Summary
O monitoramento da pressão intracraniana em modelos de roedores de hemorragia intraventricular não traumática não é comum na literatura atual. Neste trabalho, demonstramos uma técnica para medir a pressão intracraniana, a pressão arterial média e a pressão de perfusão cerebral durante hemorragia intraventricular em um modelo animal de rato.
Abstract
Sobreviventes de hemorragia intraventricular são frequentemente deixados com comprometimento significativo da memória de longo prazo; assim, pesquisas utilizando modelos animais de hemorragia intraventricular são essenciais. Neste estudo, buscamos formas de medir a pressão intracraniana, a pressão arterial média e a pressão de perfusão cerebral durante hemorragia intraventricular não traumática em ratos. O delineamento experimental incluiu três grupos de Sprague Dawley: sham, hemorragia intraventricular padrão de 200 μl e grupos controle de veículos. Com a introdução de um sensor de pressão de fibra óptica intraparenquimatoso, foram obtidas medidas precisas de pressão intracraniana em todos os grupos. As pressões de perfusão cerebral foram calculadas com o conhecimento da pressão intracraniana e dos valores médios da pressão arterial. Como esperado, os grupos hemorragia intraventricular e controle de veículos experimentaram um aumento na pressão intracraniana e subsequente declínio na pressão de perfusão cerebral durante a injeção intraventricular de sangue autólogo e líquido cefalorraquidiano artificial, respectivamente. A adição de um sensor de pressão de fibra óptica intraparenquimatosa é benéfica no monitoramento de mudanças precisas de pressão intracraniana.
Introduction
A hemorragia intraventricular (IVH), um tipo de hemorragia intracraniana (HIC), é uma doença devastadora que carrega mortalidade e morbidade significativas. A IVH é caracterizada como o acúmulo de hemoderivados no interior dos ventrículos intracranianos. A IVH isolada é incomum e geralmente ocorre em adultos1. Pode estar associada a hemorragia hipertensiva, ruptura de aneurisma intracraniano ou outra malformação vascular, tumores ou trauma1. A IVH leva à lesão cerebral secundária, bem como ao desenvolvimento de hidrocefalia2. Os sobreviventes de IVH são frequentemente deixados com deficiências funcionais, de memória e cognitivas significativas após a lesão. Esses déficits cognitivos e de memória de longo prazo são relatados em até 44% dos sobreviventes de HIC3. Na hemorragia subaracnóide (HAS), outro tipo de HIC, sabe-se que aproximadamente metade dos sobreviventes terá déficits de memória e, para aqueles que apresentam IVH, além da HAS, os desfechos tendem a ser significativamente piores 4,5,6.
Os mecanismos subjacentes de disfunção da memória após a IVH ainda precisam ser elucidados. Pesquisas in vivo utilizando modelos animais de IVH não traumáticos com disfunção funcional e de memória são essenciais para descobrir potenciais alvos terapêuticos para esses pacientes. Modelos animais com memória mais grave e disfunção funcional após IVH seriam os melhores para estudar essas mudanças. O laboratório do autor sênior também tem investigado especificamente o papel da alta pressão intracraniana (PIC) no desenvolvimento de déficits de memória em modelos de ratos IVH. Assim, métodos para medir com precisão as PIC durante a IVH foram importantes para investigar. Neste documento, relatamos métodos de medição precisa de PIC em um modelo de rato IVH. Embora o monitoramento de PIC tenha sido utilizado anteriormente em modelos animais de ICH traumática e hemorragia subaracnóide, o monitoramento de PIC em modelos espontâneos de roedores de IVH não é tão comumente relatado na literatura 7,8. Assim, o delineamento experimental aqui apresentado incluiu três grupos de ratos Sprague Dawley: simulação, hemorragia intraventricular padrão de 200 μl e controle veicular. Para o grupo IVH, foi utilizado um modelo autólogo de injeção intraventricular de sangue. Para os animais controle veiculares, foi utilizada a injeção intraventricular de solução estéril de Ringer Lactado. As PIC, as pressões arteriais médias (PAM) e as pressões de perfusão cerebral (PCCs) foram registradas no intraoperatório, e os resultados são relatados neste documento.
