Summary
Dieses Protokoll zeigt einen genauen und objektiven Ansatz zur Visualisierung viraler Titrationen unter Verwendung von Kristallviolett, indem es mit optischer Mikroskopie und immunzytochemischer Färbung verglichen wird.
Abstract
Die virale Titration ist ein Schlüsseltest für die virologische Forschung. Der Nachweis des zytopathischen Effekts (CPE) über TCID50-Assays und Plaque-bildende Einheiten (PFU)-Assays sind die beiden Hauptmethoden zur Berechnung des Titers eines Virusbestandes und basieren häufig auf mikroskopischem Nachweis oder Zellfärbung zur Visualisierung. Im Falle des TCID50-Assays basiert die objektive Visualisierung üblicherweise auf der immunzytochemischen (ICC) Färbung des intrazellulären Virus, um Titer in Kombination mit visuellem CPE-Nachweis über die Mikroskopie zu berechnen. ICC-Färbungen sind jedoch kostspielig und zeitaufwendig. In dieser Studie verglichen wir die visuelle CPE-Beobachtung mittels Mikroskopie, ICC-Färbung und Kristallviolettfärbung, um die Titer von zwei CPE-bildenden Viren zu bestimmen, dem Influenza-A-Virus (IAV) schweineischen Ursprungs und dem Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV). Wir zeigen, dass sowohl die Kristallviolett- als auch die ICC-Färbung genauer sind als die visuelle CPE-Detektion und sowohl bei IAV als auch bei PRRSV nahezu identisch genau sind. Aus diesem Grund präsentieren wir hier die Kristallviolettfärbung als eine schnellere und kostengünstigere Möglichkeit, virale Titrationen auf einem TCID50-Assay für CPE-bildende Viren zu bestimmen, die in Zelllinien titriert sind.
Introduction
Die virale Titration mittels TCID50-Assay ist eine häufig verwendete Technik in der Infektionsforschung1. Obwohl im Laufe der Zeit Variationen der Mathematik hinter dieser Methode vorgeschlagen wurden1,2,3,4, beruhen die derzeit angewandten Methoden des Infektionsnachweises auf der visuellen Bestätigung durch das Vorhandensein eines zytopathischen Effekts (CPE) unter Verwendung der Mikroskopie5. Um die CPE-Visualisierung objektiver auf TCID50-Assays zu bestätigen, ist die immunzytochemische (ICC) intrazelluläre Färbung, die auf die Proteine des Virus abzielt, eine der am häufigsten verwendeten Methoden6, da verschiedene Viren unterschiedliche Formen von CPE produzieren können. In unserem Fall sind die morphologischen Veränderungen der Zellen ähnlich, wenn sie sowohl mit dem Influenza-A-Virus (IAV) als auch mit dem Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) infiziert sind, bei dem sich infizierte Zellen zusammenballen und von der Platte lösen. Im Fall von PRRSV verursacht es eine CPE, die als "totale Zerstörung" bekannt ist, bei der sich alle Zellen vom Brunnen lösen. IAV hingegen kann sowohl eine totale Zerstörung als auch eine zusätzliche CPE darstellen, die als "subtotale Zerstörung" bekannt ist, bei der sich eine kleine Anzahl von Zellen nach der Infektion nicht löst7. Diese Technik ist jedoch zeitaufwendig und erfordert die Verwendung relativ kostspieliger Reagenzien. Es ist wichtig zu beachten, dass ICC nicht CPE kennzeichnet, sondern die Anzahl der Zellen, die erfolgreich mit dem Virus infiziert wurden. Dies bedeutet, dass die Zellen, die am Ende der Inkubation erfolgreich infiziert wurden, auch dann als positiv angesehen werden, wenn die Infektion cpe noch nicht verursacht hat, und somit ein höherer Prozentsatz an ICC-positiven Zellen im Vergleich zu CPE erwartet wird. Aus diesem Grund beschreiben wir in dieser Studie eine komplementäre Methode zum visuellen Nachweis von CPE in einem TCID50-Assay auf der Basis von Kristallviolett, einer Chemikalie mit einer positiven Ladung, die an Zellmembranen bindet und zur Färbung anhaftender Zellen verwendet wird. Kristallviolett wird häufig in der virologischen Forschung verwendet, um unter anderem plaquebildende Einheiten zu messen8.
