Summary
Overvåking av intrakranielt trykk i gnagermodeller av ikke-traumatisk intraventrikulær blødning er ikke vanlig i dagens litteratur. Her demonstrerer vi en teknikk for måling av intrakranielt trykk, gjennomsnittlig arterielt trykk og cerebralt perfusjonstrykk under intraventrikulær blødning i en rottedyrmodell.
Abstract
Overlevende av intraventrikulær blødning er ofte igjen med betydelig langsiktig hukommelsessvikt; Dermed er forskning ved bruk av intraventrikulære blødningsdyrmodeller avgjørende. I denne studien søkte vi etter måter å måle intrakranielt trykk, gjennomsnittlig arterielt trykk og cerebralt perfusjonstrykk under ikke-traumatisk intraventrikulær blødning hos rotter. Det eksperimentelle designet inkluderte tre Sprague Dawley-grupper: humbug, standard 200 μl intraventrikulær blødning og kjøretøykontrollgrupper. Ved å introdusere en intraparenkymal fiberoptisk trykksensor ble det oppnådd nøyaktige intrakranielle trykkmålinger i alle grupper. Cerebralt perfusjonstrykk ble beregnet med kunnskap om intrakranielt trykk og gjennomsnittlige arterielle trykkverdier. Som forventet opplevde begge gruppene med intraventrikulær blødning og kjøretøykontroll en økning i intrakranielt trykk og påfølgende nedgang i cerebralt perfusjonstrykk under henholdsvis intraventrikulær injeksjon av autologt blod og kunstig cerebrospinalvæske. Tilsetningen av en intraparenkymal fiberoptisk trykksensor er gunstig for å overvåke presise intrakranielle trykkendringer.
Introduction
Intraventrikulær blødning (IVH), en type intrakraniell blødning (ICH), er en ødeleggende sykdom som bærer betydelig dødelighet og sykelighet. IVH er karakterisert som akkumulering av blodprodukter inne i intrakranielle ventrikler. Isolert IVH i mindre vanlige og forekommer vanligvis hos voksne1. Det kan være forbundet med hypertensiv blødning, sprukket intrakraniell aneurisme eller annen vaskulær misdannelse, svulster eller traumer1. IVH fører til sekundær hjerneskade samt utvikling av hydrocephalus2. Overlevende av IVH sitter ofte igjen med betydelige funksjonelle, minne og kognitive funksjonsnedsettelser etter skaden. Disse langsiktige kognitive og minneunderskuddene rapporteres hos så høyt som 44% av overlevende av ICH3. I subaraknoidalblødning (SAH), en annen type ICH, er det velkjent at omtrent halvparten av de overlevende vil ha minneunderskudd, og for de som har IVH i tillegg til SAH, har resultatene en tendens til å være betydelig verre 4,5,6.
Underliggende mekanismer for hukommelsesdysfunksjon etter IVH gjenstår å bli belyst. In vivo forskning ved bruk av ikke-traumatiske IVH-dyremodeller med funksjonell og minnedysfunksjon er viktig for å oppdage potensielle terapeutiske mål for slike pasienter. Dyremodeller med mer alvorlig hukommelse og funksjonell dysfunksjon etter IVH ville være best å studere disse endringene. Seniorforfatterens laboratorium har også undersøkt spesifikt rollen som høyt intrakranielt trykk (ICP) i utviklingen av minneunderskudd i IVH-rottemodeller. Derfor var metoder for å nøyaktig måle ICP under IVH viktig å undersøke. Her rapporterer vi om metoder for nøyaktig måling av ICP i en IVH rottemodell. Selv om ICP-overvåking tidligere har vært brukt i traumatiske ICH så vel som subaraknoidale blødningsdyrmodeller, er ICP-overvåking i spontane IVH-gnagermodeller ikke så vanlig rapportert i litteraturen 7,8. Derfor inkluderte det eksperimentelle designet som ble presentert her tre grupper av Sprague Dawley-rotter: humbug, standard 200 μl intraventrikulær blødning og kjøretøykontroll. For IVH-gruppen ble det brukt en autolog intraventrikulær blodinjeksjonsmodell. For kjøretøykontrolldyr ble intraventrikulær injeksjon av steril Lactated Ringers løsning brukt. ICP, gjennomsnittlig arterielt trykk (MAPs) og cerebralt perfusjonstrykk (CPP) ble registrert intraoperativt, og resultatene rapporteres her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forskningsmetoder og dyrepleie / vedlikehold ble utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjene ved University of California, Davis. Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California, Davis, godkjente alle dyrebruksprotokoller og eksperimentelle prosedyrer (IACUC-protokoll #21874).
