Summary
Aqui, usamos a coloração vermelha de alizarina para mostrar que a exposição ao acetato de chumbo causa uma mudança na massa óssea nas larvas de peixe-zebra. Este método de coloração pode ser adaptado para a investigação da perda óssea em larvas de peixe-zebra induzida por outros tóxicos perigosos.
Abstract
A perda óssea induzida quimicamente devido à exposição ao chumbo (Pb) pode desencadear uma série de impactos adversos nos sistemas esqueléticos humanos e animais. No entanto, os efeitos e mecanismos específicos no peixe-zebra permanecem obscuros. O vermelho de alizarina tem uma alta afinidade por íons de cálcio e pode ajudar a visualizar o osso e ilustrar a massa mineral esquelética. Neste estudo, nosso objetivo foi detectar a perda óssea induzida por acetato de chumbo (PbAc) em larvas de peixe-zebra utilizando a coloração vermelha de alizarina. Embriões de peixe-zebra foram tratados com uma série de concentrações de PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) entre 2 e 120 h após a fertilização. A coloração esquelética de montagem inteira foi realizada em larvas aos 9 dias após a fertilização, e a área total corada foi quantificada usando o software ImageJ. Os resultados indicaram que os tecidos mineralizados foram corados em vermelho, e a área corada diminuiu significativamente no grupo de exposição ao PbAc, com uma mudança dose-dependente na mineralização óssea. Este trabalho apresenta um protocolo de coloração para investigar alterações esqueléticas em defeitos ósseos induzidos por PbAc. O método também pode ser usado em larvas de peixe-zebra para a detecção de perda óssea induzida por outros produtos químicos.
Introduction
Estudos recentes têm confirmado que a osteoporose decorrente de glicocorticoides, inibidores da aromatase e consumo excessivo de álcool é comum 1,2. O chumbo (Pb) é um metal tóxico encontrado em plantas, solo e ambientes aquáticos3. Embora os efeitos adversos do Pb no corpo humano tenham atraído muita atenção, seu impacto irreversível no osso precisa ser investigado mais a fundo. A intoxicação por chumbo causa uma gama diversificada de alterações patológicas no esqueleto em desenvolvimento e no adulto, afetando as atividades normais da vida. Estudos encontraram associação entre exposição crônica ao Pb e danos ósseos4, incluindo estruturas ósseas prejudicadas5,6, redução da densidade mineral óssea e até aumento do risco de osteoporose7.
O tecido mineralizado é de grande importância para a resistência óssea8, e a deposição da matriz de mineralização óssea é um índice crítico de formação óssea9. O vermelho de alizarina tem alta afinidade por íons cálcio, e a coloração vermelha de alizarina é um procedimento padrão para avaliar a formação óssea10. De acordo com este método, o tecido mineralizado é manchado de vermelho, enquanto todos os outros tecidos permanecem transparentes. A área corada é então quantificada por análise de imagem digital11.
O peixe-zebra é um importante organismo modelo amplamente utilizado na descoberta de medicamentos e modelos de doenças. Estudos genéticos em peixes-zebra e humanos demonstraram semelhanças nos mecanismos subjacentes da morfogênese esquelética em nível molecular12. Além disso, o rastreamento de fármacos ou biomoléculas de alto rendimento é mais viável em grandes embreagens de peixe-zebra do que em modelos murinos, facilitando o estudo mecanicista de moléculas proosteogênicas ou osteotóxicas13. A coloração diferencial do esqueleto em toto10 é frequentemente usada no estudo da displasia esquelética em pequenos vertebrados e fetos de mamíferos. A coloração vermelha de alizarina foi realizada para investigar a toxicidade do desenvolvimento ósseo de produtos químicos em larvas de peixe-zebra. Aqui, usamos o chumbo como exemplo para descrever um protocolo para detectar defeitos ósseos induzidos por acetato de chumbo em larvas de peixe-zebra.
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Protocol
Todos os procedimentos de animais descritos aqui foram revisados e aprovados pelo Instituto de Cuidados com Animais do Comitê de Ética da Universidade de Soochow.
1. Criação de peixes e colheita de embriões 14
- Alimentar os peixes três vezes por dia; Assegurar que o peixe-zebra é mantido a 28,5 ± 0,5 °C com um ciclo claro/escuro de 14:10 h.
- Separe os peixes adultos machos e fêmeas por placas de isolamento em tanques de desova em uma proporção de 2: 1 macho para fêmea à noite.
- Na manhã seguinte, retire as placas de isolamento às 9:00 da manhã e colete os embriões 2 h depois.
