Summary
Den nuværende protokol beskriver en unik, klinisk relevant model af perifer arteriel sygdom, der kombinerer lårbensarterie og veneelektrokoagulering med administration af en nitrogenoxidsyntasehæmmer for at inducere bagbengangren i FVB-mus. Intrakardial DiI-perfusion anvendes derefter til tredimensionel billeddannelse i høj opløsning af fodpudens vaskulatur.
Abstract
Perifer arteriel sygdom (PAD) er en væsentlig årsag til sygelighed som følge af kronisk eksponering for aterosklerotiske risikofaktorer. Patienter, der lider af sin mest alvorlige form, kronisk lemmer-truende iskæmi (CLTI), står over for betydelige svækkelser i dagligdagen, herunder kroniske smerter, begrænset gåafstand uden smerte og nonhealing sår. Prækliniske modeller er blevet udviklet i forskellige dyr for at studere PAD, men musehænglet iskæmi er fortsat den mest anvendte. Der kan være betydelig variation som reaktion på iskæmisk fornærmelse i disse modeller afhængigt af den anvendte musestamme og stedet, antallet og midlerne til arteriel forstyrrelse. Denne protokol beskriver en unik metode, der kombinerer lårbensarterie og veneelektrokoagulering med administration af en nitrogenoxidsyntase (NOS) hæmmer for pålideligt at inducere fodpudegangren i Friend Virus B (FVB) mus, der ligner vævstabet af CLTI. Mens traditionelle midler til vurdering af reperfusion såsom laser Doppler perfusionsbilleddannelse (LDPI) stadig anbefales, anvendes intrakardiel perfusion af det lipofile farvestof 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI) til at mærke vaskulaturen. Efterfølgende helmonteret konfokal laserscanningsmikroskopi muliggør højopløselig, tredimensionel (3D) rekonstruktion af fodpudevaskulære netværk, der supplerer traditionelle midler til vurdering af reperfusion i bagbensiskæmimodeller.
Introduction
Perifer arteriel sygdom (PAD), der er karakteriseret ved nedsat blodgennemstrømning til ekstremiteterne på grund af aterosklerose, påvirker 6,5 millioner mennesker i USA og 200 millioner mennesker over hele verden1. Patienter med PAD oplever nedsat lemfunktion og livskvalitet, og dem med CLTI, den mest alvorlige form for PAD, har øget risiko for amputation og død med en 5-årig dødelighed, der nærmer sig 50%2. I klinisk praksis anses patienter med ankel-brachiale indekser (ABI) <0,9 for at have PAD, og dem med ABI <0,4 forbundet med enten hvilesmerter eller vævstab som havende CLTI3. Symptomerne varierer blandt patienter med lignende ABI'er afhængigt af daglig aktivitet, muskeltolerance over for iskæmi, anatomiske variationer og forskelle i sikkerhedsudvikling4. Ciffer og lemmer koldbrand er den mest alvorlige manifestation af alle vaskulære okklusive sygdomme, der resulterer i CLTI. Det er en form for tør nekrose, der mumificerer det bløde væv. Ud over aterosklerotisk PAD kan det også observeres hos patienter med diabetes, vaskulitider såsom Buerger's sygdom og Raynauds fænomen eller calciphylaxis i indstillingen af nyresygdom i slutstadiet5,6.
Flere prækliniske modeller er blevet udviklet til at studere patogenesen af PAD / CLTI og teste effekten af potentielle behandlinger, hvoraf den mest almindelige forbliver musehælkæmi. Inducerende bagbensiskæmi hos mus opnås typisk ved obstruktion af blodgennemstrømningen fra iliac- eller lårbensarterierne, enten ved suturligation, elektrokoagulation eller andre midler til at indsnævre det ønskede kar7. Disse teknikker reducerer drastisk perfusion til bagbenet og stimulerer neovaskularisering i lår- og lægmusklerne. Der er dog væsentlige murine-stammeafhængige forskelle i følsomhed over for iskæmisk fornærmelse, delvis på grund af anatomiske forskelle i sikkerhedsfordeling8,9. For eksempel er C57BL/6-mus relativt resistente over for bagbensiskæmi, hvilket viser nedsat lemfunktion, men generelt ingen tegn på koldbrand i fodpuden. På den anden side har BALB / c-mus en iboende dårlig kapacitet til at komme sig efter iskæmi og udvikler typisk auto amputation af foden eller underbenet efter lårbensarterieligation alene. Denne alvorlige reaktion på iskæmi indsnævrer det terapeutiske vindue og kan udelukke langsgående vurdering af lemmer reperfusion og funktion. Interessant nok har genetiske forskelle i et enkelt kvantitativt træk locus placeret på murinkromosom 7 været impliceret i disse differentielle modtageligheder af C57BL/6 og BALB/c mus til vævsnekrose og lemmer reperfusion10.
