Visualisering af cytoskeletafhængig handel med lipidholdige organeller i drosophilaembryoner

Summary

I det tidlige Drosophila embryo er mange organeller bevægelige. I princippet kan de afbildes levende via specifikke fluorescerende sonder, men æggeskallen forhindrer direkte påføring på embryoet. Denne protokol beskriver, hvordan man introducerer sådanne sonder via mikroinjektion og derefter analyserer bulkorganelbevægelse via partikelbilledvelocimetri.

Abstract

Tidlige Drosophila embryoner er store celler, der indeholder et stort udvalg af konventionelle og embryospecifikke organeller. I løbet af de første tre timer af embryogenese gennemgår disse organeller dramatiske bevægelser drevet af aktinbaseret cytoplasmatisk streaming og motordrevet handel langs mikrotubuli. Udviklingen af en lang række små, organelspecifikke fluorescerende sonder (FP'er) gør det muligt at visualisere en bred vifte af forskellige lipidholdige strukturer i enhver genotype, hvilket muliggør levende billeddannelse uden at kræve en genetisk kodet fluorofor. Denne protokol viser, hvordan man injicerer vitale farvestoffer og molekylære sonder i Drosophila embryoner for at overvåge handel med specifikke organeller ved levende billeddannelse. Denne fremgangsmåde demonstreres ved mærkning af lipiddråber (LD'er) og efter deres bulkbevægelse ved partikelbilledvelocimetri (PIV). Denne protokol giver en strategi, der er egnet til undersøgelse af andre organeller, herunder lysosomer, mitokondrier, æggeblomme vesikler og ER, og til sporing af bevægelsen af individuelle LD'er langs mikrotubuli. Brug af kommercielt tilgængelige farvestoffer bringer fordelene ved adskillelse i de violette / blå og langt røde områder af spektret. Ved multiplex co-mærkning af organeller og/eller cytoskeletale elementer via mikroinjektion er alle de genetiske ressourcer i Drosophila tilgængelige for undersøgelser af menneskehandel uden behov for at indføre fluorescerende mærkede proteiner. I modsætning til genetisk kodede fluoroforer, som har lave kvanteudbytter og blegemiddel let, giver mange af de tilgængelige farvestoffer mulighed for hurtig og samtidig indfangning af flere kanaler med høje fotonudbytter.

Introduction

Vitale farvestoffer og molekylære sonder er kraftfulde værktøjer til at afbilde specifikke cellulære strukturer og organeller levende. I Drosophila-embryoet viser mange forskellige organeller cytoskeletdrevet lokalisering 1,2,3,4, men anvendelsen af disse små molekyler er udfordrende, fordi æggeskallen er uigennemtrængelig for mange af dem. Denne protokol beskriver en metode til at anvende fluorescerende sonder (FP'er) i levende embryoner via mikroinjektion for at opdage storstilet handel med organeller. Proceduren omfatter fremstilling af injektionsopløsningen, ægopsamling og fremstilling af embryoner, mikroinjektion, billeddannelse og billedanalyse.

Dramatiske rumlige omlejringer af organeller er almindelige i mange animalske oocytter, æg og embryoner, dels på grund af den store størrelse af disse celler. I Drosophila embryoet bevæger lipiddråber (LK'er) og æggeblomme vesiler sig for eksempel mod embryocentret lige før cellularisering⁵. Denne bevægelse afhænger af mikrotubuli og efterlader en ~ 40 μm region rundt om periferien af embryoet udtømt af de to organeller. Under tidligere spaltningsstadier transporteres mange organeller af cytoplasmatiske strømme, der drives af actin-myosinbaserede sammentrækninger på embryooverfladen⁶. Selvom embryoner af mange arter udviser lignende omlejringer, er Drosophila embryoet særligt velegnet til at følge disse processer ved billeddannelse, fordi det udvikler sig eksternt ved standard laboratorie 'stuetemperatur', er relativt gennemsigtigt, lille nok til at passe på de fleste mikroskopopsætninger og kan manipuleres ved hjælp af kraftfulde genetiske værktøjer.

For nogle organeller er fluorescerende mærkede proteiner tilgængelige, der specifikt mærker disse strukturer. For eksempel er LSD-2 (også kendt som dPLIN2) et protein, der i embryoner specifikt er rettet mod LDs⁷. Flyvelinjer er tilgængelige, der bærer enten inducerbare transgener, der koder for en fusion mellem grønt fluorescerende protein (GFP) og LSD-2⁸ eller en genfælde, hvor gult fluorescerende protein (YFP) indsættes i det kodende område af det endogene LSD-2-gen ^9,10. Denne tilgang har imidlertid begrænsninger, herunder at disse fusionsproteiner har lave kvanteudbytter og har tendens til let at blege. Derudover kan mærkning af flere forskellige strukturer samtidigt være udfordrende: For mange organeller er der i øjeblikket kun en type fluorescerende tag (ofte GFP eller mCherry), så billeddannelse af to organeller på samme tid kan kræve nye transgener eller indsættelser; Selvom kompatible tags er tilgængelige, kan det også kræve tidskrævende kryds at introducere dem i en enkelt stamme. Det gør det også mindre bekvemt at bruge de mange kraftfulde genetiske ressourcer, f.eks. hvis to organellemarkører, en Gal4-driver og en inducerbar RNAi-konstruktion alle skal være til stede i den samme mor.

I princippet kan disse begrænsninger overvindes ved brug af FP'er, herunder vitale farvestoffer (f.eks. LysoTracker til mærkning af lysosomer), molekylære sonder (f.eks. SiR-tubulin til mærkning af mikrotubuli) og fluorescerende mærkede biologiske molekyler (f.eks. C12 BODIPY til sondefedtsyremetabolisme¹¹). Fra brug i dyrkede celler er de typisk velvaliderede som kraftfulde værktøjer til at undersøge cellulær biologi. FP'er er alsidige, har overlegne fotoegenskaber og er kompatible med fluorescerende proteiner. Flere farvestoffer kan blandes og påføres samtidigt, ofte med fordelene ved adskillelse i de violette / blå og langt røde områder af spektret og små Stokes-skift, hvilket forhindrer kanalblødning igennem. Små Stokes-skift giver mulighed for samtidig optagelse af flere billedkanaler, hvilket muliggør sporing af flere organeller på én gang. Endelig kan de ligeledes anvendes til mærkning af organeller i embryoner af andre Drosophila-arter eller endda andre insekter, hvor der ikke kan være fluorescerende mærkede proteiner til rådighed.

