Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63231
Automatic Translation
1, 2,3, 2,4, 1
1Departamento de Genética, Microbiología y Estadística, Universidad de Barcelona, 2Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 3Department of Chemistry, Carleton University, 4Department of Biology, Carleton University

Summary

כאן, אנו מתארים את הבנייה של מוטציות ריקות של אירומונס בגליקוזילטרנספראזות ספציפיות או באזורים המכילים גליקוזילטרנספראזות, מבחני תנועתיות וטיהור פלגלה שבוצעו כדי לבסס את המעורבות והתפקוד של האנזימים המקודדים שלהם בביוסינתזה של גליקאן, כמו גם את תפקידו של גליקאן זה בפתוגנזה חיידקית.

Abstract

המחקר של גליקוסילציה אצל פרוקריוטים הוא אזור שגדל במהירות. על פני השטח שלהם יש לחיידקים מבנים גליקוסיליים שונים, שהגליקנים שלהם מהווים ברקוד ספציפי לזן. הגליקנים הקשורים אליהם מראים גיוון גבוה יותר בהרכב הסוכר ובמבנהו בהשוואה לאלה של אאוקריוטים, והם חשובים בתהליכי זיהוי חיידקים-מארחים ובאינטראקציה עם הסביבה. בחיידקים פתוגניים, גליקופרוטאינים היו מעורבים בשלבים שונים של תהליך הזיהום, ושינויי גליקאן יכולים להפריע לתפקודים ספציפיים של גליקופרוטאינים. עם זאת, למרות ההתקדמות שנעשתה בהבנת ההרכב, המבנה ומסלולי הביוסינתזה של הגליקנים, הבנת תפקידם של גליקופרוטאינים בפתוגניות או באינטראקציה עם הסביבה נותרה מוגבלת מאוד. יתר על כן, בחיידקים מסוימים, האנזימים הדרושים לגליקוזילציה של חלבונים משותפים עם מסלולים ביוסינטטיים אחרים של פוליסכרידים, כגון ליפופוליסכריד ומסלולים ביוסינטטיים כמוסות. החשיבות התפקודית של גליקוסילציה הובהרה במספר חיידקים באמצעות מוטציה של גנים ספציפיים שנחשבו מעורבים בתהליך הגליקוזילציה וחקר השפעתה על הביטוי של גליקופרוטאין המטרה והגליקן המשתנה. לאירומונס מזופילי יש פלגלום קוטבי יחיד ו-O-גליקוזילי. גליקנים פלאגלארים מראים גיוון בהרכב הפחמימות ובאורך השרשרת בין זני אירומונס . עם זאת, כל הזנים שנותחו עד כה מראים נגזרת של חומצה פסאודמינית כסוכר המקשר המשנה שאריות סרין או תראונין. נגזרת החומצה הפסאודמינית נדרשת להרכבת פלגלה קוטבית, ולאובדן שלה יש השפעה על הידבקות, היווצרות ביופילם והתיישבות. הפרוטוקול המפורט במאמר זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בבניית מוטנטים ריקים כדי להבין את המעורבות של גנים או אזורי גנום המכילים גליקוזילטרנספראזות פוטטיביות בביוסינתזה של גליקאן פלאגלאר. זה כולל את הפוטנציאל להבין את תפקודם של הגליקוזילטרנספראזות המעורבות ואת תפקידו של הגליקן. זה יושג על ידי השוואת המוטציה חסרת הגליקן לזן מסוג בר.

Introduction

גליקוזילציה של חלבונים תוארה הן בחיידקים גראם-חיוביים והן בחיידקים גראם-שליליים והיא מורכבת מהצמדה קוולנטית של גליקאן לשרשרת צד של חומצת אמינו 1,2. אצל פרוקריוטים, תהליך זה מתרחש בדרך כלל באמצעות שני מנגנונים אנזימטיים עיקריים: O- ו- N-glycosylation 3. ב-O-glycosylation, הגליקן מחובר לקבוצת ההידרוקסיל של שאריות סרין (Ser) או תראונין (Thr). ב-N-גליקוזילציה, הגליקן מחובר לשרשרת הצדדית של חנקן אמיד של שאריות אספרגין (Asn) בתוך רצפי הטריפפטידים Asn-X-Ser/Thr, כאשר X יכול להיות כל חומצת אמינו למעט פרולין.

גליקנים יכולים לאמץ מבנים ליניאריים או מסועפים והם מורכבים מחד-סוכרים או מפוליסכרידים המקושרים באופן קוולנטי על ידי קשרים גליקוזידיים. אצל פרוקריוטים, גליקנים בדרך כלל מראים גיוון בהרכב הסוכר ובמבנהו בהשוואה לגליקנים אאוקריוטים4. יתר על כן, תוארו שני מסלולי גליקוזילציה חיידקיים שונים הנבדלים זה מזה באופן שבו הגליקן מורכב ומועבר לחלבון המקבל: גליקוזילציה רציפה ו-en bloc 5,6. עבור גליקוזילציה רציפה, הגליקן המורכב בנוי ישירות על החלבון על ידי תוספת רצופה של חד-סוכרים. ב-en bloc glycosylation, גליקאן שהורכב מראש מועבר לחלבון מאוליגוזכריד המקושר בשומנים על ידי אוליגוסכריל-טרנספראז (OTase) מיוחד. שני המסלולים הוכחו כמעורבים בתהליכי N ו-O-glycosylation 7.

לגליקוזילציה של חלבונים יש תפקיד בוויסות התכונות הפיזיקוכימיות והביולוגיות של חלבונים. נוכחותו של גליקאן יכולה להשפיע על האופן שבו החלבון מתקשר עם הליגנד שלו, מה שמשפיע על הפעילות הביולוגית של החלבון, אך יכול גם להשפיע על יציבות החלבון, המסיסות, הרגישות לפרוטאוליזה, אימונוגניות ואינטראקציות בין חיידקים לפונדקאים 8,9. עם זאת, מספר פרמטרים של גליקוזילציה, כגון מספר הגליקנים, הרכב הגליקן, המיקום ומנגנון ההתקשרות, עשויים גם הם להשפיע על תפקוד ומבנה החלבון.

גליקוסילטרנספראזות (GTs) הם האנזימים המרכזיים בביוסינתזה של גליקנים וגליקו-קונג'וגטים מורכבים. אנזימים אלה מזרזים את היווצרות הקשר הגליקוזידי בין מוטי סוכר ממולקולת תורם פעילה לבין מקבל מצע מסוים. GTs יכולים להשתמש הן בנוקלאוטידים והן בנון-נוקלאוטידים כמולקולות תורמות ולמקד מקבלי מצעים שונים, כגון חלבונים, סכרידים, חומצות גרעין וליפידים10. לכן, הבנת ה-GTs ברמה המולקולרית חשובה כדי לזהות את מנגנוני הפעולה והספציפיות שלהם, וגם מאפשרת להבין כיצד הרכב הסוכר של הגליקנים שמשנים מולקולות רלוונטיות קשור לפתוגניות. מסד הנתונים של האנזים הפעיל בפחמימות (CAZy)11 מסווג GTs על פי הומולוגיה של הרצף שלהם, המספקת כלי חיזוי שכן, ברוב משפחות GT, הקפל המבני ומנגנוני הפעולה הם אינווריאנטים. עם זאת, ארבע סיבות מקשות על חיזוי ספציפיות המצע של GTs רבים: 1) לא נקבע מוטיב רצף ברור הקובע את ספציפיות המצע בפרוקריוטים12, 2) GTs ו- OTases רבים מראים הפקרות מצע13,14, 3) GTs פונקציונליים קשה לייצר בתפוקה גבוהה בצורה רקומביננטית ו -4) הזיהוי של מצעי התורם והמקבלים הוא מורכב. למרות זאת, מחקרי מוטגנזה שנערכו לאחרונה אפשרו להשיג התקדמות משמעותית בהבנת המנגנונים הקטליטיים ולחסר את הקשירה של GTs.