Sammenlignet med C57BL/6 og BALB/c stammer viser FVB-mus et mellemliggende, men inkonsekvent respons på lårbensarterieligation alene. Nogle dyr udvikler gangren i form af sorte iskæmiske negle eller mumificerede cifre, mens andre uden åbenlyse tegn på iskæmi11. Samtidig administration af Nω-Nitro-L-argininmethylesterhydrochlorid (L-NAME), en nitrogenoxidsyntase (NOS)-hæmmer12, forhindrer kompenserende vasodilatoriske mekanismer og øger yderligere oxidativt stress i bagbensvæv. I kombination med lårbensarterieligation eller koagulation producerer denne tilgang konsekvent fodpudevævstab hos FVB-mus, der ligner de atrofiske ændringer af CLTI, men sjældent udvikler sig til lemmer auto-amputation11. Oxidativ stress er et af kendetegnene ved PAD / CLTI og formeres af endoteldysfunktion og nedsat biotilgængelighed af nitrogenoxid (NO) 13,14. NO er et pluripotent molekyle, der normalt udøver gavnlige virkninger på arteriel og kapillær blodgennemstrømning, blodpladeadhæsion og aggregering og leukocytrekruttering og aktivering13. Reducerede niveauer af NOS har også vist sig at aktivere det angiotensinkonverterende enzym, som inducerer oxidativt stress og fremskynder udviklingen af åreforkalkning15.
Når en model af bagbensiskæmi er etableret, er der også behov for overvågning af efterfølgende lemmereperfusion og den terapeutiske virkning af eventuelle behandlinger. I den foreslåede murinegangrenmodel kan graden af vævstab først kvantificeres ved hjælp af Faber-scoren til vurdering af fodens bruttoudseende (0: normal, 1-5: tab af negle, hvor score repræsenterer antallet af berørte negle, 6-10: atrofi af cifre, hvor score repræsenterer antallet af berørte cifre, 11-12: delvis og fuldstændig fodatrofi, henholdsvis)9. Kvantitative målinger af bagbensperfusion foretages derefter typisk ved hjælp af LDPI, som er afhængig af Doppler-interaktioner mellem laserlys og røde blodlegemer for at indikere perfusion på pixelniveau i en region af interesse (ROI)16. Selvom denne teknik er kvantitativ, ikke-invasiv og ideel til gentagne målinger, giver den ikke granulære anatomiske detaljer i bagbensvaskulaturen16. Andre billeddannelsesmetoder, såsom mikrocomputertomografi (mikro-CT), magnetisk resonansangiografi (MRA) og røntgenmikroangiografi, viser sig enten at være dyre, kræver sofistikeret instrumentering eller på anden måde teknisk udfordrende16. I 2008 beskrev Li et al. en teknik til mærkning af blodkar i nethinden med det lipofile carbocyaninfarvestof DiI17. DiI inkorporerer i endotelceller og pletter ved direkte diffusion vaskulære membranstrukturer såsom angiogene spirer og pseudopodale processer17,18. På grund af dets direkte levering til endotelceller og farvestoffets stærkt fluorescerende karakter giver denne procedure intens og langvarig mærkning af blodkar. I 2012 tilpassede Boden et al. teknikken diI-perfusion til murine hindlimb iskæmi-modellen via helmonteret billeddannelse af høstede lår adduktormuskler efter lårbensarterieligation19.
Den nuværende metode giver en relativt billig og teknisk gennemførlig måde at vurdere neovaskularisering som reaktion på bagbensiskæmi og gen- eller cellebaseret terapi. I en yderligere tilpasning beskriver denne protokol anvendelsen af DiI-perfusion til at afbilde fodpudevaskulaturen i høj opløsning og 3D i en murinmodel af bagbengangren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg beskrevet i protokollen blev godkendt af University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). FVB-mus, både han- og hunmus, i alderen 8-12 uger, blev brugt til undersøgelsen.
1. Fremstilling af L-NAME-opløsning
- Under sterile forhold i en laminær flowhætte fremstilles en L-NAME-stamopløsning ved at opløse 1 g L-NAME-pulver (se materialetabellen) med 20 ml sterilt vand for at fremstille en opløsning på 50 mg/ml. Lageropløsningen opbevares i 300-500 μL alikvoter ved -20 °C i op til 3 måneder.
- For at fremstille en fungerende L-NAME-opløsning optøes en Alikvot L-NAME-stamopløsning og fortyndes med PBS (1:4) under sterile betingelser for at opnå en endelig koncentration på 10 mg/ml.
- Til fremstilling af PBS (pH 7,4) opløses 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 og 0,23 g NaH2PO4 i 800 ml destilleret vand. Tilsæt vand til et samlet volumen på 1.000 ml og filtrer gennem et flaskefilter på 0,22 μm.
BEMÆRK: Intraperitoneal (IP) injektion af 4 μL/g L-NAME arbejdsløsning svarer til den ønskede dosis på 40 mg/kg L-NAME. L-NAME arbejdsløsning skal opbevares på is under brug, og nye fortyndinger skal foretages dagligt ved hjælp af frisk optøede alikvoter af stamopløsning.
