Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Summary

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Abstract

Vroege Drosophila-embryo's zijn grote cellen die een breed scala aan conventionele en embryo-specifieke organellen bevatten. Tijdens de eerste drie uur van embryogenese ondergaan deze organellen dramatische bewegingen die worden aangedreven door op actine gebaseerde cytoplasmatische streaming en motorische handel langs microtubuli. De ontwikkeling van een groot aantal kleine, organel-specifieke fluorescerende sondes (FP's) maakt het mogelijk om een breed scala aan verschillende lipidenbevattende structuren in elk genotype te visualiseren, waardoor live beeldvorming mogelijk is zonder dat een genetisch gecodeerde fluorofoor nodig is. Dit protocol laat zien hoe vitale kleurstoffen en moleculaire sondes in Drosophila-embryo's kunnen worden geïnjecteerd om de handel in specifieke organellen te volgen door middel van live beeldvorming. Deze aanpak wordt gedemonstreerd door lipidedruppels (LD's) te labelen en hun bulkbeweging te volgen door deeltjesbeeld velocimetrie (PIV). Dit protocol biedt een strategie die vatbaar is voor de studie van andere organellen, waaronder lysosomen, mitochondriën, dooierblaasjes en het ER, en voor het volgen van de beweging van individuele LD's langs microtubuli. Het gebruik van in de handel verkrijgbare kleurstoffen brengt de voordelen van scheiding in de violet / blauwe en verrode gebieden van het spectrum. Door multiplex co-labeling van organellen en/of cytoskeletelementen via micro-injectie, zijn alle genetische bronnen in Drosophila beschikbaar voor smokkelstudies zonder de noodzaak om fluorescerend gelabelde eiwitten te introduceren. In tegenstelling tot genetisch gecodeerde fluoroforen, die lage kwantumopbrengsten hebben en gemakkelijk bleken, maken veel van de beschikbare kleurstoffen een snelle en gelijktijdige opname van verschillende kanalen met hoge fotonopbrengsten mogelijk.

Introduction

Vitale kleurstoffen en moleculaire sondes zijn krachtige hulpmiddelen om specifieke cellulaire structuren en organellen levend in beeld te brengen. In het Drosophila-embryo vertonen veel verschillende organellen cytoskeletgestuurde lokalisatie ^1,2,3,4, maar de toepassing van deze kleine moleculen is een uitdaging omdat de eierschaal voor velen van hen ondoordringbaar is. Dit protocol beschrijft een methode om fluorescerende sondes (FP's) in levende embryo's via micro-injectie te gebruiken om grootschalige handel in organellen op te sporen. De procedure omvat de bereiding van de injectieoplossing, het verzamelen van eieren en de bereiding van embryo's, micro-injectie, beeldvorming en beeldanalyse.

Dramatische ruimtelijke herschikkingen van organellen komen vaak voor in veel dierlijke eicellen, eieren en embryo's, deels vanwege de grote omvang van deze cellen. In het Drosophila-embryo bewegen lipidedruppeltjes (LD's) en dooierblaasjes bijvoorbeeld vlak voor de cellisatie naar het embryocentrum⁵. Deze beweging is afhankelijk van microtubuli en laat een gebied van ~ 40 μm rond de periferie van het embryo uitgeput van de twee organellen. Tijdens eerdere splitsingsfasen worden veel organellen getransporteerd door cytoplasmatische stromen die worden aangedreven door op actine-myosine gebaseerde contracties aan het embryooppervlak⁶. Hoewel de embryo's van veel soorten vergelijkbare herschikkingen vertonen, is het Drosophila-embryo bijzonder geschikt voor het volgen van deze processen door beeldvorming omdat het zich extern ontwikkelt bij standaard laboratorium 'kamertemperatuur', relatief transparant is, klein genoeg om op de meeste microscoopstellingen te passen en kan worden gemanipuleerd met behulp van krachtige genetische hulpmiddelen.

Voor sommige organellen zijn fluorescerend gelabelde eiwitten beschikbaar die specifiek deze structuren labelen. LSD-2 (ook bekend als dPLIN2) is bijvoorbeeld een eiwit dat zich in embryo's specifiek richt op LDs⁷. Er zijn vliegenlijnen beschikbaar die ofwel induceerbare transgenen dragen die coderen voor een fusie tussen Green Fluorescent Protein (GFP) en LSD-2⁸ of een genenval waarin geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt ingebracht in het coderende gebied van het endogene LSD-2 gen ^9,10. Deze aanpak heeft echter beperkingen, waaronder dat deze fusie-eiwitten lage kwantumopbrengsten hebben en de neiging hebben om gemakkelijk te bleken. Bovendien kan het labelen van meerdere verschillende structuren tegelijkertijd een uitdaging zijn: voor veel organellen is momenteel slechts één type fluorescerende tag (vaak GFP of mCherry) beschikbaar, dus het afbeelden van twee organellen tegelijkertijd kan nieuwe transgenen of inserties vereisen; zelfs als er compatibele tags beschikbaar zijn, kan het introduceren ervan in een enkele soort tijdrovende kruisingen vereisen. Het maakt het gebruik van de vele krachtige genetische bronnen ook minder handig, bijvoorbeeld als twee organelmarkers, een Gal4-driver en een induceerbare RNAi-constructie allemaal in dezelfde moeder aanwezig moeten zijn.

In principe kunnen deze beperkingen worden overwonnen met het gebruik van FP's, waaronder vitale kleurstoffen (bijv. LysoTracker om lysosomen te markeren), moleculaire sondes (bijv. SiR-tubuline om microtubuli te labelen) en fluorescerend gelabelde biologische moleculen (bijv. C12 BODIPY om vetzuurmetabolisme te onderzoeken¹¹). Van gebruik in gekweekte cellen zijn ze meestal goed gevalideerd als krachtige hulpmiddelen voor het onderzoeken van cellulaire biologie. FP's zijn veelzijdig, hebben superieure foto-eigenschappen en zijn compatibel met fluorescerende eiwitten. Meerdere kleurstoffen kunnen tegelijkertijd worden gemengd en aangebracht, vaak met de voordelen van scheiding in de violet / blauwe en verrode gebieden van het spectrum en kleine Stokes-verschuivingen, waardoor kanaaldoorbloeding wordt voorkomen. Kleine Stokes-verschuivingen maken gelijktijdige opname van meerdere beeldkanalen mogelijk, waardoor meerdere organellen tegelijk kunnen worden gevolgd. Ten slotte kunnen ze ook worden toegepast op het labelen van organellen in de embryo's van andere Drosophila-soorten of zelfs andere insecten waar geen fluorescerend getagde eiwitten beschikbaar kunnen zijn.

De meeste van deze FP's kunnen echter de uitgebreide eierschaal van het Drosophila-embryo niet doorkruisen. Het bestaat uit vijf lagen: drie buitenste chorionlagen (chorion) die mechanische schade voorkomen plus een wasachtige laag rond het vitellinemembraan die een chemische barrière creëert¹². Voor de eenvoud wordt de combinatie van de wasachtige laag en het vitelline-membraan hieronder het "vitelline-membraan" genoemd. Om de eierschaal te omzeilen, past dit protocol een gevestigde embryomicro-injectiebenadering aan om FP's in het Drosophila-embryo te introduceren. Het protocol beschrijft hoe de cytoplasmatische stroom van LD's in embryo's in het splitsingsstadium kan worden gecontroleerd. Het omvat de bereiding van injectienaalden en kooien voor het verzamelen van eieren, het proces van het verzamelen van eieren en het mechanisch verwijderen van het chorion. Het gaat over het micro-injecteren en in beeld brengen van de embryo's en hoe de bulkstroom van LD's te analyseren met behulp van deeltjesbeeld velocimetrie (PIV, aangepast van⁶). Het biedt advies over het oplossen van problemen om de overleving van embryo's te garanderen en het beste systeem voor beeldvorming te creëren. Ook wordt besproken hoe het protocol kan worden gewijzigd om tegelijkertijd LD's en microtubuli in beeld te brengen of toe te passen op de studie van andere organellen, waaronder lysosomen, mitochondriën, dooierblaasjes en het endoplasmatisch reticulum (ER).