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Protocol
Todos os métodos de pesquisa e cuidados/manutenção dos animais foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais da Universidade da Califórnia, Davis. O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia, Davis, aprovou todos os protocolos de uso de animais e procedimentos experimentais (protocolo IACUC # 21874).
1. Alojamento de animais
- Obtenha ratos Sprague-Dawley de 8-10 meses de idade. Antes de qualquer procedimento experimental, abrigue os ratos em um biotério e aguarde pelo menos 1 semana para adaptação geral em suas gaiolas após um ciclo claro/escuro de 12 horas com comida e água ad libitum.
2. Anestesia e procedimentos pré-operatórios
- Anestesiar o rato com isoflurano a 4% por 4 min. Pendurar o rato pelos dentes em decúbito dorsal sobre uma plataforma de intubação e intubar endotraquealmente usando uma cânula endotraqueal e laringoscópio.
- Coloque o rato anestesiado e entubado em um ventilador (isoflurano a 2% e gás transportador de O2/N2). O rato é adequadamente anestesiado se não for observada resposta a um estímulo doloroso, como uma pitada na pata traseira.
- Insira um termômetro retal para monitorar continuamente a temperatura.
- Realizar todos os procedimentos operatórios utilizando técnica estéril. Prenda o cabelo na cabeça e na região femoral e prepare a pele com três esfoliantes alternados de Betadine e álcool a 70% antes da cirurgia.
- Aspirar quaisquer secreções respiratórias acumuladas removendo temporariamente o rato do ventilador e aspirando as secreções com tubos PE-50 conectados a uma seringa de 10 mL.
- Proteja os olhos do rato com pomada de olho de lágrimas artificiais estéreis.
- Injete bupivacaína local (~0,1 ml de solução a 0,25%) na pele e nos tecidos subcutâneos antes da incisão no couro cabeludo.
3. Protocolo cirúrgico
- Colocação de agulha intraventricular e monitor de pressão intracraniana (PIC)
- Coloque o rato em posição prona em uma estrutura estereotáxica e corte a orelha do rato.
- Faça uma incisão no couro cabeludo de 1,5 cm ao longo da linha média com um bisturi de 15 lâminas.
- Aplique pressão leve com gaze para hemostasia.
- Usando um aplicador de ponta de algodão estéril, separe o periósteo do crânio até que o ponto de referência do bregma seja visível.
- Localizar e demarcar o bregma usando estereotáxis e marcar a localização de dois orifícios bilaterais de rebarbas, 1,4 mm laterais e 0,9 mm posteriores ao bregma.
- Usando uma broca de mão, crie esses dois pequenos furos de rebarbas cranianas (até 2 mm) nos hemisférios direito e esquerdo. Irrigue qualquer excesso de lascas ósseas com solução estéril de gengibre lactado.
- No hemisfério direito, posicione uma cânula guia 22-G ao nível do orifício da rebarba para inserir a agulha 28-G através da cânula até a profundidade do ventrículo lateral direito (4,6 mm em relação ao bregma), a fim de criar IVH.
- Conecte o sensor de pressão de fibra óptica à unidade de leitura. Ligue a unidade de leitura e verifique se as unidades selecionadas estão em mmHg. Em seguida, prima o sensor submergindo sua ponta em um pequeno copo com a solução de Lactated Ringer até que a unidade de leitura leia zero. Uma vez zerado na solução de Lactated Ringers, está tudo pronto para ser inserido.
- No hemisfério esquerdo, insira suavemente o sensor de pressão a 2-3 mm de profundidade no córtex para monitoramento de ICP em tempo real.
- Monitorização da canulação da artéria femoral e inserção da pressão arterial média (PAM)
- Após a inserção do monitor de PIC, gire o tronco inferior do rato para facilitar o acesso à área da coxa esquerda e da virilha.
- Após a preparação estéril e a administração local de bupivacaína, faça uma incisão cutânea de 1,5 cm sobre o membro posterior com um bisturi de 15 lâminas.
- Dissecar a artéria femoral esquerda primeiro superficialmente com um hemostático e, em seguida, camadas mais profundas usando pinça com pontas finas sob um microscópio. Identifique a veia femoral azul profunda para ajudar a localizar a artéria adjacente.