Imidlertid kan de fleste af disse FP'er ikke krydse den udførlige æggeskal af Drosophila-embryoet . Den består af fem lag: tre ydre chorionlag (chorion), der forhindrer mekanisk skade plus et voksagtigt lag omkring vitellinmembranen, der skaber en kemisk barriere¹². For nemheds skyld vil kombinationen af det voksagtige lag og vitellinmembranen blive omtalt som "vitellinmembranen" nedenfor. For at omgå æggeskallen tilpasser denne protokol en etableret embryomikroinjektionsmetode til at indføre FP'er i Drosophila-embryoet . Protokollen beskriver, hvordan man overvåger den cytoplasmatiske strøm af LER'er i spaltningsstadieembryoner. Det omfatter fremstilling af injektionsnåle og ægopsamlingsbure, processen med ægopsamling og mekanisk fjernelse af korionen. Det går over, hvordan man mikroinjekterer og afbilder embryonerne, og hvordan man analyserer bulkstrømmen af ND'er ved hjælp af partikelbilledvelocimetri (PIV, tilpasset fra⁶). Det giver råd om fejlfinding for at sikre embryooverlevelse og skabe det bedste system til billeddannelse. Også diskuteret er, hvordan protokollen kan ændres til samtidig at afbilde LD'er og mikrotubuli eller at anvende den til undersøgelse af andre organeller, herunder lysosomer, mitokondrier, æggeblomme vesikler og det endoplasmatiske retikulum (ER).

Protocol

1. Forbered nødvendige materialer

BEMÆRK: Disse forberedelser udføres bedst dage eller uger før tid.

1. Forbered injektionsnåle.
   BEMÆRK: Nåle kan opbevares på ubestemt tid i en overdækket beholder. Nåle skal være fine nok til at levere ~ 700 fL, mens de er stærke nok til at gennembore vitellinemembranen.
   1. Anbring en kapillær i kapillærholderen på nåletrækeren. Fastgør kapillæren med vingemøtrikker. Juster kapillærens centrum med varmeelementet, så der genereres to symmetriske nåle.
   2. Vælg passende indstillinger på nåletræk pulleren i henhold til producentens anvisninger.
   3. Udfør kvalitetskontrol ved hjælp af et dissekeringsomfang.
      BEMÆRK: Nålespidser skal være så fine som muligt. Revnede, takkede eller store borenålespidser kasseres.
   4. Forbered partier på 10 nåle (5 kapillærer værd) ad gangen.
   5. Anbring en deformerbar kitt, der er rullet op i en cylinder, i midten af bunden af en beholder med låg. Tryk forsigtigt nålene ind i kittet, så det holder dem vandret med nålespidserne sikkert ophængt i luften for at forhindre skader. Dæk med låget, og opbevar det indtil brug.
2. Forbered ægopsamlingsplader. Opbevares ved 4 °C.
   BEMÆRK: Ægopsamlingsplader er små agarplader suppleret med frugtsaft for at tilskynde til æglægning. Hvordan man forbereder dem er beskrevet i mange protokoller, herunder¹³.
3. Forbered heptanlim.
   BEMÆRK: Denne lim ekstraheres fra dobbeltsidet tape og bruges til sikkert at fastgøre embryonerne til et dækslip. Det forhindrer embryoet i at flyde ud af fokus under injektion og billeddannelse. Limen kan tilberedes dage eller uger i forvejen.
   1. Kugle dobbeltsidet tape op til en størrelse større end en golfbold, og læg den i bunden af en ~ 50 ml glasbeholder med et tæt forseglende låg. Pak tape tæt, så der er nok klæbemiddel til stede.
   2. I en stinkhætte skal du fylde glasbeholderen med heptan for at dække alt båndet. Hold beholderen tæt lukket, når den ikke er i brug.
      FORSIGTIG: Heptan er brandfarligt som væske og damp. Det kan forårsage øjen-, hud- og luftvejsirritation. Indånding af dampe kan forårsage døsighed, svimmelhed og lungeskader. Hold heptan væk fra antændelseskilder, og opbevar det i et godt ventileret område beregnet til brandfarlige stoffer og væk fra uforenelige stoffer.
   3. Lad heptanlimen sidde natten over eller længere. For at få de bedste resultater skal du placere beholderen på en ryster eller en anden omrører natten over for at hjælpe med at opløse klæbemidlet.
      BEMÆRK: Selve båndet forbliver, men klæbemidlet opløses i heptanen. I trin 5.1.2 påføres limen på en dækseddel; heptan fordamper og efterlader limen.
   4. Test heptanlimpræparatet ved at placere en dråbe af det på et glasglas og sørge for, at der er en klæbrig rest tilbage, når heptanen er fordampet. Hvis klæbemiddelrester ikke er synlige bagefter, skal du tilføje mere tape til glasbeholderen og gentage det foregående trin.
      BEMÆRK: Når limen er forberedt, kan den bruges i måneder eller endda år.
4. En 1 mg/ml (3,8 mM) BODIPY493/503 stamopløsning fremstilles ved fortynding af kommercielt fremstillet præparat i ren vandfri DMSO. Hold det tildækket for at beskytte det mod lys og vand. Opbevares på ubestemt tid ved -20 °C eller kortvarigt ved 4 °C.

2. Forbered ægopsamlingsbure

BEMÆRK: Gør dette mindst en dag (helst 2 eller 3 dage) før den eller de planlagte injektioner.

1. Forbered gærpasta.
   BEMÆRK: Gærpasta supplerer protein og andre vitale næringsstoffer, der ikke findes i æblejuicepladerne. Det fremmer ægproduktion og æglægning.
   1. Tilsæt 2-10 g tør bagergær og derefter 1 ml ledningsvand til et lille bægerglas. Bland ved hjælp af en spatel.
   2. Bliv ved med at tilsætte ledningsvand i trin på 1 ml, indtil den ønskede, tandpastalignende konsistens er nået.
   3. Blandingen dækkes, og den opbevares ved 4 °C.
2. Opret fluebure til ægopsamling.
   BEMÆRK: Mandlige og kvindelige fluer af den ønskede genotype er påkrævet: 10-50 hunner under 2 uger gamle og et tilsvarende antal mænd. Der findes en række forskellige muligheder for fluebure, herunder hjemmelavede muligheder ^14,13. Det er vigtigt, at æblejuicepladernes størrelse matches med flueburenes størrelse.
   1. Læg et lille smør af gærpasta på en æblejuiceplade. Hold det tildækket og lad det komme til stuetemperatur, fordi fluer ikke lægger æg på pladen, hvis det er for koldt.
   2. Overfør fluer til et embryoopsamlingsbur, forsegl med den gærede æblejuiceplade, og fastgør pladen til embryoopsamlingsburet.
   3. Lad nyligt overførte fluer akklimatisere sig til buret i 1-2 dage, og udløs pladen med en frisk dagligt. Hvis al gæren er blevet spist den næste dag, skal du øge mængden af gærpasta til fremtidige samlinger.
      BEMÆRK: Dette er et vigtigt skridt til at øge ægudbyttet, da velfødte hunner lægger flere æg.

