Summary
يظهر هذا البروتوكول نهجا دقيقا وموضوعيا لتصور المعايرة الفيروسية باستخدام اللون البنفسجي البلوري ، من خلال مقارنتها بالفحص المجهري البصري والتلوين الكيميائي المناعي.
Abstract
المعايرة الفيروسية هي المقايسة الرئيسية لأبحاث الفيروسات. الكشف عن تأثير الخلايا (CPE) عن طريق المقايسات TCID50 ووحدات تشكيل البلاك (PFU) المقايسات هي الطريقتين الرئيسيتين لحساب titer من مخزون الفيروس وغالبا ما تستند إلى الكشف المجهري أو تلطيخ الخلايا للتصور. في حالة اختبار TCID50 ، يستند التصور الموضوعي عادة إلى تلطيخ المناعة الكيميائية (ICC) للفيروس داخل الخلايا لحساب الثديات جنبا إلى جنب مع الكشف البصري عن CPE عن طريق المجهر. ومع ذلك ، فإن تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية مكلف ويستغرق وقتا طويلا. في هذه الدراسة، قارنا المراقبة البصرية CPE عن طريق المجهر، تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية وتلطيخ الكريستال البنفسجي لتحديد الثدي من اثنين من الفيروسات تشكيل CPE، فيروس الأنفلونزا A (IAV) من أصل الخنازير وفيروس متلازمة بورسين التناسلية والتنفسية (PRRSV). نظهر أن كل من الكريستال البنفسجي وتلطيخ ICC هي أكثر دقة من الكشف عن CPE البصرية، وتقديم مستويات متطابقة تقريبا من الدقة على كل من IAV وPRRSV. لهذا السبب، نقدم هنا تلطيخ الكريستال البنفسجي كوسيلة أسرع وأكثر بأسعار معقولة لتحديد المعايرة الفيروسية على المقايسة TCID50 للفيروسات تشكيل CPE titrated في خطوط الخلية.
Introduction
المعايرة الفيروسية عن طريق TCID50 المقايسة هي تقنية شائعة الاستخدام في أبحاث الأمراض المعدية1. على الرغم من أن الاختلافات في الرياضيات وراء هذه الطريقة قد اقترحت على مدى الوقت1,2,3,4, تعتمد الطرق المطبقة حاليا للكشف عن العدوى على تأكيد بصري من خلال وجود تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) باستخدام المجهر5. لتأكيد التصور CPE أكثر موضوعية على المقايسات TCID50، immunocytochemical (ICC) تلطيخ داخل الخلايا التي تستهدف بروتينات الفيروس هي واحدة من الطرق الأكثر استخداما6 كما يمكن للفيروسات المختلفة تنتج أشكال مختلفة من CPE. في حالتنا ، فإن التغيرات المورفولوجية للخلايا متشابهة عند إصابتها بكل من فيروس الأنفلونزا A (IAV) وفيروس متلازمة بورسين التناسلية والتنفسية (PRRSV) ، حيث تتراكم الخلايا المصابة وتنفصل عن اللوحة. في حالة PRRSV ، فإنه يسبب CPE المعروفة باسم "التدمير الكامل" ، حيث ينتهي الأمر بجميع الخلايا إلى الانفصال عن البئر. IAV من ناحية أخرى، يمكن أن تقدم كل من التدمير الكامل وCPE إضافية تعرف باسم "تدمير المجموع الفرعي" حيث عدد قليل من الخلايا لا تنفصل بعد العدوى7. ومع ذلك، تستغرق هذه التقنية وقتا طويلا في الأداء وتتطلب استخدام الكواشف المكلفة نسبيا. من المهم ملاحظة أن المحكمة الجنائية الدولية لا تسمي CPE ، بل عدد الخلايا المصابة بنجاح بالفيروس. وهذا يعني أن الخلايا التي أصيبت بنجاح بحلول نهاية الحضانة سينظر إليها على أنها إيجابية حتى لو لم تسبب العدوى CPE حتى الآن ، وبالتالي ، من المتوقع أن تكون نسبة أعلى من الخلايا الإيجابية للمحكمة الجنائية الدولية مقارنة ب CPE. لهذا السبب، في هذه الدراسة نصف طريقة تكميلية للكشف البصري عن CPE في اختبار TCID50 على أساس البنفسجي الكريستال، وهي مادة كيميائية مع تهمة إيجابية التي تعلق على أغشية الخلايا ويستخدم لتلطخ الخلايا الملتصقة. وغالبا ما يستخدم الكريستال البنفسجي في بحوث علم الفيروسات لقياس وحدات تشكيل البلاك، من بين أمور أخرى8.
