Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Summary

Im frühen Drosophila-Embryo sind viele Organellen beweglich. Im Prinzip können sie über spezifische fluoreszierende Sonden lebend abgebildet werden, aber die Eierschale verhindert eine direkte Anwendung auf den Embryo. Dieses Protokoll beschreibt, wie solche Sonden durch Mikroinjektion eingeführt und dann die Bewegung der Massenorganelle über die Teilchenbild-Velocimetrie analysiert werden.

Abstract

Frühe Drosophila-Embryonen sind große Zellen, die eine Vielzahl konventioneller und embryospezifischer Organellen enthalten. Während der ersten drei Stunden der Embryogenese durchlaufen diese Organellen dramatische Bewegungen, die durch aktinbasiertes zytoplasmatisches Strömen und motorgetriebenen Verkehr entlang von Mikrotubuli angetrieben werden. Die Entwicklung einer Vielzahl kleiner, organellenspezifischer Fluoreszenzsonden (FPs) ermöglicht es, eine breite Palette verschiedener lipidhaltiger Strukturen in jedem Genotyp sichtbar zu machen, was eine Live-Bildgebung ermöglicht, ohne dass ein genetisch kodierter Fluorophor erforderlich ist. Dieses Protokoll zeigt, wie man lebenswichtige Farbstoffe und molekulare Sonden in Drosophila-Embryonen injiziert, um den Handel mit bestimmten Organellen durch Lebendbildgebung zu überwachen. Dieser Ansatz wird durch die Markierung von Lipidtröpfchen (LDs) und die Verfolgung ihrer Massenbewegung durch Partikelbild-Velocimetrie (PIV) demonstriert. Dieses Protokoll bietet eine Strategie, die für die Untersuchung anderer Organellen, einschließlich Lysosomen, Mitochondrien, Dottervesikel und der Notaufnahme, sowie für die Verfolgung der Bewegung einzelner LDs entlang von Mikrotubuli geeignet ist. Die Verwendung kommerziell erhältlicher Farbstoffe bringt die Vorteile der Trennung in die violett / blauen und fernroten Bereiche des Spektrums. Durch die Multiplex-Co-Markierung von Organellen und/oder Zytoskelettelementen mittels Mikroinjektion stehen alle genetischen Ressourcen in Drosophila für Handelsstudien zur Verfügung, ohne dass fluoreszierend markierte Proteine eingeführt werden müssen. Im Gegensatz zu genetisch kodierten Fluorophoren, die geringe Quantenausbeuten und leicht Bleichmittel aufweisen, ermöglichen viele der verfügbaren Farbstoffe eine schnelle und gleichzeitige Erfassung mehrerer Kanäle mit hohen Photonenausbeuten.

Introduction

Vitale Farbstoffe und molekulare Sonden sind leistungsstarke Werkzeuge, um bestimmte Zellstrukturen und Organellen live abzubilden. Im Drosophila-Embryo zeigen viele verschiedene Organellen eine zytoskelettgetriebene^Lokalisation 1,2,3,4, aber die Anwendung dieser kleinen Moleküle ist eine Herausforderung^, da die Eierschale für viele von ihnen undurchlässig ist. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Verwendung von fluoreszierenden Sonden (FPs) in lebenden Embryonen durch Mikroinjektion, um den großflächigen Handel mit Organellen zu erkennen. Das Verfahren umfasst die Zubereitung der Injektionslösung, die Eizellentnahme und die Präparation von Embryonen, die Mikroinjektion, die Bildgebung und die Bildanalyse.

Dramatische räumliche Umlagerungen von Organellen sind in vielen tierischen Eizellen, Eiern und Embryonen üblich, zum Teil wegen der Größe dieser Zellen. Im Drosophila-Embryo zum Beispiel bewegen sich Lipidtröpfchen (LDs) und Dottervesikel kurz vor der Zellularisation in Richtung^{Embryozentrum 5}. Diese Bewegung hängt von Mikrotubuli ab und hinterlässt eine ~ 40 μm-Region rund um die Peripherie des Embryos, die von den beiden Organellen erschöpft ist. Während früherer Spaltungsstadien werden viele Organellen durch zytoplasmatische Ströme transportiert, die durch Aktin-Myosin-basierte Kontraktionen an der Embryooberfläche^{angetrieben werden 6}. Obwohl die Embryonen vieler Arten ähnliche Umlagerungen aufweisen, ist der Drosophila-Embryo besonders geeignet, diese Prozesse durch Bildgebung zu verfolgen, da er sich bei Standardlabor-Raumtemperatur extern entwickelt, relativ transparent ist, klein genug ist, um auf die meisten Mikroskop-Setups zu passen, und mit leistungsstarken genetischen Werkzeugen manipuliert werden kann.

Für einige Organellen stehen fluoreszierend markierte Proteine zur Verfügung, die diese Strukturen spezifisch markieren. Zum Beispiel ist LSD-2 (auch bekannt als dPLIN2) ein Protein, das in Embryonen spezifisch auf LDs⁷ abzielt. Es gibt Fliegenschnüre, die entweder induzierbare Transgene tragen, die für eine Fusion zwischen Green Fluorescent Protein (GFP) und LSD-2⁸ kodieren, oder eine Genfalle, in der gelbes fluoreszierendes Protein (YFP) in die kodierende Region des endogenen LSD-2-Gens ^9,10 eingefügt wird. Dieser Ansatz hat jedoch Einschränkungen, einschließlich der Tatsache, dass diese Fusionsproteine geringe Quantenausbeuten haben und dazu neigen, leicht zu bleichen. Darüber hinaus kann die gleichzeitige Markierung mehrerer verschiedener Strukturen eine Herausforderung darstellen: Für viele Organellen ist derzeit nur eine Art von fluoreszierendem Tag (oft GFP oder mCherry) verfügbar, so dass die gleichzeitige Abbildung von zwei Organellen neue Transgene oder Insertionen erfordern kann; Selbst wenn kompatible Tags verfügbar sind, kann das Einbringen in eine einzelne Sorte zeitaufwändige Kreuzungen erfordern. Es macht auch die Nutzung der vielen mächtigen genetischen Ressourcen weniger bequem, z.B. wenn zwei Organellenmarker, ein Gal4-Treiber und ein induzierbares RNAi-Konstrukt alle in derselben Mutter vorhanden sein müssen.

Im Prinzip können diese Einschränkungen durch die Verwendung von FPs überwunden werden, einschließlich lebenswichtiger Farbstoffe (z. B. LysoTracker zur Markierung von Lysosomen), molekularen Sonden (z. B. SiR-Tubulin zur Markierung von Mikrotubuli) und fluoreszierend markierten biologischen Molekülen (z. B. C12 BODIPY zur Untersuchung des Fettsäurestoffwechsels¹¹). Von der Verwendung in kultivierten Zellen sind sie in der Regel als leistungsfähige Werkzeuge zur Untersuchung der Zellbiologie gut validiert. FPs sind vielseitig, haben überlegene Fotoeigenschaften und sind mit fluoreszierenden Proteinen kompatibel. Mehrere Farbstoffe können gleichzeitig gemischt und aufgetragen werden, oft mit den Vorteilen der Trennung in die violett / blauen und fernroten Bereiche des Spektrums und kleiner Stokes-Verschiebungen, wodurch ein Durchbluten des Kanals verhindert wird. Kleine Stokes-Verschiebungen ermöglichen die gleichzeitige Erfassung mehrerer Bildgebungskanäle und ermöglichen die Verfolgung mehrerer Organellen gleichzeitig. Schließlich können sie auch zur Markierung von Organellen in den Embryonen anderer Drosophila-Arten oder sogar anderer Insekten angewendet werden, bei denen möglicherweise keine fluoreszierend markierten Proteine verfügbar sind.