3. På injektionsdagen skal du forberede injektionsopløsningen og lægge den i nålen

1. Brug stamopløsningen af BODIPY 493/503 (3,8 mM i DMSO) som injektionsopløsning.
2. Læg en enkelt nål med 1 μL af injektionsopløsningen ved hjælp af nålebelastningsspidser.
   BEMÆRK: Stræb efter at få væsken helt ud til spidsen uden at fange luftbobler. Vær klar til hurtigt at udskifte den belastede nål i tilfælde af utilsigtet brud.
   1. Fastgør en ilægningsspids til en mikropipette, og træk 1 μL af injektionsopløsningen ind i spidsen. Brug handsker til at holde nålen i den ene hånd med spidsen peget væk for at minimere risikoen for brud.
   2. Indsæt forsigtigt læssespidsen i nålen og skub den tæt på nålespidsen. Dispenser væsken nær nålespidsen. Når du har fjernet pipetten, skal du holde nålen lodret med spidsen nedad, indtil væsken strømmer til spidsen.
3. Opbevar de læssede nåle i en separat beholder med kitt som ovenfor (se trin 1.1.5).
   BEMÆRK: Nåle skal forberedes på forhånd (op til flere timer) efter injektion, men bør ikke anvendes efter mere end en dag.
4. Hold nåle ude af omgivende lys for at forhindre blegning af farvestofferne. Dæk opbevaringsbeholderen med aluminiumsfolie uden at beskadige nålespidserne. Sørg for, at alt lys er skjult.

4. Indsamling af embryoner til injektion

BEMÆRK: Tidspunktet for indsamlingen afhænger af, hvilket stadium af embryoner injektionen skal udføres på. Med nedenstående timingskema vil embryonerne på tidspunktet for forberedelse til injektion være 0-90 minutter gamle, hvilket svarer til spaltningstrin¹⁵.

1. På injektionsdagen skal du forberede æblejuiceplader med gær som i trin 2.2.1. Hvis N-runder af injektioner er planlagt, skal du forberede N + 2 plader. Opbevar disse plader ved stuetemperatur.
   BEMÆRK: Ud over N-pladerne til indsamling af embryoner til injektion er der brug for en plade som en foropsamlingsplade og en anden til at fodre fluerne i buret, når indsamlingen er afsluttet.
2. Udskift pladen på buret med en frisk gæret plade (foropsamlingsplade) og lad den stå på buret i 1-2 timer.
3. Udskift pladen på buret med en frisk tallerken (opsamlingsplade). Kassér forindsamlingspladen, da den vil indeholde embryoner, der er ældre end ønsket. Lad derefter fluerne lægge æg i 1,5 time.
   BEMÆRK: Da velfodrede fluer typisk lægger deres æg kort efter, at æggene er befrugtet, sikrer en opsamlingstid på 1,5 timer, at de fleste embryoner på pladen i slutningen af samlingen er 0-90 minutter gamle, dvs. er i spaltningsstadier. Kvindelige fluer, der ikke er blevet fodret med frisk gær siden den foregående dag, vil have tendens til at beholde befrugtede æg i ubestemt tid før lægning. Derfor kan pre-collection pladen have embryoner, der blev befrugtet før indsamlingens start og dermed er ældre end 60 min, nogle gange meget ældre.
4. Udskift pladen på buret med en frisk gæret plade. Dæk opsamlingspladen, så omstrejfende fluer ikke lægger æg på dem.

5. Forbered embryoner til mikroinjektion

1. Saml de nødvendige materialer.
   1. Fastgør et stykke dobbeltsidet tape til et glasglas. Undgå at røre båndet med fingrene, da det reducerer dets klæbrighed.
      BEMÆRK: Dette dias vil blive brugt til at fjerne korionen og ikke til billeddannelse.
   2. Brug en overførselspipette eller en mikropipette (p200 eller p1000) til at placere en lille dråbe (200 μL eller mindre) heptanlim omtrent i midten af et rektangulært dækslip (60 x 25 mm). Lad heptanen fordampe (dette tager mindre end et minut).
      BEMÆRK: Denne dækseddel vil blive brugt til at montere embryonerne til injektion og billeddannelse. Dimensionerne er valgt til at passe ind i en justerbar metalholder på det konfokale mikroskop.
   3. Saml et udtørringskammer, et forseglet kammer (f.eks. en Tupperware-sandwichkasse), der indeholder udtørringsperler. Brug kun udtørringsperler, der ikke er hydreret.
      BEMÆRK: For at sikre, at embryonerne optager injektionsopløsningen, skal embryoet være let udtørret for at reducere det indre tryk. Dette gøres ved at placere dæksedlen med de deforkalkede, lufteksponerede embryoner i udtørringskammeret.
2. Fjern korionen mekanisk.
   1. Dæk den passende ældede embryoplade med et tyndt lag Halocarbon Oil 27 for at gøre æggeskallen gennemsigtig.
      BEMÆRK: Embryoner bliver gennemskinnelige inden for ti sekunder¹⁵. Hvis dette trin ikke forekommer effektivt, kan æblejuicepladerne være for våde og skal tørres af inden brug.
   2. Se pladen under et dissektionsomfang med transillumination (dvs. lyset, der går gennem pladen ind i okularerne) for at bekræfte embryonernes stadium.
   3. Vælg embryoner i spaltningsstadier.
      BEMÆRK: Spaltningsstadieembryoner er helt uigennemsigtige; de efterfølgende blastodermstadier kan genkendes af et bånd af gennemsigtig cytoplasma rundt om det uigennemsigtige center¹⁵. En god introduktion til, hvordan man genkender forskellige embryonale stadier, er tilgængelig på hjemmesiden (angivet i reference¹⁶), der opretholdes af Society of Developmental Biology.
   4. Brug en fin pincet til at gribe et embryo af det ønskede stadium ved hjælp af dets dorsale vedhæng og overføre det til det forberedte glasglas dækket af et stykke dobbeltsidet tape. Placer embryoet på båndet. Minimer overførslen af olie.
   5. Rul embryoet så forsigtigt som muligt over båndets overflade ved forsigtigt at skubbe embryoet med siden af pincettens spids. Stik ikke embryoet direkte med de skarpe pincetspidser.
      BEMÆRK: Hvis den påførte kraft er for lav, ruller embryoet ikke. Hvis det er for højt, vil det briste. At finde den passende mellemliggende kraft kræver erfaring, og derfor bør dette trin praktiseres på forhånd.
   6. Fortsæt med at rulle embryoet, indtil korionen forbigående klæber til båndet og revnerne.
   7. Når korionen revner, skal du fortsætte med at rulle for at adskille embryoet (stadig inde i vitellinemembranen) fra korionen, da korionen forbliver fast på båndet.
   8. Bekræft, at korionen er helt fjernet ved at observere tabet af de dorsale vedhæng fra embryoet.
   9. Rul embryoet tilbage på korionen, som er mindre klæbende end båndet. Gnid forsigtigt embryoet med pincetten, indtil det fastgøres til pincetten til overførsel.
   10. Overfør embryoet til dæksedlen med heptanlimen og bring det i kontakt med limen, som typisk løsner det fra pincetten.
   11. Juster embryoets orientering på dæksedlen.
       1. Integrer embryoets laterale overflade i limen.
          BEMÆRK: Overfladen af embryoet indlejret i limen er den, der vil blive afbildet. Indlejring af den laterale overflade er den enkleste, men dette kan justeres afhængigt af personlig præference eller det biologiske spørgsmål, der skal besvares.
       2. Orienter embryoets lange akse vinkelret på dækslipets lange akse.
       3. Hvis embryoet ikke ligger i den foretrukne retning, skal du rengøre pincetten for at fjerne enhver olie, der vil løsne embryoet fra limen. Forsøg derefter forsigtigt at rulle embryoet på plads.
   12. Forbered det ønskede antal embryoner til injektion på den måde, der er beskrevet ovenfor.
       BEMÆRK: Som tiden går efter fjernelse af korionen, vil den omgivende luft begynde at udskære embryonerne, og dermed vil effekten af trin 5.3 være ujævn for embryonerne på dæksedlen, som blev dechorioneret på forskellige tidspunkter. Typisk er 1-3 embryoner de mest håndterbare.
3. Udsykke embryoner.
   1. Anbring dæksedlen med embryoner i det forberedte udtørringskammer og forsegl det.
   2. Lad embryonerne udsykke i 5-12 minutter.
      BEMÆRK: Tidspunktet for dette trin afhænger af omgivelsestemperaturen og fugtigheden og skal derfor bestemmes empirisk.
   3. Fjern dæksedlen fra kammeret, og læg en dråbe Halocarbon Oil 700 på den, der dækker embryonerne fuldt ud, for at forhindre yderligere udtørring.
   4. Undersøg embryonerne på et dissekerende omfang for at bedømme korrekt udtørring.
   5. Hvis embryonerne bare er lidt skrumpet, men ikke tømt, fortsæt til mikroinjektion (trin 6).
   6. Hvis embryonerne ikke er tilstrækkeligt eller overdrevent udtørrede, skal du vende tilbage til trin 5.2 og forberede et nyt parti embryoner, da Halocarbon oil 700 ikke kan fjernes. Hvis embryonerne var overdrevent udtørrede, forkortes udtørringstiden for det næste parti embryoner med 3 minutter; hvis de var underudtørrede, øges udtørringstiden med 3 minutter.

