Summary
このプロトコルは、光学顕微鏡法および免疫細胞化学染色と比較することにより、結晶バイオレットを用いてウイルス滴定を可視化する正確かつ客観的なアプローチを示す。
Abstract
ウイルス滴定は、ウイルス学研究の重要なアッセイです。TCID50アッセイおよびプラーク形成単位(PFU)アッセイ による 細胞パシー効果(CPE)の検出は、ウイルスストックの力量を計算する2つの主要な方法であり、多くの場合、可視化のための顕微鏡検査検出または細胞染色に基づいています。TCID50アッセイの場合、客観的可視化は、一般に 、細胞内 ウイルスの免疫細胞化学(ICC)染色に基づいて、顕微鏡による視覚的CPE検出と組み合わせた力素を計算する。しかし、ICC染色はコストがかかり、時間がかかります。本研究では、顕微鏡、ICC染色、結晶紫色染色 を用いた 視覚的CPE観察を比較し、豚由来のインフルエンザAウイルス(IAV)と豚生殖呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)の2つのCPE形成ウイルスの強気体を決定した。我々は、結晶バイオレットとICC染色の両方が視覚的なCPE検出よりも正確であり、IAVとPRRSVの両方でほぼ同じレベルの精度を示していることを示す。このため、ここでは、細胞株に滴定されたCPE形成ウイルスに対するTCID50アッセイのウイルス滴定を迅速かつ手頃な価格で測定する方法として、結晶紫色染色を提示する。
Introduction
TCID50アッセイを介したウイルス滴定は、感染症研究1で一般的に使用される技術である。この方法の背後にある数学のバリエーションは、時間1、2、3、4の上に提案されているが、感染検出の現在適用されている方法は、顕微鏡5を使用してサイトパシー効果(CPE)の存在を通じて視覚的確認に依存している。TCID50アッセイでCPEの可視化をより客観的に確認するために、ウイルスのタンパク質を標的とする免疫細胞化学(ICC)細胞内染色は、異なるウイルスが様々な形態のCPEを産生することができるため、最も一般的に使用される方法の1つである。我々の場合、細胞形態学的変化は、インフルエンザAウイルス(IAV)と豚生殖および呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)の両方に感染した場合に似ており、感染した細胞は切り上げられ、プレートから切り離される。PRRSVの場合、それはすべての細胞が井戸から剥離してしまう「総破壊」として知られているCPEを引き起こします。一方、IAVは、感染後に少数の細胞が剥離しない「小計破壊」として知られる総破壊と追加のCPEの両方を提示することができる7。しかし、この技術は実行に時間がかかり、比較的高価な試薬を使用する必要があります。ICCはCPEにラベルを付けるのではなく、ウイルスに感染した細胞の数に注意することが重要です。これは、インキュベーションの終わりまでに正常に感染した細胞は、感染がまだCPEを引き起こしていない場合でも陽性と見なされることを意味し、したがって、CPEと比較してICC陽性細胞のより高い割合が期待される。そのため、この研究では、細胞膜に付着し、接着細胞を染色するために使用される正の電荷を有する化学物質である、結晶バイオレットに基づくTCID50アッセイにおけるCPEの視覚的検出の相補的な方法を説明する。クリスタルバイオレットは、プラーク形成ユニットを測定するためにウイルス学の研究でしばしば利用され、とりわけ8。
本研究では、非染色顕微鏡CPE検出の感度を、高感度に起因する目的が高いことが知られているウイルスタンパク質認識に基づく結晶バイオレット染色および免疫細胞化学的染色と比較した。この研究は、結晶紫と免疫細胞化学染色の両方が視覚的な顕微鏡ベースのCPE検出よりも正確であり、TCID50滴定で感染した井戸を客観的に同定するために使用できることを示している。細胞株でテストされた細胞質ウイルスにほぼ同じレベルの精度に達する能力を考えると、結晶バイオレットはTCID50アッセイ上のウイルス滴定を決定するためのより速く、より手頃な方法として提示される。クリスタルバイオレット染色を使用した提案方法は、パラホルムアルデヒド(PFA)インキュベーションに15分、結晶バイオレットインキュベーションに5分、材料調製、緩衝液、乾燥のために最大15分で、実行するのに合計40分の時間がかかります。比較に適用される免疫細胞化学プロトコルは、平均時間4時間30分を要し、前述のとおりに行った。提案された方法は、完成したウイルス滴定を視覚化することを目的としている。感染および潜伏時間は、ウイルスに応じて異なるレイアウトで行うことができる。ここでは、細胞株に細胞性効果を有する2つのRNAウイルスを試験した。
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Protocol
1. 滴定プロトコル
注意:接着細胞に感染するサイトパシーウイルスを使用してください。このデモでは、豚由来のインフルエンザAウイルス(IAV)(A/カリフォルニア/07/2009/(H1N1))および豚生殖・呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)2型、NC1-7-4株を使用した。
- バイオセーフティレベル2(BSL-2)の研究室にあるバイオセーフティキャビネットで、これらのウイルスを96ウェルプレートで7日間テツレートします。