في هذه الدراسة، نقارن حساسية الكشف عن ال CPE المجهر غير الملون مع تلطيخ الكريستال البنفسجي وتلطيخ المناعة الكيميائية على أساس التعرف على البروتين الفيروسي، والذي هو معروف أن يكون أكثر موضوعية نظرا لحساسية عالية. وتبين هذه الدراسة أن كل من الكريستال البنفسجي وتلطيخ الكيميائية المناعية هي أكثر دقة من الكشف عن CPE البصرية القائمة على المجهر ويمكن استخدامها لتحديد موضوعي الآبار المصابة في المعايرة TCID50. نظرا لقدرتها على الوصول إلى مستوى مماثل تقريبا من الدقة على الفيروسات الباثاثية اختبارها في خطوط الخلية، يتم تقديم الكريستال البنفسجي كوسيلة أسرع وأكثر بأسعار معقولة لتحديد المعايرة الفيروسية على المقايسة TCID50. الطريقة المقترحة باستخدام الكريستال البنفسجي تلطيخ يستغرق ما مجموعه 40 دقيقة لأداء، مع 15 دقيقة لاحتضان paraformaldehyde (PFA)، 5 دقائق لاحتضان الكريستال البنفسجي والحد الأقصى من 15 دقيقة لإعداد المواد، يغسل العازلة، والتجفيف. بروتوكول الكيمياء المناعية المطبق للمقارنة يستغرق متوسط الوقت 4 ساعة 30 دقيقة، وكان يؤديها كما هو موضح سابقا9،10. وتهدف الطريقة المقترحة إلى المساعدة في تصور المعايرة الفيروسية المكتملة. يمكن إجراء العدوى وأوقات الحضانة مع تخطيط مختلف اعتمادا على الفيروس. هنا اختبرنا اثنين من فيروسات الحمض النووي الريبي مع تأثير cytopathic على خطوط الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بروتوكول المعايرة
ملاحظة: استخدام فيروس cytopathic تصيب الخلايا الملتصقة. لهذه المظاهرة، فيروس الأنفلونزا A (IAV) من أصل الخنازير (A/California/07/2009/(H1N1)) وفيروس متلازمة بورسين التناسلية والتنفسية (PRRSV) نوع 2، سلالة NC 1-7-4 استخدمت.
- يسوي هذه الفيروسات في 96 لوحة بئر لمدة 7 أيام في خزانة السلامة الحيوية الموجودة في مختبر السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2).
- لتنفيذ هذه المعايرة، البذور 96 لوحات البئر مع خط الخلية المطلوبة. بالنسبة ل PRRSV، استخدم خط الخلية MA-104 ول IAV استخدم خط الخلية MDCK. لثقافة الخلية، استخدم DMEM المتوسطة تكملها مع 10٪ FBS، L-الجلوتامين وبينيسيلين-ستريبتوميسين وتنمو الخلايا إلى التقاء.
- قبل الإصابة، اغسل الخلايا باستخدام 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- تمييع مخزون الفيروس باستخدام سلسلة تخفيف 10 أضعاف عن طريق خلط 900 ميكرولتر من الوسائط و 100 ميكرولتر من الفيروس. تأكد من دوامة أنبوب بشكل صحيح لضمان الخلط السليم للوسط والفيروس وتجنب أخطاء التخفيف.
- وضع علامة تخطيط لوحة على الغطاء. غسل الآبار مع 1x الفوسفات المالحة العازلة (PBS). إضافة 50 ميكرولتر من inoculum في الآبار المقابلة التالية أساليب المعايرة الموصوفة سابقا2،3.
- حضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة 7 أيام.
2. تقييم التأثير الخلوي (CPE) عن طريق المجهر
- بعد الحضانة لمدة 7 أيام ، اغسل جميع الآبار ب 200 ميكرولتر من 1x PBS مرتين.