Protocol

1. Bereid de benodigde materialen voor

OPMERKING: Deze voorbereidingen kunnen het beste dagen of weken van tevoren worden gedaan.

1. Bereid injectienaalden voor.
   OPMERKING: Naalden kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen in een afgedekte container. Naalden moeten fijn genoeg zijn om ~ 700 fL af te leveren terwijl ze sterk genoeg zijn om het vitelline-membraan te doorboren.
   1. Plaats een capillair in de capillaire houder op de naaldtrekker. Zet het capillair vast met de vleugelnoten. Lijn het midden van het capillair uit met het verwarmingselement zodat twee symmetrische naalden worden gegenereerd.
   2. Kies de juiste instellingen op de naaldentrekker volgens de instructies van de fabrikant.
   3. Voer kwaliteitscontrole uit met behulp van een ontleedbereik.
      OPMERKING: Naaldpunten moeten zo goed mogelijk zijn. Gebarsten, gekartelde of naaldpunten met grote boring worden weggegooid.
   4. Bereid batches van 10 naalden (5 haarvaten waard) per keer.
   5. Plaats een vervormbare stopverf, die is opgerold in een cilinder, in het midden van de bodem van een container met een deksel. Druk de naalden voorzichtig in de stopverf zodat deze ze horizontaal houdt met de naaldpunten veilig in de lucht om schade te voorkomen. Dek af met het deksel en bewaar tot gebruik.
2. Bereid eierverzamelplaten voor. Bewaren bij 4 °C.
   OPMERKING: Eieropvangplaten zijn kleine agarplaten aangevuld met vruchtensap om het leggen van eieren aan te moedigen. Hoe ze te bereiden wordt beschreven in vele protocollen, waaronder¹³.
3. Bereid heptaanlijm voor.
   OPMERKING: Deze lijm wordt geëxtraheerd uit dubbelzijdige tape en wordt gebruikt om de embryo's stevig aan een deklip te bevestigen. Het voorkomt dat het embryo onscherp blijft tijdens injectie en beeldvorming. De lijm kan dagen of weken van tevoren worden bereid.
   1. Bal dubbelzijdige tape op tot een maat groter dan een golfbal en plaats deze op de bodem van een glazen container van ~ 50 ml met een goed afdichtend deksel. Pak tape goed in zodat er voldoende lijm aanwezig is.
   2. Vul in een zuurkast de glazen container met heptaan om alle tape te bedekken. Houd de container goed gesloten wanneer deze niet in gebruik is.
      LET OP: Heptaan is brandbaar als vloeistof en damp. Het kan irritatie van ogen, huid en luchtwegen veroorzaken. Ademende dampen kunnen slaperigheid, duizeligheid en longschade veroorzaken. Houd heptaan uit de buurt van ontstekingsbronnen en bewaar het in een goed geventileerde ruimte die bedoeld is voor ontvlambare stoffen en uit de buurt van incompatibele stoffen.
   3. Laat de heptaanlijm een nacht of langer zitten. Voor het beste resultaat plaatst u de container een nacht op een shaker of een ander roerwerk om te helpen bij het oplossen van de lijm.
      OPMERKING: De tape zelf blijft, maar de lijm wordt opgelost in het heptaan. In stap 5.1.2 wordt de lijm op een dekplaat aangebracht; heptaan verdampt en laat de lijm achter.
   4. Test het heptaanlijmpreparaat door er een druppel van op een glasplaat te plaatsen en ervoor te zorgen dat er een kleverig residu achterblijft zodra het heptaan is verdampt. Als er daarna geen lijmresten zichtbaar zijn, voeg dan meer tape toe aan de glazen container en herhaal de vorige stap.
      OPMERKING: Eenmaal voorbereid, kan de lijm maanden of zelfs jaren worden gebruikt.
4. Bereid een 1 mg/ml (3,8 mM) BODIPY493/503 stamoplossing door het commercieel verkregen preparaat te verdunnen in zuiver watervrij DMSO. Houd het bedekt om het te beschermen tegen licht en water. Voor onbepaalde tijd bewaren bij -20 °C of op korte termijn bij 4 °C.

2. Bereid eieropvangkooien voor

OPMERKING: Doe dit ten minste een dag (bij voorkeur 2 of 3 dagen) voor de geplande injectie(s).

1. Bereid gistpasta.
   OPMERKING: Gistpasta vult eiwitten en andere vitale voedingsstoffen aan die niet in de appelsapplaten worden geleverd. Het bevordert de eiproductie en het leggen van eieren.
   1. Voeg 2-10 g droge bakkersgist en vervolgens 1 ml kraanwater toe aan een klein bekerglas. Meng met een spatel.
   2. Blijf kraanwater toevoegen in stappen van 1 ml totdat de gewenste, tandpasta-achtige consistentie is bereikt.
   3. Dek het mengsel af en bewaar het bij 4 °C.
2. Stel vliegenkooien in voor het verzamelen van eieren.
   OPMERKING: Mannelijke en vrouwelijke vliegen van het gewenste genotype zijn vereist: 10-50 vrouwtjes jonger dan 2 weken oud en een vergelijkbaar aantal mannetjes. Er zijn een aantal verschillende opties voor vliegenkooien beschikbaar, waaronder zelfgemaakte opties^14,13. Het is belangrijk dat de grootte van de appelsapplaten is afgestemd op de grootte van de vliegenkooien.
   1. Leg een klein uitstrijkje gistpasta op een appelsapbord. Houd het afgedekt en laat het op kamertemperatuur komen omdat vliegen geen eieren op het bord leggen als het te koud is.
   2. Breng vliegen over naar een embryo verzamelkooi, sluit af met de gegiste appelsapplaat en bevestig de plaat aan de embryo verzamelkooi.
   3. Laat nieuw overgebrachte vliegen 1-2 dagen aan de kooi wennen en vervang de plaat dagelijks door een verse. Als alle gist de volgende dag is gegeten, verhoog dan de hoeveelheid gistpasta voor toekomstige collecties.
      OPMERKING: Dit is een belangrijke stap om de eiopbrengst te verhogen, omdat goed gevoede vrouwtjes meer eieren leggen.

3. Bereid op de dag van injectie de injectieoplossing voor en laad deze in de naald

1. Gebruik de standaardoplossing van BODIPY 493/503 (3,8 mM in DMSO) als injectieoplossing.
2. Laad een enkele naald met 1 μL van de injectieoplossing met behulp van de puntjes voor het laden van de naald.
   OPMERKING: Streef ernaar om de vloeistof helemaal tot aan de punt te krijgen zonder luchtbellen op te vangen. Wees klaar om de geladen naald snel te vervangen in geval van onbedoelde breuk.
   1. Bevestig een laadpunt aan een micropipette en trek 1 μL van de injectieoplossing in de punt. Houd met handschoenen de naald in één hand met de punt weg gericht om het risico op breuk te minimaliseren.
   2. Steek de oplaadpunt voorzichtig in de naald en duw deze dicht bij de naaldpunt. Doseer de vloeistof in de buurt van de naaldpunt. Houd na het verwijderen van de pipet de naald verticaal met de punt naar beneden totdat de vloeistof naar de punt stroomt.
3. Bewaar de geladen naalden in een aparte container met stopverf zoals hierboven (zie stap 1.1.5).
   OPMERKING: Naalden moeten van tevoren (tot enkele uren) na injectie worden bereid, maar mogen niet na meer dan een dag worden gebruikt.
4. Houd naalden uit omgevingslicht om bleken van de kleurstoffen te voorkomen. Dek de opslagcontainer af met aluminiumfolie zonder de naaldpunten te beschadigen. Zorg ervoor dat al het licht verduisterd is.

