Summary
Le présent protocole décrit un modèle unique et cliniquement pertinent de maladie artérielle périphérique qui combine l’électrocoagulation de l’artère fémorale et des veines avec l’administration d’un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase pour induire la gangrène des membres postérieurs chez les souris FVB. La perfusion intracardiaque DiI est ensuite utilisée pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution du système vasculaire du coussinet plantaire.
Abstract
La maladie artérielle périphérique (MAP) est une cause importante de morbidité résultant d’une exposition chronique à des facteurs de risque athérosclérotiques. Les patients souffrant de sa forme la plus grave, l’ischémie chronique menaçant les membres (CLTI), font face à des déficiences substantielles de la vie quotidienne, y compris la douleur chronique, la distance de marche limitée sans douleur et les plaies non cicatrisantes. Des modèles précliniques ont été développés chez divers animaux pour étudier l’AOMI, mais l’ischémie des membres postérieurs de la souris reste la plus largement utilisée. Il peut y avoir une variation significative de la réponse à l’insulte ischémique dans ces modèles en fonction de la souche de souris utilisée et du site, du nombre et des moyens de perturbation artérielle. Ce protocole décrit une méthode unique combinant l’électrocoagulation de l’artère fémorale et des veines avec l’administration d’un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase (NOS) pour induire de manière fiable la gangrène du coussinet plantaire chez les souris du virus ami B (FVB) qui ressemble à la perte tissulaire du CLTI. Alors que les moyens traditionnels d’évaluation de la reperfusion tels que l’imagerie de perfusion Doppler au laser (LDPI) sont toujours recommandés, la perfusion intracardiaque du colorant lipophile 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiI) est utilisée pour marquer le système vasculaire. La microscopie confocale à balayage laser à monture entière permet une reconstruction tridimensionnelle (3D) à haute résolution des réseaux vasculaires du coussinet plantaire qui complète les moyens traditionnels d’évaluation de la reperfusion dans les modèles d’ischémie des membres postérieurs.
Introduction
La maladie artérielle périphérique (MAP), caractérisée par une réduction du flux sanguin vers les extrémités en raison de l’athérosclérose, touche 6,5 millions de personnes aux États-Unis et 200 millions de personnes dans le monde1. Les patients atteints d’AOMI présentent une réduction de la fonction et de la qualité de vie des membres, et ceux atteints d’ITLC, la forme la plus grave d’AOMI, courent un risque accru d’amputation et de décès avec un taux de mortalité à 5 ans proche de 50 %2. Dans la pratique clinique, les patients ayant des indices cheville-brachial (ABI) <0,9 sont considérés comme ayant une MAP, et ceux avec ABI <0,4 associés à une douleur au repos ou à une perte de tissu comme ayant CLTI3. Les symptômes varient d’un patient ayant des ABI similaires en fonction de l’activité quotidienne, de la tolérance musculaire à l’ischémie, des variations anatomiques et des différences de développement collatéral4. La gangrène des doigts et des membres est la manifestation la plus grave de toutes les maladies occlusives vasculaires qui entraînent une CLTI. C’est une forme de nécrose sèche qui momifie les tissus mous. En plus de l’AOMI athéroscléreuse, il peut également être observé chez les patients atteints de diabète, de vascularites tels que la maladie de Buerger et le phénomène de Raynaud, ou de calciphylaxie dans le cadre d’une insuffisance rénale terminale5,6.
Plusieurs modèles précliniques ont été développés pour étudier la pathogenèse de l’AOMI/CLTI et tester l’efficacité de traitements potentiels, dont le plus courant reste l’ischémie des membres postérieurs de la souris. L’induction de l’ischémie des membres postérieurs chez la souris est généralement réalisée par l’obstruction du flux sanguin des artères iliaques ou fémorales, soit par ligature de suture, électrocoagulation ou par d’autres moyens de resserrer le vaisseau souhaité7. Ces techniques réduisent considérablement la perfusion au membre postérieur et stimulent la néovascularisation des muscles de la cuisse et du mollet. Cependant, il existe des différences essentielles de sensibilité à l’insulte ischémique en fonction de la souche murine, en partie en raison de différences anatomiques dans la distribution collatérale8,9. Par exemple, les souris C57BL/6 sont relativement résistantes à l’ischémie des membres postérieurs, démontrant une fonction réduite des membres, mais généralement aucune preuve de gangrène dans le coussinet plantaire. D’autre part, les souris BALB / c ont une capacité intrinsèquement faible à récupérer de l’ischémie et développent généralement une auto-amputation du pied ou de la jambe après une ligature de l’artère fémorale seule. Cette réponse sévère à l’ischémie rétrécit la fenêtre thérapeutique et peut empêcher l’évaluation longitudinale de la reperfusion et de la fonction des membres. Fait intéressant, des différences génétiques dans un seul locus de trait quantitatif situé sur le chromosome murin 7 ont été impliquées dans ces susceptibilités différentielles des souris C57BL/6 et BALB/c à la nécrose tissulaire et à la reperfusion des membres10.