- تقييم جميع آبار اللوحة تحت المجهر الضوئي للكشف بصريا CPE. وفي حالة كل من PRRSV و IAV، يتكون CPE من موت الخلية والانفصال اللاحق عن اللوحة، مما يؤدي إلى تعطيل أحادي الطبقة. ومع ذلك، قد تقدم فيروسات أخرى أنواع مختلفة من CPE.
3. بروتوكول تلطيخ
ملاحظة: تم تقييم التأثير الخلوي (CPE) عن طريق تلطيخ الكريستال البنفسجي.
- بعد الحضانة لمدة 7 أيام ، اغسل جميع الآبار باستخدام 200 ميكرولتر من 1x PBS مرتين.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر / بئر من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في برنامج تلفزيوني 1x واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- بعد الحضانة، اغسل الخلايا مرتين مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x. ثم، إضافة 50 ميكرولتر / بئر من الكريستال البنفسجي المخفف إلى 4٪ في الماء واحتضان لمدة 5 دقائق في RT.
ملاحظة: البقع الكيميائية البلورية البنفسجية الخلايا التي لا تزال تعلق على لوحة في وقت التثبيت، وترك أجزاء من البئر حيث الخلايا منفصلة كما غير ملطخة. - وأخيرا، يستنشق البنفسجي الكريستال من الآبار وترك اختياريا لوحات لتجف الهواء لمدة 2-5 دقيقة في RT أو غسل لوحة مع 200 ميكروغرام من الماء لإزالة وصمة عار الزائدة قبل التصور.
- استخدام أساليب وصفها سابقا لحساب رياضيا titer. هنا، تم تطبيق صيغة كاربر وصيغة موينش لPRRSV و IAV، على التوالي2،3. وترد تفاصيل هذه المعادلات في قسم النتائج التمثيلية.
4. الوسم الكيميائي المناعي (ICC)
ملاحظة: تم إجراء وضع العلامات على الكيمياء المناعية لكلا الفيروسين باتباع الطرق الموصوفة سابقا9,10,11.
- بعد حضانة 7 أيام من المعايرة، إصلاح الخلايا باستخدام PFA كما هو موضح في الخطوة 3.2.
- غسل لوحات مع حل تتألف من 100 مل من 1 M تريس هيدروكلوريد، 1 غرام من سابونين، و 8.5 غرام من NaCl في 900 مل من H2O. ثم، إكمال اثنين يغسل إضافية مع خليط من 1x برنامج تلفزيوني و 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS) واحتضان مع أن تريس سابونين-NaCl الحل في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
- احتضان جميع الآبار مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 ساعة في RT.
ملاحظة: كان حجم الأجسام المضادة الأولية لكل فيروس 100 ميكرولتر وتم إعداده باستخدام تخفيف 1:300 من 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني 1x. - غسل الخلايا مرتين مع الحل تريس، سابونين، وNaCl أعدت في الخطوة 4.2.
- احتضان جميع الآبار مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في RT.
ملاحظة: كان حجم الأجسام المضادة الثانوية 100 ميكرولتر وتم إعداده باستخدام تخفيف 1:250 بنسبة 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني 1x. - غسل الخلايا مع تريس، سابونين، وNaCl التخفيف كما هو موضح في الخطوة 4.2.
- أسبيرات التخفيف السابق واحتضان لوحات مع 200 ميكرولتر / بئر من كاربازول الأمينيثيل (AEC) الحل في التخفيف النهائي من 1:50 في الماء وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة لمدة 30 دقيقة في RT.
- بعد الحضانة، تجاهل محلول AEC وإضافة 100 ميكرولتر/بئر من برنامج تلفزيوني 1x للتصوير عن طريق المجهر.
- رياضيا اشتقاق titer كما هو موضح في الخطوة 3.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المعادلات المستخدمة لحساب رياضيا titer وصفت سابقا2،3.
باختصار، بالنسبة ل PRRSV، نطبق طريقة Karber:
تيتر (TCID50) = 10 T + 1.3 حيث:
في هذه الصيغة د = سجل سلبي من التخفيف الأخير مع استجابة الفيروس إيجابية كاملة: خمس نسخ متماثلة إيجابية; ص = سجل نطاق التخفيف؛ N = عدد النسخ المتماثلة عن طريق التخفيف؛ n = عدد الآبار التي لها استجابة إيجابية للفيروسات في حالات التخفيف التالية.