Die meisten dieser FPs können jedoch die ausgeklügelte Eierschale des Drosophila-Embryos nicht durchqueren. Es besteht aus fünf Schichten: drei äußeren Chorionschichten (Chorion), die mechanische Schäden verhindern, sowie einer wachsartigen Schicht, die die Vitellinmembran umgibt und eine chemische Barriere¹² bildet. Der Einfachheit halber wird die Kombination der wachsartigen Schicht und der Vitellinmembran im Folgenden als "Vitellinmembran" bezeichnet. Um die Eierschale zu umgehen, passt dieses Protokoll einen etablierten Embryo-Mikroinjektionsansatz an, um FPs in den Drosophila-Embryo einzuführen. Das Protokoll beschreibt, wie der zytoplasmatische Fluss von LDs in Embryonen im Spaltstadium überwacht werden kann. Es umfasst die Vorbereitung von Injektionsnadeln und Eiersammelkäfigen, den Prozess der Eizellentnahme und die mechanische Entfernung des Chorions. Es geht darum, wie man die Embryonen mikroinjiziert und abbildet und wie man den Massenstrom von LDs mit Hilfe der Partikelbild-Velocimetrie (PIV, angepasst von⁶) analysiert. Es bietet Ratschläge zur Fehlerbehebung, um das Überleben des Embryos sicherzustellen und das beste System für die Bildgebung zu schaffen. Es wird auch diskutiert, wie das Protokoll modifiziert werden kann, um LDs und Mikrotubuli gleichzeitig abzubilden oder es auf die Untersuchung anderer Organellen anzuwenden, einschließlich Lysosomen, Mitochondrien, Dottervesikel und des endoplasmatischen Retikulums (ER).

Protocol

1. Bereiten Sie die notwendigen Materialien vor

HINWEIS: Diese Vorbereitungen werden am besten Tage oder Wochen im Voraus durchgeführt.

1. Bereiten Sie Injektionsnadeln vor.
   HINWEIS: Nadeln können unbegrenzt in einem abgedeckten Behälter aufbewahrt werden. Nadeln müssen fein genug sein, um ~ 700 fL zu liefern, während sie stark genug sind, um die Vitellinmembran zu durchbohren.
   1. Legen Sie eine Kapillare in den Kapillarhalter am Nadelzieher. Befestigen Sie die Kapillare mit den Flügelmuttern. Richten Sie die Mitte der Kapillare mit dem Heizelement aus, so dass zwei symmetrische Nadeln erzeugt werden.
   2. Wählen Sie die entsprechenden Einstellungen am Nadelzieher gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   3. Führen Sie eine Qualitätskontrolle mit einem Sezierbereich durch.
      HINWEIS: Nadelspitzen sollten so fein wie möglich sein. Rissige, gezackte oder großvolumige Nadelspitzen werden verworfen.
   4. Bereiten Sie Chargen von 10 Nadeln (5 Kapillaren wert) gleichzeitig vor.
   5. Legen Sie einen verformbaren Kitt, der zu einem Zylinder zusammengerollt wurde, in die Mitte des Bodens eines Behälters mit einem Deckel. Drücken Sie die Nadeln vorsichtig in den Kitt, so dass er sie horizontal hält, wobei die Nadelspitzen sicher in der Luft hängen, um Schäden zu vermeiden. Mit dem Deckel abdecken und bis zum Gebrauch aufbewahren.
2. Bereiten Sie Eiersammelteller vor. Bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: Eiersammelplatten sind kleine Agarplatten, die mit Fruchtsaft ergänzt werden, um die Eiablage zu fördern. Wie man sie vorbereitet, wird in vielen Protokollen beschrieben, einschließlich¹³.
3. Bereiten Sie Heptankleber vor.
   HINWEIS: Dieser Kleber wird aus doppelseitigem Klebeband extrahiert und verwendet, um die Embryonen sicher an einem Deckglas zu befestigen. Es verhindert, dass der Embryo während der Injektion und Bildgebung aus dem Fokus gerät. Der Kleber kann Tage oder Wochen im Voraus vorbereitet werden.
   1. Ballen Sie doppelseitiges Klebeband auf eine Größe, die größer als ein Golfball ist, und legen Sie es auf den Boden eines ~ 50 ml Glasbehälters mit einem dicht abdichtenden Deckel. Packen Sie das Klebeband fest ein, damit genügend Klebstoff vorhanden ist.
   2. Füllen Sie in einem Abzug den Glasbehälter mit Heptan, um das gesamte Band abzudecken. Halten Sie den Behälter fest verschlossen, wenn er nicht benutzt wird.
      ACHTUNG: Heptan ist als Flüssigkeit und Dampf brennbar. Es kann Augen-, Haut- und Atemwegsreizungen verursachen. Das Einatmen von Dämpfen kann Schläfrigkeit, Schwindel und Lungenschäden verursachen. Halten Sie Heptan von Zündquellen fern und lagern Sie es in einem gut belüfteten Bereich, der für brennbare Stoffe und von inkompatiblen Substanzen bestimmt ist.
   3. Lassen Sie den Heptankleber über Nacht oder länger ruhen. Für beste Ergebnisse legen Sie den Behälter über Nacht auf einen Shaker oder ein anderes Rührwerk, um das Auflösen des Klebstoffs zu erleichtern.
      HINWEIS: Das Klebeband selbst bleibt erhalten, aber der Klebstoff wird im Heptan aufgelöst. In Schritt 5.1.2 wird der Kleber auf ein Deckglas aufgetragen; Heptan verdunstet und hinterlässt den Kleber.
   4. Testen Sie die Heptankleberzubereitung, indem Sie einen Tropfen davon auf einen Glasobjektträger geben und sicherstellen, dass ein klebriger Rückstand verbleibt, sobald das Heptan verdunstet ist. Wenn Klebstoffrückstände danach nicht sichtbar sind, fügen Sie mehr Klebeband in den Glasbehälter ein und wiederholen Sie den vorherigen Schritt.
      HINWEIS: Einmal vorbereitet, kann der Kleber für Monate oder sogar Jahre verwendet werden.
4. Bereiten Sie eine 1 mg/ml (3,8 mM) BODIPY493/503 Stammlösung vor, indem Sie die kommerziell erhältliche Zubereitung in rein wasserfreiem DMSO verdünnen. Halten Sie es bedeckt, um es vor Licht und Wasser zu schützen. Auf unbestimmte Zeit bei -20 °C oder kurzfristig bei 4 °C lagern.

2. Eiersammelkäfige vorbereiten

HINWEIS: Tun Sie dies mindestens einen Tag (vorzugsweise 2 oder 3 Tage) vor der geplanten Injektion(en).

1. Bereiten Sie Hefepaste vor.
   HINWEIS: Hefepaste ergänzt Protein und andere lebenswichtige Nährstoffe, die nicht in den Apfelsaftplatten enthalten sind. Es fördert die Eierproduktion und das Eiablegen.
   1. Fügen Sie 2-10 g trockene Bäckerhefe und dann 1 ml Leitungswasser in ein kleines Becherglas hinzu. Mit einem Spatel mischen.
   2. Fügen Sie Leitungswasser in 1-ml-Schritten hinzu, bis die gewünschte, zahnpastaartige Konsistenz erreicht ist.
   3. Decken Sie die Mischung ab und lagern Sie sie bei 4 °C.
2. Richten Sie Fliegenkäfige für die Eiersammlung ein.
   HINWEIS: Männliche und weibliche Fliegen des gewünschten Genotyps sind erforderlich: 10-50 Weibchen unter 2 Wochen alt und eine ähnliche Anzahl von Männchen. Eine Reihe von verschiedenen Optionen für Fliegenkäfige sind verfügbar, einschließlich hausgemachter Optionen^14,13. Wichtig ist, dass die Größe der Apfelsaftplatten auf die Größe der Fliegenkäfige abgestimmt ist.
   1. Legen Sie einen kleinen Fleck Hefepaste auf einen Apfelsaftteller. Halten Sie es bedeckt und lassen Sie es auf Raumtemperatur kommen, denn Fliegen legen keine Eier auf den Teller, wenn es zu kalt ist.
   2. Transfer fliegt zu einem Embryo-Entnahmekäfig, versiegeln Sie mit der Hefe-Apfelsaftplatte und befestigen Sie die Platte am Embryo-Entnahmekäfig.
   3. Lassen Sie neu übertragene Fliegen sich für 1-2 Tage an den Käfig gewöhnen und ersetzen Sie die Platte täglich durch eine frische. Wenn die gesamte Hefe bis zum nächsten Tag gegessen wurde, erhöhen Sie die Menge an Hefepaste für zukünftige Sammlungen.
      HINWEIS: Dies ist ein wichtiger Schritt, um den Eierertrag zu erhöhen, da gut gefütterte Weibchen mehr Eier legen.