- Colocar os embriões numa incubadora bioquímica mantida a 28,5 °C antes da experiência.
2. Exposição química
- Prepare o estoque-mãe: pese o acetato de chumbo tri-hidratado (5 g) e dissolva-o em água ultrapura (50 mL) com agitação.
CUIDADO: A PbAc é tóxica. Use máscaras de poeira adequadas, roupas de proteção e luvas. Realize o experimento sob um exaustor. - Selecionar e distribuir aleatoriamente embriões de peixe-zebra em placas limpas de 6 poços (30 embriões por poço em 3 mL de água de reprodução de peixe-zebra; ver Tabela 1 para sua composição). Tratar os embriões com PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) de 2 a 120 h após a fecundação (hpf).
NOTA: As concentrações de PbAc foram escolhidas de acordo com os experimentos de determinação da faixa de dose. Os resultados mostraram que a CL50 de acetato de chumbo em embriões de peixe-zebra foi de 41,044 mg/L a 120 hpf. Assim, a maior concentração foi ajustada para metade da CL50 e uma série de soluções preparadas por diluição de 2 vezes. - Alimente as larvas duas vezes ao dia a partir de 5 dias após a fertilização (dpf). Manter os embriões de peixe-zebra a 28,5 ± 0,5 °C com um ciclo claro/escuro de 14:10 h.
- Refrescar o meio sem Pb (água de reprodução de peixe-zebra) a cada 24 h até 9 dpf.
NOTA: Após a conclusão dos experimentos, todas as soluções contendo chumbo foram despejadas em um tanque líquido designado e tratadas pelo centro de gerenciamento de experimentos.
3. Coloração vermelha de alizarina
NOTA: Use máscaras de poeira, roupas de proteção e luvas adequadas durante todo o processo de coloração. As composições de todas as soluções são apresentadas na Tabela 1.
- Etapas específicas de coloração
NOTA: O processo de tingimento foi realizado em placa de 24 poços à temperatura ambiente. Depois que cada solução foi adicionada, coloque a placa de 24 poços na mesa de agitação colocada a uma velocidade baixa.- Remova 10 larvas de peixe-zebra aleatoriamente de cada grupo a 9 dpf e fixe o peixe em 1 mL de solução salina tamponada com paraformaldeído a 2%/1x fosfato por 2 h.
- Decantar a solução e lavar as larvas de peixe-zebra com 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2 durante 10 min.
- Decante a solução e incubar as larvas nas seguintes soluções por 5 min cada para descoloração: solução de etanol anidro (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7,5) e 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).
- Decantar a solução, remover o pigmento por branqueamento com uma solução constituída por 3% H2O2 e 0,5% KOH, e observar uma vez a cada 10 min até que o pigmento seja completamente removido.
- Lave as larvas de peixe-zebra várias vezes com 25% de glicerina / 0,1% de KOH por 10 min cada até que não haja bolhas.
NOTA: É importante evitar bolhas; caso contrário, as bolhas no corpo do peixe-zebra aparecerão como um campo de visão preto sob o microscópio, o que afetará as observações e a análise quantitativa. - Coloração das larvas por imersão em 1 mL de alizarina a 0,01% por 50 min.
- Decantar a solução e adicionar 1mL de glicerina a 50%/KOH a 0,1% por 10 min para limpar o fundo. Armazene os peixes em fresco 50% de glicerina / 0,1% de KOH para observação subsequente.
4. Aquisição de imagens
- Transfira uma larva para a lâmina de vidro de cada vez, mantendo a larva no meio da gota líquida.
- Observe as larvas sob um microscópio estéreo.
- Ligue a câmera, abra o software (consulte a Tabela de materiais) e mantenha as configurações padrão.
- Clique em AE e escolha um tempo de exposição apropriado (60 ms neste experimento) para obter a melhor imagem.
- Capture todas as imagens nas mesmas configurações. Salve as imagens em formato .tif para análise posterior.
5. Análise de imagem
Observação : consulte o arquivo suplementar para obter um exemplo com um conjunto de gráficos de exemplo para análise de imagem.
- Clique duas vezes no ícone ImageJ e analise as imagens salvas na etapa 4.5.
- Clique em Arquivo | Abra para abrir as imagens salvas na etapa 4.5.
- Clique na imagem | Digite, selecione 8 bits.
- Clique em Editar | Inverter.
- Clique em Analisar | Calibrar, selecione OD não calibrado na interface pop-up, marque Calibração global no canto inferior esquerdo da interface inferior e clique em OK.
- Clique em Analisar | Definir escala | Clique para remover escala na interface pop-up, marque Global abaixo e clique em OK.