2. Kemisk og kirurgisk induktion af bagbengangren
- Få FVB-mus i alderen 8-12 uger enten fra en opdrætter eller opdrættet i anlægget (se materialetabel). 2 timer før operationen skal du administrere en IP-dosis på 40 mg/kg L-NAME.
- Anæstesi mus med IP-injektion af 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin (se tabel over materialer) fortyndet i PBS. Bekræft tilstrækkelig sedation ved fravær af tåklemmerefleks og fortsæt med at overvåge respirationshastigheden under proceduren.
- Fjern hår fra bilaterale bagben og lyske ved hjælp af en saks og/eller en hårfjerningscreme. Placer dyret under et kirurgisk mikroskop liggende; forlæng og tape ekstremiteterne på plads. Steriliser det kirurgiske felt ved omkreds at påføre povidon-jodopløsningen på det kirurgiske sted.
- Under 10-20x forstørrelse skal du bruge en saks eller en skalpel til at lave et snit på 1 cm langs lyskefolden, der er lige ringere end lyskebåndet. Brug fine tang og en steril bomuldsspidsapplikator til direkte at dissekere den inguinale fedtpude sideværts fra lyskebåndet og udsætte den underliggende lårbenskede, så lårbensarterien, venen og nerven er tydeligt identificeret (figur 1).
- Brug fine tang til at gennembore lårbenskeden. Børst forsigtigt lårbensnerven væk fra lårbensarterien. Identificer start af den laterale circumflex-gren af lårbensarterien (LCFA) dybt til lårbensnerven (figur 1).
- Fortsæt med elektrokoagulering af lårbensarterien og venen, der lige er proksimal til LCFA, ved at aktivere cautery-enheden (se Materialetabellen) og forsigtigt kontakte karrene med en side-til-side-bevægelse, hvilket sikrer, at lårbensnerven er godt isoleret og forbliver beskyttet mod termisk skade. Opdel det koagulerede beholdersegment med en saks.
- Fortsæt med eksponeringen af den distale lårbensarterie og vene ved at mobilisere den inguinale fedtpude medialt. Identificer den overfladiske epigastriske arterie og saphenopopliteal junction mere distalt.
- Pierce lårbenskeden mellem disse to steder og forsigtigt dissekere lårbensnerven væk fra lårbenskarrene. Fortsæt med koagulation og transektion af lårbensarterien og venen som beskrevet i trin 2.4.1.
- Skyl det kirurgiske felt ved hjælp af en sprøjte fyldt med steril PBS. Opnå hæmostase ved at anvende blidt tryk med en bomuldsspidsapplikator i 3-5 minutter på alle blødningsområder.
- Fortsæt med lukningen af snittet ved hjælp af absorberbar 5-0 sutur på en enkel kontinuerlig måde. Administrere en 1 mg/kg subkutan dosis buprenorphin med vedvarende frigivelse (se materialetabel) til postoperativ smertelindring.
- Bekræft tab af fodpudeperfusion i den ligerede bagben af LDPI (se tabel over materialer). Mens du stadig er bedømret, skal du placere dyret på en mørk skumpude i en udsat position under LDPI-maskinen og bruge sløjfer af elektrisk tape til at sikre fødderne på plads.
- Fortsæt med LDPI af bilaterale fødder. Når scanningen er afsluttet, skal du tegne et investeringsafkast omkring hvert fodpude og opnå de gennemsnitlige fluxværdier.
- Beregn perfusionsindekset som forholdet mellem gennemsnitlige fluxværdier fra den ligerede til ikke-ligerede fodpude. Sørg for, at perfusionsindekset er mindre end 0,1.
- Overfør dyret tilbage til et rent bur med en varmepude eller overheadlampe for at opretholde kernekropstemperaturen. Sørg for fuldstændig genopretning fra anæstesi, før du overfører mus tilbage til dyreanlægget.
3. Postoperativ administration af L-NAME og overvågning af bagbenskoldbrand
- På postoperative dage 1-3 administreres en yderligere 40 mg/kg IP-dosis L-NAME til hvert dyr. På samme tid skal du omhyggeligt evaluere foden fra det iskæmiske lem.
- Kvantificer graden af bagbensiskæmi og koldbrand ved hjælp af Faber-bagbensiskæmiscoren9. Scorer 1-5: antal iskæmiske negle; scorer 6-10: 1-5 iskæmiske cifre; score 11 og 12: delvis og fuldstændig fodatrofi. Optag Faber-scoringer på postoperative dage 1-3 og derefter ugentligt.
4. Fremstilling af DiI og arbejdsløsninger til dyreperfusion
- For at fremstille DiI-stamopløsning opløses 100 mg DiI-krystaller (se materialetabel) i 16,7 ml 100% ethanol. Dæk i aluminiumsfolie og lad den stå på en gyngeplatform natten over i mørket ved stuetemperatur.
- For at fremstille fortyndingsvandet opløses 50 g glucose i 1.000 ml destilleret vand for at give en 5% glucoseopløsning. Filtrer gennem et 0,22 μm flasketopfilter. Bland PBS og 5% glucoseopløsninger i forholdet 1:4 for at fremstille en fungerende fortyndingsopløsning.