- これらの滴定を行うために、必要な細胞株を有する96ウェルプレートをシードする。PRRSV の場合は、MA-104 セルラインを使用し、IAV 用 MDCK セルラインを使用します。細胞培養のために、10%FBS、L-グルタミンおよびペニシリンストレプトマイシンを添加したDMEM培地を使用し、合流する細胞を成長させる。
- 感染前に、200μLのPBSを用いて細胞を洗浄する。
- 900 μLのメディアと100 μLのウイルスを混合して、10倍希釈シリーズを使用してウイルスストックを希釈します。適切に媒体とウイルスの混合を確保し、希釈エラーを回避するためにチューブを適切にボルテックスしてください。
- 蓋のプレートのレイアウトに印を付けます。1xリン酸生理食塩液(PBS)で井戸を洗います。前述の滴定方法2,3に従って対応するウェルに接種液の50 μLを加えます。
- 5%CO2 インキュベーターで7日間、37°Cでインキュベートします。
2. 顕微鏡による 細胞パシー効果(CPE)評価
- 7日間のインキュベーションの後、200 μLの1x PBSで全てのウェルを2回洗浄します。
- CPEを視覚的に検出するために、光学顕微鏡下でプレートのすべてのウェルを評価します。PRRSVとIAVの両方の場合、CPEは細胞死とその後のプレートからの剥離で構成され、単層破壊を引き起こします。しかし、他のウイルスは異なる種類のCPEを提示する可能性があります。
3. 染色プロトコル
注:サイトパシー効果(CPE)は、結晶紫色染色 を介して 評価した。
- 7日間のインキュベーションの後、200 μLの1x PBSを2回使用してすべてのウェルを洗浄します。
- 1x PBSで4%パラホルムアルデヒド(PFA)の50 μL/ウェルを加えて細胞を固定し、室温(RT)で15分間インキュベートします。
- インキュベーション後、200 μLの1x PBSで細胞を2回洗浄します。その後、水で4%希釈したクリスタルバイオレットの50 μL/ウェルを加え、RTで5分間インキュベートします。
注:クリスタルバイオレット化学は、固定時にプレートに付着したままの細胞を染色し、細胞が分離した井戸のセクションを染色されていない状態のままにします。 - 最後に、ウェルからクリスタルバイオレットを吸引し、必要に応じてプレートをRTで2〜5分間空気乾燥させたままにするか、200 μLの水でプレートを洗浄して、視覚化前に余分な汚れを取り除きます。
- 前述の方法を使用して、値を数学的に計算します。ここで、カルバー式とミュンヒ式をそれぞれPRRSV及びIAVに適用し、2,3を行った。これらの方程式の詳細は、代表結果セクションに示されています。
4. 免疫細胞化学(ICC)標識
注:両方のウイルスに対する免疫細胞化学の標識は、前述の方法9,10,11に従って行った。
- 滴定の7日間のインキュベーションの後、ステップ3.2で説明したようにPFAを用いて細胞を固定する。
- 1M塩酸塩100mL、サポニン1g、および8.5gのNaClをH2Oの900mLで構成する溶液でプレートを洗浄します。その後、1x PBSと5%の胎児セラム(FBS)の混合物で2つの追加の洗剤を完了し、20分間室温(RT)でそのトリスサポニンNaCl溶液とインキュベートします。
- RTで2時間一次抗体ですべてのウェルをインキュベートします。
注:各ウイルスの一次抗体の容量は100 μLで、1x PBSで2%FBSの1:300希釈を使用して調製しました。 - ステップ4.2で調製したトリス、サポニン、およびNaCl溶液で細胞を2回洗浄します。
- RTで1時間二次抗体ですべてのウェルをインキュベートします。
注:二次抗体の体積は100 μLで、1x PBSで2%FBSの1:250希釈を使用して調製しました。 - ステップ4.2で説明したように、トリス、サポニン、およびNaCl希釈で細胞を洗浄します。
- 以前の希釈液を吸引し、RTで30分間のメーカーの指示に従って水に1:50の最終的な希釈で200 μL/ウェルのアミノエチルカルバゾール(AEC)溶液でプレートをインキュベートします。
- インキュベーション後、AEC溶液を廃棄し、1x PBSの100 μL/wellを加 えて顕微鏡で イメージングします。
- ステップ 3.5 で説明したように、数学的に、その気数を導き出します。
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Representative Results
この式は、式で式を数学的に算出するために使用した式を、前に説明した2,3。
簡単に言えば、PRRSVの場合、我々は、カルバー法を適用します。
Titer (TCID50) = 10 T + 1.3 は次の場所に示します。
この式d = 完全な陽性ウイルス応答を伴う最後の希釈の負のログ: 5 つの陽性反復;r = 希釈範囲のログ。N = 希釈による反復の数。n = 次の希釈でのウイルス応答が陽性のウェル数。
IAV の場合、ミュンヒ式を使用します。
各数学的方法の詳細については、ラマクリシュナンら(2016年)およびリードら(1938)2,3を参照してください。
視覚的な例として、 図1 に示すPRRSV用に得られたtiterは、次のように計算されます。