בחיידקים, נראה כי O-גליקוזילציה שכיחה יותר מאשר N-גליקוזילציה. אתרי ה-O-glycosylation אינם מראים רצף קונצנזוס, ורבים מחלבוני ה-O-glycosylated מופרשים או חלבונים על פני התא, כגון פלאגלינים, פילי או אוטו-טרנספורטרים1. הגליקוזילציה של פלאגלין מראה שונות במספר האתרים המקבלים, בהרכב הגליקן ובמבנה. לדוגמה, ל-Burkholderia spp flagellins יש רק אתר מקבל אחד, בעוד שבקמפילובקטר ג'ג'וני, לפלגלנים יש לא פחות מ-19 אתרים מקבלים15,16. יתר על כן, עבור חלק מהחיידקים, הגליקן הוא חד-סוכר יחיד, בעוד שחיידקים אחרים הם בעלי גליקנים הטרוגניים הטרוגניים שנפגעו מחד-סוכרים שונים ויוצרים אוליגוסכרידים. ההטרוגניות הזו מתרחשת אפילו בקרב זנים מאותו המין. הליקובקטר פלאגלינים משתנים רק על ידי חומצה פסאודאמינית (PseAc)17, וניתן לשנות את קמפילובקטר פלאגלינים על ידי PseAc, צורת האצטאמידינו של החומצה הפסאודמינית (PseAm) או חומצה לגיונאמינית (LegAm), וגליקנים המופקים מסוכרים אלה עם אצטיל, N-אצטילגלוקוסאמין, או תחליפים פרופיוניים 18,19. ב-Aeromonas, פלאגלינים משתנים על ידי גליקנים שהרכבם נע בין נגזרת אחת של חומצת PseAc להטרופוליסכריד20, והחיבור של גליקנים למונומרים של פלגלין הוא תמיד באמצעות נגזרת PseAc.

באופן כללי, גליקוזילציה של פלאגלינים חיונית להרכבת חוטים, תנועתיות, אלימות וספציפיות מארח. עם זאת, בעוד דגלונים של C. jejuni16, H. pylori17, ו - Aeromonas sp. 21 לא יכול להרכיב לתוך נימה אלא אם כן מונומרים חלבון הם glycosylated, Pseudomonas spp. ו Burkholderia spp. 15 אינם דורשים גליקוסילציה להרכבת פלגלה. יתר על כן, בחלק מזני C. jejuni , שינויים בהרכב הסוכר של הגליקן פלאגלה משפיעים על האינטראקציה בין חיידק לפונדקאי ועשויים למלא תפקיד בהתחמקות מתגובות חיסוניות מסוימות16. Autoagglutination הוא מאפיין פנוטיפי נוסף המושפע משינויים בהרכב של גליקנים הקשורים flagellins. אוטו-אגלוטינציה נמוכה יותר מובילה להפחתה ביכולת ליצור מיקרוקולוניות וביופילם22. בחיידקים מסוימים, היכולת של פלגלה לעורר תגובה פרו-דלקתית נקשרה לגליקוזילציה של פלגלין. לכן, ב P. aeruginosa, גליקוזילציה flagellin משרה תגובה פרו דלקתית גבוהה יותר מאשר unglycosylated23.

אירומונס הם חיידקים גראם-שליליים הנמצאים בכל מקום בסביבה, מה שמאפשר להם להיות בממשק של כל רכיבי One Health 24. לאירומונים מזופיליים יש פלאגלום קוטבי יחיד, המיוצר באופן מכונן. יותר ממחצית המבודדים הקליניים מבטאים גם פלאגלין לרוחב, בלתי ניתן להשראה במדיה או צלחות צמיגות גבוהה. מחקרים שונים קישרו בין שני סוגי הפלגלה לבין השלבים המוקדמים של פתוגנזה חיידקית25. בעוד שפלגלינים קוטביים שדווחו עד כה הם O-גליקוזיליים ב-5-8 Ser או Thr שאריות של התחומים האימונוגניים המרכזיים שלו, פלאגלינים לרוחב אינם O-גליקוזיליים בכל הזנים. אף על פי שהגליקנים של פלגלה קוטבית מזנים שונים מראים גיוון בהרכב הפחמימות שלהם ובאורך השרשרתשלהם 20, הסוכר המקשר הוכח כנגזרת של חומצה פסאודמינית.

מטרתו של כתב יד זה היא לתאר שיטה להשגת מוטציות ריקות ב-GTs או באזורים כרומוזומליים ספציפיים המכילים GTs כדי לנתח את מעורבותם בביוסינתזה של פוליסכרידים רלוונטיים ובפתוגניות חיידקית, כמו גם את תפקידו של הגליקן עצמו. כדוגמה, אנו מזהים ומוחקים אזור כרומוזומלי המכיל GTs של אירומונס כדי לבסס את מעורבותו בגליקוזילציה של פלאגלין קוטבי ולנתח את תפקידו של הגליקן פלאגלין. אנו מראים כיצד למחוק GT מסוים כדי לבסס את תפקודו בביוסינתזה של גליקאן זה ואת תפקידו של גליקאן שונה. למרות השימוש ב- Aeromonas כדוגמה, ניתן להשתמש בעיקרון כדי לזהות ולחקור איי גליקוזילציה של פלגלה של חיידקים גראם שליליים אחרים ולנתח את תפקודם של GTs המעורבים בביוסינתזה של גליקנים אחרים כגון O-אנטיגן ליפופוליסכריד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הייצוג הסכמטי של ההליך מוצג באיור 1.

1. זיהוי ביואינפורמטי של אי הגליקוזילציה פלאגלה (FGIs) באיארומונס

  1. כדי לזהות את האשכולות הביו-סינטטיים של PseAc בגנומים של אירומונס , השתמש בכלי ה-tblastn מתוך מסד הנתונים NCBI26. ראשית, לאחזר חלבונים אורתולוגיים ל-PseC ול-PseI של A. piscicola AH-3 (קודי הזיהוי הם OCA61126.1 ו-OCA61113.1) ממסדי נתונים של זני אירומונס מרוצפים, ולאחר מכן השתמש בכלי ה-tblastn כדי לחפש את רצפי הנוקלאוטידים המתורגמים שלהם.
    הערה: הגנים של pse מקיפים את ה-Aeromonas FGIs, כאשר pseB ו-pseC ממוקמים בקצה אחד של האשכול ו-pseI בקצה השני. המיקום של שאר הגנים של pse יכול להיות שונה מקבוצת FGI אחת לאחרת.
  2. בהתחשב בכך שאותם גנים של פלאגלין קוטבי של זנים רבים סמוכים ל- FGIs, השתמש ב - tblastn ממסד הנתונים של NCBI כדי למצוא חלבונים אורתולוגיים לפלגלין הקוטב FlaA ו- FlaB של A. piscicola AH-3 (קודי הזיהוי הם OCA61104.1 ו- OCA61105.1) ולגנים המקודדים אותם.
  3. בנוסף, אירומונס FGIs המעורבים בביוסינתזה של גליקנים הטרופוליסכרידיים (קבוצה II)27 מכילים מספר גנים המקודדים אנזימים המעורבים בסינתזה של חומצות שומן, כגון luxC ו - luxE. השתמש ב - tblastn ממסד הנתונים של NCBI כדי למצוא חלבונים אורתולוגיים ל- LuxC של A. piscicola AH-3 (קוד הזיהוי הוא OCA61121.1) והגן המקודד אותו.