3. Bereiten Sie am Tag der Injektion die Injektionslösung vor und laden Sie sie in die Nadel

1. Verwenden Sie die Stammlösung von BODIPY 493/503 (3,8 mM in DMSO) als Injektionslösung.
2. Laden Sie eine einzelne Nadel mit 1 μL der Injektionslösung unter Verwendung von Nadelladespitzen.
   HINWEIS: Bemühen Sie sich, die Flüssigkeit bis zur Spitze zu bringen, ohne Luftblasen einzufangen. Seien Sie bereit, die geladene Nadel im Falle eines versehentlichen Bruchs schnell auszutauschen.
   1. Befestigen Sie eine Ladespitze an einer Mikropipette und ziehen Sie 1 μL der Injektionslösung in die Spitze. Halten Sie die Nadel mit Handschuhen in einer Hand mit der Spitze weg, um das Bruchrisiko zu minimieren.
   2. Führen Sie die Ladespitze vorsichtig in die Nadel ein und drücken Sie sie nahe an die Nadelspitze. Geben Sie die Flüssigkeit in der Nähe der Nadelspitze ab. Nachdem Sie die Pipette entfernt haben, halten Sie die Nadel senkrecht mit der Spitze nach unten, bis die Flüssigkeit zur Spitze fließt.
3. Lagern Sie die geladenen Nadeln wie oben beschrieben in einem separaten Behälter mit Kitt (siehe Schritt 1.1.5).
   HINWEIS: Nadeln sollten im Voraus (bis zu mehreren Stunden) der Injektion vorbereitet werden, aber nicht nach mehr als einem Tag verwendet werden.
4. Halten Sie Nadeln aus dem Umgebungslicht heraus, um ein Ausbleichen der Farbstoffe zu verhindern. Decken Sie den Aufbewahrungsbehälter mit Alufolie ab, ohne die Nadelspitzen zu beschädigen. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Licht verdeckt ist.

4. Embryonen zur Injektion sammeln

HINWEIS: Der Zeitpunkt der Entnahme hängt davon ab, in welchem Stadium der Embryonen die Injektion durchgeführt werden muss. Mit dem folgenden Zeitschema sind die Embryonen zum Zeitpunkt der Vorbereitung auf die Injektion 0-90 min alt, was den Spaltungsstadien¹⁵ entspricht.

1. Am Tag der Injektion werden Apfelsaftplatten mit Hefe zubereitet, wie in Schritt 2.2.1 beschrieben. Wenn N-Injektionsrunden geplant sind, bereiten Sie N + 2-Platten vor. Bewahren Sie diese Platten bei Raumtemperatur auf.
   HINWEIS: Zusätzlich zu den N-Platten zum Sammeln von Embryonen für die Injektion wird eine Platte als Vorsammelplatte und eine weitere benötigt, um die Fliegen im Käfig zu füttern, sobald die Entnahme abgeschlossen ist.
2. Ersetzen Sie die Platte auf dem Käfig durch eine frische Hefeplatte (Vorsammelplatte) und lassen Sie sie für 1-2 h auf dem Käfig.
3. Ersetzen Sie die Platte am Käfig durch eine frische Platte (Auffangplatte). Entsorgen Sie die Vorentnahmeplatte, da sie Embryonen enthält, die älter als gewünscht sind. Dann erlauben Sie den Fliegen, Eier für 1,5 h zu legen.
   HINWEIS: Da gut gefütterte Fliegen ihre Eier typischerweise kurz nach der Befruchtung der Eier ablegen, stellt eine Sammlungszeit von 1,5 Stunden sicher, dass am Ende der Entnahme die meisten Embryonen auf dem Teller 0-90 Minuten alt sind, d.h. sich in einem Spaltungsstadium befinden. Weibliche Fliegen, die seit dem Vortag nicht mehr mit frischer Hefe gefüttert wurden, neigen dazu, befruchtete Eier für eine unbestimmte Zeit vor dem Legen zu behalten. Daher kann die Vorentnahmeplatte Embryonen enthalten, die vor Beginn der Entnahme befruchtet wurden und daher älter als 60 min, manchmal viel älter sind.
4. Ersetzen Sie die Platte auf dem Käfig durch eine frische Hefeplatte. Decken Sie die Sammelplatte ab, damit streunende Fliegen keine Eier darauf legen.

5. Embryonen für die Mikroinjektion vorbereiten

1. Stellen Sie die benötigten Materialien zusammen.
   1. Befestigen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband an einem Glasobjektträger. Vermeiden Sie es, das Band mit den Fingern zu berühren, da dies die Klebrigkeit verringert.
      HINWEIS: Diese Folie wird zum Entfernen des Chorions und nicht für die Bildgebung verwendet.
   2. Mit einer Transferpipette oder einer Mikropipette (p200 oder p1000) einen kleinen Tropfen (200 μL oder weniger) Heptankleber ungefähr in die Mitte eines rechteckigen Deckglases (60 x 25 mm) geben. Lassen Sie das Heptan verdunsten (dies dauert weniger als eine Minute).
      HINWEIS: Dieses Deckglas wird verwendet, um die Embryonen für die Injektion und Bildgebung zu montieren. Die Abmessungen sind so gewählt, dass sie in einen verstellbaren Metallhalter am konfokalen Mikroskop passen.
   3. Stellen Sie eine Austrocknungskammer zusammen, eine versiegelte Kammer (z. B. eine Tupperware-Sandwichbox), die Austrocknungsperlen enthält. Verwenden Sie nur Austrocknungsperlen, die nicht hydratisiert haben.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Embryonen die Injektionslösung aufnehmen, muss der Embryo leicht ausgetrocknet werden, um den inneren Druck zu reduzieren. Dies geschieht, indem das Deckglas mit den dechorionierten, luftexponierten Embryonen in die Austrocknungskammer gelegt wird.
2. Entfernen Sie das Chorion mechanisch.
   1. Decken Sie die entsprechend gealterte Embryoplatte mit einer dünnen Schicht Halocarbon Oil 27 ab, um die Eierschale transparent zu machen.
      HINWEIS: Embryonen werden innerhalb von Dutzenden von Sekunden^{durchscheinend 15}. Wenn dieser Schritt nicht effizient durchgeführt wird, sind die Apfelsaftplatten möglicherweise zu nass und müssen vor dem Gebrauch abgetrocknet werden.
   2. Betrachten Sie die Platte unter einem Sezierfernrohr mit Transillumination (dh das Licht, das durch die Platte in die Okulare geht), um das Stadium der Embryonen zu bestätigen.
   3. Wählen Sie Embryonen in Spaltungsstadien.
      HINWEIS: Embryonen im Spaltstadium sind völlig undurchsichtig; Die nachfolgenden Blastoderm-Stadien können an einem Band aus transparentem Zytoplasma rund um das undurchsichtige Zentrum¹⁵ erkannt werden. Eine gute Einführung in die Erkennung verschiedener Embryonalstadien ist auf der Website (unter Referenz¹⁶) verfügbar, die von der Society of Developmental Biology unterhalten wird.
   4. Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette einen Embryo des gewünschten Stadiums an seinen dorsalen Anhängseln und übertragen Sie ihn auf den vorbereiteten Glasobjektträger, der mit einem Stück doppelseitigem Klebeband bedeckt ist. Legen Sie den Embryo auf das Band. Minimieren Sie den Öltransfer.
   5. Rollen Sie den Embryo so sanft wie möglich über die Oberfläche des Bandes, indem Sie den Embryo vorsichtig mit der Seite der Pinzettenspitze anstoßen. Stechen Sie den Embryo nicht direkt mit den scharfen Pinzettenspitzen an.
      HINWEIS: Wenn die Kraft zu gering ist, rollt der Embryo nicht. Wenn es zu hoch ist, wird es platzen. Die Suche nach der geeigneten Zwischenkraft erfordert Erfahrung und daher sollte dieser Schritt vorher geübt werden.
   6. Rollen Sie den Embryo weiter, bis das Chorion vorübergehend am Band haftet und reißt.
   7. Sobald das Chorion reißt, rollen Sie weiter, um den Embryo (noch innerhalb der Vitellinmembran) vom Chorion zu trennen, während das Chorion am Band klebt.
   8. Bestätigen Sie, dass das Chorion vollständig entfernt ist, indem Sie den Verlust der dorsalen Anhängsel aus dem Embryo beobachten.
   9. Rollen Sie den Embryo zurück auf das Chorion, das weniger haftend ist als das Band. Reiben Sie den Embryo vorsichtig mit der Pinzette, bis er zur Übertragung an der Pinzette befestigt ist.
   10. Übertragen Sie den Embryo mit dem Heptankleber auf das Deckglas und bringen Sie ihn in Kontakt mit dem Kleber, der ihn typischerweise von der Pinzette löst.
   11. Passen Sie die Ausrichtung des Embryos auf dem Deckglas an.
       1. Betten Sie die laterale Oberfläche des Embryos in den Klebstoff ein.
          HINWEIS: Die Oberfläche des Embryos, die in den Klebstoff eingebettet ist, ist diejenige, die abgebildet wird. Das Einbetten der seitlichen Oberfläche ist am einfachsten, aber dies kann je nach persönlicher Vorliebe oder der zu beantwortenden biologischen Frage angepasst werden.
       2. Richten Sie die lange Achse des Embryos senkrecht zur Längsachse des Deckglases aus.
       3. Wenn der Embryo nicht in der bevorzugten Ausrichtung liegt, reinigen Sie die Pinzette, um das Öl zu entfernen, das den Embryo vom Klebstoff lösen würde. Versuchen Sie dann vorsichtig, den Embryo in Position zu bringen.
   12. Bereiten Sie die gewünschte Anzahl von Embryonen für die Injektion in der oben beschriebenen Weise vor.
       HINWEIS: Im Laufe der Zeit nach der Entfernung des Chorions beginnt die Umgebungsluft, die Embryonen auszutrocknen, und somit wird die Wirkung von Schritt 5.3 für die Embryonen auf dem Deckglas, die zu verschiedenen Zeiten dechorioniert wurden, ungleichmäßig sein. Typischerweise sind 1-3 Embryonen am überschaubarsten.
3. Embryonen austrocknen.
   1. Legen Sie das Deckglas mit den Embryonen in die vorbereitete Austrocknungskammer und verschließen Sie es.
   2. Lassen Sie die Embryonen für 5-12 min austrocknen.
      HINWEIS: Der Zeitpunkt dieses Schrittes ist abhängig von der Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit und muss daher empirisch ermittelt werden.
   3. Entfernen Sie das Deckglas aus der Kammer und geben Sie einen Tropfen Halogenkohlenwasserstofföl 700 darauf, wobei die Embryonen vollständig bedeckt sind, um eine weitere Austrocknung zu verhindern.
   4. Untersuchen Sie die Embryonen auf einem Sezierbereich, um die richtige Austrocknung zu beurteilen.
   5. Wenn die Embryonen nur leicht geschrumpft, aber nicht entleert sind, fahren Sie mit der Mikroinjektion fort (Schritt 6).
   6. Wenn die Embryonen nicht ausreichend oder übermäßig ausgetrocknet sind, kehren Sie zu Schritt 5.2 zurück und bereiten Sie eine neue Charge von Embryonen vor, da das Halogenkohlenwasserstofföl 700 nicht entfernt werden kann. Wenn die Embryonen übermäßig ausgetrocknet waren, verkürzen Sie die Austrocknungszeit für die nächste Embryonencharge um 3 Minuten; Wenn sie untergetrocknet waren, erhöhen Sie die Austrocknungszeit um 3 min.