5. Opsætning af udstyr og DiI-perfusion
- Lav DiI-arbejdsløsning ved at tilsætte 200 μL DiI-stamopløsning til 10 ml af arbejdsfortyndingsopløsningen (fremstillet i trin 4.2) umiddelbart før brug. Ryst i hånden for at blande godt.
- Tilslut to eller tre 3-vejs stophaner og en 25 G sommerfuglnål i serie. Forbered 10 ml sprøjter med 4 ml PBS, 10 ml DiI-opløsning og 10 ml 10% neutralt bufret formalin (se materialetabel).
- Tilslut sprøjten med formalin til den proksimale tilstrømningsport og injicer opløsningen for at skylle luft fra linjen; drej stophanen for at lukke porten. Gentag den samme procedure sekventielt, tilslut sprøjterne med DiI og derefter PBS til henholdsvis de midterste og distale tilstrømningsporte, og pas på at skylle alle luftbobler gennem stophaneenheden.
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er luftbobler i nogen del af stophaneenheden eller slangen. Luftbobler kan okkludere små arterier under perfusion, hvilket resulterer i dårlig intravaskulær DiI-fordeling og kompromitterede billeddannelsesresultater. - Når opsætningen er afsluttet, aflives dyret ved co2-overdosis i et induktionskammer.
- Placer dyret, der skal perfuseres i liggende stilling på en absorberende pude og fastgør axillae og underekstremiteter med nåle.
- Brug en saks til at lave et tværgående snit for at åbne bukhulen. Udsæt og del derefter venstre og højre membran for at få adgang til brysthulen.
- Skær brystvæggen på hver side af brystbenet fra de nedre ribben til den første eller anden ribben, undgå de indre thoraxarterier (brystarterier) medialt. Brug en hæmostat (se Tabel over materialer) til at gribe fat i den nedre ende af brystbenet og reflektere det mod dyrets hoved for at udsætte brysthulen.
- Identificer venstre ventrikel, som ser lysere ud i farven end højre ventrikel. Tag forsigtigt fat i hjertet med stump tang og indsæt sommerfuglnålen i venstre ventrikel.
- Brug en saks eller en 18 G nål til at punktere det højre atrium, så blod og perfusionsopløsninger kan vende tilbage til hjertet for at dræne. Stabiliser nålen med en eller to hænder, pas på ikke utilsigtet at punktere højre ventrikel og perfuse lunge snarere end systemisk cirkulation.
- Åbn porten til sprøjten med PBS, og injicer manuelt 2-4 ml med en hastighed på 1-2 ml/min i 1-2 minutter for at skylle blod ud af karsystemet. Sørg for vellykket perfusion ved at observere blødning fra højre atrium. Efter injektion skal du lukke porten på PBS-sprøjten.
- Åbn porten til sprøjten med DiI og injicer 5-10 ml med en hastighed på 1-2 ml/min i 5 min. Overvåg ørerne, næsen og håndfladerne, som skal blive lidt lyserøde med injektionen af DiI-opløsning. Efter injektion skal du lukke porten til DiI-sprøjten og vente i 2 minutter for at tillade inkorporering af farvestoffet før injektion af fikseringsmiddel.
- Åbn porten til sprøjten med formalin og injicer 5-10 ml med en hastighed på 1-2 ml/min i 5 min. Efter injektion skal du fjerne nålen fra venstre ventrikel og fortsætte med at høste væv af interesse.
- Brug en tung saks til at forskyde skinnebenet ved anklen og adskille venstre og højre fod helt fra underbenene. Anbring høstede fødder i en 6- eller 12-brønds plade med 1-2 ml 10% formalinopløsning. Pak pladen ind med folie og opbevar den ved 4 °C natten over.
6. Forberedelse af trædepudevæv til konfokal laserscanningsmikroskopi
- Den næste dag udskiftes fikseringsopløsningen i 6- eller 12-brøndsplade med 1-2 ml PBS pr. Brønd.
- For at hudfæste foden skal du først lave et langsgående snit med en skalpel på planten og dorsale aspekter af foden. Brug derefter tandpincet og en lille hæmostat forsigtigt al hud fra foden og cifrene og ikke beskadige det underliggende bløde væv.
- Fortsæt til montering og billeddannelse af væv, helst inden for 1-2 dage efter perfusion og høst. Alternativt kan du returnere fodpuder til 6- eller 12-brøndsplader med 1-2 ml PBS; dæk med folie og opbevar ved 4 °C for at opretholde fluorescens i op til 1 måned.
- For at montere væv skal du placere fødderne individuelt mellem to glasmikroskopdias med en skumbiopsipude foldet over sig selv (en eller to gange afhængigt af vævstykkelsen) i hver ende (se Materialetabel). Brug to små bindemiddelclips til at komprimere glasglider sammen i hver ende (endelig tykkelse ca. 1 mm).