في حالة IAV، نستخدم صيغة Muench:
للحصول على تفاصيل حول كل طريقة رياضية، راجع راماكريشنان وآخرون(2016) و ريد وآخرون (1938)2،3.
وكمثال مرئي، يحسب titer الذي تم الحصول عليه ل PRRSV المبين في الشكل 1 على النحو التالي:
كان عدد الآبار الإيجابية التي تم الحصول عليها عند مقارنة ICC (النصف الأيسر من اللوحة) وتلطيخ كريستال فيوليت (الجزء الأيمن من اللوحة) مشابها جدا لكل من PRRSV (الشكل 1) و IAV (الشكل 2) وكان في كلتا الحالتين قادرا على اكتشاف ما بين بئر وبينين إيجابيين أكثر مما لاحظه CPE قبل التلطيخ من خلال المجهر، بالرغم من أن هذه الاختلافات لم تكن ذات دلالة إحصائية (الجدول 1). في حين أن الناتج الذي تم الحصول عليه من تلطيخ الكريستال البنفسجي عادة ما يكون جيدا إيجابيا وسلبيا ، باستخدام ICC هناك انخفاض تدريجي في عدد الخلايا الإيجابية التي يتم تصنيفها على أنها الفيروس يحصل على مزيد من المخفف. وعلاوة على ذلك، تتطلب المحكمة الجنائية الدولية استخدام المجهر للتصور، في حين يمكن بسهولة أداء الكريستال البنفسجي بالعين.
الشكل 1: مقارنة تلطيخ الكريستال البنفسجي ووضع العلامات الكيميائية المناعية (ICC) لبطاقة المعايرة PRRSV. (أ) تصور لوحة المعايرة بالعين، مع النصف الأيسر المقابل لتلطيخ الكريستال البنفسجي والنصف الأيمن المقابل للمحكمة الجنائية الدولية؛ (ب) تمثيل تخطيطي للوح مع آبار إيجابية المشار إليها مع علامة '+' باستخدام الكريستال البنفسجي ومحكمة التجارة الدولية؛ (ج) صورة المجهر (الهدف 10x) من تلطيخ الكريستال البنفسجي؛ (د) صورة المجهر (الهدف 10x) لل آبار إيجابية اكتشفتها المحكمة الجنائية الدولية. تم تنفيذ تخفيفات عشرة أضعاف من الفيروس من -1 إلى -8 سجل. صور الآبار الإيجابية من -1 سجل إلى -5 سجل. استخدمت الخلايا غير المصابة كعنصر تحكم سالب (يشار إليه بالسلب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة تلطيخ الكريستال البنفسجي ووضع العلامات الكيميائية المناعية (ICC) ل IAV titration. (أ) تصور لوحة المعايرة بالعين ، مع النصف الأيسر المقابل لتلطيخ الكريستال البنفسجي والنصف الأيمن المقابل للمحكمة الجنائية الدولية ؛ (ب) تمثيل تخطيطي للوح مع آبار إيجابية المشار إليها مع علامة '+' باستخدام الكريستال البنفسجي ومحكمة التجارة الدولية؛ (ج) صورة المجهر (الهدف 10x) من تلطيخ الكريستال البنفسجي؛ (د) صورة المجهر (الهدف 10x) لل آبار إيجابية اكتشفتها المحكمة الجنائية الدولية. عشرة أضعاف تخفيفات الفيروس من 10-1 إلى 10-8. تم تنفيذها. صور الآبار الإيجابية من -1 سجل إلى -5 سجل. استخدمت الخلايا غير المصابة كعنصر تحكم سالب (يشار إليه بالسلب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: مقارنة المعايرة التي تم الحصول عليها لكل من PRRSV و IAV باستخدام نهج التصور الثلاثة. تم التعبير عن Titers كمتوسط ± SEM ل log10 TCID50/mL في n = 5 نسخ متماثلة. ولم توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعتين (ص > 0.05). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتستخدم المعايرة الفيروسية بشكل روتيني في أبحاث الفيروسات، مع الكشف عن PFU وتقيايس TCID50 الأكثر استخداما1،2،3،4. تعتمد كلتا الطريقتين على اكتشاف CPE في الخلايا المصابة ، وعلى الرغم من أنه يمكن تقييمها بصريا عن طريق المجهر ، عادة ما يتم تطبيق تلطيخ للحصول على نتيجة أكثر موضوعية أو حتى لتقليل أوقات الحضانة. في حالة TCID50 ، واحدة من البدائل الأكثر استخداما للكشف عن CPE البصرية التي توفر قياس