2. יצירת מוטציות ריקות בגנים של אי הגליקוזילציה של פלאגלה

הערה: שיטה זו של מוטגנזה מבוססת על ההחלפה האלילית של תוצרי מחיקה בתוך מסגרת של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות וקטור ההתאבדות pDM428 (GenBank: KC795686.1). שכפול של וקטור pDM4 הוא תלוי למבדה פיר , והחילוף האלילי השלם נכפה על ידי שימוש בגן sacB הממוקם על הווקטור.

  1. בניית מוצרי מחיקה במסגרת PCR.
    1. תכנן שני זוגות של פריימרים המגבירים את אזורי הדנ"א במעלה הזרם (פריימרים A ו-B) ובמורד הזרם (פריימרים C ו-D) של הגן או האזור שנבחרו למחיקה (איור 2B).
    2. ודא שלפריימרים A ו-D יש יותר מ-600 bp במעלה הזרם מההתחלה ומלמטה מהעצירה, בהתאמה, של הגן או הגנים שיש למחוק. שני פריימרים אלה צריכים לכלול בקצה ה-5' אתר הגבלה עבור אנדונוקלאז המאפשר שיבוט ב-pDM4.
      הערה: אתר ההגבלה הכלול בסוף 5' של פריימרים A ו- D לא צריך להיות זהה לאתרים בתוך AMPLICONS AB או CD.
    3. ודא שפריימרים B ו-C נמצאים בתוך הגן שיש למחוק או בתוך הגן הראשון והאחרון, בהתאמה, של האזור שיש למחוק. ודאו ששני הפריימרים (B ו-C) נמצאים בתוך המסגרת וממוקמים בין 5-6 קודונים בתוך הגן. יתר על כן, ודא ששני הפריימרים כוללים בקצה ה-5 רצף משלים של 21 bp (טבלה 1) המאפשר צירוף של אמפליקוני הדנ"א AB ו-CD.
    4. הגדל את זן Aeromonas שנבחר ב-5 מ"ל של ציר סויה טריפטי (TSB) למשך הלילה (O/N) ב-30 מעלות צלזיוס. השתמש בערכה זמינה מסחרית לטיהור DNA גנומי ופעל לפי הוראות היצרן (טבלת חומרים). לכמת 2 μL של הדנ"א המטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: השתמש במים מזוקקים כפולים כריקים, כאשר המכשיר מוגדר לרשום ספיגה של 260 ננומטר. רשום ספיגה עם 2 μL של דנ"א מטוהר 3-5 פעמים וחשב קריאת ספיגה ממוצעת. השתמש בחוק באר-למברט כדי לחשב את ריכוז הדנ"א, כאשר A = Ɛ.c.l. כאשר "A" הוא ספיגה, "Ɛ" הוא מקדם ההכחדה הממוצע הטוחן עבור דנ"א, "c" הוא ריכוז DNA, ו- "l" הוא אורך הנתיב (עיין בהוראת היצרן עבור אורך הנתיב של כל מכשיר).
    5. השתמש ב-100 ננוגרם של דנ"א כרומוזומלי מטוהר כתבנית בשתי קבוצות של PCR אסימטריים עם פריימרים A-B ו-C-D (טבלת חומרים). השתמש ביחס טוחנת של 10:1 של זוגות פריימרים A:B ו- D:C (חומר משלים).
      הערה: PCRs אסימטריים מאפשרים הגברה מועדפת של גדיל אחד של התבנית יותר מאשר השני.
    6. נתחו את תוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז של 1%. השתמש ב- TAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) כמאגר ריצה של ג'ל והגדרת הספק של 8 V/cm. כדי לדמיין דנ"א, הוסיפו אתידיום ברומיד (0.5 מיקרוגרם/מ"ל) לג'ל והדמיינו את תוצרי ה-PCR באמצעות תחנת הדמיה ביולוגית (טבלת חומרים).
    7. הוציאו את האמפליקונים מהג'ל באמצעות אזמל, טהרו בהתאם לפרוטוקול היצרן (טבלת החומרים) וכימתו אותם.
    8. הצטרף לאמפליקונים של AB ו-CD על-ידי רצפים חופפים של 21 bp בסוף 3' של מוצרי PCR (איור 3). יש לערבב 100 ננוגרם מכל אמפליקון (AB ו-CD) בצינור PCR עם ריאגנטים PCR (טרום-AD PCR), אך ללא פריימרים, ולהרחיב באמצעות תוכנית התרמוציקלר (חומר משלים). לאחר מכן, הוסף 100 μM של פריימרים A ו- D לתגובה (AD PCR) והגבר כמקטע יחיד (חומר משלים).
    9. נתחו את מוצר ה-PCR (AD amplicon) על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז של 1% באמצעות התנאים המתוארים בשלב 2.1.6, הוציאו את האמפליקון מהג'ל, טהרו בהתאם לפרוטוקול היצרן וכימתו את האמפליקון (טבלת החומרים).
  2. בניית פלסמיד רקומביננטי pDM4 עם מחיקה בתוך המסגרת.
    1. לגדל תרבות O/N של Escherichia coli cc18λ pir המכיל pDM4 במרק לוריא-ברטאני (LB) מילר (10 מ"ל) עם כלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    2. סובבו את התרבית בטמפרטורה של 5,000 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשעו את הכדור ב-600 μL של מים מזוקקים סטריליים. בצע מיצוי וטיהור של פלסמיד pDM4 באמצעות ערכת טיהור פלסמידים זמינה מסחרית, בהתאם להוראות הספק (טבלת חומרים).
    3. עכלו 1 מיקרוגרם של pDM4 ו-400 ננוגרם של אמפליקון AD למשך שעתיים עם אנדונוקלאז שמסוגל לעכל את שני הקצוות של אמפליקון AD ואת אתר השיבוט של pDM4 (איור 3). עקוב אחר פרוטוקול יצרן האנזים לתנאי תגובה (טבלת חומרים).
    4. נקו את הפלסמיד והאמפליקון המעוכלים באמצעות ערכת טיהור DNA וכימתו אותם בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
    5. כדי למנוע קשירה מחדש של ה-pDM4 הליניארי, הסר את קבוצת הפוספט משני הקצוות של 5 אינץ' באמצעות האנזים phosphatase אלקליין בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים). לאחר מכן, נקו את הפלסמיד המטופל וכימתו אותו באמצעות ספקטרופוטומטר כמתואר בשלב 2.1.4 (טבלת חומרים).
    6. שלב 150 ננוגרם של pDM4 מעוכל ופוספטאז אלקליין שטופל עם 95-100 ננוגרם של אמפליקון AD מעוכל ביחס וקטור טוחן:הוספה של 1:4. הכן את תגובת הקשירה בנפח של 15 μL, בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
    7. אינקובציה O / N ב 20 °C (76 °F) או בסוף השבוע ב 4 °C (64 °F). לאחר הדגירה, יש להשבית את הליגאז T4 בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    8. השתמש בקשירת קשר כדי להכניס את הפלסמיד לתוך Escherichia coli MC1061λpir strain על ידי אלקטרופורציה. השתמש בחיידקים אלקטרו-קומפקטיים ובקובטים אלקטרופורציה עם מרווח של 2 מ"מ.
  3. הכנת E. coli אלקטרו-קומפקטי ואלקטרופורציה של פלסמיד רקומביננטי pDM4
    1. לחסן מושבה אחת של E. coli MC1061λpir זן לתוך לוריא-ברטאני (LB) מרק מילר ולגדל O/N ב 30 °C עם 200 סל"ד רועדים.
    2. מדללים 2 מ"ל מתרבית החיידקים ב-18 מ"ל של ציר LB ודוגרים ב-30 מעלות צלזיוס עם רעד (200 סל"ד) עד להשגת צפיפות אופטית (OD600) בין 0.4-0.6.
    3. גלול את תרבית החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 5,000 x g ו 4 °C (88 °F) במשך 15 דקות. יש להשליך את ה-supernatant ולהשעות את הכדור ב-40 מ"ל של H2O מזוקק מצונן.
    4. חזרו על שלב ניקוי זה פעמיים נוספות כדי להסיר את כל מלחי התרבית. לבסוף, השעו את הכדור ב-4 מ"ל של H2O מזוקק מצונן והעבירו 1 מ"ל של ההשעיה לכל אחד מארבעה צינורות מיקרופוג' חרוטיים של 1.5 מ"ל.
    5. גלולה את תרבית החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 14,000 x גרם ו 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות. הסר את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור והשעה כל כדור ב-100 מיקרול' של H2O מזוקק מצונן.