- Amarre a artéria femoral distal usando sutura de seda 3-0 e coloque um clipe de metal temporário na porção proximal da artéria femoral.
- Tenha um segundo sensor de pressão de fibra óptica conectado à unidade de leitura já preparada. Insira o sensor de pressão na tubulação de polietileno (PE-50), que é inserida em um Tuohy Borst que é então fechado. Conecte o Tuohy Borst a uma torneira de 3 vias conectada a uma seringa de 1 mL em uma extremidade e a uma agulha de 22 G com tubo PE-50 na outra extremidade.
- Sob o microscópio, faça uma arteriotomia femoral de 2 mm com micro tesoura e canule-a com tubo PE-50 conectado ao resto da configuração.
- Injeção intraventricular
- Aspirar 500 μL de sangue utilizando uma seringa de 1 ml e virar a torneira de 3 vias para que o sensor de pressão leia MAP.
- Prima a agulha intraventricular 28-G conectada ao tubo PE-50 com o sangue aspirado para animais IVH e Lactated Ringer's para os animais controle do veículo. Em seguida, insira esta agulha na cânula guia até a profundidade do ventrículo lateral direito.
- Usando uma taxa de 100 μL/min, injete o sangue ou a solução estéril de Lactated Ringer (200 μL) no ventrículo lateral direito, bombeando a seringa de 1 mL com o polegar. Antes disso e durante a injeção intraventricular, monitore e registre a PIC, a pressão arterial e a temperatura retal.
- Monitore e registre os valores de ICP e MAP pós-injeção.
- Encerramento
- Após a conclusão da injeção intraventricular, retire o tubo PE-50 contendo o sensor de pressão que foi inserido na artéria femoral e aplique o clipe temporário na artéria femoral para evitar sangramento.
- Amarre a porção proximal da artéria femoral usando a sutura de seda 3-0.
- Feche a incisão femoral de forma interrompida usando seda 3-0.
- Remova a cânula guia com a agulha intraventricular e o monitor de PIC.
- Sele os orifícios da rebarba com cera óssea.
- Feche a incisão craniana com sutura de seda 3-0 de forma interrompida.
- Aplicar bupivacaína tópica na incisão e injetar 0,35 mL de carprofeno (5 mg/kg) no pós-operatório. Não deixe os animais sozinhos até que eles tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
- Permita que os ratos se recuperem totalmente após a cirurgia sob supervisão e devolva-os às gaiolas de casa com acesso gratuito a alimentos e água após a recuperação.
4. Manejo pós-operatório
- Verificar todos os animais no pós-operatório diariamente durante sete dias de pós-operatório para monitorar sua recuperação, estado neurológico, comportamento, peso e incisões.
- Administrar 0,35 mL de carprofeno (5 mg/kg) por injeção subcutânea no momento da cirurgia e no 1º e2º dias de pós-operatório.
- Retirar as suturas no7º dia de pós-operatório de forma estéril.
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Representative Results
Pressões de perfusão intracraniana, arterial média e cerebral
Tanto as PIC quanto as PAM foram monitoradas no intraoperatório em todos os animais (Figura 1). Os ratos tinham entre 8 e 10 meses de idade, com um peso médio de 495 ± 17 g. Também foram coletados gráficos de PIC em tempo real (Figura 2). Excluindo-se o grupo simulado, as PIC aumentaram significativamente durante a injeção intraventricular na IVH, bem como nos grupos controle de veículos (Figura 3). As PIC apresentaram maior pico no grupo IVH (43 mmHg) em comparação com o controle do veículo (36,5 mmHg). As CIPs então diminuíram rapidamente e se normalizaram dentro de cinco minutos após a injeção intraventricular nesses grupos de animais. O sensor de fibra óptica foi usado com sucesso para monitorar ICPs e MAPs em tempo real. Observou-se que as PAM permaneceram semelhantes durante todo o procedimento, enquanto as PPCs diminuíram durante a injeção intraventricular de sangue ou de solução de Ringer Lactato (Figura 3).