6. Mikroinjektembryoner

BEMÆRK: Sørg for, at mikroinjektionsopsætningen inkluderer et omvendt mikroskop, en mikromanipulator til at holde og placere injektionsnålen og en kommerciel mikroinjektor til at levere kontrollerede mængder.

1. Tænd for mikroinjektoren, og indtast de foretrukne indstillinger.
   BEMÆRK: Til denne protokol anbefales det at bruge lineær bevægelsesudgang og den hurtige indstilling, men mange andre fungerer. Operatøren bør bestemme personlig præference.
2. Læg nålen i mikromanipulatoren. For at forhindre, at nålen beskadiges, mens du lægger dæksedlen, der indeholder embryonerne, skal du flytte den ud af vejen til en sikker position.
3. Placer dækslaget på scenen med embryoner ovenpå mod nålen. Flyt derefter forsigtigt nålen tilbage på plads til injektion, med spidsen stadig godt over scenen.
4. Sæt 4x målet ind i lysstien. Brug fokusknappen på mikroskopet til at bringe embryonerne i fokus.
   BEMÆRK: Dette vil være det brændplan, der bruges til injektion, og vil kun blive justeret minimalt fremadrettet.
5. Brug scenekontrollerne til at flytte embryonerne vandret ind i midten af synsfeltet.
   1. Pan væk fra embryonerne, hold dem ved kanten af synsfeltet som forberedelse til at sænke nålen. Bliv i det samme brændplan for at sikre, at nålen sænkes ned til den rigtige position.
6. Sænk nålespidsen ned i det korrekte brændplan, og sørg for, at den er synlig i synsfeltet sammen med embryonerne.
   1. Brug mikromanipulatorens kontroller og se ovenfra (endnu ikke gennem okularerne), slip langsomt nålespidsen i olien og sigt mod det område, hvor målet peger på. Da olien er ret tyktflydende, skal du gå langsomt for at undgå at beskadige nålen.
   2. Når nålen er synlig gennem okularerne, skal du fortsætte med at bruge mikromanipulatorkontrollerne, indtil nålespidsen er i fokus og i midten af synsfeltet.
   3. Ved at flytte scenen skal du bringe embryonerne tilbage til midten af synsfeltet. Brug scenestyringen, mikromanipulatorkontrollerne og fokusknappen til at finjustere placeringen af embryoet og nålespidsen i forhold til hinanden, mens begge er i fokus. Sigt mod at udføre injektioner så tæt på dæksedlen som muligt.
7. Udfør nålekvalitetskontrol.
   1. For at sikre, at nålen er funktionel, skal du dispensere noget af injektionsopløsningen i Halocarbon Oil 700, der omgiver embryoet, synlig som en boble i olien.
   2. Hvis der ikke strømmer noget ud af nålen, skal du gradvist øge trykket ved injektoren. Hvis dette ikke virker, skal du få en ny nål.
8. Injicer embryoet.
   BEMÆRK: Acceptable injektionsvolumener varierer fra ~ 0,06-1 pL. Den nedre grænse er sat af, hvad der kan visualiseres ind i embryoet. Den øvre grænse er fastsat af det traume, injektionen udøver på embryoet.
   1. Injicer langs embryoets laterale kanter, da dette er den mindst invasive.
   2. Brug scenekontrollerne til at flytte embryoet mod nålespidsen, indtil sidstnævnte forsigtigt punkterer embryoet og kommer ind i det.
   3. På samme tid skal du starte strømmen af injektionsopløsning og se efter udseendet af et forbigående klart sted på nålespidsens sted, hvilket indikerer en vellykket overførsel af væske til embryoet.
   4. Overvåg embryoet. Hvis embryoet modstår nålen og brister (cytoplasma sprøjter ud) ved indrejse, skal du vende tilbage til trin 5 og øge udtørringstiden. Hvis embryoet er fladt mod dæksedlen og ser diskette ud under injektionen, skal du vende tilbage til trin 5 og forkorte udtørringstiden.
   5. Hvis der ikke kom noget farvestof ind i embryoet, skal det bekræftes, at farvestoffet stadig frit kan strømme fra nålen som i trin 6.7. Hvis farvestoffet ikke flyder, skal du udskifte nålen. Hvis farvestoffet flyder, skal du injicere et nyt embryo og begynde at frigive farvestoffet lige før nålen punkterer embryoet.
      BEMÆRK: Gentagne injektioner af det samme embryo anbefales ikke, da det brister det forrige sår/injektionssted.
9. Gentag, indtil alle embryoner er injiceret.

7. Billede embryoner

BEMÆRK: Denne protokol bruger et laserscanningskonfokalmikroskop.