BEMÆRK: Tykkere væv kræver længere scanningstider. Den skinnede fodpude kan komprimeres mellem glasrutschebaner en dag før billeddannelse for at reducere vævstykkelsen.
7. Konfokal laserscanningsmikroskopi
- Forbered dig på billedbehandlingen: Tænd for billedbehandlingssystemet, og start anskaffelsessoftwaren (se Tabel over materialer). Brug et mål med lav forstørrelse/lav numerisk blænde (f.eks. x5/0,15) til at tage billeder, da objektiver med lavere forstørrelse typisk har længere arbejdsafstande, der kræves til dette eksperiment.
- Klik på Ja til dialogboksen Aktivér fase. Aktivér laseren på 561 nm under fanen Konfiguration. På hovedskærmen skal du aktivere en synlig strålesti ved at klikke på knappen Synlig . Indstil en detektor til området 570-600 nm ved at klikke på det tilsvarende Aktive afkrydsningsfelt.
- Vælg ikonet Flisescanning under fanen Hent > anskaffelse, og indstil den ønskede opløsning (512 x 512 eller 1024 x 1024).
- Placer tørmonteret (intet vand eller PBS tilføjet) vævsprøve komprimeret mellem glasdias på mikroskopstadiet og bring væv i fokus.
- Hvis du vil indstille scanningsgrænserne, skal du navigere til øverste venstre eller højre hjørne af eksemplet. På fanen Erhvervelse under menuen Flisescanning skal du klikke på knappen Markér position . Naviger til det modsatte hjørne (henholdsvis nederst til højre eller venstre), og klik på knappen Marker position igen.
- For at indstille dybden af Z-stakken skal du klikke på live-knappen i nederste venstre hjørne af skærmen og navigere til midten af prøven. Brug z-akseknappen til at rulle igennem til bunden af prøven.
- På fanen Erhvervelse under Z-Stack-menuen skal du klikke på knappen Start . Rul gennem til toppen af eksemplet, og klik på knappen Afslut . Klik på Z-trinstørrelse , og indstil til den ønskede værdi (f.eks. 50 μm).
- I nederste højre hjørne af skærmen skal du klikke på Start for at begynde billedoptagelse.
8. Kvantitativ analyse og 3D-rekonstruktion af trædepude vaskularitet
- Download og installer den nyeste version af Fiji (ImageJ) samt Vessel Analysis plugin20. Åbn mikroskopi billedfiler i Fiji, som vil kombinere individuelle Z-serier i Z-stakke, der kan ses i z-aksen ved hjælp af skyderen nederst i billedet.
- Vælg det sammensatte Z-stack-billede, og vælg derefter Stakke > Z-projekt i menuen Billede for at oprette en todimensionel projektion. Konverter derefter Z-projektionen til binær under Process > Binary > Make Binary.
- Kør pluginet vaskulær tæthed under Plugins > vaskulær densitet. Når du bliver bedt om det, skal du bruge markøren til at spore et investeringsafkast omkring omkredsen af trædepuden og cifrene. Vær opmærksom på den beholdertæthed, der rapporteres, hvilket udtrykkes som en procentdel af ROI (vaskulær arealfraktion).
- Hvis du vil oprette 3D-rekonstruktioner i Fiji, skal du vælge Stakke > 3D-projekt og indstille den ønskede rotationsakse, vinkel og hastighed under menuen Billede. Alternativt kan du vælge Volume Viewer under menuen Plugins for at visualisere billeder som udsnit eller manipulere rekonstruktionen i de ønskede akser.
- For mere involveret 3D-gengivelse, brug alternativ billedanalyse og behandlingssoftware (se Tabel over materialer). Konverter filer til den ønskede softwares format, og sy individuelle flisescanninger ved hjælp af flisesyfunktionaliteten.
- Når du har syet individuelle flisescanninger sammen, skal du åbne den sammensatte fil og fortsætte med gengivelse af volumenoverfladen. Klik på Tilføj ny overflade for at åbne Guiden Surface Creation, og brug pilene til at skifte gennem menuer, især indstilling af ROI og tærskelintensitet. Når du er tilfreds med overfladegengivelsen, skal du bruge animationsfunktionaliteten til at oprette videoer af det behandlede billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver et pålideligt middel til at inducere iskæmi og vævstab i murinefodpuden ved hjælp af en kombination af lårbensarterie og venekoagulation med L-NAME-administration, en nitrogenoxidsyntasehæmmer, i modtagelige FVB-mus. Figur 1 beskriver anatomien af murine bagben vaskulatur og angiver stederne for lårbensarterien og venekoagulation (gul X), lige proksimal til den laterale circumflex lårbensarterie (LCFA) og proksimal til saphenopopliteal krydset. LCFA skal identificeres, og koagulationsstederne, der er respektive for denne struktur, holdes konsistente gennem alle kirurgiske procedurer. Som beskrevet, 2 timer før kirurgiske indgreb og på postoperative dage 1-3, blev mus også administreret 40 mg/kg IP L-NAME for at opretholde forhøjede vævsniveauer af oxidativ stress. Figur 2 viser variationen i vævstab, der kan forventes af denne model en uge efter operationen, med Faber scores9 registreret i nederste højre hjørne af hvert billede.