6. Mikroinjizierte Embryonen

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Mikroinjektions-Setup ein inverses Mikroskop, einen Mikromanipulator zum Halten und Positionieren der Injektionsnadel und einen kommerziellen Mikroinjektor zur Abgabe kontrollierter Volumina umfasst.

1. Schalten Sie den Mikroinjektor ein und geben Sie die gewünschten Einstellungen ein.
   HINWEIS: Für dieses Protokoll wird empfohlen, die lineare Bewegungsausgabe und die schnelle Einstellung zu verwenden, aber viele andere funktionieren. Der Bediener sollte die persönlichen Präferenzen bestimmen.
2. Laden Sie die Nadel in den Mikromanipulator. Um zu verhindern, dass die Nadel beim Laden des Deckglases mit den Embryonen beschädigt wird, bewegen Sie sie aus dem Weg in eine sichere Position.
3. Legen Sie das Deckglas auf die Bühne, mit Embryonen oben, in Richtung der Nadel. Bewegen Sie dann die Nadel vorsichtig zur Injektion zurück in Position, wobei ihre Spitze noch deutlich über dem Stadium liegt.
4. Setzen Sie das 4x-Objektiv in den Lichtweg. Bringen Sie die Embryonen mit dem Fokusknopf am Mikroskop in den Fokus.
   HINWEIS: Dies ist die Brennebene, die für die Injektion verwendet wird, und wird in Zukunft nur minimal angepasst.
5. Bewegen Sie die Embryonen mithilfe der Bühnensteuerungen horizontal in die Mitte des Sichtfeldes.
   1. Schwenken Sie von den Embryonen weg und halten Sie sie am Rand des Sichtfeldes, um sich auf das Absenken der Nadel vorzubereiten. Bleiben Sie in der gleichen Brennebene, um sicherzustellen, dass die Nadel in die richtige Position abgesenkt wird.
6. Senken Sie die Nadelspitze in die richtige Fokusebene und stellen Sie sicher, dass sie zusammen mit den Embryonen im Sichtfeld sichtbar ist.
   1. Mit der Mikromanipulatorsteuerung und Blick von oben (noch nicht durch die Okulare) lässt man die Nadelspitze langsam in das Öl fallen und zielt auf den Bereich, auf den das Objektiv zeigt. Da das Öl ziemlich viskos ist, gehen Sie langsam, um eine Beschädigung der Nadel zu vermeiden.
   2. Sobald die Nadel durch die Okulare sichtbar ist, fahren Sie mit den Mikromanipulatorsteuerungen fort, bis die Nadelspitze im Fokus und in der Mitte des Sichtfeldes ist.
   3. Indem Sie die Bühne bewegen, bringen Sie die Embryonen zurück in die Mitte des Sichtfeldes. Verwenden Sie die Bühnensteuerung, die Mikromanipulatorsteuerung und den Fokusknopf, um die Position des Embryos und der Nadelspitze relativ zueinander zu verfeinern, während beide im Fokus sind. Versuchen Sie, Injektionen so nah wie möglich am Deckglas durchzuführen.
7. Führen Sie eine Nadelqualitätskontrolle durch.
   1. Um sicherzustellen, dass die Nadel funktionsfähig ist, geben Sie einen Teil der Injektionslösung in das Halocarbon Oil 700 ab, das den Embryo umgibt und als Blase im Öl sichtbar ist.
   2. Wenn nichts aus der Nadel fließt, erhöhen Sie allmählich den Druck am Injektor. Wenn dies nicht funktioniert, besorgen Sie sich eine neue Nadel.
8. Injizieren Sie den Embryo.
   HINWEIS: Akzeptable Injektionsvolumina reichen von ~ 0,06-1 pL. Die untere Grenze wird durch das festgelegt, was beim Eintritt in den Embryo visualisiert werden kann. Die Obergrenze wird durch das Trauma festgelegt, das die Injektion auf den Embryo ausübt.
   1. Injizieren Sie entlang der lateralen Kanten des Embryos, da dies am wenigsten invasiv ist.
   2. Bewegen Sie den Embryo mit den Stufenkontrollen in Richtung der Nadelspitze, bis diese den Embryo sanft durchsticht und in ihn eindringt.
   3. Starten Sie gleichzeitig den Fluss der Injektionslösung und achten Sie auf das Auftreten einer vorübergehenden klaren Stelle an der Stelle der Nadelspitze, die auf einen erfolgreichen Transfer von Flüssigkeit in den Embryo hinweist.
   4. Überwachen Sie den Embryo. Wenn der Embryo der Nadel widersteht und beim Eintritt reißt (Zytoplasma spritzt heraus), kehren Sie zu Schritt 5 zurück und erhöhen Sie die Austrocknungszeit. Wenn der Embryo flach am Deckglas liegt und während der Injektion schlaff erscheint, kehren Sie zu Schritt 5 zurück und verkürzen Sie die Austrocknungszeit.
   5. Wenn kein Farbstoff in den Embryo gelangt ist, bestätigen Sie, dass der Farbstoff immer noch frei aus der Nadel fließen kann, wie in Schritt 6.7. Wenn der Farbstoff nicht fließt, ersetzen Sie die Nadel. Wenn der Farbstoff fließt, injizieren Sie einen neuen Embryo und beginnen Sie, den Farbstoff freizusetzen, kurz bevor die Nadel den Embryo durchsticht.
      HINWEIS: Wiederholte Injektionen desselben Embryos werden nicht empfohlen, da er die vorherige Wunde / Injektionsstelle reißt.
9. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Embryonen injiziert sind.

7. Bild Embryonen

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet ein konfokales Laserscanning-Mikroskop.