In dieser Studie vergleichen wir die Sensitivität der nicht gefärbten Mikroskopie-CPE-Detektion mit der Kristallviolettfärbung und der immunzytochemischen Färbung basierend auf viraler Proteinerkennung, von der bekannt ist, dass sie aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit objektiver ist. Diese Studie zeigt, dass sowohl die kristallviolette als auch die immunzytochemische Färbung genauer sind als die visuelle mikroskopische CPE-Detektion und zur objektiven Identifizierung infizierter Vertiefungen in einer TCID50-Titration verwendet werden können. Angesichts ihrer Fähigkeit, ein nahezu identisches Maß an Genauigkeit bei den in Zelllinien getesteten zytopathischen Viren zu erreichen, wird Crystal Violet als eine schnellere und kostengünstigere Möglichkeit zur Bestimmung von Virustitrationen auf einem TCID50-Assay präsentiert. Die vorgeschlagene Methode unter Verwendung der Kristallviolettfärbung benötigt eine Gesamtzeit von 40 minuten, mit 15 min für die Paraformaldehyd (PFA) -Inkubation, 5 min für die Kristallviolett-Inkubation und maximal 15 min für die Materialvorbereitung, Pufferwäsche und Trocknung. Das zum Vergleich verwendete immunzytochemische Protokoll dauert durchschnittlich 4 h 30 min und wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt9,10. Die vorgeschlagene Methode zielt darauf ab, eine abgeschlossene virale Titration zu visualisieren. Infektions- und Inkubationszeiten können je nach Virus mit unterschiedlichem Layout durchgeführt werden. Hier haben wir zwei RNA-Viren mit zytopathischer Wirkung auf Zelllinien getestet.
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Protocol
1. Titrationsprotokoll
HINWEIS: Verwenden Sie ein zytopathisches Virus, das adhärente Zellen infiziert. Für diesen Nachweis wurden das Influenza-A-Virus (IAV) schweineischen Ursprungs (A/California/07/2009/(H1N1)) und das Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Typ 2, Stamm NC 1-7-4 verwendet.
- Titrieren Sie diese Viren in 96 Vertiefungsplatten für 7 Tage in einer Biosicherheitswerkbank in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2).
- Um diese Titrationen durchzuführen, säen Sie 96 Wellplatten mit der erforderlichen Zelllinie aus. Verwenden Sie für PRRSV die MA-104-Zelllinie und für IAV die MDCK-Zelllinie. Verwenden Sie für die Zellkultur DMEM-Medium, ergänzt mit 10% FBS, L-Glutamin und Penicillin-Streptomycin und züchten Sie die Zellen bis zur Konfluenz.
- Waschen Sie die Zellen vor der Infektion mit 200 μL PBS.
- Verdünnen Sie die Virusvorräte mit 10-fachen Verdünnungsreihen, indem Sie 900 μL Medien und 100 μL Virus mischen. Stellen Sie sicher, dass Sie das Röhrchen richtig wirbeln, um eine ordnungsgemäße Vermischung von Medium und Virus zu gewährleisten und Verdünnungsfehler zu vermeiden.
- Markieren Sie das Layout der Platte auf dem Deckel. Waschen Sie die Vertiefungen mit 1x Phosphat-Kochsalzpuffer (PBS). 50 μL des Inokulums werden in die entsprechenden Vertiefungen nach den zuvor beschriebenen Titrationsverfahren 2,3 gegeben.
- 7 Tage lang bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren.
2. Beurteilung des zytopathischen Effekts (CPE) durch Mikroskopie
- Nach der 7-tägigen Inkubation waschen Sie alle Vertiefungen zweimal mit 200 μL 1x PBS.