دقيق وموضوعي هو تلطيخ ICC6 ، وهو مضيعة للوقت ومكلفة في كثير من الأحيان بسبب استخدام أجسام مضادة محددة9،10. ومع ذلك ، على الرغم من أن هذا النوع من المقايسة يستفيد أيضا من تطبيق تلطيخ الكريستال البنفسجي للتصور ، لا توجد دراسات مقارنة تقيم الاختلافات في الحساسية بين المحكمة الجنائية الدولية وتلطيخ الكريستال البنفسجي. وبالتالي ، فإن البروتوكول المقترح هنا هو خيار مناسب لثنائيات المخزون الفيروسي المستندة إلى TCID50 ، حيث أظهر تطبيق البنفسجي البلوري مستوى مماثلا من الدقة للتلطيخ المناعي الكيميائي الحساس داخل الخلايا الذي يستهدف بروتين فيروس محدد. هذه الطريقة أقل استهلاكا للوقت، وأسهل عموما لتنفيذ وأكثر دقة من الكشف CPE عن طريق المجهر، مما يدل على أن هذا النهج مفيد للاستخدام لثقيل الفيروسات التي يتم تنفيذها على أساس منتظم.
الخطوات الحاسمة لهذا تلطيخ الكريستال البنفسجي هي تثبيت السليم للخلايا بعد فترة حضانة 7 أيام ل titration وتطبيق ما يكفي من الكريستال البنفسجي لتغطية كامل سطح الآبار. لتحقيق تلطيخ ناجح، تأكد من أن الخلايا غير المصابة كانت مغطاة بشكل صحيح مع الكريستال البنفسجي، وأن جميع الآبار ملطخة. وهذا يشير إلى أن الخلايا كانت سليمة، وعمل البروتوكول كما هو متوقع.
في الختام، يقترح استخدام تلطيخ الكريستال البنفسجي كبديل أسرع وأقل تكلفة للكشف الموضوعي عن CPE على المقايسات TCID50، بدقة مماثلة لوضع العلامات داخل الخلايا المحكمة الجنائية الدولية محددة تطبق عادة خلال هذا النوع من المعايرة. ومع ذلك ، قد تكون هناك حالات حيث الأجسام المضادة الخاصة بمسببات الأمراض قادرة على الكشف عن الآبار الإيجابية التي من شأنها أن تذهب دون أن يتم اكتشافها من خلال طريقة لدينا البنفسجي الكريستال ، لأن إيجابيات المحكمة الجنائية الدولية سوف تظهر الخلايا المصابة بنجاح ، حتى قبل أن تؤدي العدوى إلى CPE. لذلك ، على الرغم من أننا لم نجد اختلافات كبيرة بين الاثنين ، فمن المستحسن بشدة اختبار كلتا الطريقتين لتقييم مستوى الحساسية في كل عملية تحديد للفيروس لتحديد الاختلافات المحتملة والتعديلات اللاحقة قبل استخدام هذا التلطيخ بشكل روتيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدكتور فرانك شولي لتعليقاته المفيدة في المخطوطة، وكلوي ماريانت لمساعدتها في تصوير المجهر وتيريزا م. تيدج لتنقيحها المفيد للغة الإنجليزية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
References
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae. British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).
- Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. Virus assay methods: accuracy and validation. Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).
- Kim, J., Chae, C. A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).
- Suchman, E., Blair, C.
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. Influenza Virus. , Springer. 59-88 (2018).
- Tingstedt, J. -E., Nielsen, J. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study. Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).
- Guarner, J., et al. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs. American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).
- Nicholls, J. M., et al. Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods. Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).
