med huruvida Vg i de flesta hemipteran saliv fungerar som en effektor. Man tror att detta protokoll ger en stabil och pålitlig metod för att undersöka närvaron av salivproteiner som utsöndras av bladhoppare i växter. Detta protokoll förväntas vara tillämpligt för detektion av salivproteiner från de flesta hemipteraner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (31772124 och 31972239) och Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amsterdam. (2003).
- Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Wei, T., Li, Y.
- Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps. Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).
- Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae). Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).
- Miles, P. W. Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds. Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).
- Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).
- Miles, P. W., Peng, Z. Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids. Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).
- Will, T., van Bel, A. Physical and chemical interactions between aphids and plants. Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).
- Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments. Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).
- Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).
- Funk, C. J. Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva. Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant-insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment. Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. , (2018).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant--insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Sun, P., et al. A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy. Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).
- Sri-In, C., et al. A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).
- Conway, M. J., et al. Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection. Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).
- Wang, N., et al. A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).
- Omura, T., Yan, J. Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors. Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).
- Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus. Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).
- Fukushi, T. Further studies on the dwarf disease of rice plant. Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).
- Miyazaki, N., et al. The functional organization of the internal components of rice dwarf virus. Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).
- Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes. Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).
- Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector. Virology Journal. 12, 211 (2015).
- Chen, Q., et al. Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector. Virus Research. 210, 54-61 (2015).
- Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector. Scientific Reports. 7, 38563 (2017).
- Wei, T., et al. The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures. Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).
- Mao, Q., et al. Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development. mBio. 11 (6), 01142 (2020).
- Tufail, M., Takeda, M.
- Sappington, T. W., Raikhel, A. S. Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).
- Ji, R., et al. Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses. New Phytologist. , (2021).