1. Dyr boliger
- Få Sprague-Dawley rotter i alderen 8-10 måneder gammel. Før en eksperimentell prosedyre, hus rottene i et vivarium og la minst 1 uke for generell tilpasning i burene etter en 12-timers lys / mørk syklus med mat og vann ad libitum.
2. Anestesi og preoperative prosedyrer
- Bedøv rotta med 4% isofluran i 4 min. Heng rotten ved tennene i en liggende stilling på en intubasjonsplattform, og intuber endotrakealt ved hjelp av en endotrakeal kanyle og laryngoskop.
- Plasser den bedøvede og intuberte rotten på en ventilator (2 % isofluran og O2/N2 bærergass). Rotta er tilstrekkelig bedøvet dersom ingen respons på en smertefull stimulus som en bakbensklemme observeres.
- Sett inn et rektalt termometer for kontinuerlig å overvåke temperaturen.
- Utfør alle operative prosedyrer ved hjelp av steril teknikk. Klipp håret på hodet og lårbenet og prep huden med tre vekslende skrubber av Betadin og 70% alkohol før operasjonen.
- Aspirer eventuelle akkumulerte respirasjonssekreter ved midlertidig å fjerne rotten fra ventilatoren og aspirere sekretene med PE-50-rør koblet til en 10 ml sprøyte.
- Beskytt rottens øyne med steril kunstig tårer øyesalve.
- Injiser lokal bupivakain (~0,1 ml 0,25 % oppløsning) i hud og subkutant vev før snittet i hodebunnen.
3. Kirurgi protokoll
- Plassering av intraventrikulær nål og intrakranielt trykk (ICP) monitor
- Plasser rotta i en utsatt stilling i en stereotaktisk ramme og ørestang rotta.
- Lag et 1,5 cm skalpinnsnitt langs midtlinjen med en skalpell med 15 blad.
- Påfør mildt trykk med gasbind for hemostase.
- Bruk en steril bomullsspissapplikator til å skille periosteum fra skallen til bregma-landemerket er synlig.
- Finn og ut bregma ved hjelp av stereotaxis og plasseringen av to bilaterale burrhull, 1,4 mm laterale og 0,9 mm bakre til bregma.
- Bruk en håndholdt drill til å lage disse to små (opptil 2 mm) kraniale burrhullene i høyre og venstre halvkule. Skyll ut overflødig beinflis med steril Lactated Ringer-løsning.
- I høyre halvkule plasserer du en 22-G føringskanyle på burrhullets nivå for å sette 28-G-nålen gjennom kanylen til dybden av høyre laterale ventrikel (4,6 mm i forhold til bregma) for å skape IVH.
- Koble den fiberoptiske trykksensoren til avlesningsenheten. Slå på avlesningsenheten og sørg for at de valgte enhetene er i mmHg. Klargjør deretter sensoren ved å senke spissen ned i et lite beger med Lactated Ringers løsning til utlesingsenheten leser ut null. Når den er nullstilt i Lactated Ringers-løsningen, er den klar til å settes inn.
- I venstre halvkule setter du trykksensoren forsiktig til 2-3 mm dybde inn i cortex for sanntids ICP-overvåking.
- Kanylering av lårarterien og innsetting av gjennomsnittlig arterielt trykk (MAP) monitor
- Etter innsetting av ICP-skjermen, vri den nedre stammen av rotten for enkel tilgang til venstre lår og lyskeområde.
- Etter steril forberedelse og lokal bupivakainadministrasjon, gjør et 1,5 cm hudinnsnitt over bakbenet med en 15-blads skalpell.
- Disseker ut venstre lårarterie først overfladisk med en hemostat og deretter dypere lag ved hjelp av tang med fine tips under et mikroskop. Identifiser den dype blå lårbenet for å finne den tilstøtende arterien.
- Bind av den distale lårarterien med 3-0 silkesutur og legg en midlertidig metallklips på den proksimale delen av lårarterien.
- Ha en ekstra fiberoptisk trykksensor koblet til utlesingsenheten som allerede er primet. Sett trykksensoren inn i polyetylenslangen (PE-50), som settes inn i en Tuohy Borst som deretter lukkes. Koble Tuohy Borst til en 3-veis stoppekran koblet til en 1 ml sprøyte i den ene enden og en 22-G nål med PE-50-rør i den andre enden.
- Under mikroskopet, lag en 2 mm femoral arteriotomi med mikrosaks og kanyler den med PE-50-rør koblet til resten av oppsettet.