Par rapport aux souches C57BL/6 et BALB/c, les souris FVB présentent une réponse intermédiaire mais incohérente à la ligature de l’artère fémorale seule. Certains animaux développent une gangrène de coussinet sous la forme d’ongles ischémiques noirs ou de doigts momifiés, mais d’autres sans aucun signe manifeste d’ischémie11. L’administration concomitante de chlorhydrate d’ester méthylique de Nω-Nitro-L-arginine (L-NAME), un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase (NOS)12, prévient les mécanismes vasodilatateurs compensatoires et augmente encore le stress oxydatif dans les tissus des membres postérieurs. En combinaison avec la ligature ou la coagulation de l’artère fémorale, cette approche produit systématiquement une perte de tissu du coussinet plantaire chez les souris FVB qui ressemble aux changements atrophiques de CLTI mais progresse rarement vers une auto-amputation d’un membre11. Le stress oxydatif est l’une des caractéristiques de l’AOMI/CLTI et se propage par un dysfonctionnement endothélial et une diminution de la biodisponibilité de l’oxyde nitrique (NO)13,14. Le NO est une molécule pluripotente qui exerce habituellement des effets bénéfiques sur le flux sanguin artériel et capillaire, l’adhésion et l’agrégation plaquettaires, ainsi que sur le recrutement et l’activation des leucocytes13. Il a également été démontré que des niveaux réduits de NOS activent l’enzyme de conversion de l’angiotensine, qui induit un stress oxydatif et accélère la progression de l’athérosclérose15.
Une fois qu’un modèle d’ischémie des membres postérieurs est établi, une surveillance de la reperfusion ultérieure des membres et de l’effet thérapeutique de tout traitement potentiel est également nécessaire. Dans le modèle de gangrène murine proposé, le degré de perte tissulaire peut d’abord être quantifié à l’aide du score de Faber pour évaluer l’apparence brute du pied (0: normal, 1-5: perte d’ongles où le score représente le nombre d’ongles affectés, 6-10: atrophie des chiffres où le score représente le nombre de chiffres affectés, 11-12: atrophie partielle et complète du pied, respectivement)9. Les mesures quantitatives de la perfusion des membres postérieurs sont ensuite généralement effectuées à l’aide de LDPI, qui repose sur les interactions Doppler entre la lumière laser et les globules rouges pour indiquer la perfusion au niveau du pixel dans une région d’intérêt (ROI)16. Bien que cette technique soit quantitative, non invasive et idéale pour des mesures répétées, elle ne fournit pas de détails anatomiques granulaires de la vascularisation des membres postérieurs16. D’autres modalités d’imagerie, telles que la micro-tomodensitométrie (micro-CT), l’angiographie par résonance magnétique (ARM) et la microangiographie aux rayons X, s’avèrent soit coûteuses, nécessitant une instrumentation sophistiquée, soit techniquement difficiles16. En 2008, Li et al. ont décrit une technique pour marquer les vaisseaux sanguins dans la rétine avec le colorant lipophile carbocyanine DiI17. DiI incorpore dans les cellules endothéliales et, par diffusion directe, colore les structures de la membrane vasculaire telles que les germes angiogéniques et les processus pseudopodaux17,18. En raison de son administration directe dans les cellules endothéliales et de la nature hautement fluorescente du colorant, cette procédure fournit un marquage intense et durable des vaisseaux sanguins. En 2012, Boden et al. ont adapté la technique de perfusion DiI au modèle d’ischémie des membres postérieurs murins via l’imagerie globale des muscles adducteurs de la cuisse prélevés après la ligature de l’artère fémorale19.
La méthode actuelle fournit un moyen relativement peu coûteux et techniquement réalisable d’évaluer la néovascularisation en réponse à l’ischémie des membres postérieurs et aux thérapies à base de gènes ou de cellules. Dans une autre adaptation, ce protocole décrit l’application de la perfusion DiI pour imager la vascularisation du coussinet plantaire en haute résolution et en 3D dans un modèle murin de gangrène des membres postérieurs.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux décrites dans le protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Miami (IACUC). Des souris FVB, mâles et femelles, âgées de 8 à 12 semaines, ont été utilisées pour l’étude.
1. Préparation de la solution L-NAME
- Dans des conditions stériles dans une hotte à écoulement laminaire, préparer une solution mère L-NAME en dissolvant 1 g de poudre L-NAME (voir tableau des matériaux) avec 20 mL d’eau stérile pour obtenir une solution de 50 mg/mL. Conserver la solution mère dans des aliquotes de 300 à 500 μL à -20 °C pendant 3 mois.
- Pour obtenir une solution de L-NAME fonctionnelle, décongeler une aliquote de solution mère de L-NAME et diluer avec du PBS (1:4) dans des conditions stériles pour obtenir une concentration finale de 10 mg/mL.
- Pour préparer le PBS (pH 7,4), dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 et 0,23 g de NaH2PO4 dans 800 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Ajouter de l’eau à un volume total de 1 000 mL et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm sur le dessus de la bouteille.
REMARQUE : L’injection intrapéritonéale (IP) de 4 μL/g de solution de travail L-NAME équivaut à la dose souhaitée de 40 mg/kg de L-NAME. La solution de travail L-NAME doit être conservée sur de la glace pendant l’utilisation et de nouvelles dilutions doivent être effectuées quotidiennement à l’aide d’aliquotes de solution mère fraîchement décongelées.
2. Induction chimique et chirurgicale de la gangrène des membres postérieurs
- Obtenez des souris FVB, âgées de 8 à 12 semaines, soit auprès d’un éleveur, soit élevées en installation (voir tableau des matériaux). 2 h avant la chirurgie, administrer une dose IP de 40 mg/kg de L-NAME.