    6. מוסיפים 3-3.5 מיקרול' מתערובת הקשירה לכל צינור ודוגרים על קרח למשך 5 דקות. לאחר מכן, העבירו את התוכן של כל צינור לקובט אלקטרופורציה מקורר של 2 מ"מ והחלו 2 קילו-וולט, 129 Ω וזמן קבוע סביב 5 אלפיות השנייה.
      הערה: קירור מראש של הקובטים האלקטרופורציה על קרח. לשמור על החיידקים על הקרח במהלך כל ההליך.
    7. לאחר אלקטרופורציה, הוסיפו 250 μL של מדיום SOC לכל אחד מארבעת הקובטים כדי לשחזר את תכולתם, העבירו אותן לצינור תרבית (כ-1 מ"ל), ודגרו למשך שעה אחת ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטולים (200 סל"ד).
    8. צלחת את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחות אגר לוריא-ברטאני (LB) בתוספת כלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל) כדי להבטיח שלכל המושבות הגדלות בצלחת יש את עמוד השדרה הפלסמידי.
    9. בחר כמה מושבות מלוחות אגר LB עם כלוראמפניקול ודגירה O / N ב 30 ° C. כאשר המושבות גדלות, בדוק את ההכנסה של מבנה המחיקה ל- pDM4 על ידי PCR באמצעות פריימרים הסובבים את צד השיבוט pDM4: pDM4for ו- pDM4rev (טבלה 1), ומושבות משועבדות כתבנית (חומר משלים).
    10. בחר מושבה אחת עם קיסם סטרילי וטבל אותה בצינור 1.5 מ"ל המכיל 15 μL של 1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA pH 8.0. דגירה של הצינורות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן דקה אחת על קרח.
    11. סובבו את הצינורות במיקרו-פוגה במהירות של 12,000 x גרם במשך 10 דקות כדי לזרוק חיידקים ופסולת. השתמש ב- 1 μL של ה-supernatant כתבנית בתגובת ה-PCR (טבלת החומרים). טמפרטורת החישול של זוג הפריימרים היא 50 מעלות צלזיוס, ותגובת ה-PCR דורשת 10% DMSO (חומר משלים).
    12. לחסן את המושבות שהגבירו את המכפלה המעניינת ב-10 מ"ל של ציר LB עם כלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל) ולגדל O/N ב-30 מעלות צלזיוס. הוציאו את הפלסמיד מתרבויות כמתואר בשלבים 2.2.1-2.2.2. רצף באמצעות פריימרים pDM4 בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
  4. העברת מחיקה בתוך המסגרת ל Aeromonas זן
    הערה: יש להכניס את הפלסמיד הרקומביננטי pDM4 לתוך הנבחר Aeromonas מאמץ על ידי הזדווגות משולשת (תרשים 4). Aeromonas זן צריך להיות עמיד בפני ריפאמפיצין כדי להיבחר לאחר ההזדווגות המשולשת. לכן, הגדל את הזנים שנבחרו O/N ב- TSB ב- 30 °C, צנטריפוגה 2 מ"ל, 4 מ"ל ו- 6 מ"ל של תרביות ב- 5,000 x g במשך 15 דקות, השעו כל כדור ב-100 מיקרול'ל של TSB, וצלחת ב-TSA עם ריפאמפיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל).
    1. הכינו תרביות O/N של E. coli MC1061λpir עם פלסמיד רקומביננטי pDM4 על אגר LB עם 25 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול (זן תורם), זן אירומונס עמיד בפני ריפאמפיצין על TSA עם ריפאמפיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל ריפאמפיצין (זן מקבל), ו-E. coli HB101 עם פלסמיד pRK2073 על אגר LB עם ספקטינומיצין 80 מיקרוגרם/מ"ל (זן עוזר) ב-30 מעלות צלזיוס.
    2. כאשר המושבות גדלו, השעו את אותו מספר מושבות (10-15 מושבות) של זני התורם, המקבל והעוזר בעדינות עם קיסם סטרילי בשלושה צינורות LB עם 150 μL של LB.
    3. לאחר מכן, על צלחת אגר LB, ללא אנטיביוטיקה, מערבבים את שלושת תרחיפי החיידק בשתי טיפות אצל המקבל: עוזר: יחס התורם של 5:1:1 (50 μL של המקבל, 10 μL של התורם, ו-10 μL של עוזר). דגירה של הצלחת עם הפנים כלפי מעלה O / N ב -30 מעלות צלזיוס. לבצע שליטה שלילית על הצמדה באמצעות זן התורם ללא פלסמיד רקומביננטי.
      הערה: זן העוזר נושא את הפלסמיד המצומד pRK2073 ומסייע בהעברת ה-pDM4 לתוך ה-Aeromonas. אין להשתמש במערבולת כדי להשעות את זני התורם, המקבל והמסייע כדי להימנע משבירת הפילי.
    4. קצירת חיידקים מצלחת האגר LB על ידי הוספת מרק 1 מ"ל של LB ופיזורו עם מפזר זכוכית סטרילי כדי לקבל תרחיף חיידקי. השתמשו בפיפטה כדי להעביר את ההשעיה החיידקית לצינור מיקרופוג' חרוטי של 1.5 מ"ל ולמערבולת במרץ.
    5. כדי לבחור את המושבות המקבלות המכילות את הפלסמיד הרקומביננטי pDM4, צלחת 100 μL של תרחיף החיידקים שנקטף על צלחות אגר LB עם ריפאמפיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) וכלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל).
    6. סובבו 200 μL ו-600 μL מהדגימות במיקרו-פוג ב-5,000 x גרם למשך 15 דקות, השעו את הכדור ב-100 μL של ציר LB וצלחת על LB אגר עם ריפאמפיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) וכלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל). דגירה של כל הצלחות למשך 24-48 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    7. הרימו את המושבות הגדלות, העבירו ללוחות LB עם ריפאמפיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) וכלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל), והדגרו אותן O/N ב-30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, אשרו כי המושבות הן אירומונס על ידי בדיקת האוקסידאז29 וכי פלסמיד רקומביננטי pDM4 הוכנס (רקומבינציה ראשונה) לאזור הכרומוזומלי הספציפי על ידי PCR באמצעות פריימרים E ו- F (חומר משלים), אשר נקשרים מחוץ לאזור מוגבר עם פריימרים A ו- D (טבלת חומרים). כפי שתואר בשלב 2.3.11, השתמש ב- 1 μL של מושבות שחוקות כתבנית.
    8. כדי להשלים את חילופי הדברים האליליים למחיקה בתוך המסגרת, כפה על המושבות את פלסמיד ההתאבדות המשולב לרקומבינציה שנייה. לגדל את המושבות הרקומביננטיות ב 2 מ"ל של LB עם 10% סוכרוז וללא אנטיביוטיקה, O / N ב 30 °C (84 °F).
    9. צלחת 100 μL של תרביות החיידקים משלב 2.4.8 על צלחת אגר LB עם סוכרוז (10%). כמו כן, צלחת 100 μL של דילולי תרבות שונים (10-2-10-4) ודגירה O / N ב 30 °C (74 °F).
    10. כדי לאשר את אובדן ה-pDM4, הרימו את המושבות, העבירו לצלחות LB עם ובלי כלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל), דגרו אותן O/N ב-30 מעלות צלזיוס, ואז בחרו במושבות הרגישות לכלוראמפניקול.
    11. נתח את המושבות הרגישות על ידי PCR באמצעות זוג פריימרים E-F ו-1 μL של מושבות ליסינג כתבנית (טבלת חומרים וחומר משלים). בחר את המושבות שמוצר ה-PCR שלהן תואם את גודל המבנה שנמחק.