4. Embryo's verzamelen voor injectie

OPMERKING: De timing van het verzamelen hangt af van het stadium van embryo's waarin de injectie moet worden uitgevoerd. Met het onderstaande timingschema zijn de embryo's op het moment van voorbereiding voor injectie 0-90 minuten oud, wat overeenkomt met^{splitsingsfasen 15}.

1. Bereid op de dag van injectie appelsapplaten met gist, zoals in stap 2.2.1. Als N-injectierondes zijn gepland, bereid dan N + 2-platen voor. Bewaar deze platen op kamertemperatuur.
   OPMERKING: Naast de N-platen om embryo's te verzamelen voor injectie, is één plaat nodig als een pre-verzamelplaat en een andere om de vliegen in de kooi te voeden zodra de verzamelingen zijn voltooid.
2. Vervang de plaat op de kooi door een vers gegiste plaat (pre-collection plate) en laat deze 1-2 uur op de kooi liggen.
3. Vervang de plaat op de kooi door een verse plaat (opvangplaat). Gooi de pre-collection plaat weg, omdat deze embryo's bevat die ouder zijn dan gewenst. Laat de vliegen vervolgens 1,5 uur eieren leggen.
   OPMERKING: Omdat goed gevoede vliegen hun eieren meestal kort nadat de eieren zijn bevrucht, zorgt een verzameltijd van 1,5 uur ervoor dat aan het einde van de verzameling de meeste embryo's op het bord 0-90 minuten oud zijn, d.w.z. zich in splitsingsfasen bevinden. Vrouwelijke vliegen die sinds de vorige dag geen verse gist hebben gekregen, hebben de neiging om bevruchte eieren gedurende een onbepaalde hoeveelheid tijd te behouden voordat ze worden gelegd. Vandaar dat de pre-collection plaat embryo's kan bevatten die vóór het begin van de verzameling zijn bevrucht en dus ouder zijn dan 60 minuten, soms veel ouder.
4. Vervang de plaat op de kooi door een vers gegiste plaat. Bedek de verzamelplaat zodat verdwaalde vliegen er geen eieren op leggen.

5. Bereid embryo's voor op micro-injectie

1. Monteer de benodigde materialen.
   1. Bevestig een stuk dubbelzijdige tape aan een glasplaat. Raak de tape niet met de vingers aan, omdat dat de kleverigheid vermindert.
      OPMERKING: Deze dia wordt gebruikt voor het verwijderen van het chorion en niet voor beeldvorming.
   2. Plaats met behulp van een transferpipet of een micropipette (p200 of p1000) een kleine druppel (200 μL of minder) heptaanlijm ongeveer in het midden van een rechthoekige dekplaat (60 x 25 mm). Laat het heptaan verdampen (dit duurt minder dan een minuut).
      OPMERKING: Deze coverslip zal worden gebruikt om de embryo's te monteren voor injectie en beeldvorming. De afmetingen zijn gekozen om in een verstelbare metalen houder op de confocale microscoop te passen.
   3. Monteer een uitdrogingskamer, een afgesloten kamer (bijvoorbeeld een Tupperware-sandwichdoos) met uitdrogingsparels. Gebruik alleen uitdrogingsparels die niet gehydrateerd zijn.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de embryo's de injectieoplossing opnemen, moet het embryo enigszins worden uitgedroogd om de interne druk te verminderen. Dit wordt gedaan door de coverslip met de gedechorioneerde, aan de lucht blootgestelde embryo's in de uitdrogingskamer te plaatsen.
2. Verwijder mechanisch het chorion.
   1. Bedek de op de juiste leeftijd gerijpte embryoplaat met een dunne laag Halocarbon Oil 27 om de eierschaal transparant te maken.
      OPMERKING: Embryo's worden binnen tientallen seconden doorschijnend¹⁵. Als deze stap niet efficiënt verloopt, kunnen de appelsapplaten te nat zijn en moeten ze voor gebruik worden afgedroogd.
   2. Bekijk de plaat onder een dissectiekijker met transilluminatie (d.w.z. het licht dat door de plaat naar de oculairs gaat) om het stadium van de embryo's te bevestigen.
   3. Selecteer embryo's in splitsingsfasen.
      OPMERKING: Embryo's in het splitsingsstadium zijn volledig ondoorzichtig; de daaropvolgende blastodermstadia zijn te herkennen aan een band van transparant cytoplasma rondom het ondoorzichtige centrum¹⁵. Een goede inleiding over het herkennen van verschillende embryonale stadia is beschikbaar op de website (gegeven in referentie¹⁶) die wordt onderhouden door de Society of Developmental Biology.
   4. Pak met een fijn pincet een embryo van het gewenste stadium bij zijn dorsale aanhangsels en breng het over op de voorbereide glasplaat bedekt met een stuk dubbelzijdige tape. Plaats het embryo op de tape. Minimaliseer de overdracht van olie.
   5. Rol het embryo zo voorzichtig mogelijk over het oppervlak van de tape door het embryo voorzichtig te duwen met de zijkant van de punt van het pincet. Prik het embryo niet direct met de scherpe pincetpunten.
      OPMERKING: Als de uitgeoefende kracht te laag is, zal het embryo niet rollen. Als het te hoog is, zal het barsten. Het vinden van de juiste tussenkracht vereist ervaring en daarom moet deze stap van tevoren worden geoefend.
   6. Blijf het embryo rollen totdat het chorion zich tijdelijk aan de tape hecht en barst.
   7. Zodra het chorion barst, blijf rollen om het embryo (nog steeds in het vitelline-membraan) van het chorion te scheiden, omdat het chorion aan de tape blijft kleven.
   8. Bevestig dat het chorion volledig is verwijderd door het verlies van de dorsale aanhangsels van het embryo te observeren.
   9. Rol het embryo terug op het chorion, dat minder kleefbaar is dan de tape. Wrijf het embryo voorzichtig in met het pincet totdat het zich aan het pincet hecht voor overdracht.
   10. Breng het embryo over op de deklip met de heptaanlijm en breng het in contact met de lijm, die het meestal losmaakt van het pincet.
   11. Pas de oriëntatie van het embryo op de coverslip aan.
       1. Sluit het laterale oppervlak van het embryo in de lijm in.
          OPMERKING: Het oppervlak van het embryo dat in de lijm is ingebed, is degene die in beeld wordt gebracht. Het inbedden van het zijdelingse oppervlak is het eenvoudigst, maar dit kan worden aangepast afhankelijk van persoonlijke voorkeur of de biologische vraag die moet worden beantwoord.
       2. Oriënteer de lange as van het embryo loodrecht op de lange as van de coverslip.
       3. Als het embryo niet in de gewenste oriëntatie ligt, reinigt u het pincet om eventuele olie te verwijderen die het embryo van de lijm zou losmaken. Probeer vervolgens voorzichtig het embryo in positie te rollen.
   12. Bereid het gewenste aantal embryo's voor op injectie op de hierboven beschreven manier.
       OPMERKING: Naarmate de tijd verstrijkt na het verwijderen van het chorion, zal de omgevingslucht de embryo's beginnen uitdrogen en dus zal het effect van stap 5.3 ongelijk zijn voor de embryo's op de coverslip, die op verschillende tijdstippen werden gedechorioneerd. Meestal zijn 1-3 embryo's het meest beheersbaar.
3. Verwijder embryo's.
   1. Plaats de coverslip met embryo's in de voorbereide uitdrogingskamer en verzegel deze.
   2. Laat de embryo's 5-12 minuten uitdrogen.
      OPMERKING: De timing van deze stap is afhankelijk van de omgevingstemperatuur en vochtigheid en moet dus empirisch worden bepaald.
   3. Verwijder de coverslip uit de kamer en plaats er een druppel Halocarbon Oil 700 op, die de embryo's volledig bedekt, om verdere uitdroging te voorkomen.
   4. Inspecteer de embryo's op een ontleedbare scope om de juiste uitdroging te beoordelen.
   5. Als de embryo's slechts licht verschrompeld zijn, maar niet leeglopen, ga dan verder met micro-injectie (stap 6).
   6. Als de embryo's niet voldoende of te veel uitgedroogd zijn, keert u terug naar stap 5.2 en bereidt u een nieuwe partij embryo's voor, aangezien de Halocarbon Oil 700 niet kan worden verwijderd. Als de embryo's te veel uitgedroogd waren, verkort dan de uitdrogingstijd voor de volgende batch embryo's met 3 minuten; als ze te weinig uitgedroogd waren, verhoog dan de uitdrogingstijd met 3 minuten.