- Anesthésier des souris avec une injection IP de 100 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de xylazine (voir tableau des matériaux) dilués dans du PBS. Confirmez une sédation adéquate par l’absence de réflexe de pincement des orteils et continuez à surveiller la fréquence respiratoire pendant la procédure.
- Enlevez les poils des membres postérieurs et des aines bilatéraux à l’aide de cisailles et / ou d’une crème dépilatoire. Positionner l’animal sous un microscope chirurgical couché; étendre et coller les extrémités en place. Stériliser le champ chirurgical en appliquant circonférentiellement la solution de povidone-iode sur le site chirurgical.
- Sous un grossissement de 10-20x, utilisez des ciseaux ou un scalpel pour faire une incision de 1 cm le long du pli de l’aine juste inférieur au ligament inguinal. Utilisez une pince fine et un applicateur de pointe en coton stérile pour disséquer brutalement le coussinet adipeux inguinal latéralement du ligament inguinal et exposer la gaine fémorale sous-jacente afin que l’artère fémorale, la veine et le nerf soient clairement identifiés (Figure 1).
- À l’aide de pinces fines, percez la gaine fémorale. Brossez soigneusement le nerf fémoral loin de l’artère fémorale. Identifier le décollage de la branche circonflexe latérale de l’artère fémorale (LCFA) profonde du nerf fémoral (Figure 1).
- Procéder à l’électrocoagulation de l’artère fémorale et de la veine juste proximale à la LCFA en activant le dispositif de cautérisation (voir tableau des matériaux) et en contactant doucement les vaisseaux avec un mouvement d’un côté à l’autre, en veillant à ce que le nerf fémoral soit bien isolé et reste protégé contre les lésions thermiques. Divisez le segment de récipient coagulé avec des ciseaux.
- Procéder à l’exposition de l’artère fémorale distale et de la veine en mobilisant médialement le coussinet adipeux inguinal. Identifier l’artère épigastrique superficielle et la jonction saphénopoplitée de manière plus distale.
- Percez la gaine fémorale entre ces deux endroits et disséquez soigneusement le nerf fémoral loin des vaisseaux fémoraux. Procéder à la coagulation et à la transsection de l’artère fémorale et de la veine comme décrit à l’étape 2.4.1.
- Irriguez le champ chirurgical à l’aide d’une seringue remplie de PBS stérile. Obtenez l’hémostase en appliquant une légère pression avec un applicateur de pointe en coton pendant 3-5 min à toutes les zones de saignement.
- Procédez à la fermeture de l’incision à l’aide d’une suture résorbable 5-0 de manière simple et continue. Administrer une dose sous-cutanée de 1 mg/kg de buprénorphine à libération prolongée (voir la table des matériaux) pour soulager la douleur postopératoire.
- Confirmer la perte de perfusion du coussinet plantaire dans le membre postérieur ligaturé par LDPI (voir tableau des matériaux). Pendant qu’il est encore anesthésié, placez l’animal sur un tampon en mousse foncée en position couchée sous la machine LDPI et utilisez des boucles de ruban adhésif électrique pour fixer les pieds en place.
- Procéder avec LDPI des pieds bilatéraux. Une fois la numérisation terminée, dessinez un retour sur investissement autour de chaque repose-pieds et obtenez les valeurs de flux moyennes.
- Calculez l’indice de perfusion comme le rapport des valeurs de flux moyennes du repose-pieds ligaturé au coussinet non ligaturé. Assurez-vous que l’indice de perfusion est inférieur à 0,1.
- Transférez l’animal dans une cage propre avec un coussin chauffant ou une lampe suspendue pour maintenir la température corporelle centrale. Assurez-vous d’une récupération complète de l’anesthésie avant de transférer les souris à l’animalerie.
3. Administration postopératoire de L-NAME et surveillance de la gangrène des membres postérieurs
- Les jours postopératoires 1 à 3, administrer une dose IP supplémentaire de 40 mg/kg de L-NAME à chaque animal. Dans le même temps, évaluez soigneusement le pied du membre ischémique.
- Quantifier le degré d’ischémie des membres postérieurs et de gangrène à l’aide du score d’ischémie des membres postérieurs de Faber9. Scores 1-5: nombre d’ongles ischémiques; scores 6-10: 1-5 chiffres ischémiques; scores 11 et 12 : atrophie partielle et complète du pied. Enregistrez les scores de Faber les jours postopératoires 1 à 3, puis chaque semaine.
4. Préparation de DiI et solutions de travail pour la perfusion animale
- Pour préparer la solution mère de DiI, dissoudre 100 mg de cristaux de DiI (voir tableau des matériaux) dans 16,7 mL d’éthanol à 100 %. Couvrir de papier d’aluminium et laisser sur une plate-forme à bascule pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante.
- Pour préparer le diluant, dissoudre 50 g de glucose dans 1 000 mL d’eau distillée pour obtenir une solution de glucose à 5 %. Filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Mélanger le PBS et les solutions de glucose à 5% dans un rapport de 1: 4 pour préparer une solution de diluant fonctionnel.
5. Configuration de l’équipement et perfusion DiI
- Fabriquer la solution de travail DiI en ajoutant 200 μL de solution mère DiI à 10 mL de la solution diluante de travail (préparée à l’étape 4.2) immédiatement avant utilisation. Serrez à la main pour bien mélanger.