3. מבחני תנועתיות

הערה: בכמה מיני חיידקים עם פלגלה גליקוזילית, שינויים ברמות הגליקוזילציה או הרכב הגליקנים משפיעים על ההרכבה של flagellins, אשר משתקף בדרך כלל כהפחתת תנועתיות או היעדר תנועתיות. לכן, שני מבחני תנועתיות בוצעו עם המוטנטים הריקים.

  1. בדיקת תנועתיות במדיה נוזלית
    1. תרבית אירומונס זנים O / N ב 1 מ"ל של TSB ב 25-30 מעלות צלזיוס. כדי להדביק שקופית כיסוי מיקרוסקופ לשקופית שנחפרה, הרימו כמות קטנה של סיליקון עם קצה קיסם ושמו טיפה קטנה על ארבע הפינות של מגלשת הכיסוי. לאחר מכן, הפקד 1 μL של תרבות Aeromonas באמצע שקופית העטיפה וערבב בטיפה של מדיית TSB טרייה (2 μL).
    2. הניחו שקופית שנחפרה על שקופית העטיפה. התאימו את החפירה לטיפה שהופקדה, לחצו בעדינות והפכו את המגלשה במהופך.
    3. נתחו את תנועתיות השחייה על ידי מיקרוסקופ אור באמצעות מיקרוסקופ אופטי (טבלת חומרים) עם מטרה של פי 100 באמצעות שמן טבילה.
      הערה: יש להשתמש בזן הפראי של אירומונס כבקרה חיובית. כבקרה שלילית, השתמש בחיידק שאינו מלוטש כגון קלבסיאלה.
  2. בדיקת תנועתיות במדיה מוצקה למחצה
    1. תרבית אירומונס זנים O / N ב- TSB (1 מ"ל) ב 25-30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו 3 μL מהתרבית למרכז צלחת אגר רכה (1% טריפטון, 0.5% NaCl, 0.25% בקט אגר) ודגרו את הצלחת עם הפנים כלפי מעלה O/N ב-25-30 מעלות צלזיוס.
    2. באמצעות סרגל, מדוד את נדידת החיידקים דרך האגר ממרכז הצלחת לכיוון הפריפריה.

4. טיהור פלגלה

  1. בידוד של פלגלה מעוגן על פני השטח החיידקיים
    1. תרבית אירומונס זנים O / N ב- TSB (10 מ"ל) ב 25-30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הרחיבו את התרבות לבקבוקון עם TSB (900 מ"ל) ותנו לה לגדל O/N ב-25-30 מעלות צלזיוס עם רעידות (200 סל"ד).
    2. צנטריפוגה ב 5,000 x g במשך 20 דקות ב 4 ° C. השעו את הכדור ב-20 מ"ל של מאגר Tris-HCl של 100 mM (pH 7.8).
    3. כדי להסיר את הפלגלה המעוגנת, גזזו את המתלים במערבולת עם מוט זכוכית (קוטר 2-3 מ"מ) למשך 3-4 דקות, ולאחר מכן עברו שוב ושוב (לפחות שש פעמים) דרך מזרק 21-G.
    4. חיידקי כדוריות על ידי שתי צנטריפוגות רצופות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס: הראשונה, ב-8,000 x גרם למשך 30 דקות. הסר את הסופרנאטנט והצנטריפוגה ב-18,000 x g למשך 20 דקות. אספו את הסופרנטנט, המכיל דגלונים חופשיים.
    5. Ultracentrifuge את supernatant ב 100,000 x g עבור 1 שעה ב 4 °C ולהשעות את הכדור ב 150 μL של 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) בתוספת 2 mM EDTA חיץ. הכדור מכיל חוטי דגלה.
    6. נתחו 5-10 μL של הכדור שעבר החייאה משלב 4.1.5 על ידי אלקטרופורזה בג'ל SDS-Polyacrylamide של 12% והדמיינו את החלבונים באמצעות צביעה כחולה של Coomassie.
      הערה: עקוב אחר הוראות היצרן עבור אלקטרופורזה של חלבון וכתם ג'ל. כבקרה חיובית על פלגלין גליקוזילוט, השתמש בפלגלה המטוהרת של הזן מסוג בר. לטהר את החלק המועשר של פלגלה בשיפוע צזיום כלוריד (ClCs).
  2. גרדיאנט צזיום כלוריד לטיהור פלגלה.
    1. יש לערבב 12.1 גרם של CsCl עם 27 מ"ל של H2O מזוקק.
    2. העבר את החלק המועשר של פלגלה (150 μL) לצינור דק-דופן שקוף במיוחד (14 מ"מ x 89 מ"מ) (טבלת חומרים) ומלא אותו ב-12 מ"ל של תמיסת CsCl.
    3. Ultracentrifuge את הצינור ב 60,000 x g במשך 48 שעות ב 4 °C ברוטור דלי מתנדנד (טבלת חומרים).
    4. אסוף את רצועת הדגל לתוך שיפוע CsCl עם מזרק ודיאליזה כנגד 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) בתוספת 2 mM EDTA. לאחר מכן, נתחו את הפלגלה הדיאליזדתית על ידי אלקטרופורזה בג'ל SDS-Polyacrylamide של 12% ובכתם כחול של Coomassie (שלב 4.1.6) או על ידי ספקטרומטריית מסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מתודולוגיה זו מספקת מערכת יעילה ליצירת מוטנטים ריקים בגנים או באזורים כרומוזומליים של אירומונס שיכולים להשפיע על הגליקוזילציה של פלאגלה ועל תפקידו של חוט פלגלה (איור 1).

הפרוטוקול מתחיל עם זיהוי ביואינפורמטי של FGIs putative ואת הגנים המקודדים GTs מציג באזור זה. ב-Aeromonas, המיקום הכרומוזומלי של FGIs מבוסס על זיהוי של שלושה סוגים של גנים: גנים המעורבים בביוסינתזה של החומצה הפסאודאמינית (pseI ו-pseC), גנים של פלגלין קוטבי ו-luxC. לזנים שהפלגלה הקוטבית שלהם מגולגלת על ידי נגזרת של חומצה פסאודמינית אחת, כגון A. hydrophila AH-130, אין גנים המקודדים GTs בין הגנים pse הממוקמים בקבוצת FGIs I27. רוב הזנים השייכים לקבוצת FGI זו מראים גנים של פלגלין קוטביים הסמוכים לאזור זה. לעומת זאת, זנים שהפלגלה הקוטבית שלהם היא גליקוזילציה עם גליקאן הטרופוליסכריד, כגון A. piscicola AH-319, מראים גנים שונים המקודדים GTs במורד הזרם של luxC, הממוקמים בין גנים pse של קבוצת FGIs II27, והם לא תמיד סמוכים לגנים של פלגלין קוטבי (איור 2A).