6. Micro-injectie-embryo's

OPMERKING: Zorg ervoor dat de micro-injectie-opstelling een omgekeerde microscoop bevat, een micromanipulator om de injectienaald vast te houden en te positioneren en een commerciële micro-injector om gecontroleerde volumes te leveren.

1. Schakel de micro-injector in en voer de gewenste instellingen in.
   OPMERKING: Voor dit protocol wordt aanbevolen om lineaire bewegingsuitvoer en de snelle instelling te gebruiken, maar vele andere zullen werken. De operator moet zijn persoonlijke voorkeur bepalen.
2. Laad de naald in de micromanipulator. Om te voorkomen dat de naald wordt beschadigd tijdens het laden van de dekplaat met de embryo's, verplaatst u deze uit de weg naar een veilige positie.
3. Plaats de deklap op het podium, met embryo's erop, in de richting van de naald. Beweeg de naald vervolgens voorzichtig terug in positie voor injectie, met de punt nog steeds ruim boven het stadium.
4. Zet het 4x objectief in het lichtpad. Gebruik de focusknop op de microscoop om de embryo's scherp te stellen.
   OPMERKING: Dit zal het brandpuntsvlak zijn dat wordt gebruikt voor injectie en zal in de toekomst slechts minimaal worden aangepast.
5. Gebruik de podiumbedieningen om de embryo's horizontaal naar het midden van het gezichtsveld te verplaatsen.
   1. Pan weg van de embryo's en houd ze aan de rand van het gezichtsveld, ter voorbereiding op het laten zakken van de naald. Blijf in hetzelfde brandpuntsvlak om ervoor te zorgen dat de naald in de juiste positie wordt neergelaten.
6. Laat de naaldpunt in het juiste brandpuntsvlak zakken en zorg ervoor dat deze samen met de embryo's zichtbaar is in het gezichtsveld.
   1. Gebruik de micromanipulatorregelaars en kijk van bovenaf (nog niet door de oculairs) en laat de naaldpunt langzaam in de olie vallen, gericht op het gebied waar het doel naartoe wijst. Omdat de olie vrij stroperig is, ga je langzaam om beschadiging van de naald te voorkomen.
   2. Zodra de naald zichtbaar is door de oculairs, blijft u de micromanipulatorbedieningen gebruiken totdat de naaldpunt scherp is en zich in het midden van het gezichtsveld bevindt.
   3. Door het podium te verplaatsen, breng je de embryo's terug naar het midden van het gezichtsveld. Gebruik de podiumbediening, micromanipulatorbediening en focusknop om de positie van het embryo en de naaldpunt ten opzichte van elkaar te verfijnen terwijl beide scherp zijn. Probeer injecties zo dicht mogelijk bij de coverslip uit te voeren.
7. Voer de kwaliteitscontrole van de naald uit.
   1. Om ervoor te zorgen dat de naald functioneel is, doseert u een deel van de injectieoplossing in de Halocarbon Oil 700 rond het embryo, zichtbaar als een bel in de olie.
   2. Als er niets uit de naald stroomt, verhoog dan geleidelijk de druk op de injector. Als dit niet werkt, koop dan een nieuwe naald.
8. Injecteer het embryo.
   OPMERKING: Acceptabele injectievolumes variëren van ~ 0,06-1 pL. De ondergrens wordt bepaald door wat kan worden gevisualiseerd in het embryo. De bovengrens wordt bepaald door het trauma dat de injectie op het embryo uitoefent.
   1. Injecteer langs de laterale randen van het embryo omdat dit het minst invasief is.
   2. Gebruik de fasecontroles om het embryo naar de naaldpunt te bewegen totdat de laatste het embryo voorzichtig doorboort en erin gaat.
   3. Start tegelijkertijd de stroom van injectieoplossing en let op het verschijnen van een voorbijgaande heldere plek op de plaats van de naaldpunt, wat wijst op een succesvolle overdracht van vloeistof in het embryo.
   4. Controleer het embryo. Als het embryo weerstand biedt aan de naald en scheurt (cytoplasma spuit eruit) bij binnenkomst, keert u terug naar stap 5 en verhoogt u de uitdrogingstijd. Als het embryo plat tegen de dekenslip ligt en tijdens de injectie slap lijkt, keert u terug naar stap 5 en verkort u de uitdrogingstijd.
   5. Als er geen kleurstof in het embryo is gekomen, bevestig dan dat de kleurstof nog steeds vrij uit de naald kan stromen, zoals in stap 6.7. Als de kleurstof niet stroomt, vervang dan de naald. Als de kleurstof stroomt, injecteer dan een nieuw embryo en begin met het vrijgeven van de kleurstof net voordat de naald het embryo doorboort.
      OPMERKING: Herhaalde injecties van hetzelfde embryo worden niet aanbevolen omdat het de vorige wond/injectieplaats scheurt.
9. Herhaal dit totdat alle embryo's zijn geïnjecteerd.

7. Beeldembryo's

OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een laser scanning confocale microscoop.

1. Plaats coverslip in de metalen houder op de confocale microscoop, zodat de embryo's direct van onderaf door de coverslip worden afgebeeld; boven de coverslip is er alleen olie en geen andere barrière.
2. Als kwaliteitscontrole stap, beeld eerst met behulp van de epifluorescentie functie op de confocale microscoop, met een 40x objectief. Zorg ervoor dat de fluorofoor zichtbaar is in het embryo voordat u verder gaat.
3. Als het gewenste beeldvlak verschilt van de injectieplaats, geef de kleurstof dan voldoende tijd om de kleurstof naar het doelgebied te verspreiden.
   OPMERKING: Voor BOPIPY 493/503 varieert deze tijd meestal van 30-60 minuten. Omdat de diffusietijd sterk afhankelijk is van de kleurstof, kunnen andere kleurstoffen het optimaliseren van de injectieplaats en wachttijd vereisen.
4. Gebruik verschillende doelstellingen voor beeldvorming op verschillende schalen. Gebruik een 40x-objectief om het hele embryo in beeld te brengen en een 63x-objectief om subsecties voor kleinere schalen weer te geven.
5. Voor live beeldvorming tijdens de syncytiele stadia vóór cellularisatie, gebruik de volgende voorwaarden om mee te beginnen: afbeeldingsgrootte van 512 x 512 pixels, lijngemiddelde van 3, framesnelheid van 0,1 frames per seconde (d.w.z. 1 frame verkregen elke 10 s). Pas de omstandigheden aan volgens de mogelijkheden van de gebruikte microscoop.
   OPMERKING: Deze voorwaarden maken het mogelijk om ~ 500 + -afbeeldingen van BOPIPY 493 /503 te verkrijgen en het grootste deel van de beweging vast te leggen.