DiI-perfusion blev udført i FVB-mus 5 og 20 dage efter lårbensarterie og venekoagulation for at vurdere bagbensreperfusion efter induktion af iskæmi. Figur 3A illustrerer murinanatomien efter dissektion for at udsætte brysthulen. En sommerfuglnål indsættes i venstre ventrikel for at starte hjerteperfusion. Bemærk, at venstre ventrikel ser lidt lysere ud i farven end højre ventrikel. Figur 3B viser udstyret sat op med stophaner forbundet i serie og tre sprøjter fyldt med PBS, DiI-opløsning og fikseringsmiddel. Efter DiI-perfusion blev fødderne høstet, flået og komprimeret mellem mikroskopdias som vist i figur 3C, D før billeddannelse med et konfokalt laserscanningsmikroskop under 5x forstørrelse. Rekonstruktionsmikroskopibilleder afslørede normal vaskulær anatomi i ikke-ligeret kontrolfodpude (figur 4A) sammenlignet med alvorligt nedsat perfusion til fodpuden af ligeret bagben 5 dage efter operationen (figur 4B). Tyve dage efter operationen blev perfusionen til trædepuden signifikant forbedret (figur 4C, D og figur 5B), men ikke i det omfang, der er ikke-ligeret kontrol (figur 4A og figur 5A). Vaskularitet blev kvantificeret som beskrevet ovenfor ved hjælp af Vessel Density plugin i Fiji. Den vaskulære fraktion for kontrolfodpuden var 28%. Fem dage efter operationen blev fodpudens vaskulære fraktion alvorligt reduceret til 2%, men gradvist genoprettet til 15% og 18% i to separate mus med 20 dage postoperativt. For at visualisere den vaskulære anatomi i 3D importerede vi et syet mikroskopibillede til alternativ billedanalyse- og behandlingssoftware for at skabe en overfladegengivelse som beskrevet tidligere (supplerende figur 1). En video af overfladegengivelsen blev derefter oprettet ved hjælp af animationsfunktionaliteten (Video 1).
Figur 1: Anatomi af murine bagben vaskulatur og steder af lårbensarterien og venekoagulation. Den ydre iliac arterie fortsætter som lårbensarterien (FA) distal til inguinal ligament. De første grene af lårbensarterien omfatter lateral circumflex (LCFA) og dybe lårbensarterier (ikke afbildet). Mere distalt forgrener den proksimale kaudale lårben (PCFA) og overfladiske kaudale epigastriske arterier (SCEA) sig fra FA proksimal til bifurcation af saphenous (SA) og popliteal arterier (PA). Lårbensnerven (FN) løber langs lårbenskarrene og bør forsigtigt isoleres før koagulation af lårbenskarrene. FA og lårbensvene (FV) koagulationssteder er også angivet (X). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative billeder af bagbensgangren i FVB-mus med tilsvarende Faber-scorer. Graden af iskæmiske ændringer induceret af denne model varierer fra en eller flere iskæmiske negle (Faber scorer 1-5) til gangrenøse cifre (Faber scorer 6-10) og delvis eller fuldstændig fodatrofi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dissektion af dyr og udstyrsopsætning til DiI-perfusion og montering af musefod til billeddannelse. (A) Anatomisk fotografi af murinanatomien under DiI-perfusion. Mave- og brysthulen åbnes, brystbenet reflekteres, og ribbenene skæres på hver side af brystbenet. En 25 G sommerfuglnål forbundet til stophaneenheden indsættes i venstre ventrikel. (B) Tre 3-vejs stophaner er forbundet i serie. Tre 10 ml sprøjter er fyldt med fikseringsmiddel, DiI og PBS og forbundet til stophaneenheden. En 25 G sommerfuglnål er forbundet til udstrømningsporten på den proksimale stophane. (C) Montering af flået fod mellem to mikroskopdias med en foldet skumbiopsipude og bindemiddelklemme i hver ende for at komprimere diasene sammen. (D) Et alternativt billede af den flåede fod komprimeret mellem mikroskopdias. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative 5x billeder opnået ved konfokal laserscanning mikroskopi af musefodkåtten efter DiI-perfusion med kvantificeret kartæthed udtrykt som en procent af ROI. (A) Normal fodpudevaskulatur. (B) Fodpudevaskulatur 5 dage efter lårbensarterie og venekoagulation viser alvorligt reduceret perfusion med minimal karofikificering. (C) Footpad vaskulatur 20 dage efter lårbensarterie og venekoagulation viser en vis rekonstitution af distal strømning til metatarsale og digitale arterier. (D) Billede af en ekstra musefodpude opnået 20 dage efter lårbensarterie og venekoagulation, der viser minimal stor kar sammenlignet med mikrovaskulær opacificering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Forstørrede billeder af fodpuden vaskulatur. (A) 5x og 20x billeder af kontrolfodpudevaskulatur, der viser intakt perfusion via metatarsale og digitale arterier. (B) 5x og 20x billeder af fodpude fra ligeret bagben 20 dage postoperativt, der viser reduceret perfusion via større metatarsale arterielle grene, men udviklingen af et omfattende, overdådigt kapillærnetværk. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Animation af 3D-overfladegengivelsen af fodpudens vaskulatur. Video, der viser en overfladegengivelse af fodpudens vaskulatur, illustrerer den 3D-opløsning, der kan opnås med den beskrevne protokol. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende figur 1: Trin i overfladegengivelsen af DiI-perfusionsbilleder. (A) Originalt DiI-perfusionsbillede importeret til billedanalyse- og behandlingssoftware. (B) Overfladegengivelse overlejret på DiI-perfusionsbillede under indstilling af tærskelintensiteten. (C) Endelig 3D-overfladegengivelse af DiI-perfusionsmikroskopibillede. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens musehælkæmi er den mest anvendte prækliniske model til at studere neovaskularisering i PAD og CLTI, er der signifikant variation i iskæmi sværhedsgrad og genopretning afhængigt af den specifikke musestamme, der anvendes, og stedet, antallet og metoden til arteriel forstyrrelse. Kombinationen af lårbensarterieligation og IP-administration af L-NAME kan pålideligt inducere bagbengangren i FVB-mus11. Den samme behandling resulterer i bagbensiskæmi uden vævstab hos C57BL/6-mus, mens autoamputation af foden eller benet i BALB/c-mus kan induceres ved lårbensarterieligation alene. Som sådan giver den ovenfor beskrevne teknik til lårbensarteriekoagulation med samtidig L-NAME-administration hos FVB-mus, som har et mellemliggende svar på iskæmifornærmelse, en unik og reproducerbar model af fodpudegangren beslægtet med den, der ses i den mest alvorlige manifestation af sygdomme, der fører til CLTI. Graden af vævstab observeret med denne model kan variere fra et par iskæmiske negle til flere gangrenøse cifre, men udvikler sig sjældent til automatisk amputation af foden eller benet, hvilket giver mulighed for langsgående vurdering af lemmer reperfusion og funktion. I modsætning til BALB / c-mus, hvor starten af koldbrand er hurtig med lemmer auto-amputation typisk forekommer på mindre end en uge, er der forsinket debut af vævstab i denne FVB-mus gangren model. Lårbensarteriekoagulation begrænser akut blodgennemstrømningen til bagbenet. Alligevel er akkumulering af oxidativt stress på grund af L-NAME administration på postoperative dage 0-3 mere gradvis, med peak atrofiske ændringer observeret mellem 7-14 dage. Derfor tilbyder denne model et forbedret terapeutisk vindue til at evaluere virkningerne af en bestemt intervention på bruttovævsudseende og redning af vævstab ud over at kvantificere reperfusion og vurdere lemmernes funktion.
Med hensyn til kirurgisk teknik foretrækkes koagulation eller ligering af både lårbensarterien og venen på grund af den relative lethed ved denne operation sammenlignet med isoleringen af lårbensarterien. Mens denne teknik kan føre til venøs trombose og insufficiens, forbinder den den iskæmiske fornærmelse og hjælper med at fremkalde gangrenøse ændringer mere pålideligt. Derudover er kronisk venøs insufficiens (CVI) meget udbredt i den generelle befolkning, hvor 10% -30% af de voksne er berørt. Konsekvent har ca. 20% af patienterne med PAD, især dem med svær arteriel insufficiens, også comorbid CVI21,22. Uanset om man beslutter at ligere eller koagulere lårbenet, er det kritisk vigtigt at opretholde det eller de specifikke sted (er) for lårbensarterieforstyrrelse konstant på tværs af eksperimentelle grupper. Mere proksimale ligationer, såsom iliacarteriens, fører til okklusion af yderligere nedstrøms sikkerhedsstillelser og begrænser muligheden for arteriogenese8,16. Imidlertid bør angiogenese i den distale del af lemmet, især gastrocnemius-musklen, stadig udløses. I FVB-mus inducerer dobbelt ligering eller koagulation af lårbensarterien lige proksimal til den laterale circumflex lårbensarterie og proksimal til saphenopopliteal bifurcation mere konsekvent koldbrand end et enkelt ligations- eller koagulationssted.
Det skal bemærkes, at hos PAD- og CLTI-patienter er limbiskæmi forårsaget af aterosklerotisk obstruktion (en kronisk proces). I modsætning hertil induceres lemmeriskæmi i musemodeller kirurgisk (en akut proces). Selvom denne FVB-musehalmgangrenmodel har en relativt langsommere indtræden af koldbrand med forsinket maksimal sværhedsgrad af vævstab, er den ikke direkte sammenlignelig med den kroniske, progressive arterielle stenose, der er karakteristisk for PAD og CLTI. Andre grupper har udviklet subakutte lårbensarterieokklusionsteknikker ved hjælp af ameroidindsnævringsre bestående af en ydre metalbøsning og et indre lag af fugtabsorberende materiale, der gradvist udvider sig selv. Denne teknik har vist sig at resultere i nedsat ekspression af inflammatoriske markører, lavere restitution af blodgennemstrømningen efter 4-5 uger og reduceret muskelnekrose23,24. Bortset fra forskelle i iskæmi skarphed undlader prækliniske modeller, der bruger unge, sunde dyr, også at replikere risikofaktorer som diabetes, hypertension, fedme, hyperlipidæmi, rygning og infektion, der bidrager til større uønskede lemmer og byrden ved vaskulær sygdom.