- Beurteilen Sie alle Vertiefungen der Platte unter einem Lichtmikroskop, um CPE visuell zu erkennen. Sowohl bei PRRSV als auch bei IAV besteht ihr CPE aus dem Zelltod und der anschließenden Ablösung von der Platte, was zu einer Monolayer-Störung führt. Andere Viren können jedoch unterschiedliche Arten von CPE aufweisen.
3. Färbeprotokoll
HINWEIS: Die zytopathische Wirkung (CPE) wurde über eine kristallviolette Färbung beurteilt.
- Nach der 7-tägigen Inkubation waschen Sie alle Vertiefungen zweimal mit 200 μL 1x PBS.
- Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 50 μL/Well 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS und inkubieren Sie für 15 min bei Raumtemperatur (RT).
- Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 μL 1x PBS. Dann fügen Sie 50 μL / Well Kristallviolett hinzu, das auf 4% in Wasser verdünnt ist, und inkubieren Sie es für 5 min bei RT.
HINWEIS: Die kristallviolette Chemikalie färbt die Zellen, die zum Zeitpunkt der Fixierung an der Platte befestigt bleiben, und lässt die Abschnitte des Brunnens, in denen sich die Zellen ablösten, als ungefärbt zurück. - Zum Schluss Kristallviolett aus den Vertiefungen absaugen und die Platten optional 2-5 min bei RT an der Luft trocknen lassen oder die Platte mit 200 μL Wasser waschen, um überschüssige Flecken vor der Visualisierung zu entfernen.
- Verwenden Sie zuvor beschriebene Methoden, um den Titer mathematisch zu berechnen. Hier wurden die Karber-Formel und die Münch-Formel für PRRSV bzw. IAV angewendet2,3. Details zu diesen Gleichungen werden im Abschnitt repräsentative Ergebnisse dargestellt.
4. Immunzytochemische (ICC) Kennzeichnung
ANMERKUNG: Die immunzytochemische Markierung für beide Viren wurde nach zuvor beschriebenen Methoden durchgeführt9,10,11.
- Nach der 7-tägigen Inkubation der Titration fixieren Sie die Zellen mit PFA wie in Schritt 3.2 beschrieben.
- Waschen Sie die Platten mit einer Lösung, die aus 100 ml 1 M Trishydrochlorid, 1 g Saponin und 8,5 g NaCl in 900 ml H2O besteht. Dann vervollständigen Sie zwei zusätzliche Waschungen mit einer Mischung aus 1x PBS und 5% Fetal Bovine Serum (FBS) und inkubieren Sie mit dieser Tris-Saponin-NaCl-Lösung bei Raumtemperatur (RT) für 20 minuten.
- Inkubieren Sie alle Vertiefungen mit dem primären Antikörper für 2 h bei RT.
ANMERKUNG: Das Volumen der primären Antikörper für jedes Virus betrug 100 μL und wurde unter Verwendung einer 1:300-Verdünnung von 2% FBS in 1x PBS hergestellt. - Waschen Sie die Zellen zweimal mit der in Schritt 4.2 hergestellten Tris-, Saponin- und NaCl-Lösung.
- Inkubieren Sie alle Vertiefungen mit dem sekundären Antikörper für 1 h bei RT.
ANMERKUNG: Das Volumen des sekundären Antikörpers betrug 100 μL und wurde unter Verwendung einer 1:250-Verdünnung von 2% FBS in 1x PBS hergestellt. - Waschen Sie die Zellen mit der Tris-, Saponin- und NaCl-Verdünnung wie in Schritt 4.2 beschrieben.
- Aspirieren Sie die vorherige Verdünnung und inkubieren Sie die Platten mit 200 μL/Well Aminoethylcarazol (AEC) -Lösung in einer Endverdünnung von 1:50 in Wasser nach den Anweisungen des Herstellers für 30 min bei RT.