- Connectez deux ou trois robinets d’arrêt à 3 voies et une aiguille papillon de 25 G en série. Préparer des seringues de 10 mL avec 4 mL de PBS, 10 mL de solution de DiI et 10 mL de formol tamponné neutre à 10 % (voir tableau des matériaux).
- Connectez la seringue avec du formol à l’orifice d’entrée proximal et injectez la solution pour évacuer l’air de la ligne; tournez le robinet d’arrêt pour fermer le port. Répétez la même procédure séquentiellement, en connectant les seringues avec DiI puis PBS aux orifices d’entrée du milieu et du distal, respectivement, en prenant soin de rincer toutes les bulles d’air à travers l’assemblage du robinet d’arrêt.
REMARQUE: Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans aucune partie de l’assemblage du robinet d’arrêt ou du tuyau. Les bulles d’air peuvent obstruer les petites artères pendant la perfusion, ce qui entraîne une mauvaise distribution intravasculaire de DiI et des résultats d’imagerie compromis. - Une fois la mise en place terminée, euthanasier l’animal par surdosage de CO2 dans une chambre d’induction.
- Placez l’animal à perfuser en position couchée sur un tampon absorbant et fixez les aisselles et les membres inférieurs avec des aiguilles.
- À l’aide de ciseaux, faites une incision transversale pour ouvrir la cavité abdominale. Exposez puis divisez le diaphragme gauche et droit pour accéder à la cavité thoracique.
- Coupez la paroi thoracique de chaque côté du sternum des côtes inférieures à la première ou à la deuxième côte, en évitant les artères thoraciques internes (mammaires) médialement. Utilisez un hémostat (voir Tableau des matériaux) pour saisir l’extrémité inférieure du sternum et la réfléchir vers la tête de l’animal pour exposer la cavité thoracique.
- Identifiez le ventricule gauche, qui semble de couleur plus claire que le ventricule droit. Saisissez doucement le cœur avec une pince émoussée et insérez l’aiguille papillon dans le ventricule gauche.
- Utilisez des ciseaux ou une aiguille de 18 G pour percer l’oreillette droite, permettant au sang et aux solutions de perfusion de retourner au cœur pour s’écouler. Stabilisez l’aiguille avec une ou deux mains, en prenant soin de ne pas percer par inadvertance le ventricule droit et de perfuser la circulation pulmonaire plutôt que systémique.
- Ouvrez le port de la seringue avec PBS et injectez manuellement 2-4 mL à raison de 1-2 mL / min pendant 1-2 min pour rincer le sang du système vasculaire. Assurer une perfusion réussie en observant les saignements de l’oreillette droite. Après l’injection, fermez l’orifice de la seringue PBS.
- Ouvrez le port à la seringue avec DiI et injectez 5-10 mL à raison de 1-2 mL/min pendant 5 min. Surveillez les oreilles, le nez et les paumes qui devraient devenir légèrement roses avec l’injection de solution de DiI. Après l’injection, fermez l’orifice de la seringue DiI et attendez 2 min pour permettre l’incorporation du colorant avant l’injection de fixateur.
- Ouvrez le port à la seringue avec du formol et injectez 5-10 mL à raison de 1-2 mL/min pendant 5 min. Après l’injection, retirez l’aiguille du ventricule gauche et procédez au prélèvement des tissus d’intérêt.
- À l’aide de ciseaux lourds, disloquez le tibia à la cheville, en séparant complètement les pieds gauche et droit du bas des jambes. Placer les pieds récoltés dans une plaque de 6 ou 12 puits avec 1 à 2 mL de solution de formol à 10%. Envelopper la plaque avec du papier d’aluminium et conserver à 4 °C pendant la nuit.
6. Préparation du tissu du coussinet plantaire pour la microscopie confocale à balayage laser
- Le lendemain, remplacez la solution fixatrice dans une plaque de 6 ou 12 puits par 1 à 2 mL de PBS par puits.
- Pour écorcher le pied, faites d’abord une incision longitudinale avec un scalpel sur les aspects plantaire et dorsal du pied. Ensuite, à l’aide d’une pince dentée et d’un petit hémostat, retirez soigneusement toute la peau du pied et des doigts, sans endommager les tissus mous sous-jacents.
- Procéder au montage et à l’imagerie des tissus, de préférence dans les 1-2 jours suivant la perfusion et la récolte. Alternativement, retournez les repose-pieds sur des plaques de 6 ou 12 puits avec 1 à 2 mL de PBS; couvrir avec du papier d’aluminium et conserver à 4 °C pour maintenir la fluorescence jusqu’à 1 mois.
- Pour monter les tissus, placez individuellement les pieds entre deux lames de microscope en verre avec un tampon de biopsie en mousse plié sur lui-même (une ou deux fois selon l’épaisseur du tissu) à chaque extrémité (voir Tableau des matériaux). Utilisez deux petits clips de liant pour comprimer les lames de verre ensemble à chaque extrémité (épaisseur finale d’environ 1 mm).
REMARQUE: Les tissus plus épais nécessiteront des temps de balayage plus longs. Le repose-pieds écorché peut être comprimé entre des lames de verre un jour avant l’imagerie pour réduire l’épaisseur des tissus.