1. Legen Sie Deckglas in den Metallhalter auf dem konfokalen Mikroskop, so dass die Embryonen direkt von unten durch das Deckglas abgebildet werden; Über dem Deckglas befindet sich nur Öl und keine andere Barriere.
2. Als Qualitätskontrollschritt können Sie zuerst die Epifluoreszenzfunktion am konfokalen Mikroskop mit einem 40-fachen Objektiv aufnehmen. Stellen Sie sicher, dass das Fluorophor im Embryo sichtbar ist, bevor Sie fortfahren.
3. Wenn sich die gewünschte Bildgebungsebene von der Injektionsstelle unterscheidet, sollten Sie genügend Zeit einplanen, damit der Farbstoff in den Zielbereich diffundieren kann.
   HINWEIS: Für BOPIPY 493/503 liegt diese Zeit typischerweise zwischen 30 und 60 Minuten. Da die Diffusionszeit stark vom Farbstoff abhängt, können andere Farbstoffe eine Optimierung der Injektionsstelle und der Wartezeit erfordern.
4. Verwenden Sie verschiedene Objektive für die Bildgebung in verschiedenen Maßstäben. Verwenden Sie ein 40-faches Objektiv, um den gesamten Embryo abzubilden, und ein 63-faches Objektiv, um Unterabschnitte für kleinere Maßstäbe abzubilden.
5. Für die Live-Bildgebung während der Synzytialphasen vor der Zellularisierung verwenden Sie zunächst die folgenden Bedingungen: Bildgröße von 512 x 512 Pixeln, Zeilendurchschnitt von 3, Bildrate von 0,1 Bildern pro Sekunde (d. h. 1 Bild, das alle 10 s erfasst wird). Passen Sie die Bedingungen entsprechend den Fähigkeiten des verwendeten Mikroskops an.
   HINWEIS: Diese Bedingungen ermöglichen es, ~ 500 + Bilder von BOPIPY 493 / 503 zu erfassen und den größten Teil der Bewegung zu erfassen.

8. Analysieren Sie den LD-Fluss, indem Sie zuerst FIJI verwenden, um eine Zeitreihe von Bildern vorzubereiten, und dann Python für die PIV-Analyse

1. Optimieren Sie die Bildaufnahme.
   1. Führen Sie Injektionen des gewünschten Farbstoffs im entsprechenden Stadium durch. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die tägliche Variation vernachlässigbar ist.
   2. Optimieren Sie die Bildaufnahmeeinstellungen, einschließlich Vergrößerung, Zoom, Auflösung und Bildrate.
      HINWEIS: Es gibt einen Kompromiss zwischen qualitativ hochwertigen Bildern (Auflösung + Zeilenmittelung) und Aufnahmegeschwindigkeit (Bildrate).
2. Bereiten Sie Daten in FIDSCHI vor.
   1. Erfassen Sie eine qualitativ hochwertige Zeitreihe, die analysiert werden soll.
   2. Öffnen Sie einen Frame der Zeitreihe, um eine Maske mit FIJI zu generieren. Duplizieren Sie das Bild. Konvertieren Sie den Typ des Bildes in ein 8-Bit.
   3. Definieren Sie die Grenze des Embryos mit dem Polygon- oder Freihand-Auswahlwerkzeug. Verwenden Sie "Außen löschen", um Pixelwerte außerhalb der Auswahl auf 0 festzulegen. Deaktivieren und dann innerhalb der Auswahl umkehren, um den Wert der Pixel innerhalb der Auswahl auf den Maximalwert (255) festzulegen.
   4. Heben Sie die Auswahl auf, und verwenden Sie dann den Befehl Histogramm, um sicherzustellen, dass nur die Pixelwerte 0 und 255 vorhanden sind.
   5. Speichern Sie diese neue Bildmaske für die jeweilige Zeitreihe.
   6. Öffnen Sie die Zeitreihe von Interesse. Wählen Sie, welche zehn Bilder die interessierende Zeit am besten erfassen, z. B. Kernzyklus 9 zu Beginn der kortikalen Kontraktion. Duplizieren Sie die zehn interessanten Frames und bilden Sie einen Substack.
   7. Verwenden Sie die Funktion "Zu Bildern stapeln ", um 10 Bilder zu generieren, die mit PIV analysiert werden sollen.
   8. Speichern Sie die einzelnen Dateien so, dass ihre Reihenfolge erhalten bleibt (SeriesX_1, SeriesX_2, SeriesX_3 ...).
3. Verwenden Sie die vorbereitete Maske und einzelne Frames für die PIV-Analyse unter Verwendung des bereitgestellten Beispiel-Python-Skripts (Zusätzliche Daten) oder eines benutzerdefinierten Skripts, das vom Benutzer generiert wurde.
   HINWEIS: Das bereitgestellte Skript basiert auf der Python-Anwendung von OpenPIV¹⁷. Es gibt die Entfernung in Pixeln aus, die mit der Pixelbreite und der Bildrate konvertiert werden können, um Geschwindigkeiten oder Geschwindigkeiten zu erzeugen.
4. Generieren Sie Replikate, indem Sie die vorherigen Schritte für weitere Embryonen ausführen und die Ausgabewerte zusammenstellen.

Representative Results

Nach der Injektion wird der Farbstoff nur an der Stelle lokalisiert, an der die Nadelspitze eingeführt wurde. Der Farbstoff diffundiert dann in Abhängigkeit von seinen diffusiven Eigenschaften von der Injektionsstelle weg. Abbildung 1 zeigt die Injektion von BODIPY 493/503 kurz nach der Injektion (Panel A) und 24 Minuten später (Panel B). Nach 24 min hat es der Farbstoff ungefähr bis zur Mitte der langen Achse des Embryos geschafft.

Die Analyse der Organellenmotilität kann durch Farbstoffinjektionen und Zeitrafferbildgebung erreicht werden. In Abbildung 2 wurde ein Embryo mit BODIPY 493/503 (Abbildung 2A) und LysoTracker Red (Abbildung 2B) koinjiziert und mittels Laseranregung bei 488 bzw. 596 nm abgebildet. Dieser Embryo wurde dann im Zeitraffer abgebildet (ein Bild alle 30 s für 30 min, 5 min analysiert). Die Zeitreihe wurde dann durch die PIV-Analyse geführt, deren Ausgabe über Stromlinien in Abbildung 2A,B dargestellt ist. Beachten Sie, dass die Stromlinien nicht die Flugbahn einzelner Partikel darstellen, sondern dass der zytoplasmatische Fluss aus der Analyse aller Partikel in diesem Bereich des Zytoplasmas abgeleitet wird. Durch die Markierung von zwei unabhängigen zellulären Strukturen (LDs und saure Organellen) findet die PIV-Analyse ähnliche Strömungen, wobei beide Markierungen in der zentralen Region des Embryos konvergieren, wo das Zytoplasma in das Innere des Embryos fließt⁶.

Derzeit verfügbare FPs erlauben die Markierung vieler anderer Organellen und zellulärer Strukturen. Abbildung 3 zeigt die Beschriftung der Notaufnahme über den ER-Tracker Green. Der ER-Tracker bietet eine schöne Auflösung der Kernhülle und ermöglicht die Visualisierung wichtiger Zellzyklusstufen. ER-Tracker Green wird mit 488-nm-Anregung abgebildet.

Die Kennzeichnung der Mitochondrien ist schwierig, da die meisten getesteten Farbstoffe im ersten Mitochondrien, in das sie gelangen, gefangen zu sein scheinen. Auf der anderen Seite wurden keine Anzeichen von Farbstofftoxizität festgestellt, was es ermöglichte, markierte Mitochondrien durch Zellularisierung und den ektodermalen Kernzyklus 15 zu verfolgen. Abbildung 4 zeigt eine ektodermale Zelle mehrere Stunden nach der Injektion mit Mitoview 633 (Anregungswellenlänge 633 nm).

BODIPY, Lysotracker und LipidSpot sind robust und können verwendet werden, um ~ 500 + -Bilder bei 512 x 512, Liniendurchschnitt 3, Bildraten von 1 / s bis 0,1 / s zu erfassen. ER-Tracker Green, SiR-Tubulin und die genannten mitochondrialen Farbstoffe sind weniger robust und liefern ~ 50-200 Bilder unter den gleichen Bedingungen.

Ausgehend von Blastotermischen bewegen sich LDs bidirektional entlang von Mikrotubuli, angetrieben von den Gegenpolaritätsmotoren Kinesin-1 und zytoplasmatisches Dynein⁵. Diese Bewegung kann durch Co-Labeling von LDs und Mikrotubuli durch Injektion von BODIPY 493/503 und SiR-Tubulin visualisiert werden (Abbildung 5). Da LDs häufig ihre Bewegungsrichtung umkehren (da sie zwischen Kinesin-1 und zytoplasmatischem Dynein wechseln), erfassen höhere Bildraten während der Erfassung besser kritische Details der LD-Motilität.