- Clique em Analisar | Defina Medidas, selecione a área do item na interface pop-up, marque o limite Limite abaixo (para medir apenas o intervalo selecionado) e clique em OK.
- Clique na imagem | Ajustar| Limite, deslize o controle deslizante no meio da interface pop-up para selecionar o limite apropriado (altere o limite para cada imagem) para que todos os destinos a serem testados em uma imagem sejam selecionados e clique em Definir.
- Clique em Analisar | Medida. Registre as datas de cada grupo.
- Use ANOVA one-way seguida do teste de comparação múltipla de Tukey para analisar as diferenças e defina o nível de significância em p < 0,001 (***).
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Representative Results
A coloração vermelha de alizarina é um método sensível e específico para medir mudanças na mineralização óssea em larvas de peixe-zebra. Neste estudo, observamos que a PbAc teve efeitos adversos sobre as larvas de peixe-zebra, incluindo morte, malformação, diminuição da frequência cardíaca e encurtamento do comprimento corporal. Além disso, as áreas do esqueleto mineral de larvas de peixe-zebra foram avaliadas para examinar a perda óssea induzida por PbAc. A 9 dpf (Figura 1A), muitos ossos do esqueleto da cabeça são mineralizados e, portanto, corados em vermelho, como parasfenóide (PS), opérculo (OP), ceratobranquial (CB) e notocorda (NC). Em contraste, os otólitos (OT) (estruturas não ósseas) parecem marrom-pretos em vez de vermelhos. A análise digital foi realizada para quantificar a área total corada em cada imagem. Em comparação com o grupo controle, os grupos acetato de chumbo tratados com PbAc de 10 e 20 mg/L apresentaram diminuição significativa (p < 0,001) na área corada (Figura 1B). As alterações na mineralização óssea mostraram dependência da dose.
Figura 1: Efeitos de diferentes concentrações de PbAc no crânio de larvas de peixe-zebra . (A) Imagens do aspecto dorsal do osso da cabeça corado com vermelho de alizarina em larvas a 9 dpf. O tecido mineralizado é corado de vermelho. Barras de escala = 0,5 mm. (B) Alterações na área mineralizada relativa a 9 dpf; 10 larvas por grupo. Os dados são expressos como média ± EPM. Foram realizadas três repetições. p < 0,001 ***. Abreviaturas: PS = parasfenóide; OP = opérculo; OT = otólito; CB = ceratobranquial; NC = notocorda; dpf = dias pós-fertilização. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Composição | |
| Água de reprodução do peixe-zebra | pH 7-7,3, 27-29 °C, condutividade 450-550 μs, salinidade 0,25-0,75 %0, oxigénio dissolvido >6 mg/L, fotoperíodo 14/10 h, dureza 100-200 mg/L, cloro 0 mg/L, concentração de azoto amoniano <0,02 mg/L, nitrito <1 mg/L, nitrato <50 mg/L, dióxido de carbono <50 mg/L | |
| Solução mista (50 mL) de paraformaldeído a 2% e PBS 1x | 25 mL de paraformaldeído a 4%, 5 mL de tampão PBS 10x e água destilada dupla (ddH2O) q.s. a 50 mL | |
| Solução mista (50 mL) de Tris-HCl 100 mM (pH 7,5) e 10 mM MgCl2 | 5 mL de 1 M Tris-HCl (pH=7,5), 0,5 mL de 1 M MgCl 2 e ddH2O q.s. a 50 mL | |
| Solução mista (50 mL) de etanol anidro a 80%, 10 mM MgCl2 e 100 mM Tris-HCl (pH=7,5) | 42,1 mL de etanol anidro a 95%, 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH=7,5), 0,5 mL de 1 M MgCl 2 e ddH2O q.s. a 50 mL | |
| Solução mista (50 mL) de etanol anidro a 50% e Tris-HCl a 100 mM (pH=7,5) | 26,3 mL de etanol anidro a 95%, 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH = 7,5) e ddH2O q.s. a 50 mL | |
| Solução mista (50 mL) de etanol anidro a 25% e Tris-HCl a 100 mM (pH=7,5) | 13,2 mL de etanol anidro a 95%, 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH = 7,5) e ddH2O q.s. a 50 mL | |
| Solução mista de solução de H2 O 2a 3% e solução de KOHa 0,5% | Quantidades iguais de 6% H 2 O2e 1% KOH misturadas antes da utilização | |
| Solução mista (50 mL) de glicerina a 25% e KOH a 0,1% | 12,5 mL de glicerina a 100%, 0,25 mL de KOH a 20% e ddH2O q.s. a 50 mL | |
| Alizarina a 0,01% (50 ml) | 1 mL de Alizarina a 0,5%, 12,5 mL de glicerina a 100%, 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH = 7,5) e ddH2O q.s. a 50 mL | |
| Solução mista (50 mL) de glicerina a 50% e KOH a 0,1% | 25 mL de glicerina a 100%, 0,25 mL de KOH a 20% e ddH2O q.s. a 50 mL | |
Tabela 1: Composição das soluções utilizadas no protocolo de coloração vermelho de alizarina. Abreviação: q.s. = quantum suficiente (conforme necessário).