8. Analyseer de LD-stroom door eerst FIJI te gebruiken om een tijdreeks van afbeeldingen voor te bereiden en vervolgens python voor PIV-analyse

1. Optimaliseer beeldacquisitie.
   1. Voer injecties van de gewenste kleurstof uit in het juiste stadium. Herhaal deze stap totdat de dagelijkse variatie verwaarloosbaar is.
   2. Optimaliseer instellingen voor beeldacquisitie, waaronder vergroting, zoom, resolutie en framesnelheid.
      OPMERKING: Er is een afweging tussen afbeeldingen van hoge kwaliteit (resolutie + lijngemiddelde) en acquisitiesnelheid (framesnelheid).
2. Bereid gegevens voor in FIJI.
   1. Verkrijg een hoogwaardige tijdreeks om te analyseren.
   2. Open een frame van de tijdreeks om een masker te genereren met FIJI. Dupliceer de afbeelding. Converteer het type van de afbeelding naar een 8-bits.
   3. Definieer de grens van het embryo met behulp van de Polygon of Freehand Selection Tool. Gebruik Buiten wissen om pixelwaarden buiten de selectie in te stellen op 0. Wis en keer vervolgens om binnen de selectie om de waarde van de pixels binnen de selectie in te stellen op de maximale waarde (255).
   4. Hef de selectie op en gebruik vervolgens de opdracht Histogram om ervoor te zorgen dat alleen pixelwaarden van 0 en 255 aanwezig zijn.
   5. Sla dit nieuwe afbeeldingsmasker op voor de specifieke tijdreeks.
   6. Open de gewenste tijdreeks. Kies welke tien frames het beste de tijd van interesse vastleggen, bijvoorbeeld nucleaire cyclus 9 bij het begin van de corticale contractie. Dupliceer de tien frames van belang en vorm een substack.
   7. Gebruik de functie Stapelen naar afbeeldingen om 10 afbeeldingen te genereren om te analyseren met PIV.
   8. Sla de afzonderlijke bestanden op een manier op die hun volgorde behoudt (SeriesX_1, SeriesX_2, SeriesX_3 ...).
3. Gebruik het voorbereide masker en de afzonderlijke frames voor PIV-analyse, met behulp van het meegeleverde voorbeeld python-script (aanvullende gegevens) of een aangepast script dat door de gebruiker is gegenereerd.
   OPMERKING: Het meegeleverde script is gebaseerd op de python-toepassing van OpenPIV¹⁷. Het voert afstand uit in pixels die kunnen worden geconverteerd met behulp van de pixelbreedte en framesnelheid om snelheden of snelheden te genereren.
4. Genereer replicaties door de vorige stappen voor extra embryo's te voltooien en de uitvoerwaarden te compileren.

Representative Results

Na injectie wordt de kleurstof alleen gelokaliseerd op de plaats waar de naaldpunt is ingebracht. De kleurstof zal dan diffunderen weg van de injectieplaats, afhankelijk van de diffusieve eigenschappen. Figuur 1 toont injectie van BODIPY 493/503, kort na injectie (paneel A) en 24 minuten later (paneel B). Na 24 minuten heeft de kleurstof ongeveer het middelpunt van de lange as van het embryo bereikt.

Het analyseren van organelmotiliteit kan worden bereikt door middel van kleurstofinjecties en time-lapse beeldvorming. In figuur 2 werd een embryo mede geïnjecteerd met BODIPY 493/503 (figuur 2A) en LysoTracker Red (figuur 2B) en afgebeeld met behulp van laserexcitatie bij respectievelijk 488 en 596 nm. Dit embryo werd vervolgens in beeld gebracht (één frame om de 30 s gedurende 30 minuten, 5 minuten geanalyseerd). De tijdreeks werd vervolgens uitgevoerd door piv-analyse, waarvan de output wordt weergegeven via stroomlijnen in figuur 2A, B. Merk op dat de stroomlijnen niet het traject van individuele deeltjes vertegenwoordigen, maar de cytoplasmatische stroom wordt afgeleid uit het analyseren van alle deeltjes in dat gebied van het cytoplasma. Door labeling van twee onafhankelijke cellulaire structuren (LD's en zure organellen), vindt de PIV-analyse vergelijkbare stromen, waarbij beide labels samenkomen op het centrale gebied van het embryo waar het cytoplasma in het binnenste van het embryo stroomt⁶.

Momenteel beschikbare FP's maken het labelen van vele andere organellen en cellulaire structuren mogelijk. Figuur 3 toont de etikettering van de ER via ER-tracker Green. ER-tracker biedt een mooie resolutie van de nucleaire envelop, waardoor visualisatie van belangrijke celcyclusstadia mogelijk is. ER tracker Green is afgebeeld met behulp van 488 nm excitatie.

Het labelen van de mitochondriën is lastig, omdat de meeste geteste kleurstoffen gevangen lijken te zitten in het eerste mitochondrion dat ze binnenkomen. Aan de andere kant werd geen teken van kleurstoftoxiciteit gedetecteerd, waardoor het mogelijk was om gelabelde mitochondriën te volgen door cellularisatie en de ectodermale nucleaire cyclus 15. Figuur 4 toont een ectodermale cel enkele uren na injectie met Mitoview 633 (excitatiegolflengte 633 nm).

BODIPY, Lysotracker en LipidSpot zijn robuust en kunnen worden gebruikt om ~ 500 + afbeeldingen te verkrijgen bij 512 x 512, lijngemiddelde 3, framesnelheden van 1 / s tot 0,1 / s. ER-tracker Green, SiR-tubulin en de genoemde mitochondriale kleurstoffen zijn minder robuust en leveren ~ 50-200 afbeeldingen op onder dezelfde omstandigheden.

Vanaf blastodermstadia bewegen LD's bidirectioneel langs microtubuli, aangedreven door de tegenpolariteitsmotoren kinesine-1 en cytoplasmatisch dyneïne⁵. Deze beweging kan worden gevisualiseerd door LDs en microtubuli te co-labelen via het injecteren van zowel BODIPY 493/503 als SiR-Tubulin (figuur 5). Omdat LD's vaak hun bewegingsrichting omkeren (omdat ze schakelen tussen kinesine-1 en cytoplasmatisch dyneïne), leggen hogere framesnelheden tijdens acquisitie kritieke details van LD-motiliteit beter vast.

Live beeldvorming van autofluorescente dooierblaasjes is mogelijk zonder enige vorm van kleurstofinjectie (figuur 6). De autofluorescentie is echter zwak en de excitatielaser is fototoxisch. Live beeldvorming van autofluorescente dooier heeft dus een slechte signaal-ruisverhouding ten opzichte van kleurstofinjectie.

