Summary
여기에서는 아세트산 납 노출이 제브라 피쉬 유충의 뼈 질량 변화를 유발한다는 것을 보여주기 위해 알리자린 레드 염색을 사용했습니다. 이 염색 방법은 다른 위험한 독성 물질에 의해 유도 된 제브라 피쉬 유충 손실의 뼈 손실 조사에 적용될 수 있습니다.
Abstract
납(Pb) 노출로 인한 화학적으로 유발된 뼈 손실은 인간과 동물의 골격계 모두에 일련의 부정적인 영향을 유발할 수 있습니다. 그러나 제브라 피쉬의 구체적인 효과와 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. Alizarin red는 칼슘 이온에 대한 친화력이 높으며 뼈를 시각화하고 골격 미네랄 덩어리를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 연구에서는 알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 아세트산납(PbAc)으로 인한 뼈 손실을 감지하는 것을 목표로 했습니다. 제브라피쉬 배아는 수정 후 2시간에서 120시간 사이에 일련의 PbAc 농도(0, 5, 10, 20mg/L)로 처리되었습니다. 수정 후 9일에 유충에 대해 전체 마운트 골격 염색을 수행하고, 전체 염색 면적을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화했습니다. 결과는 광물화된 조직이 빨간색으로 염색되었고, PbAc 노출 그룹에서 염색된 영역이 유의하게 감소했으며, 뼈 광물화의 용량 의존적 변화가 있음을 나타냈다. 이 논문은 PbAc 유발 뼈 결함의 골격 변화를 조사하기 위한 염색 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 다른 화학 물질에 의해 유도 된 뼈 손실을 감지하기 위해 제브라 피쉬 유충에서도 사용할 수 있습니다.
Introduction
최근 연구에 따르면 글루코 코르티코이드, 아로마 타제 억제제 및 과도한 알코올 섭취로 인한 골다공증이 흔하다는 것이 확인되었습니다 1,2. 납 (Pb)은 식물, 토양 및 수생 환경에서 발견되는 독성 금속입니다3. 인체에 대한 Pb의 악영향이 많은 관심을 끌었지만 뼈에 대한 돌이킬 수없는 영향은 더 조사해야합니다. 납 중독은 발달 중과 성인 골격 모두에서 다양한 병리학 적 변화를 일으켜 정상적인 생활 활동에 영향을 미칩니다. 연구에 따르면 만성 Pb 노출과 뼈 손상4 사이의 연관성이 발견되었으며, 여기에는 뼈 구조 손상5,6, 골밀도 감소, 골다공증 위험 증가7가 포함됩니다.
광물화된 조직은 뼈 강도8에 매우 중요하며, 골 광물화 매트릭스 침착은골 형성의 중요한 지표입니다9. 알리자린 레드는 칼슘 이온에 대한 친화력이 높으며 알리자린 레드 염색은 골 형성을 평가하기위한 표준 절차입니다10. 이 방법에 따르면, 광물 화 된 조직은 빨간색으로 염색되고 다른 모든 조직은 투명하게 유지됩니다. 염색 된 영역은 디지털 이미지 분석(11)에 의해 정량화된다.
제브라피쉬는 약물 발견 및 질병 모델에 널리 사용되는 중요한 모델 유기체입니다. 제브라 피쉬와 인간에 대한 유전 연구는 분자 수준12에서 골격 형태 형성의 기본 메커니즘에서 유사성을 입증했습니다. 더욱이, 고처리량 약물 또는 생체 분자 스크리닝은 쥐 모델보다 제브라피쉬의 큰 클러치에서 더 실현 가능하여, 프로오스테겐 또는 골독성 분자13의 기계론적 연구를 용이하게 한다. 토토10 에서 골격의 차별 염색은 작은 척추 동물과 포유류 태아에서 골격 이형성증을 연구하는 데 자주 사용됩니다. 알리자린 레드 염색은 제브라피쉬 유충에서 화학 물질의 골 발생 독성을 조사하기 위해 수행되었습니다. 여기에서는 제브라피쉬 유충에서 납 아세테이트 유발 뼈 결함을 검출하기 위한 프로토콜을 설명하기 위해 납을 예로 사용했습니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 동물 절차는 Soochow 대학의 윤리위원회 동물 관리 연구소에서 검토하고 승인했습니다.