Figura 1: Configuração experimental . (A) Localização dos orifícios de rebarbas. (B) Representação de toda a configuração experimental. Abreviaturas: A-P, eixo anterior ao posterior; M-L, eixo medial a lateral. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Gravações de PIC. Registros de pressão intracraniana (PIC) em tempo real em (A) sham, (B) IVH e (C) animais de controle de veículos. Seta denota o início da injeção de IVH/LR. N=1 em cada grupo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gráficos de PIC, PAM e PPC . (A) Valores médios de pressão intracraniana (PIC), (B) pressão arterial média (PAM) e (C) pressão média de perfusão cerebral (DPC) pré-injeção ventricular, durante injeção ventricular e pós-injeção ventricular em animais de controle de veículos e IVH. N=1 em cada grupo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este estudo investigou mecanismos para medir PIC, PAM e CPPs em um modelo animal de rato IVH não traumático. Os resultados foram registrados nos seguintes grupos: animais simulados, VH 200 μL e controle veicular (injeção intraventricular de líquido cefalorraquidiano artificial). Este delineamento experimental foi escolhido para investigar como as PIC podem ser monitoradas durante a injeção de IVH, pois levantamos a hipótese de que o pico de ICPs pode contribuir para a lesão cerebral secundária mais significativa e, portanto, para o déficit de memória em modelos animais de IVH. Portanto, os objetivos deste estudo foram estabelecer um modelo animal de IVH com monitoramento objetivo de CIPs, MAPs e CPPs após IVH não traumática para que possamos aplicá-lo ainda mais em experimentos futuros que enfocarão os efeitos das ICPs induzidas pela IVH na disfunção de memória subsequente. Este estudo piloto descobriu que as PIC e MAPs podem ser monitoradas com precisão usando um sensor de pressão de fibra óptica introduzido no ventrículo lateral esquerdo e na artéria femoral, respectivamente. As PIC aumentam significativamente durante a injeção intraventricular de sangue e líquido cefalorraquidiano artificial. Além disso, as PPCs correspondentes diminuem durante a injeção intraventricular.
Uma das principais preocupações deste estudo foi encontrar uma maneira de monitorar e registrar com precisão as mudanças muito pequenas nas pressões (PIC e MAPs). Isso foi feito usando um sensor de pressão de fibra óptica. O sensor de fibra óptica tinha que ser pequeno para medir com precisão as mudanças mínimas na pressão. O sensor de fibra óptica que foi usado é isolado em uma bainha de cabo para sua proteção. O diâmetro externo da bainha é de 0,9 mm e o diâmetro da própria ponta do sensor é de 420 μm. Garantimos que os valores de PIC e PAM de ratos pudessem cair na faixa normal de pressão de operação para este sensor (-50 mmHg a +300 mmHg). Além disso, a precisão do sensor de fibra óptica foi assegurada para ser pequena, ±1 mmHg (Opsens Solutions).
A maioria dos modelos pré-clínicos atuais de HIC neste momento utiliza roedores com infusão de sangue total e colagenase (injeção da enzima colagenase para ferir a matriz extracelular resultando em IVH) como os dois delineamentos experimentais mais comuns 9,10. O modelo de infusão de sangue total envolve a infusão de sangue através de uma craniotomia ou orifício de rebarba e foi relatado não apenas em ratos, mas também em porcos e espécies de primatas. No entanto, nenhum modelo animal é perfeito, e cada um tem suas próprias vantagens e desvantagens 9,10. Com relação aos desfechos, comportamento, edema cerebral, morte celular e tamanho do hematoma são alguns dos desfechos mais comuns testados em estudos de ICH. Dos testes comportamentais que avaliam a disfunção cognitiva e de memória, a maioria utiliza o teste do labirinto aquático de Morris10. Não encontramos estudos que meçam objetivamente as PIC em modelos de ratos não traumáticos IVH.