Figuur 1: Diffusie van BODIPY 493/503 door het embryo. De kleurstof werd geïnjecteerd langs de laterale rand naar het voorste uiteinde (rechtsboven) en diffundeert van deze injectieplaats in het embryo, met als label LDs. (A) De kleurstof is verspreid door delen van het embryo naast de injectieplaats. (B) Ongeveer 24 min/2 kerncycli later is de kleurstof voorbij het middelpunt van het embryo ges diffundeerd. Schaalbalk: 100 μm. Een frame van 1024 x 1024 (lijngemiddelde 4) werd elke 30 s aangeschaft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Particle image velocimetry (PIV) voor LDs en zure organellen. Een embryo werd geïnjecteerd met zowel BODIPY 493/503 als LysoTracker Red. (A) BODIPY-kanaal. (B) LysoTracker Rood kanaal. (A',B') Stroomlijn diagrammen gegenereerd door PIV-analyse van de twee kanalen gegenereerd uit 10 opeenvolgende frames, inclusief die weergegeven in A en B. A' komt overeen met de stroom van LD's en B' komt overeen met de stroom van zure organellen. Merk op dat zowel A' als B' een links-van-het-midden samenvloeiing vertonen waarbij embryonale inhoud uit het gezichtsvlak stroomt, in het midden van het embryo. Merk ook op dat BODIPY meer heeft verspreid dan LysoTracker, omdat verschillende kleurstoffen verschillende diffusieve eigenschappen hebben. Schaalbalk: 100 μm. Een frame van 1024 x 1024 (lijngemiddelde 4) werd elke 30 s aangeschaft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: ER-tracker labelt syncytiele nucleaire divisies. Een syncytieel blastoderm-embryo werd micro-geïnjecteerd met ER-tracker en een deel van het oppervlak werd in de loop van de tijd in beeld gebracht. (A) Spindelassemblage tijdens een nucleaire divisie. (B) Vrijstelling van de nucleaire enveloppe tijdens dezelfde verdeling. (C) Volgende interfase. (D) Het begin van de volgende deling wordt aangegeven door centrosoomverschijning (voorkomen van cirkelvormige ER-vrije gebieden, gemarkeerd door pijlpunten). Let op het geleidelijke bleken van de kleurstof. Excitatie golflengte: 488 nm. Schaalbalk: 5 μm. A: initieel frame, B: 3 min verstreken, C: 10 min verstreken, D: 13 min verstreken. Een frame van 1024 x 1024 (lijngemiddelde 4) werd elke 30 s aangeschaft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Mitoview 633 etikettering van mitochondriën. Een embryo werd geïnjecteerd met Mitoview 633 tijdens het syncytiele blastodermstadium en 4 uur later, na cellisatie, in beeld gebracht. De afbeelding toont een neuro-ectodermale cel van een embryo in kiembandverlenging. Schaalbalk: 5 μm. Een frame van 1024 x 1024 (lijngemiddelde 4) werd elke 30 s aangeschaft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Co-labeling van LD's en microtubuli. Een celliserend embryo werd geïnjecteerd met een mengsel van BODIPY 493/503 (geel A,B,C) en SiR Tubulin (magenta A',B',C'). A'', B'', C'' tonen de samengevoegde kanalen. Panelen A, A', en A'' tonen het oorspronkelijke frame, panelen B, B' en B'' tonen het frame na 5 s, en panelen C, C' en C'' tonen het frame na 10 s. Schaalbalk: 5 μm. Een frame van 512 x 512 (lijngemiddelde 3) werd elke 2,5 s aangeschaft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Beeldvorming van de autofluorescentie van dooierblaasjes tijdens syncytiele splitsingsfasen. (A) Aan het begin van de acquisitie. (B) Na 8 min. (C) Na 16 min. Excitatie golflengte: 405 nm. Lage excitatie-intensiteit werd gebruikt om het embryo in leven te houden. Schaalbalk: 100 μm. Een frame van 1024 x 1024 (lijngemiddelde 4) werd elke 30 s aangeschaft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende gegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het Drosophila-embryo is een krachtig en handig model om fundamentele vragen in cellulaire en organismale biologie te bestuderen. De relatieve eenvoud, krachtige genetica en kleine omvang maken het een uitstekend systeem voor het in beeld brengen van zowel cellulaire processen als ontwikkeling. Hier wordt een standaard micro-injectieprotocol aangepast om FP-gebruik in embryo's mogelijk te maken. Deze aanpak maakt fluorescerende beeldvorming van specifieke cellulaire structuren mogelijk zonder de noodzaak van genetisch gecodeerde fluoroforen, waardoor veel genetische achtergronden voor beeldvorming worden geopend. Het combineren van meerdere kleurstoffen plus strategisch gekozen fluorescerend gelabelde eiwitten kan meerkanaals live beeldvorming openen die het hele spectrum van zichtbaar licht overspant.

Kritieke stappen in het protocol:
Dit protocol gebruikt BODIPY 493/503 om LD's te labelen. Deze aanpak kan gemakkelijk worden aangepast om andere cellulaire structuren te markeren. Voor latere beeldanalyse is een van de belangrijkste factoren de signaal-ruisverhouding, d.w.z. de helderheid van de kleurstof in vergelijking met het achtergrondsignaal. Lysosomen zijn met succes in beeld gebracht (LysoTracker Red, 1 mM), evenals mitochondriën (Mitoview 633, 200 μM), de ER (ER tracker Green, 10 μM) en microtubuli (SiR tubuline, 200 nM in DMSO), zoals weergegeven in figuur 2, figuur 3, figuur 4, figuur 5. Bovendien zijn dooierblaasjes autofluorescent en geven ze blauw licht af bij UV-excitatie (afbeelding met 405 nm als excitatiegolflengte (figuur 6)). Streef er voor andere kleurstoffen naar dat de kleurstofconcentratie 100-1.000x is van wat nodig zou zijn voor het kleuren van gekweekte cellen; dit is vergelijkbaar met de concentratie van een stamoplossing die zou worden verdund tot celkweekmedia. Aangezien dit protocol een injectie van 100 fL vereist en het Drosophila-embryo ongeveer 9 nL is in volume¹⁸, zullen deze kleurstofconcentraties gemiddeld uitkomen op een interne embryonale concentratie van minder dan 1/100e van wat aanwezig is in de celkweekmedia. Tijdelijk zal de lokale concentratie hoger zijn op de injectieplaats, wat het meest relevant is voor FP's die niet goed diffunderen (d.w.z. mitochondriale kleurstoffen en SiR-tubuline). Begin voor deze FP's bij de aanbevolen hoge concentraties; als onverwachte dood wordt waargenomen, verdun dan achtereenvolgens tweevoudig totdat een aanvaardbaar compromis tussen overleving en signaalsterkte is bereikt.

Bij het co-injecteren van meerdere kleurstoffen moeten beide kleurstoffen in hetzelfde oplosmiddel zitten, of zowel de oplosmiddelen als de kleurstoffen moeten compatibel zijn met het mengsel (alcoholconcentraties van meer dan ~ 10% worden niet aanbevolen).

De kwaliteit van de naalden is essentieel voor het succes van deze procedure, omdat de punt zo goed mogelijk moet zijn. Anders kan schade door de injectiewond de verdere ontwikkeling van het embryo in gevaar brengen. Omdat commerciële naaldtrekkers verschillen, is het belangrijk om de suggesties van de fabrikant te volgen en meerdere trekparameters uit te proberen totdat de gewenste vorm is bereikt. Het is van cruciaal belang om de kwaliteitscontrole stap 1.1.3 uit te voeren, omdat het werken met een gebarsten, gekartelde of grote boring naaldpunt de succesvolle injectie moeilijker of zelfs onmogelijk zal maken.