- Verwerfen Sie nach der Inkubation die AEC-Lösung und geben Sie 100 μL/Well 1x PBS für die Bildgebung mittels Mikroskopie hinzu.
- Mathematisch leiten Sie den Titer wie in Schritt 3.5 beschrieben ab.
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Representative Results
Die Gleichungen, die zur mathematischen Berechnung des Titers verwendet wurden, wurden zuvor beschrieben2,3.
Kurz gesagt, für PRRSV wenden wir die Karber-Methode an:
Titer (TCID50) = 10 T + 1,3 wobei:
In dieser Formel d = negatives Protokoll der letzten Verdünnung mit vollständiger positiver Virusreaktion: fünf positive Replikate; r = log des Verdünnungsbereichs; N = Anzahl der Replikate durch Verdünnung; n = Anzahl der Vertiefungen mit positiver Virusreaktion bei den nächsten Verdünnungen.
Im Falle von IAV verwenden wir die Münch-Formel:
Einzelheiten zu jeder mathematischen Methode finden Sie in Ramakrishnan et al., (2016) und Reed et al., (1938) 2,3.
Als visuelles Beispiel würde der in Abbildung 1 dargestellte Titer für PRRSV wie folgt berechnet:
Die Anzahl der positiven Vertiefungen, die beim Vergleich von ICC (linke Hälfte der Platte) und Crystal Violet -Färbung (rechter Teil der Platte) erhalten wurden, war sowohl für PRRSV (Abbildung 1) als auch für IAV (Abbildung 2) sehr ähnlich und konnte in beiden Fällen zwischen einem und zwei positiven Vertiefungen mehr nachweisen als das CPE, das vor der Färbung durch Mikroskopie beobachtet wurde. auch wenn diese Unterschiede statistisch nicht signifikant waren (Tabelle 1). Während die Ausgabe der kristallvioletten Färbung in der Regel eine positiv-negative Vertiefung ist, gibt es mit ICC eine allmähliche Abnahme der Anzahl der positiven Zellen, die markiert werden, wenn das Virus verdünnter wird. Darüber hinaus erfordert ICC die Verwendung eines Mikroskops zur Visualisierung, während Kristallviolett leicht mit dem Auge durchgeführt werden kann.
Abbildung 1: Vergleich der Kristallviolettfärbung und der immunzytochemischen Markierung (ICC) für die PRRSV-Titration. (A) Visualisierung der Titrationsplatte nach Auge, wobei die linke Hälfte der Kristallviolettfärbung und die rechte Hälfte ICC entspricht; (B) Schematische Darstellung der Platte mit positiven Vertiefungen, die mit einem "+"-Zeichen unter Verwendung von Kristallviolett und ICC gekennzeichnet sind; (C) Mikroskopische Aufnahme (10x Objektiv) der Kristallviolettfärbung; (D) Mikroskopieaufnahme (10-fach objektiv) von positiven Bohrlöchern, die von ICC entdeckt wurden. Zehnfache Verdünnungen des Virus von -1 bis -8 log. wurden durchgeführt. Bilder von positiven Bohrlöchern von -1 log bis -5 log. Nicht infizierte Zellen wurden als Negativkontrolle (als negativ bezeichnet) verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vergleich der Kristallviolettfärbung und der immunzytochemischen Markierung (ICC) für die IAV-Titration. (A) Visualisierung der Titrationsplatte nach Auge, wobei die linke Hälfte der Kristallviolettfärbung und die rechte Hälfte ICC entspricht; (B) Schematische Darstellung der Platte mit positiven Vertiefungen, die mit einem "+"-Zeichen unter Verwendung von Kristallviolett und ICC gekennzeichnet sind; (C) Mikroskopische Aufnahme (10x Objektiv) der Kristallviolettfärbung; (D) Mikroskopieaufnahme (10-fach objektiv) von positiven Bohrlöchern, die von ICC entdeckt wurden. Zehnfache Verdünnungen des Virus von 10-1 auf 10-8. durchgeführt wurden. Bilder von positiven Bohrlöchern von -1 log bis -5 log. Nicht infizierte Zellen wurden als Negativkontrolle (als negativ bezeichnet) verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Vergleich der Titer, die sowohl für PRRSV als auch für IAV mit den drei Visualisierungsansätzen erhalten wurden. Titer, ausgedrückt als durchschnittliche ± REM des log10 TCID50/ml in n = 5 Replikaten. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen gefunden (P > 0,05). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Virale Titrationen werden routinemäßig in der virologischen Forschung verwendet, wobei PFU-Nachweis und TCID50-Assays am häufigsten verwendet werden1,2,3,4. Beide Methoden beruhen auf dem Nachweis von CPE in infizierten Zellen, und obwohl sie visuell durch Mikroskopie beurteilt werden können, wird in der Regel eine Färbung angewendet, um ein objektiveres Ergebnis zu erhalten oder sogar die Inkubationszeiten zu verkürzen. Im Fall von TCID50 ist eine der am häufigsten verwendeten Alternativen zum visuellen CPE-Nachweis, die eine genaue und objektive Messung bietet, die ICC-Färbung6, die aufgrund der Verwendung spezifischer Antikörper zeitaufwendig und oft teuer ist9,10. Obwohl diese Art von Assay auch von der Anwendung der Kristallviolettfärbung zur Visualisierung profitiert, gibt es keine vergleichenden Studien, die die Unterschiede in der Empfindlichkeit zwischen ICC- und Kristallviolettfärbung bewerten. Daher ist das hier vorgeschlagene Protokoll eine geeignete Option für TCID50-basierte virale Bestandstitrationen, da die Anwendung von Kristallviolett eine vergleichbare Genauigkeit wie die empfindliche immunzytochemische intrazelluläre Färbung zeigte, die auf spezifisches Virusprotein abzielt. Diese Methode ist weniger zeitaufwendig, im Allgemeinen einfacher auszuführen und genauer als der CPE-Nachweis über die Mikroskopie, was zeigt, dass dieser Ansatz für Virustitrationen, die regelmäßig durchgeführt werden, von Vorteil ist.
Die kritischen Schritte für diese Kristallviolettfärbung sind eine ordnungsgemäße Fixierung der Zellen nach der 7-tägigen Inkubationszeit für die Titration und die Anwendung von genügend Kristallviolett, um die gesamte Oberfläche der Vertiefungen abzudecken. Um eine erfolgreiche Färbung zu erreichen, stellen Sie sicher, dass nicht infizierte Zellen ordnungsgemäß mit Kristallviolett bedeckt sind und dass alle Vertiefungen gefärbt sind. Dies deutet darauf hin, dass die Zellen gesund waren und das Protokoll wie erwartet funktionierte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung der Kristallviolettfärbung als eine schnellere und kostengünstigere Alternative für den objektiven Nachweis von CPE auf TCID50-Assays vorgeschlagen wird, mit ähnlicher Genauigkeit wie die spezifische intrazelluläre ICC-Markierung, die üblicherweise bei dieser Art der Titration angewendet wird. Es kann jedoch Fälle geben, in denen die erregerspezifischen Antikörper in der Lage sind, positive Vertiefungen nachzuweisen, die durch unsere kristallviolette Methode unentdeckt bleiben würden, da ICC-Positive erfolgreich infizierte Zellen zeigen, noch bevor die Infektion zu CPE führt. Obwohl wir keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden gefunden haben, wird daher dringend empfohlen, beide Methoden zu testen, um den Grad der Empfindlichkeit in jeder Virustitration zu beurteilen, um potenzielle Unterschiede und nachfolgende Anpassungen zu bestimmen, bevor diese Färbung routinemäßig verwendet wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Frank Scholle für seine hilfreichen Kommentare im Manuskript, Chloe Mariant für ihre Hilfe bei den Mikroskopiebildern und Teresa M. Tiedge für ihre hilfreiche englische Überarbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
References
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