Die Live-Bildgebung von autofluoreszierenden Dottervesikeln ist ohne jegliche Form der Farbstoffinjektion möglich (Abbildung 6). Die Autofluoreszenz ist jedoch schwach und der Anregungslaser ist phototoxisch. Daher hat die Live-Bildgebung von autofluoreszierendem Eigelb ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zur Farbstoffinjektion.

Abbildung 1: Diffusion von BODIPY 493/503 durch den Embryo. Der Farbstoff wurde entlang der lateralen Kante zum vorderen Ende (oben rechts) injiziert und diffundiert von dieser Injektionsstelle in den Embryo, wobei LDs markiert werden. (A) Der Farbstoff ist durch Teile des Embryos diffusiert, die an die Injektionsstelle angrenzen. (B) Etwa 24 min/2 Kernzyklen später hat sich der Farbstoff über den Mittelpunkt des Embryos hinaus verbreitet. Maßstabsstab: 100 μm. Alle 30 s wurde ein 1024 x 1024 Rahmen (Liniendurchschnitt 4) erworben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Partikelbild-Velocimetrie (PIV) für LDs und saure Organellen. Einem Embryo wurde sowohl BODIPY 493/503 als auch LysoTracker Red injiziert. (A) BODIPY-Kanal. (B) LysoTracker Roter Kanal. (A',B') Optimieren Sie Diagramme, die durch PIV-Analyse der beiden Kanäle generiert werden, die aus 10 sequenziellen Frames generiert wurden, einschließlich der in A und B gezeigten. A' entspricht dem Fluss von LDs, und B' entspricht dem Fluss saurer Organellen. Beachten Sie, dass sowohl A 'als auch B ' einen Zusammenfluss links von der Mitte zeigen, bei dem embryonaler Inhalt aus der Sichtebene in die Mitte des Embryos fließt. Beachten Sie auch, dass BODIPY mehr diffundiert hat als LysoTracker, da verschiedene Farbstoffe unterschiedliche diffusive Eigenschaften haben. Maßstabsstab: 100 μm. Alle 30 s wurde ein 1024 x 1024 Rahmen (Liniendurchschnitt 4) erworben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: ER-Tracker kennzeichnen synzytiale nukleare Divisionen. Ein synzytialer Blastoderm-Embryo wurde mit ER-Tracker mikroinjiziert und ein Teil seiner Oberfläche wurde im Laufe der Zeit abgebildet. (A) Spindelmontage während einer nuklearen Division. b) Spaltung der Kernhülle während derselben Division. (C) Nachfolgende Interphase. (D) Der Beginn der nächsten Teilung wird durch das Auftreten von Zentrosomen (Auftreten von kreisförmigen ER-freien Regionen, gekennzeichnet durch Pfeilspitzen) angezeigt. Beachten Sie die allmähliche Farbstoffbleiche. Anregungswellenlänge: 488 nm Maßstabsstab: 5 μm. A: Ausgangsrahmen, B: 3 min verstrichen, C: 10 min verstrichen, D: 13 min verstrichen. Alle 30 s wurde ein 1024 x 1024 Rahmen (Liniendurchschnitt 4) erworben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Mitoview 633-Kennzeichnung von Mitochondrien. Ein Embryo wurde mit Mitoview 633 während des Synzytialblastodermstadiums injiziert und 4 h später, nach der Zellularisierung, aufgenommen. Das Bild zeigt eine neuroektodermale Zelle eines Embryos in Keimbandverlängerung. Maßstabsstab: 5 μm. Alle 30 s wurde ein 1024 x 1024 Rahmen (Liniendurchschnitt 4) erworben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Co-Labeling von LDs und Mikrotubuli. Einem zellularisierenden Embryo wurde eine Mischung aus BODIPY 493/503 (gelb A,B,C) und SiR-Tubulin (Magenta A',B',C') injiziert. A'', B'', C'' zeigen die zusammengeführten Kanäle. Die Felder A, A' und A'' zeigen den Anfangsrahmen, die Felder B, B' und B'' zeigen den Rahmen nach 5 s und die Felder C, C' und C' ' zeigen den Rahmen nach 10 s. Maßstabsstab: 5 μm. Alle 2,5 s wurde ein 512 x 512 Rahmen (Liniendurchschnitt 3) erworben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Abbildung der Autofluoreszenz von Dottervesikeln während synzytieller Spaltungsstadien. (A) Zu Beginn des Erwerbs. (B) Nach 8 min. (C) Nach 16 min. Anregungswellenlänge: 405 nm. Eine geringe Erregungsintensität wurde verwendet, um den Embryo am Leben zu erhalten. Maßstabsstab: 100 μm. Alle 30 s wurde ein 1024 x 1024 Rahmen (Liniendurchschnitt 4) erworben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Der Drosophila-Embryo ist ein leistungsfähiges und bequemes Modell, um grundlegende Fragen der Zell- und Organismenbiologie zu untersuchen. Seine relative Einfachheit, leistungsfähige Genetik und geringe Größe machen es zu einem ausgezeichneten System zur Abbildung sowohl zellulärer Prozesse als auch Entwicklung. Hier wird ein Standard-Mikroinjektionsprotokoll angepasst, um die FP-Anwendung in Embryonen zu ermöglichen. Dieser Ansatz ermöglicht die fluoreszierende Bildgebung spezifischer zellulärer Strukturen, ohne dass genetisch kodierte Fluorophore erforderlich sind, wodurch viele genetische Hintergründe für die Bildgebung geöffnet werden. Die Kombination mehrerer Farbstoffe und strategisch ausgewählter, fluoreszierend markierter Proteine kann mehrkanalige Live-Bildgebung eröffnen, die das gesamte Spektrum des sichtbaren Lichts abdeckt.

Kritische Schritte im Protokoll:
Dieses Protokoll verwendet BODIPY 493/503 zur Kennzeichnung von LDs. Dieser Ansatz kann leicht angepasst werden, um andere zelluläre Strukturen zu markieren. Für die anschließende Bildanalyse ist einer der wichtigsten Faktoren das Signal-Rausch-Verhältnis, also die Helligkeit des Farbstoffs im Vergleich zum Hintergrundsignal. Lysosomen wurden erfolgreich abgebildet (LysoTracker Red, 1 mM), ebenso wie Mitochondrien (Mitoview 633, 200 μM), der ER (ER Tracker Green, 10 μM) und Mikrotubuli (SiR-Tubulin, 200 nM in DMSO), wie in Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 , Abbildung 5 gezeigt. Darüber hinaus sind Eigelbvesikel autofluoreszierend und geben bei UV-Anregung blaues Licht ab (Bild mit 405 nm als Anregungswellenlänge (Abbildung 6)). Für andere Farbstoffe sollten Sie die Farbstoffkonzentration auf das 100-1.000-fache dessen erhöhen, was für die Färbung kultivierter Zellen erforderlich wäre; Dies ist vergleichbar mit der Konzentration einer Stammlösung, die zu Zellkulturmedien verdünnt würde. Da dieses Protokoll eine Injektion von 100 fL vorsieht und der Drosophila-Embryo in Band¹⁸ etwa 9 nL beträgt, werden diese Farbstoffkonzentrationen auf eine interne embryonale Konzentration von unter 1/100 von dem, was in den Zellkulturmedien vorhanden ist, gemittelt. Vorübergehend wird die lokale Konzentration an der Injektionsstelle höher sein, was am relevantesten für FPs ist, die nicht gut diffundieren (d. h. mitochondriale Farbstoffe und SiR-Tubulin). Beginnen Sie für diese FPs mit den empfohlenen hohen Konzentrationen. Wenn ein unerwarteter Tod beobachtet wird, verwässern Sie nacheinander das Zweifache, bis ein akzeptabler Kompromiss zwischen Überleben und Signalstärke erreicht ist.

Bei der gemeinsamen Injektion mehrerer Farbstoffe sollten sich beide Farbstoffe entweder im selben Lösungsmittel befinden oder sowohl die Lösungsmittel als auch die Farbstoffe sollten mit der Mischung kompatibel sein (Alkoholkonzentrationen von mehr als ~ 10% werden nicht empfohlen).