Het embryo moet gedeeltelijk worden uitgedroogd, zodat tijdens de injectie extra hoeveelheden vloeistof kunnen worden toegevoegd. Als het embryo onvoldoende is uitgedroogd, zal de naald niet gemakkelijk binnendringen en zal cytoplasma eruit spuiten als de naald binnendringt of als de oplossing wordt geïnjecteerd. Als het embryo te veel uitgedroogd is, zal het er leeggelopen uitzien en zich niet goed ontwikkelen. De exacte droogtijd is afhankelijk van de lokale omstandigheden, bijvoorbeeld de luchtvochtigheid, en kan van dag tot dag veranderen. Het moet empirisch worden bepaald voor elke sessie.

Het vermogen van het embryo om te overleven na micro-injectie hangt kritisch af van de kwaliteit van de naald, de juiste uitdroging en het beperken van het injectievolume tot minder dan 1 pL (idealiter 100 fL). Zolang deze parameters zijn geoptimaliseerd, is er geen significante toxiciteit zichtbaar wanneer de beschreven kleurstoffen in de aanbevolen concentraties worden geïnjecteerd. Als embryo's de uitdrogings- en injectiestappen overleven, ontwikkelen ze zich meestal met succes goed tot kiembanduitbreiding, met uitzondering van de microtubuli- en ER-sondes die cellularisatiedefecten op hoge niveaus veroorzaakten (100 fL injectie van de stamconcentratie van elk). Testen vonden geen duidelijke ontwikkelingsdefecten wanneer DMSO, water en mengsels van de twee werden geïnjecteerd met de aanbevolen volumes, met een embryooverlevingspercentage door kiembanduitbreiding van ~ 75% of meer. Injectievolumes van meer dan 1 pL veroorzaakten defecten en embryo's geïnjecteerd met ~ 4 pL volumes ontwikkeld gedurende minder dan 1 uur. Daarom moeten de injectievolumes laag worden gehouden, wat betekent dat de kleurstofconcentraties hoog moeten zijn.

Over het algemeen worden injecties langs de zijrand van het embryo aanbevolen omdat die resulteren in de minste schade. Het kan echter nodig zijn de injectieplaats aan te passen, afhankelijk van de diffusieve eigenschappen van de gebruikte FP's. BODIPY 493/503 en LysoTracker diffunderen sneller over het hele embryo dan Lipid Spot 610 (een andere kleurstof om LD's te markeren), terwijl SiR-Tubulin en Mitoview 633 nooit volledig over het embryo diffunderen (beeldvorming tot 7 uur na de injectie). Injectie in of nabij de plaats van belang kan dus noodzakelijk zijn. Bij het injecteren in de voorste of achterste regio's wordt een bijzonder fijne naald aanbevolen.

Beeldverwerving is afhankelijk van confocale microscopie om kleine organellen en alle cytoskeletcomponenten optisch te sectieren en op te lossen. Technieken die analyse van veel beelden vereisen (bijv. STORM of PALM) zullen niet werken omdat de embryonale inhoud in beweging is en de fluoroforen niet zijn geoptimaliseerd voor fotoschakeling. Epifluorescentiemicroscopie mist de laterale en axiale resolutie om de meeste organellen en kleinere cellulaire structuren te onderscheiden. Om deze redenen wordt het sterk aanbevolen om een confocale microscoop te gebruiken of lichtplaattechnologie te gebruiken.

De reproduceerbaarheid van de beeldanalyse is sterk afhankelijk van consistente beeldgegevens. Voor de grootste kans op succes is optimalisatie van de injectietechniek en beeldverwerving nodig. Het vaststellen en oefenen van een techniek waarbij de kleurstof (en) van belang, de plaats van injectie, de leeftijd van het embryo, het injectievolume en de acquisitie-instelling allemaal consistent zijn, zal de meest robuuste gegevens voor beeldanalyse genereren.

Wijzigingen en probleemoplossing van de methode
Dit protocol demonstreert een methode voor het analyseren van de bulkstroom van LD's in embryo's in het splitsingsstadium met behulp van deeltjesbeeld velocimetrie. Dezelfde aanpak kan worden gebruikt voor andere organellen, andere ontwikkelingsstadia en andere analysemethoden. Figuur 2 toont bijvoorbeeld analyse van LD's en zure organellen die stromen in de syncytiele stadia van embryogenese, gevisualiseerd door het co-injecteren van BODIPY 493/503 en LysoTracker Red. Verdere succesvolle beeldvorming van LD-beweging in embryo's tot 7 uur na de bevruchting is bereikt; deze embryo's behouden wel de injectiewond maar kunnen zich enkele uren ontwikkelen.

Gegevens verzameld met behulp van dit protocol zijn gebruikt voor deeltjesbeeld velocimetrie, maar er zijn veel andere analysetechnieken beschikbaar. Deeltjesvolgprogramma's zoals die in ImageJ, Imaris of handmatige tracking kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om snelheden en directionaliteiten van bewegende structuren te verkrijgen. Merk op dat de meeste van dergelijke trackingsoftware zijn gebouwd om te werken met gegevens van planaire celkweeksystemen en zich niet altijd goed aanpassen aan 3D-structuren zoals het Drosophila-embryo . Verder zouden voor het genereren van de beste kwaliteit deeltjesvolggegevens meerdere Z-vlakken in beeld moeten worden gebracht; dit zou haalbaar moeten zijn als de acquisitietijden van de afbeeldingsstapel minder dan ~ 2 s zijn. Deze benchmark moet bereikbaar zijn op ronddraaiende schijf confocale, roosterlichtplaat en recente laserscanning confocale systemen. De haalbaarheid van deeltjestracking voor overvloedige organellen zoals LD's, mitochondriën en lysosomen is echter laag omdat de hoeveelheid positief signaal in een gezichtsveld te hoog is voor de huidige trackingmethoden. Het volgen van minder overvloedige structuren zoals kernen of dooierblaasjes kan mogelijk zijn. PIV voor stromingsanalyse werkt goed voor LD's en zure organellen in splitsingsfasen omdat beide organellen vrij bewegen. Organellen zoals kernen, ER en mitochondriën zijn vastgebonden aan andere cellulaire structuren en bewegen dus niet vrij en zijn niet geschikt voor software-analyse die uitgaat van vrije beweging. De onderzoeker moet de technieken kiezen die het meest geschikt zijn voor het organel van belang.

Tijdens de syncytiele en cellulaire blastodermstadia bewegen LD's (evenals enkele andere organellen) langs radiaal georiënteerde microtubuli⁵. Het is daarom mogelijk om dwarsdoorsnedebeelden te vinden (zoals in figuur 5) waar enkele microtubuli gedurende lange afstanden scherp zijn, waardoor deeltjes in 2D kunnen worden gevolgd. Omdat deze optische vlakken zich diep in het embryo bevinden, neemt de totale signaalsterkte af en wordt de signaal-ruisverhouding verminderd.

Voor trackinganalyse kan beeldvorming zo snel mogelijk cruciale details van de beweging en dus van de beweeglijke machinerie onthullen. Lipidedruppelbeweging is bijvoorbeeld een mengsel van twee beweeglijke toestanden, slow-short motion (~ 200 nm / s; gemiddelde reisafstand ~ 100 nm) en snel-lange beweging (~ 450 nm / s; gemiddelde reisafstand ~ 1.000 nm)¹⁹; dus als er elke seconde of zelfs minder vaak foto's worden gemaakt, wordt de langzaam-korte toestand niet detecteerbaar. Frequente beeldvorming induceert echter ook fluorofoorbleking en fototoxiciteit. Beeldvormingsomstandigheden moeten daarom worden aangepast afhankelijk van de exacte vraag die moet worden behandeld.