Arquivo suplementar: um conjunto de gráficos de exemplo para análise de imagens. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O peixe-zebra é um modelo adequado para o estudo da doença metabólica óssea. Em comparação com os modelos de roedores, os modelos de peixe-zebra são relativamente rápidos de estabelecer, e a medição da gravidade da doença é mais fácil. Em larvas de peixe-zebra do tipo selvagem, a mineralização do esqueleto da cabeça ocorre a 5 dpf e do esqueleto axial a 7 dpf15. Assim, ossos cranianos como PS, OP, CB e NC estão bem desenvolvidos a 9 dpf. Depois que as larvas foram completamente descoradas e branqueadas, os tecidos moles foram limpos, resultando em uma aparência transparente do corpo do peixe. O reagente de coloração vermelho de alizarina foi adicionado para corar e visualizar os ossos minerais em peixe-zebra em vermelho.
A análise de imagens é fundamental para obter conclusões experimentais confiáveis neste experimento. Fotografias de peixe-zebra com boa postura e fundo limpo foram selecionadas para análise quantitativa. Quando quantificarmos a área corada para uma única imagem, todos os ossos mineralizados corados em vermelho de um peixe serão calculados. Assim, podemos comparar as alterações da massa óssea entre os grupos exposto ao chumbo e controle. Neste estudo, a exposição à PbAc causou toxicidade para o desenvolvimento em peixes-zebra, e uma redução significativa na área corada do osso mineral foi observada nos grupos de exposição à PbAc de 10 e 20 mg/L a 9 dpf. Assim, a exposição embrionária precoce à PbAc reduziu a massa óssea das larvas de peixe-zebra. A Figura 1 mostra a perda óssea induzida por PbAc visualizada pela coloração vermelha de alizarina nas larvas de peixe-zebra.
Corantes que se ligam à matriz calcificada são usados para rotular todo o esqueleto. A calceina é um cromóforo fluorescente que também pode se ligar especificamente ao cálcio em tecidos vivos e tem sido usada para rotular estruturas ósseas e estudar o crescimento ósseo10. Ao contrário da calceína, a coloração vermelha de alizarina do tecido fixo gera um registro permanente de alterações esqueléticas que podem facilitar comparações de vários espécimes. A tomografia microcomputadorizada (Micro CT) pode fornecer uma análise quantitativa precisa do tecido mineralizado, adquirindo uma série de raios-X 2D. No entanto, devido ao pequeno tamanho do peixe-zebra e muitos dos ossos do esqueleto do peixe-zebra em desenvolvimento serem finos, as ferramentas de análise de Micro TC não podem caracterizar com precisão esses ossos16.
Linhagens de repórteres transgênicos fluorescentes também ajudam a visualizar o desenvolvimento esquelético em larvas vivas ou até mesmo peixes mais maduros em tempo real17. Da mesma forma, a coloração S in vivo vermelho de alizarina permite a avaliação de peixes vivos e o rastreamento contínuo de malformações18. Assim, a coloração vermelha de alizarina é uma maneira útil e econômica de analisar a perda óssea em larvas de peixe-zebra. No entanto, devido à complexidade das etapas experimentais e ao número de soluções utilizadas, os resultados finais da análise das imagens coradas em vermelho de alizarina podem ser afetados pela operação experimental. Além disso, é difícil usar este método de coloração para peixes-zebra adultos devido ao aumento do volume corporal e tecidos moles; A análise de microtomografia computadorizada ou linhas transgênicas seria uma escolha melhor para imagens esqueléticas de peixes-zebra adultos. Em resumo, o protocolo aqui apresentado pode ser utilizado para estudar as alterações na mineralização óssea em larvas de peixe-zebra após exposição a tóxicos químicos. Este procedimento pode ser útil para estabelecer um modelo de peixe-zebra para estudar doenças ósseas e desenvolver novas drogas terapêuticas.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81872646; 81811540034; 81573173) e pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
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