7. Microscopie confocale à balayage laser
- Préparez-vous à la séance d’imagerie : allumez le système d’imagerie et démarrez le logiciel d’acquisition (voir Tableau des matériaux). Utilisez un objectif à faible grossissement/faible ouverture numérique (par exemple, x5/0,15) pour capturer des images, car les objectifs à faible grossissement ont généralement des distances de travail plus longues requises pour cette expérience.
- Cliquez sur Oui à la boîte de dialogue Activer la scène. Activez le laser 561 nm dans l’onglet Configuration. Sur l’écran principal, activez un tracé de faisceau visible en cliquant sur le bouton Visible . Réglez un détecteur sur la plage 570-600 nm en cliquant sur la case à cocher Actif correspondante.
- Sélectionnez l’icône Analyse des vignettes dans l’onglet Acquérir > Acquisition et définissez la résolution souhaitée (512 x 512 ou 1024 x 1024).
- Positionnez l’échantillon de tissu monté à sec (sans eau ni PBS ajouté) comprimé entre les lames de verre sur la scène du microscope et mettez les tissus au point.
- Pour définir les limites d’analyse, accédez au coin supérieur gauche ou droit de l’exemple. Dans l’onglet Acquisition, sous le menu Analyse des vignettes, cliquez sur le bouton Marquer la position . Naviguez jusqu’au coin opposé (en bas à droite ou à gauche, respectivement) et cliquez à nouveau sur le bouton Marquer la position .
- Pour définir la profondeur de la pile Z, cliquez sur le bouton Live dans le coin inférieur gauche de l’écran et accédez au centre de l’échantillon. Utilisez le bouton de l’axe Z pour faire défiler jusqu’au bas de l’échantillon.
- Dans l’onglet Acquisition, sous le menu Z-Stack, cliquez sur le bouton Commencer . Faites défiler jusqu’en haut de l’échantillon et cliquez sur le bouton Fin . Cliquez sur Z-step Size et réglez sur la valeur souhaitée (par exemple, 50 μm).
- Dans le coin inférieur droit de l’écran, cliquez sur Démarrer pour commencer l’acquisition d’image.
8. Analyse quantitative et reconstruction 3D de la vascularisation du coussinet plantaire
- Téléchargez et installez la dernière version de Fiji (ImageJ) ainsi que le plugin Vessel Analysis20. Ouvrez des fichiers d’image de microscopie aux Fidji, qui combineront des séries Z individuelles en piles Z pouvant être visualisées sur l’axe Z à l’aide du curseur en bas de l’image.
- Sélectionnez l’image composite Z-stack, puis sous le menu Image, choisissez Piles > Z Project pour créer une projection bidimensionnelle. Ensuite, convertissez la projection Z en binaire sous Process > Binary > Make Binary.
- Exécutez le plugin Vascular Density sous Plugins > Vascular Density. Lorsque vous y êtes invité, utilisez le curseur pour tracer un retour sur investissement autour du périmètre du repose-pieds et des chiffres. Prenez note de la densité des vaisseaux qui est rapportée, qui est exprimée en pourcentage du ROI (fraction de l’aire vasculaire).
- Pour créer des reconstructions 3D aux Fidji, sélectionnez Piles > projet 3D et définissez l’axe de rotation, l’angle et la vitesse souhaités dans le menu Image. Vous pouvez également sélectionner Volume Viewer dans le menu Plugins pour visualiser les images sous forme de tranches ou manipuler la reconstruction dans les axes souhaités.
- Pour un rendu 3D plus impliqué, utilisez un autre logiciel d’analyse et de traitement d’images (voir Tableau des matériaux). Convertissez les fichiers au format du logiciel souhaité et assemblez des scans de tuiles individuels à l’aide de la fonctionnalité d’assemblage de carreaux.
- Après avoir assemblé des numérisations de tuiles individuelles, ouvrez le fichier composite et procédez au rendu de la surface du volume. Cliquez sur Ajouter une nouvelle surface pour ouvrir l’assistant de création de surface et utilisez les flèches pour basculer dans les menus, notamment en définissant le retour sur investissement et l’intensité du seuil. Une fois satisfait du rendu de surface, utilisez la fonctionnalité d’animation pour créer des vidéos de l’image traitée.
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Representative Results
Ce protocole détaille un moyen fiable d’induire une ischémie et une perte de tissu dans le coussinet plantaire murin en utilisant une combinaison de coagulation de l’artère fémorale et des veines avec l’administration de L-NAME, un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase, chez les souris FVB sensibles. La figure 1 détaille l’anatomie du système vasculaire des membres postérieurs murins et indique les sites de l’artère fémorale et de la coagulation veineuse (X jaune), juste proximaux à l’artère fémorale circonflexe latérale (LCFA) et proximaux à la jonction saphénopoplitée. La LCFA doit être identifiée et les sites de coagulation respectifs à cette structure sont maintenus cohérents tout au long de toutes les interventions chirurgicales. Comme décrit, 2 heures avant les interventions chirurgicales et les jours postopératoires 1-3, les souris ont également reçu 40 mg / kg IP de L-NAME pour maintenir des niveaux élevés de stress oxydatif dans les tissus. La figure 2 montre la variation de la perte tissulaire que l’on peut attendre de ce modèle une semaine après la chirurgie, avec des scores faber9 enregistrés dans le coin inférieur droit de chaque image.