האזור המעורב בביוסינתזה של הגליקן הטרופוליסכריד הפלגלה והתפקוד של GTs פוטטיביים הכלולים שם אושר על ידי בניית מוטציות ריקות. יצירת כל מוטציה דורשת ארבעה פריימרים: A, B, C ו-D (טבלה 1). פריימר B חישולים 5-6 קודונים במורד הזרם של תחילת הגן (fgi-4) או הגן הראשון של האשכול (fgi-1) שיימחק ויעלה את ה-A חישולים 600-800 bp במעלה הזרם מתחילת הגן הזה (fgi-4 או fgi-1). פריימר C חישולים במעלה הזרם של 5-6 הקודונים האחרונים של הגן (fgi-4) או הגן האחרון של הצביר (fgi-12) שיש למחוק, ופריימר D חישולים 600-800 bp במורד הזרם מעצירת הגן הזה (fgi-4 או fgi-12) (איור 2B). פריימרים A ו-D למחיקת אשכול fgi ו-fgi-4 של A. piscicola AH-3 מכילים אתר הגבלה עבור האנדונוקלאז BamHI בקצוות 5' שלהם (טבלה 1). לאנדונוקלאז זה אין מטרות פנימיות בשברי AB או CD PCR. צעד חשוב אחד הוא עיצובם של פריימרים B ו-C. שניהם צריכים להיות בתוך המסגרת כדי לא לשבור את מסגרת הקריאה הפתוחה של גן או קטע כדי להימחק. הרצפים המשלימים של 21 bp בסוף 5' של פריימרים B ו-C מאפשרים יצירת אמפליקוני AB ו-CD עם רצפים משלימים בסוף 3', המאפשרים צירוף והרחבה של אמפליקונים אלה. תוכנית ה- PCR להצטרף ולהרחיב את האמפליקונים מורכבת משלב דה-טבעיזציה ראשוני וחמישה מחזורים עם טמפרטורת חישול של 54 מעלות צלזיוס (חומר משלים). לאחר מכן, התוספת של פריימרים A ו-D מאפשרת הגברה של השבר המורחב (איור 3). הפעולה האנזימטית של BamHI יוצרת אמפליקון עם קצוות דביקים התואמים לקשירת קשר עם וקטור ההתאבדות pDM4 המעוכל עם BglII.

בהתחשב בכך ש-pDM4 הוא פלסמיד תלוי λpir, תוצר ההצמדה התחשמל לזן E. coli MC1061λpir (thi thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 λ pir) ונבחר בלוחות כלורמפניקול. ל-pDM4 אין מערכת ישירה לבחירת השיבוטים הרקומביננטיים, והמושבות נותחו על ידי PCR עם זוג פריימרים pDM4 (pDM4for ו-pDM4rev) (טבלה 1 וחומר משלים) המקיפים את אזור השיבוט. זן E. coli MC1061λpir ללא pDM4 שימש כבקרה השלילית בתגובת ה-PCR.

כדי לבצע את ההחלפה האלילית, הפלסמיד הרקומביננטי pDM4 הועבר לזן המקבל A. piscicola AH-3. בהתחשב בכך שאירומונות רבות אינן ניתנות לטרנספורמציה על ידי אלקטרופורציה, ה-pDM4 הרקומביננטי הועבר על ידי הצמדה באמצעות הזדווגות משולשת (איור 4). כדי לבחור את המושבות הטרנס-קונגוגנטיות, אנו משתמשים בזן מושתל עמיד בפני ריפאמפיצין, המאפשר לבחור את זן אירומונס מתוך ההזדווגות ההצמדה. יתר על כן, המושבות שנבחרו הוגשו לבדיקת האוקסידאז מכיוון שבעוד אירומונס הוא חיובי לאוקסידאז, E. coli הוא אוקסידאז שלילי. הרקומבינציות הראשונה והשנייה אושרו על-ידי PCR עם פריימרים חיצוניים (פריימרים E ו-F) של אזורים מוגברים (מקטעי AB ו-CD) (טבלה 1, חומר משלים ואיור 5A).

ב - Aeromonas, הגליקוזילציה של פלגלינים קוטביים חיונית להרכבת נימה פלאגלרית. נוכחותה של פלגלה קוטבית פונקציונלית נותחה באמצעות מבחני תנועתיות של מושבות החיידקים עם גנים או אזור GTs שנמחקו. מבחני מיקרוסקופיית אור הראו כי תנועתיות השחייה בתווך נוזלי פחתה בשתי המוטנטים בהשוואה לזן הפראי. יתר על כן, שניהם הראו ירידה בהתפשטות הרדיאלית ביחס לזן הפראי כאשר תנועתיות נותחה על אגר רך (איור 5B). בהתחשב בכך ששתי המוטנטים היו מסוגלות לשחות אך עם תנועתיות מופחתת ביחס לזן הפראי, הפלגלה הקוטבית שלהן טוהרה, והמשקל המולקולרי של הפלגלין נותח בג'ל SDS-polyacrylamide של 12%. ניתוח זה הראה שלשני המוטנטים יש פלגלינים קוטביים עם משקל מולקולרי נמוך יותר מאשר לזן מסוג בר (איור 5C), מה שמרמז על שינויים בפלגלה גליקאן. פלגלה המטוהרת על ידי גרדיאנטים של CsCl (איור 5C) תשמש במבחני ספקטרומטריית מסה כדי לזהות את הרכב הגליקנים ואת המוטנטים הריקים המשמשים בביופילם, הידבקות או מבחנים אחרים כדי לזהות את התפקיד של הרכב הגליקן והגליקן.