1. Placer dæksler i metalholderen på det konfokale mikroskop, så embryonerne afbildes direkte nedenfra gennem dæksedlen; over dæksedlen er der kun olie og ingen anden barriere.
2. Som et kvalitetskontroltrin skal du først afbilde ved hjælp af epifluorescensfunktionen på det konfokale mikroskop med et 40x mål. Sørg for, at fluoroforen er synlig i embryoet, før du fortsætter.
3. Hvis det ønskede billeddannelsesplan er forskelligt fra injektionsstedet, skal du give tilstrækkelig tid til, at farvestoffet diffunderer til målområdet.
   BEMÆRK: For BOPIPY 493/503 varierer denne tid typisk fra 30-60 min. Da diffusionstiden afhænger meget af farvestoffet, kan andre farvestoffer kræve optimering af injektionsstedet og ventetiden.
4. Brug forskellige mål til billeddannelse i forskellige skalaer. Brug en 40x målsætning til at afbilde hele embryoet og en 63x målsætning til at afbilde underafsnit for mindre skalaer.
5. For live billeddannelse under syncytialfaserne før cellularisering skal du bruge følgende betingelser til at begynde med: billedstørrelse på 512 x 512 pixels, linjegennemsnit på 3, billedhastighed på 0,1 billeder i sekundet (dvs. 1 ramme erhvervet hver 10. s). Juster forholdene i henhold til funktionerne i det anvendte mikroskop.
   BEMÆRK: Disse betingelser gør det muligt at hente ~ 500+ billeder fra BOPIPY 493/503 og fange det meste af bevægelsen.

8. Analysér LD-flow ved først at bruge FIJI til at forberede en tidsserie af billeder og derefter python til PIV-analyse

1. Optimer billedoptagelse.
   1. Udfør injektioner af det ønskede farvestof på det relevante stadium. Gentag dette trin, indtil den daglige variation er ubetydelig.
   2. Optimer indstillinger for billedoptagelse, herunder forstørrelse, zoom, opløsning og billedhastighed.
      BEMÆRK: Der er en afvejning mellem billeder i høj kvalitet (opløsning + linjegennemsnit) og anskaffelseshastighed (billedhastighed).
2. Forbered data i FIJI.
   1. Få en tidsserie af høj kvalitet, der skal analyseres.
   2. Åbn en ramme i tidsserien for at generere en maske med FIJI. Dupliker billedet. Konverter billedets type til en 8 bit.
   3. Definer embryoets grænse ved hjælp af Polygon eller Freehand Selection Tool. Brug Ryd udenfor til at indstille pixelværdier uden for markeringen til 0. Ryd og inverter derefter i markeringen for at indstille værdien af pixels i markeringen til den maksimale værdi (255).
   4. Fjern markeringen, og brug derefter kommandoen Histogram til at sikre, at der kun findes pixelværdier på 0 og 255.
   5. Gem denne nye billedmaske til den specifikke tidsserie.
   6. Åbn tidsserien af interesse. Vælg hvilke ti billeder der bedst fanger tidspunktet for interesse, for eksempel nuklear cyklus 9 ved begyndelsen af den kortikale sammentrækning. Dupliker de ti rammer af interesse og danner en understak.
   7. Brug funktionen Stabl til billeder til at generere 10 billeder, der skal analyseres med PIV.
   8. Gem de enkelte filer på en måde, der bevarer deres rækkefølge (SeriesX_1, SeriesX_2, SeriesX_3 ...).
3. Brug den forberedte maske og individuelle rammer til PIV-analyse ved hjælp af det medfølgende python-eksempelscript (supplerende data) eller et brugerdefineret script, der genereres af brugeren.
   BEMÆRK: Det medfølgende script er baseret på python-applikationen af OpenPIV¹⁷. Det udsender afstand i pixels, som kan konverteres ved hjælp af pixelbredden og billedhastigheden for at generere hastigheder eller hastigheder.
4. Generer replikater ved at udføre de foregående trin for yderligere embryoner og kompilere outputværdierne.

Representative Results

Efter injektion vil farvestoffet kun blive lokaliseret på det sted, hvor nålespidsen blev indsat. Farvestoffet diffunderer derefter væk fra injektionsstedet afhængigt af dets diffusive egenskaber. Figur 1 viser injektion af BODIPY 493/503, kort efter injektion (panel A) og 24 min senere (panel B). Efter 24 minutter er farvestoffet nået nogenlunde til midtpunktet af fosterets lange akse.

Analyse af organelmotilitet kan opnås gennem farvestofinjektioner og time-lapse-billeddannelse. I figur 2 blev et embryo co-injiceret med BODIPY 493/503 (figur 2A) og LysoTracker Red (figur 2B) og afbildet ved hjælp af laserexcitation ved henholdsvis 488 og 596 nm. Dette embryo blev derefter time-lapse afbildet (en ramme hver 30 s i 30 min, 5 min analyseret). Tidsserien blev derefter kørt gennem PIV-analyse, hvis output er vist via strømlinjer i figur 2A,B. Bemærk, at strømlinjerne ikke repræsenterer banen for individuelle partikler, men den cytoplasmatiske strøm udledes af at analysere alle partiklerne i det område af cytoplasmaet. Gennem mærkning af to uafhængige cellulære strukturer (ND'er og sure organeller) finder PIV-analysen lignende strømme, hvor begge etiketter konvergerer på det centrale område af embryoet, hvor cytoplasmaet strømmer ind i embryoets indre⁶.

Aktuelt tilgængelige FP'er tillader mærkning af mange andre organeller og cellulære strukturer. Figur 3 viser mærkningen af ER via ER tracker Green. ER tracker giver en god opløsning af den nukleare konvolut, hvilket muliggør visualisering af større cellecyklusfaser. ER tracker Green er afbildet ved hjælp af 488 nm excitation.

Mærkning af mitokondrierne er vanskelig, da de fleste testede farvestoffer synes at være fanget i den første mitokondrier, de kommer ind i. På den anden side blev der ikke påvist tegn på farvestoftoksicitet, hvilket gjorde det muligt at følge mærkede mitokondrier gennem cellularisering og den ektodermale nukleare cyklus 15. Figur 4 viser en ektodermal celle flere timer efter injektion med Mitoview 633 (excitationsbølgelængde 633 nm).

BODIPY, Lysotracker og LipidSpot er robuste og kan bruges til at erhverve ~ 500+ billeder ved 512 x 512, linjegennemsnit 3, billedhastigheder fra 1 / s til 0,1 / s. ER tracker Green, SiR-tubulin og de nævnte mitokondrielle farvestoffer er mindre robuste og giver ~ 50-200 billeder under de samme forhold.

Begyndende ved blastodermstadier bevæger LED'er sig tovejs langs mikrotubuli, drevet af de modsatte polaritetsmotorer kinesin-1 og cytoplasmatisk dynein⁵. Denne bevægelse kan visualiseres ved at co-mærke LER og mikrotubuli via injektion af både BODIPY 493/503 og SiR-Tubulin (figur 5). Da LD'er ofte vender deres bevægelsesretning (da de skifter mellem kinesin-1 og cytoplasmatisk dynein), fanger højere billedhastigheder under erhvervelse bedre kritiske detaljer om LD-motilitet.

Levende billeddannelse af autofluorescerende æggeblomme vesikler er mulig uden nogen form for farvestofinjektion (figur 6). Autofluorescensen er imidlertid svag, og excitationslaseren er fototoksisk. Således har levende billeddannelse af autofluorescerende æggeblomme et dårligt signal-støj-forhold i forhold til farvestofinjektion.