La perfusion de DiI a été réalisée chez des souris FVB 5 et 20 jours après la coagulation de l’artère fémorale et des veines pour évaluer la reperfusion des membres postérieurs après l’induction de l’ischémie. La figure 3A illustre l’anatomie murine après dissection pour exposer la cavité thoracique. Une aiguille papillon est insérée dans le ventricule gauche pour commencer la perfusion cardiaque. Notez que le ventricule gauche apparaît légèrement plus pâle en couleur que le ventricule droit. La figure 3B illustre l’équipement mis en place avec des robinets d’arrêt connectés en série et trois seringues remplies de PBS, de solution DiI et de fixateur. Après la perfusion diI, les pieds ont été récoltés, écorchés et comprimés entre les lames de microscope, comme le montre la figure 3C, D avant l’imagerie avec un microscope à balayage laser confocal sous un grossissement 5x. Les images de microscopie de reconstruction ont révélé une anatomie vasculaire normale dans le repose-pieds témoin non ligaturé (figure 4A) par rapport à une perfusion sévèrement diminuée au coussinet plantaire du membre postérieur ligaturé 5 jours après la chirurgie (figure 4B). Vingt jours après la chirurgie, la perfusion au repose-pieds s’est considérablement améliorée (figure 4C, D et figure 5B), mais pas dans la mesure du contrôle non ligaturé (figure 4A et figure 5A). La vascularisation a été quantifiée comme décrit ci-dessus à l’aide du plugin Vessel Density aux Fidji. La fraction vasculaire du repose-pieds témoin était de 28 %. Cinq jours après la chirurgie, la fraction vasculaire du coussinet plantaire a été sévèrement réduite à 2%, mais s’est progressivement rétablie à 15% et 18% chez deux souris distinctes 20 jours après l’opération. Pour visualiser l’anatomie vasculaire du repose-pieds en 3D, nous avons importé une image de microscopie cousue dans un autre logiciel d’analyse et de traitement d’images pour créer un rendu de surface comme décrit précédemment (Figure supplémentaire 1). Une vidéo du rendu de surface a ensuite été créée à l’aide de la fonctionnalité d’animation (Vidéo 1).
Figure 1 : Anatomie du système vasculaire des membres postérieurs murins et des sites de l’artère fémorale et de la coagulation veineuse. L’artère iliaque externe continue comme l’artère fémorale (AF) distale au ligament inguinal. Les premières branches de l’artère fémorale comprennent le circonflexe latéral (LCFA) et les artères fémorales profondes (non illustrées). Plus distalement, les artères fémorales caudales proximales (PCFA) et épigastriques caudales superficielles (SCEA) se ramifient du proximal FA à la bifurcation des artères saphènes (SA) et poplitées (PA). Le nerf fémoral (FN) longe les vaisseaux fémoraux et doit être isolé doucement avant la coagulation des vaisseaux fémoraux. Les sites de coagulation de l’AF et de la veine fémorale (FV) sont également indiqués (X). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images représentatives de la gangrène des membres postérieurs chez les souris FVB avec les scores de Faber correspondants. Le degré de changements ischémiques induits par ce modèle varie d’un ou plusieurs ongles ischémiques (Faber scores 1-5) à des chiffres gangreneux (Faber scores 6-10) et une atrophie partielle ou complète du pied. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Dissection animale et configuration de l’équipement pour la perfusion DiI et le montage du pied de souris pour l’imagerie. (A) Photographie anatomique de l’anatomie murine pendant la perfusion DiI. Les cavités abdominale et thoracique sont ouvertes, le sternum est réfléchi et les côtes sont coupées de chaque côté du sternum. Une aiguille papillon de 25 G reliée à l’ensemble du robinet d’arrêt est insérée dans le ventricule gauche. (B) Trois robinets d’arrêt à 3 voies sont connectés en série. Trois seringues de 10 mL sont remplies de fixateur, de DiI et de PBS et connectées à l’ensemble du robinet d’arrêt. Une aiguille papillon de 25 G est reliée à l’orifice de sortie du robinet d’arrêt proximal. (C) Montage du pied écorché entre deux lames de microscope avec un tampon de biopsie en mousse plié et un clip de liant à chaque extrémité pour comprimer les lames ensemble. (D) Une vue alternative du pied écorché comprimé entre les lames du microscope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images représentatives 5x obtenues par microscopie confocale à balayage laser du repose-pieds de la souris après perfusion DiI avec une densité de vaisseau quantifiée exprimée en pourcentage du retour sur investissement. (A) Vasculaire normal du coussinet plantaire. (B) Le système vasculaire du coussinet plantaire 5 jours après la coagulation de l’artère fémorale et des veines montre une perfusion sévèrement réduite avec une opacification minimale des vaisseaux. (C) La vascularisation du coussinet plantaire 20 jours après la coagulation de l’artère fémorale et des veines démontre une certaine reconstitution du flux distal vers les artères métatarsiennes et digitales. (D) Image d’un coussinet plantaire de souris supplémentaire obtenu 20 jours après la coagulation de l’artère fémorale et des veines montrant un gros vaisseau minimal par rapport à l’opacification microvasculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Images agrandies de la vascularisation du repose-pieds. (A) Images 5x et 20x du système vasculaire du coussinet plantaire de contrôle démontrant une perfusion intacte via les artères métatarsiennes et numériques. (B) Images 5x et 20x du coussinet plantaire des membres postérieurs ligaturés 20 jours après l’opération montrant une perfusion réduite via des branches artérielles métatarsiennes plus grandes, mais le développement d’un réseau capillaire étendu et moelleux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : Animation du rendu de surface 3D de la vascularisation du repose-pieds. La vidéo affichant un rendu de surface de la vascularisation du repose-pied illustre la résolution 3D réalisable avec le protocole décrit. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Figure supplémentaire 1 : Étapes du rendu de surface des images de perfusion DiI. (A) Image de perfusion DiI originale importée dans un logiciel d’analyse et de traitement d’images. (B) Rendu de surface superposé sur l’image de perfusion DiI lors du réglage de l’intensité du seuil. (C) Rendu de surface 3D final de l’image de microscopie de perfusion DiI. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Bien que l’ischémie des membres postérieurs de la souris soit le modèle préclinique le plus largement utilisé pour étudier la néovascularisation dans l’AOMI et le CLTI, il existe une variation significative de la gravité et de la récupération de l’ischémie en fonction de la souche de souris spécifique utilisée et du site, du nombre et de la méthode de perturbation artérielle. La combinaison de la ligature de l’artère fémorale et de l’administration IP de L-NAME peut induire de manière fiable la gangrène des membres postérieurs chez les souris FVB11. Le même traitement entraîne une ischémie des membres postérieurs sans perte de tissu chez les souris C57BL/6, tandis que chez les souris BALB/c, l’auto-amputation du pied ou de la jambe peut être induite par la ligature de l’artère fémorale seule. En tant que telle, la technique décrite ci-dessus de coagulation de l’artère fémorale avec administration simultanée de L-NAME chez les souris FVB, qui ont une réponse intermédiaire à l’ischémie insultante, fournit un modèle unique et reproductible de gangrène du coussinet plantaire semblable à celui observé dans la manifestation la plus grave des maladies qui conduisent à CLTI. Le degré de perte tissulaire observé avec ce modèle peut varier de quelques ongles ischémiques à plusieurs doigts gangreneux, mais progresse rarement vers l’auto-amputation du pied ou de la jambe, ce qui permet une évaluation longitudinale de la reperfusion et de la fonction des membres. Contrairement aux souris BALB / c, chez lesquelles l’apparition de la gangrène est rapide avec une auto-amputation des membres se produisant généralement en moins d’une semaine, il y a un début retardé de la perte de tissu dans ce modèle de gangrène de souris FVB. La coagulation de l’artère fémorale restreint de manière aiguë le flux sanguin vers le membre postérieur. Néanmoins, l’accumulation de stress oxydatif due à l’administration de L-NAME les jours postopératoires 0-3 est plus progressive, avec des changements atrophiques de pointe observés entre 7 et 14 jours. Par conséquent, ce modèle offre une fenêtre thérapeutique améliorée pour évaluer les effets d’une intervention particulière sur l’apparence globale des tissus et le sauvetage de la perte tissulaire en plus de quantifier la reperfusion et d’évaluer la fonction des membres.
En ce qui concerne la technique chirurgicale, la coagulation ou la ligature de l’artère fémorale et de la veine est favorisée en raison de la facilité relative de cette opération par rapport à l’isolement de l’artère fémorale. Bien que cette technique puisse entraîner une thrombose veineuse et une insuffisance, elle aggrave l’insulte ischémique et aide à induire des changements gangreneux de manière plus fiable. De plus, l’insuffisance veineuse chronique (IVC) est très répandue dans la population générale, avec 10% à 30% des adultes touchés. De manière constante, environ 20% des patients atteints d’AOMI, en particulier ceux présentant une insuffisance artérielle sévère, ont également un CVI comorbide 21,22. Que l’on décide de ligaturer ou de coaguler la veine fémorale, il est d’une importance cruciale de maintenir le ou les sites spécifiques de perturbation de l’artère fémorale constants dans tous les groupes expérimentaux. Des ligatures plus proximales, telles que celle de l’artère iliaque, entraînent l’occlusion de collatéraux supplémentaires en aval et limitent la possibilité d’artériogenèse8,16. Cependant, l’angiogenèse dans la partie distale du membre, en particulier le muscle gastrocnémien, doit toujours être déclenchée. Chez les souris FVB, la double ligature ou la coagulation de l’artère fémorale proximale à l’artère fémorale circonflexe latérale et proximale à la bifurcation saphénopoplitée induit plus systématiquement la gangrène qu’un seul site de ligature ou de coagulation.
Il convient de noter que chez les patients atteints d’AOMI et de CLTI, l’ischémie des membres est causée par une obstruction athéroscléreuse (un processus chronique). En revanche, dans les modèles murins, l’ischémie des membres est induite chirurgicalement (un processus aigu). Bien que ce modèle de gangrène des membres postérieurs de la souris FVB ait une apparition relativement plus lente de la gangrène avec une gravité maximale retardée de la perte tissulaire, il n’est pas directement comparable à la sténose artérielle chronique et progressive caractéristique de l’AOMI et de l’ITPC. D’autres groupes ont développé des techniques d’occlusion subaiguë de l’artère fémorale en utilisant des constricteurs améroïdes composés d’un manchon métallique externe et d’une couche interne de matériau absorbant l’humidité qui s’auto-dilate progressivement. Il a été démontré que cette technique entraîne une diminution de l’expression des marqueurs inflammatoires, une récupération du flux sanguin plus faible à 4-5 semaines et une réduction de la nécrose musculaire23,24. Outre les différences d’acuité de l’ischémie, les modèles précliniques utilisant des animaux jeunes et en bonne santé ne parviennent pas non plus à reproduire les facteurs de risque tels que le diabète, l’hypertension, l’obésité, l’hyperlipidémie, le tabagisme et l’infection qui contribuent à des événements indésirables majeurs des membres et au fardeau des maladies vasculaires.