Figure 1
איור 1: מבט כולל על השלבים שבהם נעשה שימוש בהליך זה. סכמת התהליך המתואר בפרוטוקול לזיהוי האי גליקוזילציה של פלגלה של אירומונס, ו-GTs המעורבים בביוסינתזה של גליקאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: זיהוי ביואינפורמטי של אזורים כרומוזומליים ותכנון פריימרים. (A) סכימה של אזורים כרומוזומליים שזוהו ב- A. hydrophila AH-1 ו- A. piscicola AH-3. א. הידרופילה האי AH-1 flagella glycosylation מייצג זנים שלדגנים שלפלגלה גליקאן שלהם יש רק נגזרת של חומצה פסאודמינית, והאי A. piscicola AH-3 flagella glycosylation מייצג זנים שהפלגלה גליקאן שלהם הוא הטרופוליסכריד. גנים המסומנים בשחור מעורבים בביוסינתזה של חומצה פסאודאמינית, ואלה המסומנים בצהוב הם GTs. (B) סכימה של המיקום הכרומוזומלי של זוגות פריימרים המיועדים למחיקות PCR בתוך המסגרת. קופסאות כחולות בפריימרים A ו-D מכילות את אתר קשירת ההגבלה עבור אנדונוקלאז. תיבות אדומות בפריימרים B ו-C מכילות רצפים משלימים של 21 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: סכימה המתארת את השיטה לבניית מחיקות PCR בתוך המסגרת וקשירה לפלסמיד ההתאבדות pDM4. MCS: אתר שיבוט מרובה, CmR: גנים עמידים לכלוראמפניקול, sacB: מקודד את Bacillus subtilis levansucrase, שהביטוי שלו מושרה על ידי סוכרוז והוא קטלני עבור חיידקים גראם שליליים, ואספסוף: גנים מתגייסים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הצמדה משולשת ופרוצדורה המשמשת לחילופי האלילים. רקומבינציה ראשונה מתרחשת עקב היעדר λpir לתוך זני אירומונס ומולידה את השילוב של הפלסמיד הרקומביננטי בגן שנבחר. רקומבינציה שנייה מושרית על ידי גדילה ב- LB עם 10% סוכרוז, מה שמוביל לביטוי של גן שק , והפלסמיד נכרת מהכרומוזום. לאחר ההצלבה, סוג הבר או הגן שעבר מוטציה יכולים להישאר על כרומוזום החיידקים. מוטנטים ריקים נבחרים על ידי PCR עם פריימרים חיצוניים. ריףR: עמיד בפני ריפאמפיצין; ס"מR: עמיד בפני כלורמפניקול; SpcR: עמיד לספקטינומיצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: אישור של מוטציות ריקות וניתוח פנוטיפי של פלגלה קוטבית. (A) PCR עם פריימרים חיצוניים fgi-4 (פריימרים EF) של A. piscicola AH-3 כדי לאשר את ההחלפה האלילית לאחר רקומבינציה שנייה במושבות רגישות לכלוראמפניקול. ליין WT: A. piscicola AH-3; נתיבים 1-8: מושבות רגישות לכלוראמפניקול של הרקומבינציה השנייה; St: סמן HyperLadder 1 Kb. נתיבים 1-3 ו-5-8 מראים את המושבות עם גן fgi-4 מסוג פראי כ-Lane WT. נתיב 4 מראה מושבה עם הגן fgi-4 שנמחק. (B) תנועתיות על אגר רך של A. piscicola AH-3 ומוטנטים ריקים באזור fgi (AH-3ΔFgi) והגן fgi-4 (AH-3ΔFgi-4) בטמפרטורה של 25 °C. (C) פלאגלום קוטבי מ- AH-3 (נתיב1) ומוטנטים ריקים באזור fgi (נתיב 2) והגן fgi-4 (נתיב 3), מבודדים, מטוהרים בשיפוע CsCl, מנותחים ב-12% SDS-PAGE, ומוכתמים באמצעות כחול Coomassie. גודל סטנדרטי (St). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שם פריימר רצף בכיוון של 5' עד 3' משמש עבור
A. piscicola AH-3
א-פלגי1 CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA fgi mutant
B-Flgi1 CCCATCCACTAAACTTAAACA GATCACCTCGAACTCGAAA
C-Flgi12 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG GGAACCTTAAATGCCATGA
D-Flgi12 CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-Flgi1 ACCCGCTTCATTCGCTAT
F-Flgi12 TCCGATTTTCTGACTCAGGG
א-פגי4 CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA fgi-4 מוטציה
B-Fgi4 CCCATCCACTAAACTTAAACA CATATTATCTTGCCCCTGAT
C-Fgi4 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG ATGGAGCTAATCACTCGTTT
D-Fgi4 CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
E-Fgi4 ATTTCCCTGCCAAATACG
F-Fgi4 CCTGCCAACAGAGGATGTAAG
וקטור pDM4
pDM4for AGTGATCTTCCGTCACAGG תוספות לווקטור pDM4
pDM4rev AAGGTTTAACGG TTGTGGA

טבלה 1: פריימרים המשמשים לבניית מוטציות ריקות. אזורים חופפים בפריימרים B ו-C מסומנים בקו תחתון. בום אתר HI מודגש בפריימרים A ו- D.

חומר משלים. ריאגנטים ותגובות המשמשים ב- PCRs אסימטריים כדי להשיג את אמפליקוני AB ו- CD, קדם-AD ו- AD PCR כדי להרחיב ולהשיג את אמפליקוני AD, pDM4 PCR כדי לאמת את הכנסת המבנה שנמחק בווקטור pDM4, ו- EF PCR כדי לאמת את הרקומבינציה הראשונה והשנייה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלב המוקדם הקריטי של שיטה זו הוא זיהוי של אזורים המעורבים בגליקוסילציה של פלגלה ו-GTs פוטטיביים מכיוון שאנזימים אלה מראים הומולוגיה גבוהה ומעורבים בתהליכים רבים. ניתוח ביואינפורמטי של גנומים של אירומונס במאגרי מידע ציבוריים מראה כי אזור זה צמוד לאזור הדגלה הקוטבי 2, המכיל את הגנים פלאגלין בזנים רבים ומכיל גנים המעורבים בביוסינתזה של חומצה פסאודמינית27. זה איפשר לפתח קו מנחה לאיתור איי גליקוזילציה של פלגלה ב-Aeromonas שיכולים לשמש לזיהוי אזור זה בחיידקים אחרים שהגליקן הפלגלרי שלהם מכיל נגזרות של חומצה פסאודמינית. בנוסף, למרות ששיטה זו מתארת כיצד לנתח אשכול גנים המעורב בגליקוזילציה של פלאגלה, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור גנים המקודדים חלבונים שעשויים להיות מעורבים בהיווצרות, סיבוב או ויסות של פלגלה בחיידקים גראם שליליים שונים.

חשוב גם ביצירת מחיקות PCR במסגרת הוא העיצוב של פריימרים B ו- C. פריימרים אלה צריכים להיות מקומיים 5-6 קודונים במורד הזרם של ההתחלה (פריימר B) ובמעלה הזרם של העצירה (פריימר C) של הגן או האזור שנבחרו למחיקה ואין לשבור את מסגרת הקריאה הפתוחה. יתר על כן, גורם חשוב שיש לקחת בחשבון הוא אורך האזור ההומולוגי המוגדל כדי ליצור את אמפליקוני AB ו- CD. פרוטוקול זה ממליץ ששני האמפליקונים יכילו אזור הומולוגי של 600-800 bp כל אחד. אזורים הומולוגיים קצרים יותר הופכים את הרקומבינציה הראשונה למאתגרת יותר.

זני אירומונס אינם נושאים את הגן למבדה פיר, הנדרש כדי לשכפל את פלסמיד ההתאבדות pDM4. לכן, הפלסמיד הרקומביננטי pDM4 חייב להשתלב בדנ"א הכרומוזומלי. לאחר ההזדווגות המשולשת, חשוב לזהות את מושבות החיידקים שבהן התרחשה הרקומבינציה הראשונה. מושבות אלה מכילות את ה-pDM4 הרקומביננטי המוחדר לאזור הכרומוזומלי ההומולוגי. זיהוי מושבות רקומביננטיות מתבצע באמצעות תגובת PCR עם פריימרים (פריימרים E ו-F) חיצוניים לאזור המיועד למחיקה. אם נעשה שימוש בפולימראז DNA סטנדרטי, פריימרי E-F יובילו רק ליצירת מוצר PCR בסוג הבר. זוג פריימרים זה לא יפיק שום מוצר PCR במושבות חיידקים שבהן הוכנס הפלסמיד הרקומביננטי pDM4 לדנ"א הכרומוזומלי. המחסור במוצר PCR נובע מהמרחק בין רצפי החישול של פריימרים E ו- F. לא ניתן להגביר מרחק זה על ידי פולימראזות סטנדרטיות. עם זאת, גורמים אחרים יכולים גם למנוע היווצרות של מוצרי PCR. לכן, ניתן לזהות מושבות רקומביננטיות ראשונות על ידי פולימראזות DNA להגברת שברים ארוכים או על ידי תגובות PCR באמצעות זוגות פריימרים המורכבים מ- pDM4 ופריימר חיצוני. כאשר אשכולות גנטיים גדולים נמחקים, הגברה בזן מסוג בר דורשת שימוש בפולימראזות DNA להגברת שברים ארוכים. מושבות חיידקים עם הרקומבינציה הראשונה ניתנות לזיהוי על ידי PCR עם זוגות פריימרים חיצוניים pDM4. עם זאת, רקומבינציות ראשונות ושניות מיוצרות בדרך כלל בו זמנית, ומשאירות את ה- pDM4 עם סוג הבר או עם הגן שנמחק לאחר רקומבינציה. זה מוביל למושבות עמידות לכלוראמפניקול שה-PCR שלהן באמצעות פריימרים חיצוניים נותנים אמפליקונים בגודל זהה של הגן מסוג בר או אמפליקונים קטנים, אשר מתואמים עם הגן או השבר שנמחק. מושבות שהוכחו שיש להן את התוספת הרקומביננטית הנכונה הודגמו עם סוכרוז כדי להסיר את ה-pDM4 שלא הוכנס. סוכרוז משרה את הביטוי של הגן sacB הממוקם על pDM4, אשר מקודד אנזים קטלני עבור חיידקים גראם שליליים. לכן, רק מושבות חסרות פלסמיד התאבדות יגדלו ב- LB עם סוכרוז. כדי לתמוך בזהות המושבות המכילות את הגן שנמחק, ניתן לרצף את הקטע המוגברה עם זוג הפריימרים החיצוניים.