Figur 1: Diffusion af BODIPY 493/503 gennem embryoet. Farvestoffet blev injiceret langs sidekanten mod den forreste ende (øverst til højre) og diffunderer fra dette injektionssted ind i embryoet og mærker LED'er. (A) Farvestoffet har diffunderet gennem dele af embryoet ved siden af injektionsstedet. (B) Ca. 24 min/2 nukleare cyklusser senere har farvestoffet diffunderet forbi embryonets midtpunkt. Vægtstang: 100 μm. En 1024 x 1024 ramme (linje gennemsnit 4) blev erhvervet hver 30 s. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Partikelbilledvelocimetri (PIV) for ND'er og sure organeller. Et embryo blev injiceret med både BODIPY 493/503 og LysoTracker Red. (A) BODIPY kanal. (B) LysoTracker Rød kanal. (A',B') Strømlin diagrammer genereret ved PIV-analyse af de to kanaler, der genereres fra 10 sekventielle rammer, herunder dem, der er vist i A og B. A' svarer til strømmen af LER'er, og B' svarer til strømmen af sure organeller. Bemærk, at både A ' og B' viser en sammenløb til venstre for midten, hvor embryonalt indhold strømmer ud af synsplanet, ind i midten af embryoet. Bemærk også, at BODIPY har diffunderet mere end LysoTracker, da forskellige farvestoffer har forskellige diffusive egenskaber. Vægtstang: 100 μm. En 1024 x 1024 ramme (linje gennemsnit 4) blev erhvervet hver 30 s. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: ER tracker etiketter syncytial nukleare divisioner. Et syncytial blastoderm embryo blev mikroinjiceret med ER tracker og en del af overfladen blev afbildet over tid. (A) Spindelsamling under en nuklear division. B) Afskæring af den nukleare kuvert under samme opdeling. C) Efterfølgende interfase. D) Begyndelsen af den næste opdeling er angivet ved centrosomudseende (forekomst af cirkulære ER-frie områder, markeret med pilespidser). Bemærk den gradvise farvestofblegning. Excitation bølgelængde: 488 nm. Skalabjælke: 5 μm. A: indledende ramme, B: 3 min forløbet, C: 10 min forløbet, D: 13 min forløbet. En 1024 x 1024 ramme (linje gennemsnit 4) blev erhvervet hver 30 s. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Mitoview 633 mærkning af mitokondrier. Et embryo blev injiceret med Mitoview 633 under syncytial blastoderm-stadiet og afbildet 4 timer senere efter cellularisering. Billedet viser en neuroektodermal celle af et embryo i kimbåndsudvidelse. Vægtstang: 5 μm. En 1024 x 1024 ramme (linje gennemsnit 4) blev erhvervet hver 30 s. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Co-mærkning af LER'er og mikrotubuli. Et cellulariserende embryo blev injiceret med en blanding af BODIPY 493/503 (gul A,B,C) og SiR Tubulin (magenta A',B',C'). A'', B'', C'' viser de fusionerede kanaler. Panelerne A, A' og A'' viser den oprindelige ramme, panelerne B, B' og B'' viser rammen efter 5 s, og panelerne C, C' og C'' viser rammen efter 10 s. Vægtstang: 5 μm. En 512 x 512 ramme (linje gennemsnit 3) blev erhvervet hver 2,5 s. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Billeddannelse af æggeblomme vesicle autofluorescens under syncytial spaltningsfaser. (A) Ved starten af erhvervelsen. (B) Efter 8 min. (C) Efter 16 min. Excitation bølgelængde: 405 nm. Lav excitationsintensitet blev brugt til at holde embryoet i live. Vægtstang: 100 μm. En 1024 x 1024 ramme (linje gennemsnit 4) blev erhvervet hver 30 s. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende data. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Drosophila embryoet er en kraftfuld og bekvem model til at studere grundlæggende spørgsmål i cellulær og organismebiologi. Dens relative enkelhed, kraftfulde genetik og lille størrelse gør det til et fremragende system til billeddannelse af både cellulære processer og udvikling. Her er en standard mikroinjektionsprotokol tilpasset for at muliggøre FP-brug i embryoner. Denne tilgang giver mulighed for fluorescerende billeddannelse af specifikke cellulære strukturer uden behov for genetisk kodede fluoroforer, hvilket åbner mange genetiske baggrunde for billeddannelse. Kombination af flere farvestoffer plus strategisk udvalgte fluorescerende mærkede proteiner kan åbne multikanals levende billeddannelse, der spænder over hele spektret af synligt lys.

Kritiske trin i protokollen:
Denne protokol bruger BODIPY 493/503 til at mærke ED'er. Denne tilgang kan let tilpasses til at markere andre cellulære strukturer. Til efterfølgende billedanalyse er en af de vigtigste faktorer signal-støj-forholdet, dvs. farvestoffets lysstyrke sammenlignet med baggrundssignalet. Lysosomer er blevet afbildet med succes (LysoTracker Red, 1 mM) såvel som mitokondrier (Mitoview 633, 200 μM), ER (ER tracker Green, 10 μM) og mikrotubuli (SiR tubulin, 200 nM i DMSO), som vist i figur 2, figur 3, figur 4, figur 5. Derudover er æggeblomme vesikler autofluorescerende og afgiver blåt lys ved UV-excitation (billede ved hjælp af 405 nm som excitationsbølgelængde (figur 6)). For andre farvestoffer skal du sigte mod, at farvestofkoncentrationen skal være 100-1.000x af, hvad der ville være nødvendigt for farvning af dyrkede celler levende; dette svarer til koncentrationen af en stamopløsning, der ville blive fortyndet i cellekulturmedier. Da denne protokol kræver en injektion på 100 fL, og Drosophila-embryoet er ca. 9 nL i volumen¹⁸, vil disse farvestofkoncentrationer i gennemsnit være en intern embryonal koncentration på under 1/100 af, hvad der er til stede i cellekulturmediet. Midlertidigt vil den lokale koncentration være højere på injektionsstedet, hvilket er mest relevant for FP'er, der ikke diffunderer godt (dvs. mitokondrielle farvestoffer og SiR-tubulin). For disse FP'er skal du starte ved de anbefalede høje koncentrationer; hvis uventet død observeres, fortyndes successivt to gange, indtil et acceptabelt kompromis mellem overlevelse og signalstyrke er nået.

Ved samtidig injektion af flere farvestoffer skal begge farvestoffer enten være i samme opløsningsmiddel, eller både opløsningsmidler og farvestoffer skal være kompatible med blandingen (alkoholkoncentrationer på over ~10% anbefales ikke).

Nålens kvalitet er afgørende for succesen med denne procedure, da spidsen skal være så fin som muligt. Ellers kan skader fra injektionssåret kompromittere den efterfølgende udvikling af embryoet. Da kommercielle nåletrækkere er forskellige, er det vigtigt at følge producentens forslag og afprøve flere trækparametre, indtil den ønskede form er opnået. Det er vigtigt at udføre kvalitetskontroltrin 1.1.3, da arbejde med en revnet, hakket eller stor borenålespids vil gøre den vellykkede injektion vanskeligere eller endda umulig.