Dans la plupart des études sur l’ischémie des membres postérieurs murins, la restauration du flux sanguin vers le membre postérieur ischémique est généralement évaluée via LDPI24,25. Cette méthode est non invasive et reproductible, mais peut être influencée par la température corporelle centrale, l’utilisation d’anesthésiques, la présence de cheveux et le positionnement des membres postérieurs26. La normalisation de ces procédures et l’utilisation du membre postérieur non ligaturé comme contrôle interne peuvent aider à atténuer toute variation. Contrairement au LDPI, la micro-tomodensitométrie et l’ARM fournissent des informations anatomiques 3D à haute résolution, mais nécessitent traditionnellement l’injection d’agent de contraste16. La microangiographie aux rayons X est également invasive et techniquement difficile16,27. Comme DiI, la perfusion avec des agents de coulée de silicone radio-opaques permet une reconstruction 3D post-mortem du système vasculaire périphérique28. L’injection intracardiaque ou veineuse caudale de lectine fluorescente a également été décrite pour le marquage de la vascularisation tissulaire29. Après la récolte de tissus d’intérêt, la coloration immunohistochimique avec des marqueurs endothéliaux spécifiques (par exemple, CD31, facteur de von Willebrand) est souvent utilisée pour quantifier la densité capillaire30.
Par rapport aux techniques mentionnées ci-dessus, la perfusion DiI offre plusieurs avantages. Tout d’abord, les réactifs et les matériaux nécessaires sont relativement peu coûteux, à condition que l’accès à un microscope à balayage laser confocal soit disponible. Cette méthode permet une reconstruction 3D de la vascularisation, qui peut être quantifiée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Bien que ce protocole se concentre sur le système vasculaire du coussinet plantaire, l’imagerie globale d’autres tissus murins des membres postérieurs, notamment les muscles gastrocnémiens et adducteurs, est également réalisable et pertinente pour les études sur l’angiogenèse et l’artériogenèse19. Cette technique peut être modifiée pour des modèles animaux plus grands, y compris les rats et les lapins, en augmentant le volume des solutions de perfusion. Cependant, les contraintes d’imagerie concernant la taille des tissus sont décrites ci-dessous.
Les portions critiques de la perfusion diI sont les suivantes. Les bulles d’air dans l’appareil peuvent obstruer de petits vaisseaux et entraver la distribution de DiI dans tout le système vasculaire, influençant ainsi les résultats d’imagerie. En tant que tel, il faut prendre soin d’éliminer les bulles d’air dans l’appareil de robinet d’arrêt et le tuyau avant la perfusion. Il est également recommandé de filtrer toutes les solutions, à l’exception de DiI, à l’aide d’un filtre de 0,22 μm pour éliminer les microparticules. Pendant la perfusion intracardiaque, surveillez attentivement les poumons. S’ils s’agrandissent et deviennent roses, c’est un signe que l’aiguille du papillon a pénétré dans le ventricule droit et doit être légèrement rétractée.
Une limitation importante de la perfusion DiI est la nature terminale de la procédure, qui ne permet pas de mesures répétées. Étant donné que de mauvais résultats de perfusion peuvent refléter une insuffisance artérielle sous-jacente ou une erreur technique, il est recommandé de prélever et d’imager le membre postérieur non ligaturé en tant que contrôle interne. En ce qui concerne l’imagerie, l’épaisseur optimale des tissus pour la pénétration laser est d’environ 1 mm après compression. Par conséquent, les tissus plus gros nécessitent une section en morceaux plus petits pour être montés sur des lames et logés sur la scène du microscope et des temps d’acquisition d’image proportionnellement plus longs.
En résumé, ce protocole décrit un modèle préclinique unique pour l’étude de l’AOMI et du CLTI. Plus précisément, la coagulation de l’artère fémorale et des veines avec administration concomitante de L-NAME, un inhibiteur de NOS, induit de manière fiable une perte de tissu dans les coussinets plantaires des souris FVB. La perfusion intracardiaque DiI post-mortem est ensuite utilisée pour marquer le système vasculaire de manière fluorescente. L’imagerie ultérieure en monture entière des pieds récoltés avec la microscopie confocale à balayage laser permet une reconstruction 3D à haute résolution de la vascularisation du coussinet plantaire et la visualisation des réseaux artériels et capillaires qui complètent les moyens traditionnels d’évaluation de la reperfusion dans les modèles d’ischémie des membres postérieurs.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions à Z-J L et OC V des National Institutes of Health [R01HL149452 et VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Nous remercions également le centre de microscopie et d’imagerie du Miami Project to Cure Paralysis de la faculté de médecine de l’Université de Miami d’avoir fourni un accès à son logiciel d’analyse et de traitement d’images.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
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