I de fleste undersøgelser af murine hindlimb iskæmi vurderes genoprettelse af blodgennemstrømningen til den iskæmiske bagben typisk via LDPI24,25. Denne metode er ikke-invasiv og repeterbar, men kan påvirkes af kropstemperatur, bedøvelsesbrug, hårtilstedeværelse og placering af bagbenene26. Standardisering af disse procedurer og brug af det ikke-ligerede bagben som en intern kontrol kan hjælpe med at afbøde eventuelle variationer. I modsætning til LDPI giver micro-CT og MRA anatomisk 3D-anatomisk information i høj opløsning, men kræver traditionelt injektion af kontrastmiddel16. Røntgenmikroangiografi er også invasiv og teknisk udfordrende16,27. Ligesom DiI giver perfusion med radiopaque silikonestøbemidler mulighed for post mortem 3D-rekonstruktion af den perifere vaskulatur28. Intrakardie- eller haleveneinjektion af fluorescerende lektin er også blevet beskrevet til mærkning af vævsvaskulatur29. Efter høst af væv af interesse anvendes immunohistokemisk farvning med endotelspecifikke markører (f.eks. CD31, von Willebrand-faktor) ofte til at kvantificere kapillærdensiteten30.
Sammenlignet med de ovennævnte teknikker giver DiI-perfusion flere fordele. For det første er de nødvendige reagenser og materialer relativt billige, forudsat at der er adgang til et konfokalt laserscanningsmikroskop. Denne metode muliggør 3D-rekonstruktion af vaskulaturen, som kan kvantificeres ved hjælp af billedanalysesoftware. Mens denne protokol fokuserer på fodpudevaskulaturen, er helmonteret billeddannelse af andre murine bagbenvæv, især gastrocnemius og adduktor muskler, også gennemførlig og relevant for angiogenese og arteriogenese19 undersøgelser. Denne teknik kan modificeres til større dyremodeller, herunder rotter og kaniner, ved at øge mængden af perfusionsopløsninger. Imidlertid er billeddannelsesbegrænsninger vedrørende vævsstørrelse beskrevet nedenfor.
Kritiske dele af DiI perfusion er som følger. Luftbobler i apparatet kan okkludere små kar og hindre fordelingen af DiI gennem vaskulaturen og derved påvirke billeddannelsesresultaterne. Som sådan skal man sørge for at fjerne eventuelle luftbobler i stophaneapparatet og slangen inden perfusion. Filtrering af alle opløsninger undtagen DiI gennem et 0,22 μm flasketopfilter anbefales også at fjerne eventuelle mikropartikler. Under intrakardiel perfusion skal du omhyggeligt overvåge lungerne. Hvis de bliver forstørrede og bliver lyserøde i farven, er dette et tegn på, at sommerfuglnålen er trængt igennem til højre ventrikel og skal trækkes lidt tilbage.
En vigtig begrænsning af DiI-perfusion er procedurens terminale karakter, som ikke tillader gentagne målinger. Fordi dårlige perfusionsresultater kan afspejle underliggende arteriel insufficiens eller teknisk fejl, anbefales det at høste og afbilde den ikke-ligerede bagben som en intern kontrol. Med hensyn til billeddannelse er optimal vævstykkelse til laserindtrængning ~ 1 mm efter kompression. Derfor kræver større væv sektionering i mindre stykker, der skal monteres på dias og indkvarteres på mikroskopscenen og forholdsmæssigt længere billedoptagelsestider.
Sammenfattende skitserer denne protokol en unik præklinisk model til undersøgelse af PAD og CLTI. Specifikt inducerer lårbensarterie og venekoagulation med samtidig administration af L-NAME, en NOS-hæmmer, pålideligt vævstab i FVB-musens fodpuder. Post-mortem, intrakardiel DiI-perfusion bruges derefter til at mærke vaskulaturen fluorescerende. Efterfølgende helmonteret billeddannelse af de høstede fødder med konfokal laserscanningsmikroskopi muliggør 3D-rekonstruktion af fodpudens vaskulatur og visualisering af arterielle og kapillære netværk, der supplerer traditionelle midler til vurdering af reperfusion i bagbensiskæmimodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud til Z-J L og OC V fra National Institutes of Health [R01HL149452 og VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Vi takker også Mikroskopi og Imaging Facility i Miami Project to Cure Paralysis ved University of Miami School of Medicine for at give adgang til deres billedanalyse- og behandlingssoftware.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