Beperkingen van de methode
Afhankelijk van de gewenste kleurstof kan de methode worden beperkt door de compatibiliteit tussen de oplosbaarheid van de kleurstof en de toxiciteit van de injectieoplossing. Alcoholen zoals isopropanol en ethanol zijn moeilijk te hanteren in een naald vanwege hun lagere viscositeit en lijken cellulaire componenten te beschadigen en het embryo te doden.

De methode is ook niet goed geschikt voor het visualiseren van de vroegste stappen in embryogenese, omdat het 30+ minuten duurt om de embryo's voor te bereiden op injectie. Bij kamertemperatuur zijn de eerste celcycli van het embryo elk slechts ~ 10 minuten lang; dus zelfs als men in stap 5.2.3 een nieuw bevruchte eicel zou kiezen, zouden de eerste paar celcycli al voltooid zijn tegen de tijd dat het embryo klaar is voor beeldvorming.

Verlichting met licht in het UV/blauwe bereik is aanzienlijk fototoxischer dan bij langere golflengten. Onder dergelijke omstandigheden (bijv. om autofluorescente dooierblaasjes te volgen; Figuur 6), moet men de beeldtijd beperken (wat leidt tot kortere tijdreeksen) of een lager laservermogen gebruiken (wat resulteert in een verminderde signaal-ruisverhouding).

Na cellularisatie hebben kleurstoffen die op een specifieke locatie worden geïnjecteerd de neiging om slecht te diffunderen, omdat ze veel celmembranen moeten doorkruisen. Dit beperkt het waarnemingsgebied in latere ontwikkelingsstadia.

De betekenis van de methode ten opzichte van bestaande/alternatieve methoden
De beweging van LD's en andere lipidebevattende organellen in vroege embryo's kan worden gevisualiseerd met genetisch gecodeerde fluoroforen, labelvrije technieken en door de introductie van FP's. Dit laatste kan worden bereikt door permeabilisatie van het vitellinemembraan¹² of de hier besproken micro-injectiebenadering.

Genetisch gecodeerde fluoroforen zijn veelzijdige markers waarvan de niveaus meestal zeer reproduceerbaar zijn van embryo tot embryo. Ze hebben echter lagere kwantumopbrengsten en bleken gemakkelijker dan FP's. Meestal zijn ze alleen beschikbaar in een of twee gelabelde versie (s) (bijv. GFP of mCherry), waardoor de keuze van welke structuren tegelijkertijd kunnen worden afgebeeld, wordt beperkt. FP's daarentegen bestaan vaak in een grote verscheidenheid; er zijn bijvoorbeeld verschillende lipidedruppelspecifieke kleurstoffen beschikbaar met emissiespectra van Autodot in het UV/blauwe spectrum tot Lipidtox en LipidSpot 610 in het verrode spectrum. FP's kunnen ook direct worden toegepast op elke stam van belang en vereisen dus geen spanningsconstructie om bijvoorbeeld de gewenste organelmarker in een mutante stam van belang te introduceren. Dit voordeel is vooral uitgesproken wanneer meerdere structuren tegelijkertijd moeten worden gelabeld; in plaats van tijdrovende kruisingen over meerdere generaties, kan dit in één dag worden bereikt door de relevante kleurstoffen te mengen en tegelijkertijd te introduceren. Ten slotte, als cellulaire processen moeten worden onderzocht met farmacologische remming, kunnen geneesmiddelen en kleurstoffen samen worden geïntroduceerd.

Labelvrije methoden zijn zeer krachtige benaderingen voor het detecteren van specifieke cellulaire structuren. Ld's kunnen bijvoorbeeld specifiek worden gedetecteerd in vroege embryo's door microscopie van de derde harmonische generatie²⁰ of door femtoseconde gestimuleerde Raman-verliesmicroscopie²¹. Net als FP's kunnen deze benaderingen op elke genetische achtergrond worden toegepast en omdat ze geen bleken veroorzaken, zorgen ze mogelijk voor snellere beeldverwerving. Ze zijn echter meestal beperkt tot specifieke organellen en ondersteunen dus op zichzelf geen multiplexbeeldvorming; ze vereisen ook gespecialiseerde microscopen.

Er zijn twee algemene strategieën voor het introduceren van kleine moleculen in embryo's. Een daarvan is de micro-injectiebenadering die hier wordt gebruikt; de andere is een chemische (terpeen) behandeling om het vitellinemembraan te permeabiliseren. De laatste benadering¹² is minder betrokken dan micro-injectie, maar ook meer variabel van embryo tot embryo. Bovendien wordt na permeabilisatie de bescherming van het vitellinemembraan aangetast en is het eigenlijke embryo toegankelijk voor het externe medium, waardoor het moeilijker wordt om het in leven te houden. Micro-injectie heeft veel minder kans om de embryonale ontwikkeling te laten ontsporen dan permeabilisatie. Permeabilisatie wordt echter aanbevolen als veel embryo's tegelijkertijd moeten worden gecontroleerd, bijvoorbeeld voor screeningsdoeleinden voor geneesmiddelen. Om de beweging van cellulaire structuren te volgen en reproduceerbare beeldreeksen te verkrijgen die geschikt zijn voor beeldanalyse, is micro-injectie de methode bij uitstek.

Belang en mogelijke toepassingen van de methode in specifieke onderzoeksgebieden
Het Drosophila embryo is een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen van vele celbiologische en ontwikkelingsprocessen ^1,5,6. Het taggen van organellen met fluorescerende eiwitten heeft belangrijke bijdragen geleverd aan het begrip van hoe het vroege embryo zich ontwikkelt, hoe verschillende organellen worden verhandeld en hoe dergelijke handel ontwikkelings- en genetisch wordt gemoduleerd. Hun neiging om te bleken en de uitdagingen van het genereren van stammen waarin meerdere organellen met verschillende kleuren zijn gelabeld, beperken echter de toepassing van deze aanpak. Het gebruik van FP's geïntroduceerd door micro-injectie lost veel van deze uitdagingen op en kan zelfs worden gecombineerd met fluorescerend getagde eiwitten. Deze techniek maakt het mogelijk om meerdere organellen, celstructuren en cytoskeletcomponenten in elke genetische achtergrond in beeld te brengen. Hierdoor kunnen verschillende genotypen via live imaging worden vergeleken, waardoor het mogelijk is om het effect van mutaties op de handel in meerdere organellen te bepalen.

Dit protocol demonstreert de FP-injectiebenadering voor embryo's van Drosophila melanogaster, maar in principe is deze benadering van toepassing op alle insecteneieren waarvoor micro-injectietechnieken zijn vastgesteld, inclusief andere soorten Drosophila, krekels²² en bladluizen²³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	Stains lipid droplets in violet/blue
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	Stains lipid droplets in green
Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite	W.A. Hammond Drierite Company	21001
Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base	Zeiss	4350030000000000
Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape	Scotch (3M)	-	Sold by many vendors
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	Stains the ER/nuclear envelope
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	Ready to use
Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in	World Precision Instruments	TW100F-4	Must be pulled
Glass coverslip	-	-	Buy the appropriate refractive index for your objective lens
Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned	FisherBrand	12-550-343
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
Heptane greener alternative anhydrous, 99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	Heptane is considered toxic by the USA's OSHA
Confocal microscope	Leica	Sp5	Many different types of confocal microscopes will work.
LipidSpot 610	Biotium	#70069	Stains lipid droplets in far red
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	Stains lysosomes in red
MitoView 633	Biotium	#70055	Stains mitochondria
Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, Next Generation Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.
SiR-Tubulin	Cytosketon Inc	CY-SC014	Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	Stains microtubules in violet/blue