Die Qualität der Nadeln ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens, da die Spitze so fein wie möglich sein muss. Andernfalls können Schäden durch die Injektionswunde die spätere Entwicklung des Embryos beeinträchtigen. Da sich handelsübliche Nadelzieher unterscheiden, ist es wichtig, den Vorschlägen des Herstellers zu folgen und mehrere Zugparameter auszuprobieren, bis die gewünschte Form erreicht ist. Es ist wichtig, den Qualitätskontrollschritt 1.1.3 durchzuführen, da die Arbeit mit einer rissigen, gezackten oder großen Nadelspitze die erfolgreiche Injektion erschwert oder sogar unmöglich macht.

Der Embryo muss teilweise ausgetrocknet werden, damit während der Injektion zusätzliche Flüssigkeitsvolumina hinzugefügt werden können. Wenn der Embryo untergetrocknet ist, dringt die Nadel nicht leicht ein, und Zytoplasma spritzt heraus, wenn die Nadel eindringt oder wenn die Lösung injiziert wird. Wenn der Embryo übermäßig ausgetrocknet ist, sieht er entleert aus und entwickelt sich nicht richtig. Die genaue Trocknungszeit hängt von den örtlichen Gegebenheiten, z.B. der Luftfeuchtigkeit, ab und kann sich von Tag zu Tag ändern. Sie muss für jede Sitzung empirisch ermittelt werden.

Die Überlebensfähigkeit des Embryos nach der Mikroinjektion hängt entscheidend von der Qualität der Nadel, der richtigen Austrocknung und der Begrenzung des Injektionsvolumens auf weniger als 1 pL (idealerweise 100 fL) ab. Solange diese Parameter optimiert sind, ist keine signifikante Toxizität erkennbar, wenn die beschriebenen Farbstoffe in den empfohlenen Konzentrationen injiziert werden. Wenn Embryonen die Austrocknungs- und Injektionsschritte überleben, entwickeln sie sich typischerweise erfolgreich zu einer Keimbanderweiterung, mit Ausnahme der Mikrotubuli- und ER-Sonden, die Zellularisierungsdefekte in hohen Konzentrationen verursachten (100 fL Injektion der Stammkonzentration von jedem). Die Tests ergaben keine offensichtlichen Entwicklungsfehler, wenn DMSO, Wasser und Mischungen der beiden in den empfohlenen Volumina injiziert wurden, mit einer Überlebensrate des Embryos durch Keimbandausdehnung von ~ 75% oder mehr. Injektionsvolumina von mehr als 1 ml verursachten Defekte und Embryonen, denen ~ 4 ml Volumina injiziert wurden, die für weniger als 1 Stunde entwickelt wurden. Daher müssen die Injektionsvolumina niedrig gehalten werden, was bedeutet, dass die Farbstoffkonzentrationen hoch sein müssen.

Im Allgemeinen werden Injektionen entlang des seitlichen Randes des Embryos empfohlen, da diese zu den geringsten Schäden führen. Die Injektionsstelle muss jedoch möglicherweise in Abhängigkeit von den diffusiven Eigenschaften der eingesetzten FPs angepasst werden. BODIPY 493/503 und LysoTracker diffundieren schneller über den gesamten Embryo als Lipid Spot 610 (ein weiterer Farbstoff zur Markierung von LDs), während SiR-Tubulin und Mitoview 633 nie vollständig über den Embryo diffundieren (Bildgebung bis zu 7 h nach der Injektion). Daher kann eine Injektion in oder in der Nähe der interessierenden Stelle erforderlich sein. Bei der Injektion in den vorderen oder hinteren Bereich wird eine besonders feine Nadel empfohlen.

Die Bildaufnahme stützt sich auf konfokale Mikroskopie, um kleine Organellen und alle Zytoskelettkomponenten optisch zu schneiden und aufzulösen. Techniken, die die Analyse vieler Bilder erfordern (z. B. STORM oder PALM), funktionieren nicht, da der embryonale Inhalt in Bewegung ist und die Fluorophore nicht für das Photoswitching optimiert sind. Der Epifluoreszenzmikroskopie fehlt die laterale und axiale Auflösung, um die meisten Organellen und kleineren zellulären Strukturen zu erkennen. Aus diesen Gründen wird dringend empfohlen, ein konfokales Mikroskop zu verwenden oder die Lichtblatttechnologie zu verwenden.

Die Reproduzierbarkeit der Bildanalyse hängt stark von konsistenten Bilddaten ab. Für die größten Erfolgsaussichten ist eine Optimierung der Injektionstechnik und Bildaufnahme erforderlich. Durch die Etablierung und Anwendung einer Technik, bei der die interessierenden Farbstoffe, die Injektionsstelle, das Alter des Embryos, das Injektionsvolumen und der Aufnahmeaufbau konsistent sind, werden die robustesten Daten für die Bildanalyse generiert.

Modifikationen und Fehlerbehebung der Methode
Dieses Protokoll demonstriert eine Methode zur Analyse des Massenflusses von LDs in Embryonen im Spaltstadium unter Verwendung der Partikelbild-Velocimetrie. Der gleiche Ansatz kann für andere Organellen, andere Entwicklungsstadien und andere Analysemethoden verwendet werden. Zum Beispiel zeigt Abbildung 2 eine Analyse von LDs und sauren Organellen, die in den synzytialen Stadien der Embryogenese fließen, sichtbar durch gemeinsame Injektion von BODIPY 493/503 und LysoTracker Red. Eine weitere erfolgreiche Bildgebung der LD-Bewegung in Embryonen bis zu 7 h nach der Befruchtung wurde erreicht; Diese Embryonen behalten die Injektionswunde, können sich aber mehrere Stunden entwickeln.

Daten, die mit diesem Protokoll gesammelt wurden, wurden für die Velocimetrie von Partikelbildern verwendet, aber viele andere Analysetechniken sind verfügbar. Zum Beispiel können Partikelverfolgungsprogramme, wie sie in ImageJ, Imaris oder manueller Verfolgung zu finden sind, verwendet werden, um Geschwindigkeiten und Richtungsabhängigkeiten von sich bewegenden Strukturen zu erhalten. Beachten Sie, dass die meisten solcher Tracking-Software für die Arbeit mit Daten aus planaren Zellkultursystemen entwickelt wurden und sich nicht immer gut an 3D-Strukturen wie den Drosophila-Embryo anpassen. Darüber hinaus müssten für die Erzeugung von Partikelverfolgungsdaten von bester Qualität mehrere Z-Ebenen abgebildet werden. Dies sollte machbar sein, wenn die Bilderfassungszeiten unter ~2 s liegen. Dieser Benchmark sollte auf konfokalen Konfokalsystemen mit rotierenden Scheiben, Gitterlichtplatten und neueren konfokalen Laserscanning-Systemen erreichbar sein. Die Machbarkeit der Partikelverfolgung für reichlich vorhandene Organellen wie LDs, Mitochondrien und Lysosomen ist jedoch gering, da die Menge an positivem Signal in einem Sichtfeld für die derzeitigen Tracking-Methoden zu hoch ist. Die Verfolgung von weniger häufigen Strukturen wie Kernen oder Dottervesikeln kann möglich sein. PIV für die Strömungsanalyse funktioniert gut für LDs und saure Organellen in Spaltungsstadien, da sich beide Organellen frei bewegen. Organellen wie Kerne, ER und Mitochondrien sind an andere zelluläre Strukturen gebunden und bewegen sich daher nicht frei und eignen sich nicht für Softwareanalysen, die freie Bewegung voraussetzen. Der Ermittler sollte die Techniken auswählen, die für die interessierende Organelle am besten geeignet sind.

Während der synzytialen und zellulären Blastoderm-Stadien bewegen sich LDs (sowie einige andere Organellen) entlang radial orientierter Mikrotubuli⁵. Es ist daher möglich, Querschnittsansichten (wie in Abbildung 5) zu finden, in denen einzelne Mikrotubuli über große Entfernungen im Fokus stehen, was eine Partikelverfolgung in 2D ermöglicht. Da sich diese optischen Ebenen tief im Inneren des Embryos befinden, wird die Gesamtsignalstärke verringert und das Signal-Rausch-Verhältnis reduziert.

Für die Tracking-Analyse kann eine möglichst schnelle Bildgebung entscheidende Details der Bewegung und damit der beweglichen Maschinerie aufdecken. Zum Beispiel ist die Lipid-Tröpfchen-Bewegung eine Mischung aus zwei beweglichen Zuständen, Zeitlupe (~ 200 nm / s; durchschnittliche Verfahrstrecke ~ 100 nm) und schnelle lange Bewegung (~ 450 nm / s; durchschnittliche Reiseentfernung ~ 1.000 nm)¹⁹; Wenn also Bilder jede Sekunde oder sogar seltener aufgenommen werden, wird der langsam-kurze Zustand nicht mehr erkennbar. Häufige Bildgebung induziert jedoch auch Fluorophorbleiche und Phototoxizität. Die bildgebenden Bedingungen müssen daher in Abhängigkeit von der genauen Fragestellung, die behandelt werden soll, angepasst werden.