- Intraventrikulær injeksjon
- Aspirer 500 μL blod ved hjelp av en 1 ml sprøyte og vri 3-veis stoppekranen for å få trykksensoren til å lese MAP.
- Klargjør 28-G intraventrikulær nål koblet til PE-50-slangen med aspirert blod for IVH-dyr og Lactated Ringer's for kjøretøykontrolldyrene. Sett deretter denne nålen inn i føringskanylen til dybden av høyre laterale ventrikel.
- Bruk 100 μL/min hastighet til å injisere blodet eller den sterile ringer-laktatoppløsningen (200 μL) i høyre sideventrikkel ved å pumpe 1 ml sprøyten med tommelen. Før dette og under intraventrikulær injeksjon, overvåke og registrere ICP, arterielt blodtrykk og rektal temperatur.
- Overvåk og registrer ICP- og MAP-verdiene etter injeksjon.
- Nedleggelse
- Etter fullført intraventrikulær injeksjon, trekk opp PE-50-slangen som inneholder trykksensoren som ble satt inn i lårarterien og påfør det midlertidige klipset på lårarterien for å forhindre blødning.
- Bind av den proksimale delen av lårarterien ved hjelp av 3-0 silkesuturen.
- Lukk lårinnsnittet på en avbrutt måte med 3-0 silke.
- Fjern føringskanylen med intraventrikulær nål og ICP-monitor.
- Forsegl burrhullene med beinvoks.
- Lukk kranialsnittet med 3-0 silkesutur på en avbrutt måte.
- Påfør topikal bupivakain på snittet og injiser 0,35 ml karprofen (5 mg/kg) postoperativt. Ikke la dyrene være uten tilsyn før de har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal tilbakeholdenhet.
- Tillat rotter å komme seg helt etter operasjonen under tilsyn og returnere dem til hjemmeburene med fri tilgang til mat og vann etter utvinning.
4. Postoperativ ledelse
- Sjekk alle postoperative dyr daglig i syv postoperative dager for å overvåke utvinning, nevrologisk status, oppførsel, vekt og snitt.
- Administrer 0,35 ml karprofen (5 mg/kg) ved subkutan injeksjon på operasjonstidspunktet og på 1. og 2. postoperative dager.
- Fjern suturene på den 7. postoperative dagen på en steril måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intrakranialt, gjennomsnittlig arterielt og cerebralt perfusjonstrykk
Både ICP og MAP ble overvåket intraoperativt hos alle dyr (figur 1). Rottene var 8-10 måneder gamle med en gjennomsnittsvekt på 495 ± 17 g. Det ble også samlet inn ICP-grafer i sanntid (figur 2). Med unntak av humbuggruppen økte ICP signifikant under intraventrikulær injeksjon i IVH så vel som kjøretøykontrollgrupper (figur 3). ICP-er toppet seg mer i IVH-gruppen (43 mmHg) sammenlignet med kjøretøykontrollen (36,5 mmHg). ICP-ene ble deretter raskt redusert og normalisert innen fem minutter etter intraventrikulær injeksjon i disse dyregruppene. Den fiberoptiske sensoren ble vellykket brukt til å overvåke ICPs og MAPs i sanntid. Det ble observert at MAPs forble like gjennom hele prosedyren, mens CPP ble redusert under intraventrikulær injeksjon av enten blod eller Laktert Ringers løsning (figur 3).
Figur 1: Eksperimentelt oppsett . (A) Plassering av burr hull. (B) Skildring av hele det eksperimentelle oppsettet. Forkortelser: A-P, fremre til bakre akse; M-L, medial til lateral akse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: ICP-opptak. Intrakranielt trykk i sanntid (ICP) opptak i (A) humbug, (B) IVH og (C) kjøretøykontrolldyr. Pil angir starten på IVH/LR-injeksjonen. N=1 i hver gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: ICP-, MAP- og CPP-grafer . (A) Gjennomsnittlig intrakranielt trykk (ICP), (B) gjennomsnittlig arterielt trykk (MAP) og (C) gjennomsnittlig cerebralt perfusjonstrykk (CPP) verdier før ventrikulær injeksjon, under ventrikulær injeksjon og etter ventrikulær injeksjon i IVH og kjøretøykontrolldyr. N=1 i hver gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien undersøkte mekanismer for å måle ICPs, MAPs og CPPs i en ikke-traumatisk IVH rottedyrmodell. Resultatene ble registrert fra følgende grupper: humbug, VH 200 μL og kjøretøykontroll (kunstig cerebrospinalvæske intraventrikulær injeksjon) dyr. Dette eksperimentelle designet ble valgt for å undersøke hvordan ICP kan overvåkes under IVH-injeksjon, da vi antydet at spissen i ICP kan bidra til den mer signifikante sekundære hjerneskaden og dermed minneunderskuddet i IVH dyremodeller. Derfor var målene med denne studien å etablere en IVH-dyremodell med objektiv overvåking av ICPs, MAPs og CPPs etter ikke-traumatisk IVH, slik at vi kan bruke dette videre i fremtidige eksperimenter som vil fokusere på effekten av ICP indusert av IVH på påfølgende minnedysfunksjon. Denne pilotstudien fant at ICP og MAPs kan overvåkes nøyaktig ved hjelp av en fiberoptisk trykksensor introdusert i henholdsvis venstre laterale ventrikel og lårarterie. ICP øker betydelig under intraventrikulær injeksjon av blod og kunstig cerebrospinalvæske. I tillegg reduseres de tilsvarende CPP-ene under intraventrikulær injeksjon.