Uma revisão recente de MacLellan et al. encontrou muitas questões-chave com a literatura pré-clínica de HIC9. MacLellan et al. descobriram que a esmagadora maioria dos estudos relata apenas os efeitos positivos do tratamento. Muitos estudos com resultados negativos são publicados em periódicos de nível inferior ou não publicados, contribuindo para um viés de publicação não insignificante. Eles também descobriram que muitos estudos não descrevem a metodologia, como randomização, idade e sexo dos animais, entre outros. A falta de cegamento, a falta de relato de variáveis fisiológicas, bem como o poder estatístico são fraquezas adicionais que foram observadas nessa revisão. Tudo isso o torna desafiador para outros que tentam replicar o experimento10. Além disso, alguns estudos, como Hatman et al., demonstraram que os déficits de aprendizagem e memória tendem a ser agudos e diminuir já em 8 semanas após a ICH experimental em modelos animais11. Portanto, esses efeitos de memória de curto prazo em modelos animais podem não refletir com precisão a memória de longo prazo e a disfunção cognitiva que acontece após a ICH em seres humanos.
Este estudo não é isento de limitações. Uma grande limitação é a baixa madeira dos animais. Este foi um estudo piloto, e futuros estudos em animais conterão um maior número de animais para solidificar os resultados aqui observados. Outra limitação deste estudo é a incapacidade de monitorar adequadamente as MAPs durante toda a cirurgia, pois a artéria femoral e o sistema de Tuohy Borst se desprendem facilmente, apesar do uso de solução salina heparinizada baixa para lavar a tubulação.
Em conclusão, neste documento, relatamos métodos de monitoramento preciso de ICPs, MAPs e CPPs em um modelo animal de rato IVH não traumático. Estudos como este abrirão o caminho para o estabelecimento de um modelo animal de IVH mais consistente e, posteriormente, uma pesquisa pré-clínica mais rigorosa. A pesquisa pré-clínica de maior qualidade em modelos animais de IVH não traumáticos é fundamental para elucidar possíveis opções terapêuticas para sobreviventes de IVH no futuro.
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Disclosures
Todos os autores não relatam conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela subvenção NINDS: K08NS105914
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira, Inc. | 409115901 | |
| 1 mL syringe | Covetrus | 60734 | |
| 10% providine iodine solution | Aplicare | MSD093947 | |
| 20 mL syringe | Covidien | 8881520657 | |
| 22 G needles | Becton Dickinson | 305155 | |
| 28 G intraventricular needles | P technologies | 8IC313ISPCXC | C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection |
| 3-0 silk suture | Henry Schein, Inc. | SP116 | |
| 3-way-stopcock | Merti Medical Systems | M3SNC | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Chemical | 30525-89-4 | |
| AnyMaze software | Any-Maze behavioral tracking software | Stoelting CO, USA | |
| Artificial ointment | Covetrus | 48272 | |
| Blood collection vials with EDTA | Becton Dickinson | 367856 | |
| Bone wax | CP Medical, Inc. | CPB31A | |
| Carprofen | Zoetis, Inc. | 54771-8507-1 | |
| Centrifuge | Beckman | BE-GS6R | Model GS-6R |
| Cotton tip applicators | Covetrus | 71214 | |
| Drill | Dremel | 1600A011JA | |
| Fiberoptic pressure sensors with readout units | Opsens Medical | OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC | Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system |
| Forceps | 11923-13, 11064-07 | ||
| Gauze | Covetrus | 71043 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | 51330 | |
| Heating pad with rectal thermometer | CWE, Inc. | 08-13000 ,08-13014 | TC1000 Temperature controller |
| Hemostats | 13013-14, 13008-12 | ||
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter Healthcare Corp. | Y345583 | |
| Laryngoscope | American Diagnostic Corporation | 4080 | |
| Metal clip | Fine Scientic Tools | 18056-14 | |
| Micro scissors | Fine Scientic Tools | 15007-08 | |
| Microscope | Leica | model L2 | |
| Needle driver | 12003-15 | ||
| Polyethylene tubing | Thermo Fisher Scientific | 14-170-12B | PE-50 tubing |
| Rats | Envigo | Sprague Dawley rats 8–10 months old | |
| Scalpel | 10010-00 | ||
| Scissors | 14090-11 | ||
| Stereotaxic instrument | Kopf instruments | Model 940 with ear bars | |
| Syringe pump | KD Scientific | 780100 | Model 100 series |
| Tuohy Borst | Abbott | 23242 | |
| Ventilator | Harvard rodent ventilator | 55-0000 | Model 683 |
References
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