1. 어류 사육 및 배아 수집 14
- 매일 세 번 물고기를 먹이십시오. 제브라 피쉬가 28.5 ± 0.5 ° C에서 14:10 시간의 명암 주기로 유지되도록하십시오.
- 저녁에 수컷과 암컷 성체 물고기를 산란 탱크의 격리 보드로 2 : 1 수컷 대 암컷 비율로 분리하십시오.
- 다음날 아침 9:00 AM에 격리 보드를 제거하고 2 시간 후에 배아를 수집합니다.
- 실험 전에 28.5°C로 유지되는 생화학적 인큐베이터에 배아를 넣었다.
2. 화학 물질 노출
- 모국을 준비하십시오 : 아세트산 납 삼수화물 (5g)을 계량하고 교반하면서 초순수 (50mL)에 녹입니다.
주의 : PbAc는 독성이 있습니다. 적절한 방진 마스크, 보호 복 및 장갑을 착용하십시오. 흄 후드 아래에서 실험을 수행하십시오. - 제브라 피쉬 배아를 선택하여 깨끗한 6 웰 플레이트 (제브라 피쉬 사육수 3mL에 웰 당 30 개의 배아, 조성은 표 1 참조)에 무작위로 분배합니다. 수정 후 2 시간에서 120 시간 (hpf)까지 PbAc (0, 5, 10, 20 mg / L)로 배아를 처리하십시오.
참고: PbAc의 농도는 용량 범위 측정 실험에 따라 선택되었습니다. 결과는 제브라 피쉬 배아에서 납 아세테이트의 LC50이 120 hpf에서 41.044 mg / L임을 보여주었습니다. 따라서, 최고 농도는LC50 의 절반으로 설정되고 일련의 용액은 2배 희석에 의해 제조되었다. - 수정 후 5 일부터 하루에 두 번 유충을 먹이십시오 (dpf). 제브라 피쉬 배아를 28.5 ± 0.5 ° C에서 14:10 시간의 명암 주기로 유지하십시오.
- 9dpf까지 24시간마다 무연 배지(제브라피쉬 번식수)를 새로 고칩니다.
참고 : 실험 완료 후, 모든 납 함유 용액을 지정된 액체 탱크에 붓고 실험 관리 센터에서 처리했습니다.
3. 알리자린 레드 염색
알림: 전체 염색 과정에서 적절한 방진 마스크, 보호 복 및 장갑을 착용하십시오. 모든 용액의 조성은 표 1에 나타내었다.
- 특정 염색 단계
참고: 염색 공정은 실온에서 24-웰 플레이트에서 수행되었다. 각 용액을 첨가한 후 24웰 플레이트를 저속으로 설정된 쉐이킹 테이블 위에 놓습니다.- 9dpf에서 각 그룹에서 무작위로 10마리의 제브라피쉬 유충을 제거하고 1mL의 2% 파라포름알데히드/1x 인산염 완충 식염수에 2시간 동안 물고기를 고정합니다.
- 용액을 따라 내고 제브라 피쉬 유충을 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM MgCl2 로 10 분 동안 세척하십시오.
- 용액을 따라 내고 무수 에탄올 (EtOH) 용액 (80 % EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM MgCl2, 50 % EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH = 7.5) 및 25 % EtOH / 100mM Tris-HCl (pH = 7.5).
- 용액을 따라 내고, 3%H2O2및 0.5% KOH로 이루어진 용액으로 표백하여 안료를 제거하고, 안료가 완전히 제거될 때까지 10분마다 한 번씩 관찰한다.
- 제브라 피쉬 유충을 25 % 글리세린 / 0.1 % KOH로 거품이 없을 때까지 각각 10 분 동안 여러 번 헹굽니다.
알림: 거품을 피하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 제브라 피쉬 몸체의 거품이 현미경 아래에서 검은 색 시야로 나타나 관찰 및 정량 분석에 영향을 미칩니다. - 0.01 % 알리자린 1mL에 50 분 동안 담가 유충을 염색합니다.
- 용액을 따라 내고 1mL의 50 % 글리세린 / 0.1 % KOH를 10 분 동안 첨가하여 배경을 제거합니다. 후속 관찰을 위해 신선한 50 % 글리세린 / 0.1 % KOH에 물고기를 보관하십시오.
4. 이미지 획득
- 매번 하나의 유충을 유리 슬라이드에 옮겨 유충을 액체 방울의 중간에 유지합니다.
- 실체 현미경으로 유충을 관찰하십시오.
- 카메라를 켜고 소프트웨어를 열고( 재료 표 참조) 기본 설정을 유지합니다.
- AE를 클릭하고 적절한 노출 시간(이 실험에서는 60ms)을 선택하여 최상의 이미지를 얻습니다.
- 동일한 설정에서 모든 이미지를 캡처합니다. 나중에 분석할 수 있도록 이미지를 .tif 형식으로 저장합니다.
5. 이미지 분석
참고: 이미지 분석을 위한 샘플 그래프 세트가 있는 예는 보충 파일을 참조하십시오.
- ImageJ 아이콘을 두 번 클릭하고 4.5단계에서 저장한 이미지를 분석합니다.
- 파일 | 열기 4.5단계에서 저장한 이미지를 엽니다.
- 클릭 이미지 | 입력하고 8비트를 선택합니다.
- 편집 | 반전.
- 분석 | 보정, 팝업 인터페이스에서 보정되지 않은 OD를 선택하고 하단 인터페이스의 왼쪽 하단에서 전역 보정을 확인한 다음 확인을 클릭합니다.
- 분석 | 스케일 설정 | 클릭하여 스케일 제거 팝업 인터페이스에서 글로벌 아래, 클릭 OK.
- 분석 | 측정을 설정하고 팝업 인터페이스에서 항목 영역을 선택한 다음 아래의 임계값 제한(선택한 범위만 측정)을 확인하고 확인을 클릭합니다.
- 클릭 이미지 | 조정| 임계값에서 팝업 인터페이스 중간에 있는 슬라이더를 밀어 적절한 임계값(각 이미지의 임계값 변경)을 선택하여 하나의 이미지에서 테스트할 모든 대상이 선택되도록 하고 설정을 클릭합니다.
- 분석 | 측정. 각 그룹의 날짜를 기록한다.
- 일원 분산 분석과 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 차이를 분석하고 유의 수준을 p < 0.001(***)로 설정합니다.
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Representative Results
Alizarin 적색 염색은 제브라 피쉬 유충의 뼈 광물 화 변화를 측정하는 민감하고 구체적인 방법입니다. 이 연구에서 우리는 PbAc가 사망, 기형, 심박수 감소 및 신체 길이 단축을 포함하여 제브라피쉬 유충에 악영향을 미친다는 것을 관찰했습니다. 또한, 제브라피쉬 유충의 미네랄 골격 영역을 평가하여 PbAc로 인한 뼈 손실을 조사했습니다. 9dpf(그림 1A)에서 머리 골격의 많은 뼈가 광물화되어 파라스페노이드(PS), 수술(OP), 세라토브랜치(CB) 및 노토코드(NC)와 같이 빨간색으로 염색됩니다. 대조적으로, 이석(OT)(비뼈 구조)은 빨간색이 아닌 갈색-검은색으로 보입니다. 각 이미지에서 전체 염색 영역을 정량화하기 위해 디지털 분석을 수행했습니다. 대조군과 비교하여 10 및 20 mg / L PbAc로 처리 된 납 아세테이트 그룹은 염색 된 영역에서 상당한 감소 (p < 0.001)를 보였습니다 (그림 1B). 뼈 광물화의 변화는 용량 의존성을 보였다.