En av de største bekymringene for denne studien var å finne en måte å overvåke og registrere de svært små endringene i trykk (ICP og MAPs) nøyaktig. Dette ble gjort ved hjelp av en fiberoptisk trykksensor. Den fiberoptiske sensoren måtte være liten for å måle minimale trykkendringer nøyaktig. Den fiberoptiske sensoren som ble brukt, er isolert i en kabelkappe for beskyttelse. Den ytre diameteren på kappen er 0,9 mm, og diameteren på selve sensorspissen er 420 μm. Vi sørget for at ICP- og MAP-verdiene for rotter kunne falle innenfor det normale trykkområdet for denne sensoren (-50 mmHg til +300 mmHg). Presisjonen til den fiberoptiske sensoren ble også sikret å være liten, ±1 mmHg (Opsens Solutions).
Flertallet av dagens prekliniske ICH-modeller på dette tidspunktet bruker gnagere med fullblodsinfusjon og kollagenase (injeksjon av kollagenaseenzym for å skade den ekstracellulære matrisen som resulterer i IVH) modeller som de to vanligste eksperimentelle designene 9,10. Fullblodsinfusjonsmodellen innebærer infusjon av blod via en kraniotomi eller burrhull og er rapportert ikke bare hos rotter, men også hos griser og primater. Imidlertid er ingen dyremodell perfekt, og hver har sine egne fordeler og ulemper 9,10. Med hensyn til utfall er atferd, hjerneødem, celledød og hematomstørrelse noen av de vanligste endepunktene som testes i ICH-studier. Av atferdstestene som vurderer kognitiv og minnedysfunksjon, bruker flertallet Morris vannlabyrinttest10. Vi har ikke funnet studier som objektivt måler ICP i IVH nontraumatiske rottemodeller.
En nylig gjennomgang av MacLellan og medarbeidere fant mange sentrale problemer med preklinisk ICH-litteratur9. MacLellan og medarbeidere fant at et overveldende flertall av studiene kun rapporterer om positive behandlingseffekter. Mange studier med negative resultater publiseres i lavere tidsskrifter eller publiseres ikke i det hele tatt, noe som ikke bidrar til en ubetydelig publikasjonsskjevhet. De fant også at mange studier ikke beskriver metodikken som randomisering, alder og kjønn på dyr, blant andre. Mangel på blinding, mangel på rapportering av fysiologiske variabler samt statistisk styrke er ytterligere svakheter som ble observert i den gjennomgangen. Alt dette gjør det utfordrende for andre som forsøker å gjenskape eksperimentet10. I tillegg viste noen studier, som Hatman et al., at lærings- og minneunderskuddene har en tendens til å være akutte og avta så tidlig som i 8 uker etter eksperimentell ICH i dyremodeller11. Derfor kan disse kortsiktige minneeffektene i dyremodeller ikke nøyaktig gjenspeile det langsiktige minnet og kognitiv dysfunksjon som skjer etter ICH hos mennesker.
Denne studien er ikke uten begrensninger. En stor begrensning er dyrs lave tømmer. Dette var en pilotstudie, og fremtidige dyreforsøk vil inneholde et større antall dyr for å styrke resultatene observert her. En annen begrensning av denne studien er manglende evne til å overvåke MAPs tilstrekkelig i løpet av hele operasjonen, da lårarterien og Tuohy Borst-systemet begge koagulerer lett til tross for bruk av lavt heparinisert saltvann for å skylle slangen.