ICC(プレートの左半分)とクリスタルバイオレット染色(プレートの右側)を比較した場合に得られた正のウェルの数は、PRRSV(図1)とIAV(図2)の両方で非常に類似しており、両方の場合において顕微鏡を通じて染色する前に観察されたCPEよりも1〜2個の正のウェルを検出することができた。 これらの差は統計的に有意ではなかったにもかかわらず(表1)。結晶紫色染色から得られる出力は通常、正負の井戸であるが、ICCを使用すると、ウイルスがより希釈されるにつれて標識される陽性細胞の数が徐々に減少する。さらに、ICCは視覚化のための顕微鏡の使用を必要とし、一方、クリスタルバイオレットは目で容易に行うことができる。
図1:PRRSV滴定に対する結晶紫色染色と免疫細胞化学標識(ICC)の比較(A)左半分が水晶紫色染色に対応し、右半分がICCに対応する点眼による滴定プレートの可視化。(B)結晶バイオレットとICCを使用して「+」記号で示された正のウェルを持つプレートの模式的表現。(C) 結晶紫色染色の顕微鏡画像(10倍目的)(D) ICCによって検出された陽性ウェルの顕微鏡画像(10倍の目的)。-1から-8のログにウイルスの10倍の希釈が行われた。1 ログから -5 ログまでの正の井戸のイメージ。未感染細胞は、ネガティブコントロール(ネガティブと呼ばれる)として使用された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:IAV滴定用の結晶紫色染色と免疫細胞化学標識(ICC)の比較(A)眼による滴定板の可視化、左半分は水晶紫色染色に対応し、右半分はICCに対応する。(B)結晶バイオレットとICCを使用して「+」記号で示された正のウェルを持つプレートの模式的表現。(C) 結晶紫色染色の顕微鏡画像(10倍目的)(D) ICCによって検出された陽性ウェルの顕微鏡画像(10倍の目的)。ウイルスの10-1から10-8への10倍の希釈。が行われた。1 ログから -5 ログまでの正の井戸のイメージ。未感染細胞は、ネガティブコントロール(ネガティブと呼ばれる)として使用された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:3つの可視化アプローチを用いたPRRSVとIAVの両方について得られたタイターの比較。 n = 5反復のlog10 TCID50/mLの平均±SEMとして表される。グループ間に統計的に有意な差は見つからなかった(p > 0.05)。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ウイルス滴定はウイルス学研究で日常的に使用されており、PFU検出およびTCID50アッセイは最も一般的に使用される1,2,3,4です。どちらの方法も感染細胞のCPEの検出に依存しており、顕微鏡検査を介して視覚的に評価することができるにもかかわらず、通常、より客観的な結果を得るために、あるいは潜伏時間を短縮するために染色が適用される。TCID50の場合、正確で客観的な測定を提供する視覚的なCPE検出に最も一般的に使用される代替手段の1つはICC染色6であり、これは特定の抗体の利用のために時間がかかり、しばしば高価である9,10です。しかし、この種のアッセイは、可視化のための結晶紫色染色の適用からも恩恵を受けているにもかかわらず、ICCと結晶紫色染色の感度の違いを評価する比較研究はない。したがって、ここで提案されるプロトコルは、特定のウイルスタンパク質を標的とする感受性免疫細胞内染色に対して同等のレベルの精度を示したため、TCID50ベースのウイルスストック滴定に適した選択肢である。この方法は、時間がかかりにくく、一般的に実行が容易で、顕微鏡によるCPE検出よりも正確であり、このアプローチが定期的に行われるウイルス滴定に使用するのに有益であることを実証する。
この結晶紫色染色の重要なステップは、滴定のための7日間のインキュベーション期間後の細胞の適切な固定化であり、ウェルの全表面を覆うのに十分な結晶バイオレットの塗布である。染色を成功させるために、非感染細胞がクリスタルバイオレットで適切に覆われ、すべてのウェルが染色されていることを確認してください。これは、セルが正常であり、プロトコルが期待どおりに機能したことを示します。
結論として、このタイプの滴定の間に一般的に適用される特定のICC細胞内標識と同様の精度で、TCID50アッセイ上のCPEを客観的に検出するための、より速く、より低コストの代替手段として、結晶紫色染色の利用が提案されている。しかし、感染がCPEにつながる前であっても、ICC陽性が正常に感染した細胞を示すので、病原体特異的抗体が私たちの結晶紫色法によって検出されない陽性の井戸を検出できる場合があります。したがって、両者の間に有意な違いは見つからなかったにもかかわらず、この染色を日常的に使用する前に、各ウイルス滴定の感度レベルを評価して潜在的な違いとそれに続く調整を判断するために、両方の方法をテストすることを強くお勧めします。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者は、原稿の中で彼の有用なコメントのためにフランク・ショール博士を認めたいと思います, 顕微鏡画像で彼女の助けのためのクロエ・マリアントと彼女の役に立つ英語の改訂のためのテレサ・M・ティッジ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
References
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