Embryoet skal delvist udtørres, så der kan tilsættes yderligere mængder væske under injektionen. Hvis embryoet er underudtørret, kommer nålen ikke let ind, og cytoplasma sprøjter ud, når nålen trænger ind, eller når opløsningen injiceres. Hvis embryoet er overudtørret, vil det se deflateret ud og vil ikke udvikle sig ordentligt. Den nøjagtige tørretid afhænger af lokale forhold, f.eks. luftfugtighed, og kan ændre sig fra dag til dag. Det skal bestemmes empirisk for hver session.

Embryoets evne til at overleve efter mikroinjektion afhænger kritisk af nålens kvalitet, korrekt udtørring og begrænsning af injektionsvolumen til mindre end 1 pL (ideelt 100 fL). Så længe disse parametre er optimeret, er der ingen signifikant toksicitet, når de beskrevne farvestoffer injiceres i de anbefalede koncentrationer. Hvis embryoner overlever udtørrings- og injektionstrinnene, udvikler de sig typisk med succes godt ind i kimbåndsforlængelse, en undtagelse er mikrotubuli- og ER-sonderne, der forårsagede cellulariseringsdefekter på høje niveauer (100 fL injektion af lagerkoncentrationen af hver). Testning fandt ingen åbenlyse udviklingsfejl, når DMSO, vand og blandinger af de to blev injiceret ved de anbefalede volumener med en embryooverlevelsesrate gennem kimbåndsforlængelse på ~ 75% eller mere. Injektionsvolumener mere end over 1 pL forårsagede defekter og embryoner injiceret med ~ 4 pL volumener udviklet til mindre end 1 time. Derfor skal injektionsvolumenerne holdes lave, hvilket betyder, at farvestofkoncentrationerne skal være høje.

Generelt anbefales injektioner langs embryoets laterale kant, da de resulterer i mindst mulig skade. Det kan dog være nødvendigt at justere injektionsstedet afhængigt af de diffusive egenskaber hos de anvendte FP'er. BODIPY 493/503 og LysoTracker diffunderer hurtigere over hele embryoet end Lipid Spot 610 (et andet farvestof til at markere ND'er), mens SiR-Tubulin og Mitoview 633 aldrig diffunderer fuldt ud over embryoet (billeddannelse så sent som 7 timer efter injektion). Således kan injektion i eller i nærheden af det interessante sted være nødvendigt. Ved injektion i de forreste eller bageste områder anbefales en særlig fin nål.

Billedoptagelse er afhængig af konfokal mikroskopi for optisk at sektionere og løse små organeller og alle cytoskeletale komponenter. Teknikker, der kræver analyse af mange billeder (f.eks. STORM eller PALM), fungerer ikke, fordi det embryonale indhold er i bevægelse, og fluoroforerne ikke er optimeret til fotoskift. Epifluorescensmikroskopi mangler den laterale og aksiale opløsning til at udarbejde de fleste organeller og mindre cellulære strukturer. Af disse grunde anbefales det kraftigt at bruge et konfokalmikroskop eller anvende lysarkteknologi.

Billedanalysens reproducerbarhed afhænger i høj grad af konsistente billeddata. For den største chance for succes kræves optimering af injektionsteknikken og billedoptagelse. Etablering og øvelse af en teknik, hvor farvestoffet /farverne af interesse, injektionsstedet, embryoets alder, injektionsvolumen og erhvervelsesopsætning alle er konsistente, genererer de mest robuste data til billedanalyse.

Ændringer og fejlfinding af metoden
Denne protokol demonstrerer en metode til analyse af bulkstrømmen af LER'er i spaltningsstadieembryoner ved hjælp af partikelbilledvelocimetri. Den samme tilgang kan anvendes til andre organeller, andre udviklingsstadier og andre analysemetoder. For eksempel viser figur 2 analyse af LER og sure organeller, der flyder i de syncytiale stadier af embryogenese, visualiseret ved co-injektion bodipy 493/503 og LysoTracker Red. Yderligere vellykket billeddannelse af LD-bevægelse i embryoner op til 7 timer efter befrugtning er opnået; disse embryoner bevarer injektionssåret, men er i stand til at udvikle sig i flere timer.

Data indsamlet ved hjælp af denne protokol er blevet brugt til partikelbilledvelocimetri, men mange andre analyseteknikker er tilgængelige. For eksempel kan partikelsporingsprogrammer som dem, der findes i ImageJ, Imaris eller manuel sporing, bruges til at opnå hastigheder og retningsbestemtheder af bevægelige strukturer. Bemærk, at de fleste sådanne sporingssoftware er bygget til at arbejde med data fra plane cellekultursystemer og ikke altid tilpasser sig godt til 3D-strukturer som Drosophila-embryoet . For at kunne producere partikelsporingsdata af bedste kvalitet skal der desuden afbildes flere Z-planer; dette bør være muligt, hvis erhvervelsestiderne for billedstakken er under ~ 2 s. Dette benchmark bør kunne nås på roterende skivekonfokal, gitterlysark og nylige laserscanningskonfokale systemer. Muligheden for partikelsporing for rigelige organeller som LD'er, mitokondrier og lysosomer er imidlertid lav, da mængden af positivt signal i et synsfelt er for høj til de nuværende sporingsmetoder. Sporing af mindre rigelige strukturer som kerner eller æggeblomme vesikler kan være muligt. PIV til flowanalyse fungerer godt for ND'er og sure organeller i spaltningsstadier, fordi begge organeller bevæger sig frit. Organeller som kerner, ER og mitokondrier er bundet til andre cellulære strukturer og bevæger sig således ikke frit og er ikke egnede til softwareanalyse, der antager fri bevægelse. Efterforskeren bør vælge de teknikker, der passer bedst til organellen af interesse.

Under de syncytiale og cellulære blastodermstadier bevæger LED'er (såvel som nogle andre organeller) sig langs radialt orienterede mikrotubuli⁵. Det er derfor muligt at finde tværsnitsbilleder (som i figur 5), hvor enkelte mikrotubuli er i fokus i lange afstande, hvilket muliggør partikelsporing i 2D. Da disse optiske planer er dybt inde i embryoet, reduceres den samlede signalstyrke, og signal-støj-forholdet reduceres.

Til sporingsanalyse kan billeddannelse så hurtigt som muligt afsløre vigtige detaljer om bevægelsen og dermed om det bevægelige maskineri. For eksempel er lipid-dråbebevægelse en blanding af to bevægelige tilstande, langsom kort bevægelse (~ 200 nm / s; gennemsnitlig rejseafstand ~ 100 nm) og hurtig-lang bevægelse (~ 450 nm / s; gennemsnitlig rejseafstand ~ 1.000 nm)¹⁹; således, hvis billeder tages hvert sekund eller endnu sjældnere, bliver den langsomme-korte tilstand uopdagelig. Imidlertid inducerer hyppig billeddannelse også fluoroforblegning og fototoksicitet. Billeddannelsesforholdene skal derfor justeres afhængigt af det nøjagtige spørgsmål, der skal behandles.