Avslutningsvis rapporterer vi her om metoder for nøyaktig overvåking av ICPs, MAPs og CPPs i en ikke-traumatisk IVH rottedyrmodell. Studier som denne vil bane veien mot å etablere en mer konsistent IVH dyremodell og deretter strengere preklinisk forskning. Preklinisk forskning av høyere kvalitet på ikke-traumatiske IVH-dyremodeller er avgjørende for å belyse potensielle terapeutiske muligheter for IVH-overlevende i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NINDS-tilskuddet: K08NS105914
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira, Inc. | 409115901 | |
| 1 mL syringe | Covetrus | 60734 | |
| 10% providine iodine solution | Aplicare | MSD093947 | |
| 20 mL syringe | Covidien | 8881520657 | |
| 22 G needles | Becton Dickinson | 305155 | |
| 28 G intraventricular needles | P technologies | 8IC313ISPCXC | C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection |
| 3-0 silk suture | Henry Schein, Inc. | SP116 | |
| 3-way-stopcock | Merti Medical Systems | M3SNC | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Chemical | 30525-89-4 | |
| AnyMaze software | Any-Maze behavioral tracking software | Stoelting CO, USA | |
| Artificial ointment | Covetrus | 48272 | |
| Blood collection vials with EDTA | Becton Dickinson | 367856 | |
| Bone wax | CP Medical, Inc. | CPB31A | |
| Carprofen | Zoetis, Inc. | 54771-8507-1 | |
| Centrifuge | Beckman | BE-GS6R | Model GS-6R |
| Cotton tip applicators | Covetrus | 71214 | |
| Drill | Dremel | 1600A011JA | |
| Fiberoptic pressure sensors with readout units | Opsens Medical | OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC | Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system |
| Forceps | 11923-13, 11064-07 | ||
| Gauze | Covetrus | 71043 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | 51330 | |
| Heating pad with rectal thermometer | CWE, Inc. | 08-13000 ,08-13014 | TC1000 Temperature controller |
| Hemostats | 13013-14, 13008-12 | ||
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter Healthcare Corp. | Y345583 | |
| Laryngoscope | American Diagnostic Corporation | 4080 | |
| Metal clip | Fine Scientic Tools | 18056-14 | |
| Micro scissors | Fine Scientic Tools | 15007-08 | |
| Microscope | Leica | model L2 | |
| Needle driver | 12003-15 | ||
| Polyethylene tubing | Thermo Fisher Scientific | 14-170-12B | PE-50 tubing |
| Rats | Envigo | Sprague Dawley rats 8–10 months old | |
| Scalpel | 10010-00 | ||
| Scissors | 14090-11 | ||
| Stereotaxic instrument | Kopf instruments | Model 940 with ear bars | |
| Syringe pump | KD Scientific | 780100 | Model 100 series |
| Tuohy Borst | Abbott | 23242 | |
| Ventilator | Harvard rodent ventilator | 55-0000 | Model 683 |
References
- Gates, P. C., Barnett, H. J. M., Vinters, H. V., Simonsen, R. L., Siu, K.
- Strajle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of hydrocephalus after neonatal and adult intraventricular hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, Suppl 1 25-38 (2012).
- Murao, K., Rossi, C., Cordonnier, C. Intracerebral hemorrhage and cognitive decline. Revue Neurologique. 169, 772-778 (2013).
- Al-Khindi, T., Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Cognitive and functional outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 41, 519-536 (2010).
- Kreiter, K. T., et al. Predictors of cognitive dysfunction after subarachnoid hemorrhage. Stroke. 33, 200-208 (2002).
- Zanaty, M., et al. Intraventricular extension of an aneurysmal subarachnoid hemorrhage is an independent predictor of a worse functional outcome. Clinical Neurology and Neurosurgery. 170, 67-72 (2018).
- Gabrielian, L., Willshire, L. W., Helps, S. C., vanden Heuvel, C., Mathias, J., Vink, R. Intracranial pressure changes following traumatic brain injury in rats: lack of significant change in the absence of mass lesions or hypoxia. Journal of Neurotrauma. 28, 2103-2111 (2011).
- Kolar, M., Nohejlova, K., Duska, F., Mares, J., Pachl, J. Changes of cortical perfusion in the early phase of subarachnoid bleeding in a rat model and the role of intracranial hypertension. Physiological Research. 66, 545-551 (2017).
- Ariesen, M. J., Claus, S. P., Rinkel, G. J. E., Algra, A. Risk factors for intracerebral hemorrhage in the general population. A systematic review. Stroke. 34, 2060-2066 (2003).
- MacLellan, C. L., Paquette, R., Colbourne, F. A critical appraisal of experimental intracerebral hemorrhage research. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32, 612-627 (2012).
- Hartman, R., Lekic, T., Rojas, H., Tang, J., Zhang, J. H. Assessing functional outcomes following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Research. 1280, 148-157 (2009).