יישום שיטת מוטציה זו במסגרת ב-Aeromonas מאפשר יצירת מוטנטים ריקים יציבים יותר ללא שינויים ברמות הביטוי של גנים במורד הזרם. שיטות אחרות, כגון החדרת קלטת אנטיביוטית, מבטיחות שעתוק של גנים במורד הזרם, אך ניתן לשנות את רמת הביטוי. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות אקסטרפולציה לגנים ואזורי מטרה אחרים, כולל חיידקים גראם שליליים אחרים 29,31,32,33.

בחלק מזני החיידקים, אובדן או שינוי של גליקאן המקושר לפלגלינים יכול להוביל לחוסר היכולת של הרכבה של פלאגלה או לחוסר יציבות של חוטי פלאגלה, מה שמוביל להפחתת תנועתיות הפלגלה הקוטבית. בעוד שקל להבחין בין פנוטיפ שאינו תנועתי לבין פנוטיפ תנועתי באמצעות מבחני תנועתיות במדיה נוזלית, הבדלים במידת תנועתיות יכולים להיות קשים לכימות. מבחני צלחת תנועתיות נדרשים כדי למדוד הבדלים במידת התנועתיות. עם זאת, כמה מיני חיידקים, כולל זני אירומונס מזופיליים רבים, מבטאים פלגלה צידית בלתי ניתנת להשראה כאשר הם גדלים במדיה צמיגית גבוהה או בלוחות, בנוסף לפלגלה הקוטבית המכוננת. שני סוגי הפלגלה תורמים לתנועתיות החיידקים בלוחות מוצקים למחצה. לכן, שינויים של פלאגלה קוטבית או צידית רק מובילים להפחתה בקוטרי הנדידה. לפיכך, המוטנטים AH-3ΔFgi ו-AH-3ΔFgi-4 מראים רק תנועתיות מופחתת ביחס לזן מסוג בר. כדי לשפר את הערכת התנועתיות המיוצרת על ידי סיבוב של פלגלה קוטבית, יש להשוות את קוטר ההתפשטות של מוטציות ריקות ביחס לא רק לזן מסוג בר אלא גם למוטנט חסר פלגלום הקוטב. יתר על כן, ירידה במספר שאריות הגליקן או השינויים בהרכב הגליקן משפיעה על התנועתיות האלקטרופורטית של הגליקוזילטים. לדוגמה, המשקל המולקולרי של גליקוסילינים שנצפו באמצעות ג'לים מסוג SDS-PAGE גבוה מהנחווי מרצף חומצות האמינו פלגלין, ושיבושים בגליקן נצפים כהפחתה במשקל המולקולרי שלהם. במקרים מסוימים, ייתכן שלא ניתן יהיה לזהות את השינויים בשינוי הגליקן לחלבון פלאגלין באמצעות SDS-PAGE. במקרים אלה, ייתכן שיידרש ניתוח ספקטרומטריית מסה של חלבון שלם או פפטידי פלאגלין כדי לאשר את נוכחותו ומסתו של הגליקן.

פתוגניות של אירומונס, כמו גם חיידקים גראם שליליים אחרים, יכולה להיות מושפעת מהיעדר פלאגלום אך גם משינויים בהרכב של פלגלה גליקנים. שינויים אלה יכולים להשפיע על אינטראקציה חיידקית עם משטחים ביוטיים וא-ביוטיים, אוטו-אגלוטינציה, למלא תפקיד בהתחמקות מתגובה חיסונית ו/או אינדוקציה של תגובה פרו-דלקתית. לכן, דבקות, היווצרות ביופילם ומבחני תגובה פרו-דלקתיים נדרשים כדי להעריך את הקשר בין גליקוזילציה של פלאגלה לבין פתוגניות של אירומונס .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר הלאומית של קנדה, עבור תוכנית Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, ספרד) ועבור הגנרליטאט דה קטלוניה (מרכז ההתייחסות לביוטכנולוגיה).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Applied Biosystems 4337455 Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity Invitrogen 12346-086 Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose Conda-Pronadise 8008 Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) Promega M1821 Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar Becton Dickinson 214010 Use for motility analysis
BamHI Promega R6021 Used for endonuclease restriction
BglII Promega R6081 Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System UVP Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase Bioline BIO-21040 Used for colony screening
Cesium chloride Applichem A1126,0100 Used for flagella purification
Chloramphenicol Applichem A1806,0025 Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit Cytivia 28-9034-71 Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA Applichem 131026.1211 Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap VWR 732-1133 Used for transformation
Ethidium bromide Applichem A1152,0025 Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker Bioline BIO-33053 DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit Invitrogen 10750204 Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar Condalab 996 Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth Condalab 1551 Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000 NanoDrop Techonologies Inc Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin Applichem A2220,0005 Used for triparental mating
SOC Medium Invitrogen 15544034 Used for electroporation recovery
Spectinomycin Applichem A3834,0005 Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman 331362 Used for flagella purification
T4 DNA ligase Invitrogen 15224017 Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar Condalab 1068 Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth Condalab 1224 Used for Aeromonas grown
Tryptone Condalab 1612 Use for motility analysis
Tris Applichem A2264,0500 Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100 Applichem A4975,0100 Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) Beckman 344059 Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler Applied Biosystems Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit Zymmo research D4020 Used for isolation of plasmid DNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
  2. De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
  3. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
  4. Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
  5. Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
  6. Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
  7. Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
  8. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  9. Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
  10. Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
  11. Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, Database Issue 490-495 (2014).
  12. Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
  13. Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
  14. Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
  15. Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
  16. Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
  17. Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
  18. McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
  19. Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
  20. Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
  21. Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, Pt 4 1165-1175 (2007).
  22. Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
  23. Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
  24. Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
  25. Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
  26. Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  27. Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
  28. Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
  29. Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
  30. Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
  31. Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
  32. Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
  33. Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 181 O-גליקוסילציה גליקוזילטרנספראזות הטרוגליקן מוטנטים בתוך מסגרת אירומונס מזופיליים פלאגלינים טיהור פלגלה שיפוע CsCl
יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomás, J. M., Fulton, K. M.,… More

Tomás, J. M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Merino, S. Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility. J. Vis. Exp. (181), e63231, doi:10.3791/63231 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter