Summary
Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd in dit protocol een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren.
Abstract
Drosophila fototransductie is een van de snelst bekende G-eiwit-gekoppelde signaalroutes. Om de specificiteit en efficiëntie van deze cascade te garanderen, bindt het calcium (Ca2+)-permeabele kationkanaal, transient receptor potential (TRP), zich stevig aan het steigereiwit, inactivatie-no-after-potential D (INAD), en vormt een groot signaleringseiwitcomplex met oogspecifiek eiwitkinase C (ePKC) en fosfolipase Cβ/No-receptorpotentiaal A (PLCβ/NORPA). De biochemische eigenschappen van het Drosophila TRP-kanaal blijven echter onduidelijk. Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene TRP-kanaal te zuiveren. Ten eerste werd het gezuiverde histidine (His)-gelabelde NORPA 863-1095-fragment gebonden aan Ni-kralen en gebruikt als lokaas om het endogene INAD-eiwitcomplex uit Drosophila-hoofdhomogenaten naar beneden te halen. Vervolgens werd overmatig gezuiverd glutathion S-transferase (GST)-gelabeld TRP 1261-1275-fragment toegevoegd aan de Ni-kralen om te concurreren met het TRP-kanaal. Ten slotte werd het TRP-kanaal in het supernatant gescheiden van het overmatige TRP 1261-1275-peptide door grootte-uitsluitingschromatografie. Deze methode maakt het mogelijk om het gatingmechanisme van het Drosophila TRP-kanaal te bestuderen vanuit zowel biochemische als structurele hoeken. De elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverde Drosophila TRP-kanalen kunnen ook in de toekomst worden gemeten.
Introduction
Fototransductie is een proces waarbij geabsorbeerde fotonen worden omgezet in elektrische codes van neuronen. Het geeft uitsluitend opsinen en de volgende G-eiwit-gekoppelde signaleringscascade door bij zowel gewervelde als ongewervelde dieren. In Drosophila organiseert scaffold protein inactivation-no-after-potential D (INAD) met behulp van zijn vijf PDZ-domeinen een supramoleculair signaleringscomplex, dat bestaat uit een transient receptor potential (TRP) kanaal, fosfolipase Cβ/No receptor potential A (PLCβ/NORPA) en oogspecifiek eiwitkinase C (ePKC)1. De vorming van dit supramoleculaire signaleringscomplex garandeert de juiste subcellulaire lokalisatie, hoge efficiëntie en specificiteit van Drosophila-fototransductiemachines. In deze complexe, lichtgevoelige TRP fungeren kanalen als downstream effectoren van NORPA en bemiddelen calciuminstroom en de depolarisatie van fotoreceptoren. Eerdere studies toonden aan dat de opening van het Drosophila TRP-kanaal wordt gemedieerd door protonen, verstoring van de lokale lipidenomgeving of mechanische kracht 2,3,4. Het Drosophila TRP-kanaal interageert ook met calmodulin5 en wordt gemoduleerd door calcium door zowel positieve als negatieve feedback 6,7,8.
Tot nu toe waren elektrofysiologische studies over het gatingmechanisme van Drosophila TRP- en TRP-achtige (TRPL) kanalen gebaseerd op weggesneden membraanpleisters, hele-cel opnames van gedissocieerde wild-type Drosophila-fotoreceptoren en hetero-uitgedrukte kanalen in S2-, SF9- of HEK-cellen 2,9,10,11,12,13, maar niet op gezuiverde kanalen. De structurele informatie van het drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte blijft ook onduidelijk. Om de elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverd eiwit in een gereconstitueerde membraanomgeving te bestuderen en structurele informatie te verkrijgen over het Drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte, is het verkrijgen van gezuiverde TRP-kanalen over de volledige lengte de noodzakelijke eerste stap, vergelijkbaar met de methodologieën die worden gebruikt in TRP-kanaalstudies van zoogdieren 14,15,16,17.
Onlangs werd op basis van het assemblagemechanisme van INAD-eiwitcomplex 18,19,20 voor het eerst een affiniteitszuiverings- plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het TRP-kanaal te zuiveren van Drosophila-hoofdhomogenaten door streptavidin-kralen 5. Gezien de lage capaciteit en de dure kosten van streptavidin-kralen, wordt hier een verbeterd zuiveringsprotocol geïntroduceerd dat his-tagged aaseiwit en bijbehorende goedkope Ni-kralen met een veel hogere capaciteit gebruikt. De voorgestelde methode zal helpen om het gatingmechanisme van het TRP-kanaal vanuit structurele hoeken te bestuderen en de elektrofysiologische eigenschappen van het TRP-kanaal te meten met gezuiverde eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zuivering van GST-gelabelde TRP- en His-tagged NORPA-fragmenten
- Zuiveren GST-tagged TRP 1261-1275 fragment
- Transformeer de pGEX 4T-1 TRP 1261-1275plasmide 10 in Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) cellen met behulp van de CaCl2 heat-shock transformatiemethode21. Ent een enkele kolonie in 10 ml Luria Bertani (LB) medium en groei 's nachts bij 37 °C. Versterk vervolgens de 10 ml zaaicultuur in 1 L LB-medium bij 37 °C.
- Nadat de optische dichtheid (OD600) van de cellen 0,5 heeft bereikt, koelt u de cellen af tot 16 °C en voegt u 0,1 mM isopropyl toe β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; eindconcentratie) om de overexpressie van het doeleiwit te induceren en incubeert u gedurende 18 uur bij 16 °C.
- Na overexpressie pellet 1 L gekweekte cellen door centrifugatie bij 3.993 × g gedurende 20 minuten en resuspensie in 40 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer.
- Laad de geresuspendeerde cellen in een hogedrukhomogenisator die is voorgekoeld bij 4 °C. Verhoog langzaam de homogenisatordruk tot 800 bar. Open de inlaatkraan en laat de geresuspendeerde cellen cirkelvormig door een klep met zeer smalle spleten gaan.
OPMERKING: De cellen worden gehomogeniseerd door de hoge schuifkrachten veroorzaakt door een grote drukval en cavitatie. - Laad 5 ml glutathionkorrels op een zwaartekrachtstroomkolom en was de kralen met 50 ml PBS-buffer voor een totaal van drie keer.
- Centrifugeer het cellysaat uit de hogedrukhomogenisator bij 48.384 x g. Voeg het supernatant van het gecentrifugeerde cellysaat (40 ml) toe aan de gebalanceerde glutathionkorrels in de zwaartekrachtstroomkolom en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C. Resuspend de glutathion kralen om de 10 min.
- Open na 30 minuten incubatie de kolomuitlaatkraan om de kralen en doorstroomfractie te scheiden. Gooi de doorstroomfractie weg. Spoel de resterende glutathionparels tweemaal met 50 ml PBS-buffer.
- Voeg 15 ml el elutiebuffer toe aan de glutathionparels en incubeer gedurende 30 minuten. Resuspend de kralen om de 10 minuten.
- Elueerde na 30 minuten incubatie het GST-gelabelde TRP 1261-1275-fragment in een conische buis van 50 ml en belasting in een kolom met grootte-uitsluiting (voorbereidingsgraad), die in evenwicht wordt gebracht met behulp van 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) buffer.
- Houd het elutiedebiet van de kolom met grootte-uitsluiting op 3 ml/min. Verzamel de geëlueerde eiwitten met een snelheid van 5 ml / buis.
- Identificeer de piek van het doeleiwit in de kolom met grootte-uitsluiting door de UV-absorptiesignalen bij 280 nm te analyseren en te verifiëren door SDS-PAGE-gelanalyse (elektroforeseparameters: 150 V voor de stapelgel; 200 V voor de oplossende gel). Kleur de gel met Coomassie blue R250.
- Concentreer het gezuiverde GST-gelabelde TRP 1261-1275-fragment van de maatuitsluitingskolom tot 1 ml met behulp van een 15 ml ultrafiltratiespinkolom gecentrifugeerd bij 3.000 x g bij 4 °C in een gekoelde centrifuge op een bureau.
- Bepaal de concentratie geconcentreerd eiwit met behulp van de Beer-Lambert Law. Meet de UV-absorptie van GST-gelabeld TRP 1261-1275 fragment bij 280 nm met behulp van een spectrofotometer.
- Verkrijg de extinctiecoëfficiënt bij 280 nm door de eiwitsequenties te importeren in het Protparam-programma (https://web.expasy.org/protparam/). Typisch, 1 L cultuur van GST-gelabelde TRP 1261-1275 levert 1 ml van 600 μM eiwit (6 x 10-7 mol). Zie tabel 1 voor de benodigde materialen.
- Zuivering van his-tagged NORPA 863-1095 fragment
- Transformeer de pETM.3C NORPA 863-1095plasmide 20 in E. coli BL21 (DE3) cellen met behulp van de CaCl2 heat-shock transformatiemethode21. Ent een enkele kolonie in 10 ml LB-medium en groei 's nachts bij 37 °C. Versterk vervolgens de zaaicultuur van 10 ml in 1 L LB-medium bij 37 °C.
- Nadat de OD600 van de cellen 0,5 heeft bereikt, koelt u de cellen af tot 16 °C en voegt u 0,1 mM IPTG (eindconcentratie) toe om de overexpressie van het doeleiwit te induceren en incubeert u bij 16 °C gedurende 18 uur.
- Na overexpressie pellet 1 L gekweekte cellen door centrifugatie bij 3.993 x g gedurende 20 minuten en resuspensie in 40 ml bindingsbuffer. Laat vervolgens de geresuspendeerde cellen in een hogedrukhomogenisator bij 4 °C lyseren, zoals beschreven in stap 1.1.4.
- Laad 5 ml Ni-kralen in een zwaartekrachtstroomkolom en was drie keer met 50 ml bindingsbuffer.
- Centrifugeer het cellysaat uit de hogedrukhomogenisator bij 48.384 x g. Voeg het supernatant van het gecentrifugeerde cellysaat toe aan de gebalanceerde Ni-kralen in de zwaartekrachtstroomkolom en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C. Resuspend de Ni-kralen elke 10 min.
- Open na 30 minuten incubatie de kolomuitlaatkraan om de kralen en doorstroomfractie te scheiden. Gooi de doorstroomfractie weg en was de resterende Ni-kralen twee keer met 50 ml wasbuffer.
- Voeg 15 ml el elutibuffer toe aan de Ni-kralen en incubeer gedurende 30 minuten. Resuspend de Ni-kralen elke 10 min.
- Verzamel na 30 minuten incubatie het geëlueerde His-tagged NORPA 863-1095-fragment in een conische buis van 50 ml en laad het in een kolom met grootte-uitsluiting (bereidingsklasse), die in evenwicht wordt gebracht met behulp van 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
- Houd het elutiedebiet van de kolom met grootte-uitsluiting op 3 ml/min. Verzamel het geëlueerde eiwit met een snelheid van 5 ml / buis.
- Identificeer de piek van het doeleiwit in de kolom met grootte-uitsluiting door de UV-absorptiesignalen bij 280 nm te analyseren en te verifiëren door SDS-PAGE-gelanalyse (elektroforeseparameters: 150 V voor de stapelgel; 200 V voor de oplossende gel). Kleur de gel met Coomassie blue R250.
- Concentreer het gezuiverde His-tagged NORPA 863-1095-fragment van de maat-uitsluitingskolom tot 1 ml met behulp van een 15 ml ultrafiltratiespinkolom gecentrifugeerd bij 3.000 x g bij 4 °C in een gekoelde centrifuge op een bureau.
- Bepaal de concentratie geconcentreerd eiwit met behulp van de Beer-Lambert Law. Meet de UV-absorptie van het HIS-tagged NORPA 863-1095 fragment bij 280 nm met behulp van een spectrofotometer.
- Verkrijg de extinctiecoëfficiënt bij 280 nm door de eiwitsequenties te importeren in het Protparam-programma (https://web.expasy.org/protparam/). Typisch, 1 L cultuur van His-tagged NORPA 863-1095 fragment levert 1 ml van 600 μM eiwit (6 x 10-7 mol). Zie tabel 2 voor de benodigde materialen.
2. Bereiding van Drosophila-koppen
- Verzamel volwassen vliegen in conische centrifugatiebuizen van 50 ml met behulp van de CO 2-anesthesiemethode22,23; onmiddellijk invriezen in vloeibare stikstof gedurende 10 min en bewaren in een -80°C vriezer.
- Nadat u een voldoende aantal vliegen hebt verzameld, schudt u de bevroren conische buizen van 50 ml krachtig met de hand om de benen, hoofden, vleugels en lichamen van de vliegen te scheiden. Breng het mengsel over in drie opeenvolgend gestapelde voorgekoelde roestvrijstalen zeven (respectievelijk 20/30/40 maaswijdte) en schud de zeven.
- Aangezien de koppen vervolgens niet door de zeef met 40 mazen kunnen, gebruikt u een borstel om de vliegenkoppen van de zeef met 40 mazen te vegen, brengt u ze over in conische buizen van 50 ml en bewaart u ze bij −80 °C.
- Verzamel de vliegen en hun hoofden continu en bewaar ze in een vriezer van -80 °C totdat ze de vereiste hoeveelheid bereiken die nodig is voor experimenten (0,5 g). Typisch, om 0,5 g koppen te verzamelen, is 35 ml vliegen in een conische buis van 50 ml nodig. Zie tabel 3 voor de benodigde materialen.
3. Drosophila TRP kanaalzuivering
- Weeg in totaal 0,5 g koppen en homogeniseer volledig in vloeibare stikstof met behulp van een voorgekoelde vijzel-stamper. Los de gehomogeniseerde koppen op in 10x v/g lysisbuffer (5 ml), incubeer in een schudder bij 4 °C gedurende 20 minuten en centrifugeer vervolgens bij 20,817 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Verzamel het spin-down supernatant ("20817 g S", figuur 4) en centrifugeer het verder bij 100.000 x g gedurende 60 minuten bij 4 °C. Gebruik het spin-down supernatant ("100.000 g S", figuur 4) voor de volgende pull-down assay.
- Voeg 1 ml Ni-kralen toe aan de zwaartekrachtstroomkolom en was de kralen met 10 ml dubbel gedestilleerd H2O (ddH2O) bij 4 °C gedurende in totaal drie keer. Breng de kralen in evenwicht met 10 kolomvolumes lysisbuffer driemaal bij 4 °C.
- Voeg 500 μL 600 μM gezuiverd His-tagged NORPA 863-1095 eiwit (3 x 10-7 mol) toe aan de Ni-kolom en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C. Resuspend de kralen om de 10 minuten.
- Open de kolomuitlaatkraan om de kralen en doorstroomfractie te scheiden. Neem de doorstroomfractie voor SDS-PAGE-analyse (NORPA F, figuur 4). In dit gedeelte worden de aaseiwitten geïmmobiliseerd op de Ni-kralen.
- Was de Ni-kralen met 10 kolomvolumes lysisbuffer (10 ml) op 4 °C en bewaar de wasfractie voor SDS-PAGE-analyse (Was 1, figuur 4A). Herhaal de bovenstaande stappen en bewaar het monster voor SDS-PAGE-analyse (Wash 2, Figuur 4A). In deze sectie worden de overmatige aaseiwitten op de Ni-kralen verwijderd.
- Voeg het supernatant van Drosophila-hoofdhomogenaat na 100.000 x g centrifugatie toe aan de Ni-kolom bij 4 °C, waar het NORPA 863-1095-fragment met his-label is geïmmobiliseerd.
- Incubeer het supernatant met de Ni-kralen bij 4 °C gedurende 30 min. Resuspend de kralen om de 10 minuten. Open vervolgens de kolomuitlaatkraan om de kralen en doorstroomfractie te scheiden.
- Verzamel het supernatant voor SDS-PAGE analyse (Dro head lysis F, Figuur 4A). In deze sectie worden de INAD-eiwitcomplexen (INAD/TRP/ePKC) in de hoofdhomogenaten opgevangen door de geïmmobiliseerde NORPA 863-1095-fragmenten op de Ni-kralen.
- Was de Ni-kralen met 10 kolomvolumes lysisbuffer (10 ml) bij 4 °C en houd het supernatant uit de neerslag van de zwaartekracht voor SDS-PAGE-analyse (Wash 3, figuur 4A). Herhaal de bovenstaande stappen en verzamel het supernatant voor SDS-PAGE-analyse (Wash 4, Figuur 4A). In deze sectie worden de ongebonden eiwitten op de Ni-kralen verwijderd.
- Voeg 500 μL 600 μM GST-gelabeld TRP 1261-1275 eiwit (3 x 10-7 mol) toe aan de Ni-kralen en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C. Resuspend de kralen om de 10 minuten.
- Verzamel de geëlueerde fractie uit de zwaartekrachtkolom (TRP E1, figuur 4B), die het endogene Drosophila TRP-kanaal bevat. Herhaal de bovenstaande stappen en verzamel de elutifractie (TRP E2, figuur 4B). In deze stap, door de GST-gelabelde TRP 1261-1275-fragmenten als concurrent te gebruiken, worden de TRP-kanalen geëlueerd uit de gevangen INAD-eiwitcomplexen (INAD / TRP / ePKC) op de Ni-kralen.
- Was de Ni-kralen met 10 kolomvolumes bindingsbuffer (10 ml; Tabel 1) bij 4 °C en verzamel de wasfractie voor SDS-PAGE-analyse (Was 5, figuur 4B).
- Voeg 500 μL el el elutibuffer (tabel 1) toe aan de Ni-kralen en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C. Verzamel de elutiefractie uit de kolom met de zwaartekrachtstroom (NORPA E1, figuur 4B). Herhaal de bovenstaande stappen en verzamel de elutiedractie (NORPA E2, figuur 4B).
- Eluuteer met behulp van de elutibuffer het His-tagged NORPA 863-1095-fragment vergezeld van de INAD/ePKC-eiwitcomplexen. Resuspendeer vervolgens de Ni-kralen in 500 μL bindingsbuffer.
- Neem de resuspended Ni-kralen om de SDS-PAGE (gekleurd door Coomassie blue R250) uit te voeren om de efficiëntie van de elutie te analyseren en te evalueren of de eluutbuffer werkt (kralen, figuur 4B). Zie tabel 4 voor de benodigde materialen.
4. Grootte-uitsluiting kolom zuivering van Drosophila TRP kanaal
- Installeer een kolom met grootte-uitsluiting (analytische kwaliteit) op het eiwitzuiveringssysteem. Breng de kolom in evenwicht met de kolombuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), die wordt gefilterd door een filter van 0,45 μm.
- Concentreer de TRP E1- en E2-fractie uit stap 3.14 met behulp van een ultrafiltratiespinkolom van 4 ml, gecentrifugeerd bij 3.000 x g bij 4 °C in een gekoelde centrifuge.
- Spoel de monsterlus af met de kolombuffer en laad het monster in de monsterlus. Injecteer het monster in de kolom met grootte-uitsluiting en eluteer de eiwitten met een juiste stroomsnelheid (0,5 ml / min).
- Identificeer de piek van het doeleiwit door absorptie bij 280 nm en voer een SDS-PAGE-gel uit om het gezuiverde endogene Drosophila TRP-kanaal te detecteren (figuur 5). Zie tabel 5 voor de benodigde materialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit artikel wordt een eiwitzuiveringsmethode gedemonstreerd om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren (figuur 1).
Ten eerste worden recombinante eiwitexpressie en -zuivering toegepast om het aas en concurrerende eiwitten te verkrijgen. Vervolgens wordt een GST-gelabeld TRP 1261-1275-fragment uitgedrukt in E. coli BL21 (DE3) -cellen in LB-medium en gezuiverd met glutathionparels en een kolom met grootte-uitsluiting (figuur 2). De monsters werden geverifieerd met behulp van SDS-PAGE-analyse met Coomassie blauwe R250-kleuring. In het SDS-PAGE monstervoorbereidingsproces wordt 30 μL eiwitmonster gemengd met 10 μL 4x ladende kleurstof en gedurende 10 minuten gekookt bij 100 °C. Vervolgens wordt 15 μL gekookt monster individueel in elke put geladen. Het His-tagged NORPA 863-1095 fragment wordt ook op dezelfde manier tot expressie gebracht in E. coli BL21 (DE3) cellen in LB medium en gezuiverd door Ni-kralen en grootte-uitsluiting kolom (Figuur 3). De gezuiverde GST-gelabelde TRP 1261-1275 en His-tagged NORPA 863-1095 zijn geconcentreerd voor de zuivering van het endogene Drosophila TRP-kanaal.
Ten tweede worden Drosophila-koppen verzameld en gehomogeniseerd in vloeibare stikstof met behulp van een voorgekoelde mortel-stamper en vervolgens opgelost in 10x v /w lysisbuffer (tabel 4). Het opgeloste hoofdhomogenaat wordt gedurende 20 minuten geïncubeerd in een schudder bij 4 °C en gedurende 20 minuten bij 4 °C bij 20,817 x g gecentrifugeerd. Het spin-down supernatant (20817 g S, figuur 4A) wordt verzameld en verder gecentrifugeerd bij 100.000 x g gedurende 60 minuten bij 4 °C. Het tweede spin-down supernatant (100.000 g S, figuur 4A) wordt gebruikt voor de daaropvolgende pull-down assay.
Ten slotte wordt, op basis van de principes van pull-down en concurrentietest, de affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie gebruikt om het endogene TRP-kanaal te zuiveren. Het gezuiverde His-tagged NORPA 863-1095 fragment is gebonden aan Ni-kralen en wordt gebruikt als het lokaas om de endogene INAD-eiwitcomplexen van Drosophila-hoofdhomogenen naar beneden te trekken. Vervolgens wordt een overmatig gezuiverd GST-getagd TRP 1261-1275-fragment toegevoegd om te concurreren om het TRP-kanaal van de gevangen INAD-complexen op de Ni-kralen (TRP E1, TRP E2, Figuur 4B). Uiteindelijk wordt het geëlueerde TRP-kanaal gescheiden van het overmatige GST-gelabelde TRP 1261-1275-peptide door grootte-uitsluitingschromatografie (figuur 5). In het SDS-PAGE monstervoorbereidingsproces wordt 30 μL eiwitmonster gemengd met 10 μL 4x ladende kleurstof en gedurende 10 minuten gekookt bij 100 °C. Vervolgens wordt de 15 μL monster individueel in elke put geladen. Als bijproduct kunnen de INAD-ePKC-NORPA 863-1095 complexen ook worden verkregen door de Ni-kralen te eluteren na TRP 1261-1275 peptide competitie (NORPA E1, NORAP E2, Figuur 4B). Met behulp van deze methode is de typische opbrengst van het uiteindelijke gezuiverde Drosophila TRP-kanaal van 0,5 g vliegenkoppen 50 μL 3 μM TRP-eiwit (1,5 x 10-10 mol). Als er meer gezuiverde TRP-kanalen nodig zijn, schaal dan de hoeveelheid vliegenkoppen, Ni-kralen, aaseiwit en concurrent dienovereenkomstig op.
Figuur 1: Het schematische diagram voor zuivering van endogene Drosophila TRP-kanaal. (A) Gezuiverde His-tagged NORPA 863-1095-eiwitten worden geïmmobiliseerd op de Ni-kralen. (B) Drosophila-koppen worden gehomogeniseerd en het spin-down supernatant na 100.000 x g centrifugatie wordt toegevoegd aan de NORPA-gebonden Ni-kralen, waar het NORPA 863-1095-eiwit fungeert als het lokaas om de endogene INAD-eiwitcomplexen (INAD / TRP / ePKC) te vangen. (C) Het GST-gelabelde TRP 1261-1275-fragment wordt toegevoegd om te concurreren om het endogene Drosophila TRP-kanaal van de gevangen INAD-eiwitcomplexen. (D) Het geëlueerde TRP-eiwit wordt verder gezuiverd door een kolom met grootte-uitsluiting om het overmatige GST-gelabelde TRP 1261-1275-fragment te scheiden. De rode pijlen markeren respectievelijk de elutieposities van het TRP-kanaal en het GST-gelabelde TRP 1261-1275-fragment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Zuivering van GST-gelabeld TRP-CT 1261-1275 eiwit door glutathionkorrels en grootte-uitsluitingschromatografie. (A) Zuiveringsprofiel van GST-gelabeld TRP-CT 1261-1275 eiwit in een maat-uitsluitingskolom (bereidingsgraad). De fracties worden verzameld bij 5 ml/buis. De fracties op de pijlpositie (buizen 44-48) worden verzameld en geconcentreerd voor de volgende zuivering van het endogene TRP-kanaal. (B) Coomassie blauwe R250 gekleurde SDS-PAGE gel met het GST-gelabelde TRP 1261-1275 fragment in de glutathion-kralen affiniteitszuivering en daaropvolgende grootte-uitsluiting kolom zuivering. De pijl markeert de positie van het GST-getagde TRP 1261-1275 fragment in de SDS-PAGE gel. Afkortingen: P: pellet van E. coli. BL21 (DE3) cellysaat na homogenisatie in PBS-buffer en centrifugatie bij 48.384 x g; S: supernatant van E. coli. BL21 (DE3) cellysaat na homogenisatie en centrifugatie bij 48.384 x g; F: doorstroomfractie na eerdere S-fractie geïncubeerd met glutathionparels gedurende 30 minuten bij 4 °C; W1 en W2: de eerste en tweede wasfractie met 10 kolomvolumes PBS-buffer; B: Niet-geëlueerd eiwit op de geresuspendeerde glutathionkorrels wordt geanalyseerd door SDS-PAGE-gel om de elutie-efficiëntie te evalueren; E: elutiedractie van glutathionparels door elutiebuffer. Het bufferrecept voor de GST-gelabelde eiwitzuivering wordt beschreven in tabel 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Zuivering van his-tagged NORPA 863-1095 eiwit door Ni-kralen en grootte-uitsluiting chromatografie. (A) Zuiveringsprofiel van His-tagged NORPA 863-1095 eiwit in een grootte-uitsluiting kolom. Debiet = 3 ml/min. De fracties worden verzameld bij 5 ml/buis. De fracties op de pijlpositie (buizen 44-49) worden verzameld en geconcentreerd voor de volgende zuivering van het endogene TRP-kanaal. (B) Coomassie blauwe R250 gekleurde SDS-PAGE gel met het His-tagged NORPA 863-1095 eiwit in Ni-kolom zuivering en daaropvolgende grootte-uitsluiting kolom zuivering. De pijl markeert de positie van het NORPA 863-1095-eiwit in de SDS-PAGE-gel. Afkortingen: P: pellet van E. coli. BL21 (DE3) cellysaat na homogenisatie in bindingsbuffer en centrifugatie bij 48.384 x g; S: supernatantfractie van E. coli. BL21 (DE3) cellysaat na homogenisatie en centrifugatie bij 48.384 x g; F: doorstroomfractie na de vorige S-fractie wordt gedurende 30 minuten bij 4 °C geïncubeerd met Ni-kralen; W1 en W2: de eerste en tweede wasfractie met 10 kolomvolumes wasbuffer; B: Niet-geëlueerd eiwit op de geresuspendeerde Ni-kralen na elutie; E: elutiefracties van Ni-kralen door de elutiebuffer. Het bufferrecept voor de His-tagged eiwitzuivering staat vermeld in tabel 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Zuivering van endogene Drosophila TRP kanaal. De verzamelde monsters van elke stap worden geanalyseerd door SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie blauwe R-250 kleurstof. A) 20817 g S: supernatantfractie van de kophomogenaten na 20,817 x g centrifugatie; NORPA F: doorstroomfractie van Ni-kralen na His-tagged NORPA 863-1095 fragmentbinding; Wash1 en Wash2: de eerste en tweede wasfracties van Ni-kralen door lysisbuffer na His-tagged NORPA 863-1095 binding; 100.000 g S: het vorige supernatant van 20.817 g S wordt verder gecentrifugeerd bij 100.000 x g en het supernatant wordt verzameld voor SDS-PAGE; Drokoplysis F: doorstroomfractie ni-kralen na incubatie met het monster van 100.000 g S; Wash3 en Wash4: wassen van fracties ni-kralen door lysisbuffer na incubatie met 100.000 g S-monster. (B) TRP E1 en E2: de eerste en tweede geëlueerde TRP-kanaalfracties door GST-gelabeld TRP 1261-1275-fragment; Wash5: wassen van fracties van Ni-kralen door bindingsbuffer na concurrentie door GST-gelabelde TRP 1261-1275; NORPA E1 en E2: de eerste en tweede elutiedractie van His-tagged NORPA 863-1095 fragmenten met gevangen INAD/ePKC complexen; kralen: niet-geëlueerd eiwit dat na een elutiebufferbehandeling in de geresuspendeerde Ni-kralen blijft. Het bufferrecept voor endogene Drosophila TRP-kanaalzuivering is beschreven in tabel 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Zuivering van endogene Drosophila TRP-kanaaleiwit door grootte-uitsluitingschromatografie. (A) Zuiveringsprofiel van endogene Drosophila TRP-kanaaleiwit in grootte-uitsluitingskolom. Debiet = 0,5 ml/min. De fracties werden verzameld bij 0,5 ml/buis. De fracties op de pijlpositie (1E8-1F2) werden verzameld en geconcentreerd. (B) Coomassie blauwe R-250 gekleurde SDS-PAGE gel met het endogene Drosophila TRP-kanaaleiwit na grootte-uitsluiting kolomzuivering. De positie van gezuiverd endogene Drosophila TRP-kanaaleiwit wordt gemarkeerd door de rode pijl. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Materialen die nodig zijn voor de zuivering van het GST-gelabelde TRP 1261-1275 fragment. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Materialen die nodig zijn voor de zuivering van het HIS-tagged NORPA 863-1095 fragment. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Materialen die nodig zijn voor de bereiding van Drosophila-koppen . Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Materialen die nodig zijn voor de zuivering van het Drosophila TRP-kanaal. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 5: Materialen die nodig zijn voor de zuivering van de kolomgrootte van het Drosophila TRP-kanaal. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
INAD, dat vijf PDZ-domeinen bevat, is de kernorganisator van Drosophila-fototransductiemachines. Eerdere studies toonden aan dat INAD PDZ3 bindt aan de TRP-kanaal C-terminale staart met een voortreffelijke specificiteit (KD = 0,3 μM)18. INAD PDZ45 tandem interageert met NORPA 863-1095 fragment met een extreem hoge binding affiniteit (KD = 30 nM). Deze bevindingen bieden een solide biochemische basis voor het ontwerpen van de affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie, waardoor het NORPA CC-PBM-fragment kan worden gebruikt als het pulldown-aas, terwijl de TRP C-terminale staart (fragment 1261-1275) functioneert als een concurrerend reagens. Daarom is het eerste kritieke punt voor deze methode om het assemblagemechanisme van het INAD-complex te begrijpen en voldoende NORPA- en TRP-fragmenten te verkrijgen. Tegelijkertijd, aangezien het TRP-kanaal het membraaneiwit is dat uit het membraan moet worden geëxtraheerd en in oplossing moet worden gestabiliseerd, is het gebruik van wasmiddel het tweede kritieke punt van deze methode. Als een populair reinigingsmiddel voor structurele en functionele studies van TRP-kanalen24,25, wordt n-Dodecyl-B-D-Maltoside (DDM) gebruikt in deze methode. Als de zuiveringsresultaten onbevredigend zijn, moeten de kwaliteiten van het aaseiwit, het eiwit van de concurrent en het wasmiddel zorgvuldig worden gecontroleerd. Bovendien kan de extractie-efficiëntie van de TRP-kanalen worden getraceerd door western blot met behulp van het TRP-antilichaam.
In een eerdere studie5 werden dure streptavidin-kralen gebruikt om het TRP-kanaal te zuiveren van vliegenkopextracten, wat routinematige zuivering in het laboratorium beperkt. Daarom werd de methode verbeterd door een His-tagged NORPA 863-1095-fragment te gebruiken in combinatie met Ni-kralen om de kosten te verlagen en de opbrengst te verhogen. Momenteel zijn de opbrengsten van het gezuiverde TRP-kanaal in de verbeterde methode voldoende om een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) negatief kleuringsexperiment uit te voeren, waarbij de gezuiverde TRP-kanalen tetrameren vormen (gegevens niet getoond), wat aangeeft dat het zuiveringsproces de tetrameervorming van TRP-kanalen niet verstoort. Daarom zal dit protocol mogelijk geschikt zijn voor toekomstige cryo-EM en elektrofysiologische experimenten.
Aangezien de concurrenten die in de experimenten worden gebruikt (NORPA 863-1095-fragment, TRP 1261-1275-fragment) vergelijkbare bindingsaffiniteiten hebben met wild-type eiwitten, is de beperking van deze methode dat enorme concurrerende eiwitten en kralen moeten worden gebruikt om het doeleiwit naar beneden te trekken. Het zal niet handig zijn voor laboratoria die het aas niet op grote schaal kunnen zuiveren.
Een mogelijke toekomstige toepassing van deze methode zal zijn om de structurele informatie van het Drosophila TRP-kanaal te bestuderen met behulp van Cryo-EM-technieken. Daarnaast is het meten van de elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverde endogene TRP-kanalen in het kunstmatige dubbellaagse lipidemembraan ook haalbaar. Bovendien zal het in dit gereconstitueerde modelsysteem interessant zijn om de elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverde endogene TRP-kanalen te karakteriseren door de INAD-complexe samenstelling en lipidesamenstelling te moduleren. Ten slotte kunnen, in combinatie met structurele informatie en elektrofysiologische eigenschappen, de gating- en regulatiemechanismen van het TRP-kanaal in de toekomst zorgvuldig worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) en natural science foundation van de provincie Guangdong, China (nr. 2021A1515010796) aan W. L. Wij danken LetPub (www.letpub.com) voor haar taalkundige hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
- Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
- Hardie, R. C., Franze, K.
- Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
- Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
- Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
- Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
- Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
- Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
- Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
- Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
- Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
- Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
- Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
- Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
- Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
- Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Hellmich, U. A., Gaudet, R.