그림 1: 다양한 농도의 PbAc가 제브라피쉬 유충 두개골에 미치는 영향 . (A) 9dpf에서 유충에서 알리자린 레드로 염색된 머리 뼈의 등쪽 측면 이미지. 미네랄 화 된 조직은 빨간색으로 염색됩니다. 스케일 바 = 0.5mm. (B) 9dpf에서 상대적 광물 면적의 변화; 그룹당 10 마리의 유충. 데이터는 평균± SEM으로 표현된다. 세 번의 반복이 수행되었습니다. p < 0.001 ***. 약어 : PS = 파라 스 페노이드; OP = 조작; OT = 이석; CB = 세라토 분지; NC = 노토코드; DPF = 수정 후 일수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용액 | 구성 | |
| 제브라 피쉬 번식 물 | pH 7-7.3, 27-29 °C, 전도도 450-550 μs, 염분 0.25-0.75 %0, 용존 산소 >6 mg/L, 광주기 14/10 h, 경도 100-200 mg/L, 염소 0 mg/L, 암모니아 질소 농도 <0.02 mg/L, 아질산염 <1 mg/L, 질산염 <50 mg/L, 이산화탄소 <50 mg/L | |
| 2% 파라포름알데히드와 1x PBS의 혼합 용액(50mL) | 25 mL의 4% 파라포름알데히드, 5 mL의 10x PBS 완충액, 및 이중 증류수(ddH2O) q.s. 내지 50 mL | |
| 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) 및 10 mMMgCl2의 혼합 용액 (50 mL) | 5 mL의 1 M 트리스-HCl (pH=7.5), 0.5 mL의 1 MMgCl2, 및ddH2Oq.s. 내지 50 mL | |
| 80 % 무수 에탄올, 10 mMMgCl2 및 100 mM Tris-HCl (pH = 7.5)의 혼합 용액 (50 mL) | 42.1 mL의 95% 무수 에탄올, 5 mL의 1 M Tris-HCl (pH=7.5), 0.5 mL의 1 MMgCl2, 및ddH2O를 50 mL로 | |
| 50 % 무수 에탄올과 100mM Tris-HCl (pH = 7.5)의 혼합 용액 (50mL) | 26.3 mL의 95% 무수 에탄올, 5 mL의 1 M Tris-HCl (pH=7.5), 및ddH2Oq.s. 내지 50 mL | |
| 25 % 무수 에탄올과 100mM Tris-HCl (pH = 7.5)의 혼합 용액 (50mL) | 13.2 mL의 95% 무수 에탄올, 5 mL의 1 M Tris-HCl (pH=7.5), 및ddH2Oq.s. 내지 50 mL | |
| 3%H2O2용액과 0.5% KOH 용액의 혼합 용액 | 사용 전에 혼합된 동일한 양의 6%H2O2및 1% KOH | |
| 25 % 글리세린과 0.1 % KOH의 혼합 용액 (50 mL) | 100% 글리세린 12.5mL, 20% KOH 0.25mL, 및ddH2Oq.s. 내지 50mL | |
| 0.01 % 알리자린 (50 mL) | 0.5% 알리자린 1mL, 100% 글리세린 12.5mL, 1M 트리스-HCl(pH=7.5) 5mL, 및ddH2Oq.s. 내지 50mL | |
| 50 % 글리세린과 0.1 % KOH의 혼합 용액 (50 mL) | 100% 글리세린 25mL, 20% KOH 0.25mL, 및ddH2Oq.s. 내지 50mL | |
표 1: 알리자린 적색 염색 프로토콜에 사용된 용액의 조성. 약어 : q.s. = 양자 충분 (필요한 경우).