Einschränkungen der Methode
Je nach gewünschtem Farbstoff kann das Verfahren durch die Verträglichkeit zwischen der Farbstofflöslichkeit und der Toxizität der Injektionslösung eingeschränkt werden. Alkohole wie Isopropanol und Ethanol sind aufgrund ihrer niedrigeren Viskosität in einer Nadel schwer zu handhaben und scheinen zelluläre Komponenten zu schädigen und den Embryo abzutöten.

Die Methode ist auch nicht gut geeignet, um die frühesten Schritte in der Embryogenese zu visualisieren, da es 30+ Minuten dauert, um die Embryonen für die Injektion vorzubereiten. Bei Raumtemperatur sind die anfänglichen Zellzyklen des Embryos jeweils nur ~ 10 Minuten lang; Selbst wenn man also in Schritt 5.2.3 ein neu befruchtetes Ei kommissionieren würde, wären die ersten Zellzyklen bereits abgeschlossen, wenn der Embryo für die Bildgebung bereit ist.

Die Beleuchtung mit Licht im UV/Blau-Bereich ist deutlich phototoxischer als bei längeren Wellenlängen. Unter solchen Bedingungen (z. B. nach autofluoreszierenden Dottervesikeln; Abbildung 6) muss man die Bildgebungszeit begrenzen (was zu kürzeren Zeitreihen führt) oder eine geringere Laserleistung verwenden (was zu einem reduzierten Signal-Rausch-Verhältnis führt).

Nach der Zellularisierung neigen Farbstoffe, die an einer bestimmten Stelle injiziert werden, dazu, schlecht zu diffundieren, da sie viele Zellmembranen durchqueren müssen. Dies schränkt den Beobachtungsbereich in späteren Entwicklungsstadien ein.

Die Bedeutung der Methode im Vergleich zu bestehenden/alternativen Methoden
Die Bewegung von LDs und anderen lipidhaltigen Organellen in frühen Embryonen kann mit genetisch kodierten Fluorophoren, markierungsfreien Techniken und durch die Einführung von FPs visualisiert werden. Letzteres kann durch Permeabilisierung der Vitellinmembran¹² oder den hier diskutierten Mikroinjektionsansatz erreicht werden.

Genetisch kodierte Fluorophore sind vielseitige Marker, deren Konzentrationen typischerweise von Embryo zu Embryo hochgradig reproduzierbar sind. Sie haben jedoch geringere Quantenausbeuten und bleichen leichter als FPs. Typischerweise sind sie nur in einer oder zwei getaggten Versionen (z. B. GFP oder mCherry) verfügbar, was die Auswahl einschränkt, welche Strukturen gleichzeitig abgebildet werden können. FPs hingegen existieren oft in einer großen Vielfalt; So stehen beispielsweise verschiedene lipidtröpfchenspezifische Farbstoffe mit Emissionsspektren von Autodot im UV/Blau-Spektrum bis hin zu Lipidtox und LipidSpot 610 im Fernrotspektrum zur Verfügung. FPs können auch direkt auf jeden interessierenden Stamm angewendet werden und erfordern daher keine Dehnungskonstruktion, um beispielsweise den gewünschten Organellenmarker in einen mutierten Stamm von Interesse einzuführen. Dieser Vorteil ist besonders ausgeprägt, wenn mehrere Strukturen gleichzeitig beschriftet werden sollen; Statt zeitaufwändiger Kreuzungen über mehrere Generationen hinweg, kann dies an einem einzigen Tag erreicht werden, indem die relevanten Farbstoffe gemischt und gleichzeitig eingeführt werden. Schließlich, wenn zelluläre Prozesse mit pharmakologischer Hemmung untersucht werden sollen, können Medikamente und Farbstoffe zusammen eingeführt werden.

Markierungsfreie Methoden sind sehr leistungsfähige Ansätze zum Nachweis spezifischer zellulärer Strukturen. Zum Beispiel können LDs in frühen Embryonen spezifisch durch Mikroskopie der dritten harmonischen Generation²⁰ oder durch Femtosekunden-stimulierte Raman-Verlust-Mikroskopie²¹ nachgewiesen werden. Wie FPs können diese Ansätze in jedem genetischen Hintergrund angewendet werden, und da sie kein Bleichen verursachen, ermöglichen sie möglicherweise eine schnellere Bildaufnahme. Sie sind jedoch typischerweise auf bestimmte Organellen beschränkt und unterstützen daher nicht allein die Multiplex-Bildgebung; Sie erfordern auch spezielle Mikroskope.

Es gibt zwei allgemeine Strategien, um kleine Moleküle in Embryonen einzuführen. Einer ist der hier verwendete Mikroinjektionsansatz; Die andere ist eine chemische (Terpen-) Behandlung zur Permeabilisierung der Vitellinmembran. Der letztgenannte Ansatz¹² ist weniger involviert als die Mikroinjektion, aber auch variabler von Embryo zu Embryo. Darüber hinaus ist nach der Permeabilisierung der Schutz durch die Vitellinmembran beeinträchtigt und der eigentliche Embryo ist für das externe Medium zugänglich, was es schwieriger macht, ihn am Leben zu erhalten. Es ist viel weniger wahrscheinlich, dass die Mikroinjektion die Embryonalentwicklung entgleisen lässt als die Permeabilisierung. Eine Permeabilisierung wird jedoch empfohlen, wenn viele Embryonen gleichzeitig überwacht werden müssen, z. B. für Drogenscreening-Zwecke. Um die Bewegung zellulärer Strukturen zu verfolgen und reproduzierbare Bildserien zu erhalten, die für die Bildanalyse geeignet sind, ist die Mikroinjektion die Methode der Wahl.

Bedeutung und Anwendungsmöglichkeiten der Methode in spezifischen Forschungsbereichen
Der Drosophila-Embryo ist ein wichtiges Modellsystem zur Untersuchung vieler zellbiologischer und entwicklungsbedingter Prozesse ^1,5,6. Die Markierung von Organellen mit fluoreszierenden Proteinen hat wichtige Beiträge zum Verständnis geleistet, wie sich der frühe Embryo entwickelt, wie verschiedene Organellen verkehren und wie ein solcher Handel entwicklungs- und genetisch moduliert wird. Ihre Neigung zur Bleichung und die Herausforderungen bei der Erzeugung von Stämmen, bei denen mehrere Organellen mit unterschiedlichen Farben gekennzeichnet sind, schränken jedoch die Anwendung dieses Ansatzes ein. Der Einsatz von FPs, die durch Mikroinjektion eingeführt werden, löst viele dieser Herausforderungen und kann sogar mit fluoreszierend markierten Proteinen kombiniert werden. Diese Technik ermöglicht die Abbildung mehrerer Organellen, Zellstrukturen und Zytoskelettkomponenten in jedem genetischen Hintergrund. Dadurch können mehrere Genotypen mittels Live-Imaging verglichen werden, so dass die Wirkung von Mutationen auf den Handel mit multiplen Organellen bestimmt werden kann.

Dieses Protokoll demonstriert den FP-Injektionsansatz für Embryonen von Drosophila melanogaster, aber im Prinzip gilt dieser Ansatz für alle Insekteneier, für die Mikroinjektionstechniken etabliert wurden, einschließlich anderer Arten von Drosophila, Grillen²² und Blattläusen²³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	Stains lipid droplets in violet/blue
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	Stains lipid droplets in green
Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite	W.A. Hammond Drierite Company	21001
Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base	Zeiss	4350030000000000
Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape	Scotch (3M)	-	Sold by many vendors
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	Stains the ER/nuclear envelope
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	Ready to use
Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in	World Precision Instruments	TW100F-4	Must be pulled
Glass coverslip	-	-	Buy the appropriate refractive index for your objective lens
Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned	FisherBrand	12-550-343
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
Heptane greener alternative anhydrous, 99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	Heptane is considered toxic by the USA's OSHA
Confocal microscope	Leica	Sp5	Many different types of confocal microscopes will work.
LipidSpot 610	Biotium	#70069	Stains lipid droplets in far red
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	Stains lysosomes in red
MitoView 633	Biotium	#70055	Stains mitochondria
Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, Next Generation Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.
SiR-Tubulin	Cytosketon Inc	CY-SC014	Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	Stains microtubules in violet/blue