Begrænsninger af metoden
Afhængigt af det ønskede farvestof kan metoden begrænses af kompatibiliteten mellem farvestofopløseligheden og injektionsopløsningens toksicitet. Alkoholer som isopropanol og ethanol er vanskelige at håndtere i en nål på grund af deres lavere viskositet og synes at beskadige cellulære komponenter og dræbe embryoet.

Metoden er heller ikke velegnet til at visualisere de tidligste trin i embryogenese, fordi det tager 30+ minutter at forberede embryonerne til injektion. Ved stuetemperatur er embryoets indledende cellecyklusser kun ~ 10 minutter lange hver; så selv hvis man skulle vælge et nybefrugtet æg i trin 5.2.3, ville de første par cellecyklusser allerede være afsluttet, når embryoet er klar til billeddannelse.

Belysning med lys i UV/blå-området er betydeligt mere fototoksisk end ved længere bølgelængder. Under sådanne forhold (f.eks. at følge autofluorescerende æggeblomme vesikler; Figur 6), skal man begrænse billedbehandlingstiden (hvilket fører til kortere tidsserier) eller bruge lavere lasereffekt (hvilket resulterer i et reduceret signal-støj-forhold).

Efter cellularisering har farvestoffer injiceret på et bestemt sted en tendens til at diffundere dårligt, da de skal krydse mange cellemembraner. Dette begrænser observationsområdet i senere udviklingsstadier.

Metodens betydning i forhold til eksisterende/alternative metoder
Bevægelsen af LED'er og andre lipidholdige organeller i tidlige embryoner kan visualiseres med genetisk kodede fluoroforer, etiketfrie teknikker og ved introduktion af FP'er. Sidstnævnte kan opnås ved permeabilisering af vitellinmembranen¹² eller mikroinjektionsmetoden, der diskuteres her.

Genetisk kodede fluoroforer er alsidige markører, hvis niveauer typisk er meget reproducerbare fra embryo til embryo. De har dog lavere kvanteudbytter og blegemiddel lettere end FP'er. Typisk er de kun tilgængelige i en eller to mærkede versioner (f.eks. GFP eller mCherry), hvilket begrænser valget af, hvilke strukturer der kan afbildes samtidigt. FP'er findes der derimod ofte i et stort udvalg; for eksempel er forskellige lipiddråbespecifikke farvestoffer tilgængelige med emissionsspektre fra Autodot i UV / blå spektret til Lipidtox og LipidSpot 610 i det langt røde spektrum. FP'er kan også påføres direkte på enhver stamme af interesse og kræver derfor ikke belastningskonstruktion for f.eks. at indføre den ønskede organelmarkør i en mutant stamme af interesse. Denne fordel er særlig udtalt, når flere strukturer skal mærkes samtidigt; i stedet for tidskrævende krydsninger, der spænder over flere generationer, kan dette opnås på en enkelt dag ved at blande de relevante farvestoffer og introducere dem på samme tid. Endelig, hvis cellulære processer skal undersøges med farmakologisk hæmning, kan lægemidler og farvestoffer introduceres sammen.

Etiketfrie metoder er meget kraftfulde tilgange til påvisning af specifikke cellulære strukturer. For eksempel kan LER'er specifikt påvises i tidlige embryoner ved tredjeharmonisk generationsmikroskopi²⁰ eller ved femtosekund stimuleret Raman Loss mikroskopi²¹. Ligesom FP'er kan disse tilgange anvendes i enhver genetisk baggrund, og fordi de ikke forårsager blegning, giver de potentielt mulighed for hurtigere billedoptagelse. De er dog typisk begrænset til specifikke organeller og understøtter således ikke i sig selv multiplexbilleddannelse; de kræver også specialiserede mikroskoper.

Der er to generelle strategier for at indføre små molekyler i embryoner. Den ene er den mikroinjektionsmetode, der anvendes her; den anden er kemisk (terpen) behandling for at permeabilisere vitellinmembranen. Sidstnævnte tilgang¹² er mindre involveret end mikroinjektion, men også mere variabel fra embryo til embryo. Derudover kompromitteres beskyttelsen fra vitellinmembranen efter permeabilisering, og det egentlige embryo er tilgængeligt for det ydre medium, hvilket gør det mere udfordrende at holde det i live. Mikroinjektion er meget mindre tilbøjelig til at afspore embryonal udvikling end permeabilisering. Permeabilisering anbefales dog, hvis mange embryoner skal overvåges samtidigt, f.eks. til lægemiddelscreeningsformål. For at følge bevægelsen af cellulære strukturer og opnå reproducerbare billedserier, der er egnede til billedanalyse, er mikroinjektion den valgte metode.

Metodens betydning og potentielle anvendelsesmuligheder inden for specifikke forskningsområder
Drosophila embryoet er et vigtigt modelsystem til at studere mange cellebiologiske og udviklingsmæssige processer ^1,5,6. Mærkning af organeller med fluorescerende proteiner har ydet store bidrag til forståelsen af, hvordan det tidlige embryo udvikler sig, hvordan forskellige organeller trafikerer, og hvordan sådan handel moduleres udviklingsmæssigt og genetisk. Imidlertid begrænser deres tilbøjelighed til blegemiddel og udfordringerne ved at generere stammer, hvor flere organeller er mærket med forskellige farver, anvendelsen af denne tilgang. Brugen af FP'er introduceret ved mikroinjektion løser mange af disse udfordringer og kan endda kombineres med fluorescerende mærkede proteiner. Denne teknik muliggør billeddannelse af flere organeller, cellestrukturer og cytoskeletale komponenter i enhver genetisk baggrund. Som følge heraf kan flere genotyper sammenlignes via levende billeddannelse, hvilket gør det muligt at bestemme effekten af mutationer på handel med flere organeller.

Denne protokol viser FP-injektionsmetoden for embryoner af Drosophila melanogaster, men i princippet gælder denne tilgang for alle insektæg, for hvilke der er etableret mikroinjektionsteknikker, herunder andre arter af Drosophila, crickets²² og bladlus²³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	Stains lipid droplets in violet/blue
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	Stains lipid droplets in green
Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite	W.A. Hammond Drierite Company	21001
Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base	Zeiss	4350030000000000
Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape	Scotch (3M)	-	Sold by many vendors
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	Stains the ER/nuclear envelope
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	Ready to use
Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in	World Precision Instruments	TW100F-4	Must be pulled
Glass coverslip	-	-	Buy the appropriate refractive index for your objective lens
Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned	FisherBrand	12-550-343
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
Heptane greener alternative anhydrous, 99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	Heptane is considered toxic by the USA's OSHA
Confocal microscope	Leica	Sp5	Many different types of confocal microscopes will work.
LipidSpot 610	Biotium	#70069	Stains lipid droplets in far red
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	Stains lysosomes in red
MitoView 633	Biotium	#70055	Stains mitochondria
Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, Next Generation Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.
SiR-Tubulin	Cytosketon Inc	CY-SC014	Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	Stains microtubules in violet/blue