보충 파일: 이미지 분석을 위한 샘플 그래프 집합입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제브라 피쉬는 뼈 대사 질환을 연구하기에 적합한 모델입니다. 설치류 모델에 비해 제브라 피쉬 모델은 비교적 빠르게 확립 할 수 있으며 질병의 중증도 측정이 더 쉽습니다. 야생형 제브라 피쉬 유충에서 머리 골격의 광물 화는 5dpf에서 발생하고 축 골격은 7dpf15에서 발생합니다. 따라서 PS, OP, CB 및 NC와 같은 두개골 뼈는 9dpf에서 잘 발달되어 있습니다. 유충이 완전히 염색되고 표백 된 후 연조직이 제거되어 물고기 몸체가 투명하게 보입니다. 알리자린 레드 염색 시약을 첨가하여 제브라피쉬의 미네랄 뼈를 빨간색으로 염색하고 시각화했습니다.
이미지 분석은 이 실험에서 신뢰할 수 있는 실험 결론을 얻는 데 중요합니다. 좋은 자세와 깨끗한 배경을 가진 제브라 피쉬의 사진이 정량 분석을 위해 선택되었습니다. 단일 이미지에 대해 염색 된 영역을 정량화하면 한 물고기의 빨간색으로 염색 된 모든 광물 화 된 뼈가 계산됩니다. 따라서 납 노출군과 대조군 간의 골량 변화를 비교할 수 있습니다. 이 연구에서 PbAc 노출은 제브라 피쉬에서 발달 독성을 유발했으며 9dpf에서 10 및 20 mg / L PbAc 노출 그룹에서 미네랄 뼈의 염색 된 영역의 현저한 감소가 관찰되었습니다. 따라서 PbAc에 대한 초기 배아 노출은 제브라 피쉬 유충의 뼈 질량을 감소 시켰습니다. 그림 1 은 제브라피쉬 유충에서 알리자린 레드 염색으로 시각화된 PbAc 유도 골 손실을 보여줍니다.
석회화 된 매트릭스에 결합하는 염료는 전체 골격에 라벨을 붙이는 데 사용됩니다. Calcein은 살아있는 조직의 칼슘에 특이적으로 결합할 수 있는 형광 발색단이며 뼈 구조를 표시하고 뼈 성장을 연구하는 데 사용되었습니다10. 칼세인과 달리 고정 조직의 알리자린 적색 염색은 여러 표본의 비교를 용이하게 할 수 있는 골격 변화에 대한 영구적인 기록을 생성합니다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (Micro CT)은 일련의 2D X- 레이를 획득하여 광물 조직의 정확한 정량 분석을 제공 할 수 있습니다. 그러나, 제브라피쉬의 크기가 작고 발달하는 제브라피쉬 골격의 많은 뼈가 얇기 때문에, Micro CT 분석 도구는 이들 뼈를 정확하게 특성화할 수 없다(16).
형광 형질전환 리포터 라인은 또한 살아있는 유충 또는 더 성숙한 물고기의 골격 발달을 실시간으로 시각화하는 데 도움이 됩니다17. 유사하게, 알리자린 레드 S 생체내 염색은 활어의 평가 및 기형의 연속적인 추적을 허용한다18. 따라서 알리자린 레드 염색은 제브라 피쉬 유충의 뼈 손실을 분석하는 유용하고 비용 효율적인 방법입니다. 그러나 실험 단계의 복잡성과 사용 된 용액의 수로 인해 알리자린 적색 염색 이미지 분석의 최종 결과는 실험 작업의 영향을받을 수 있습니다. 또한, 체적 및 연조직의 증가로 인해 성인 제브라 피쉬에 대해이 염색 방법을 사용하는 것은 어렵다; 마이크로 CT 분석 또는 형질 전환 라인은 성인 제브라 피쉬의 골격 영상에 더 나은 선택이 될 것입니다. 요약하면, 여기에 제시된 프로토콜은 화학 독성 물질 노출 후 제브라 피쉬 유충의 뼈 광물 화 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차는 뼈 질환을 연구하고 새로운 치료 약물을 개발하기 위해 제브라 피쉬 모델을 수립하는 데 유용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81872646; 81811540034; 81573173)과 강소 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발 (PAPD)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
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