Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein neuartiges Modell der glaukomatösen Neurodegeneration zu charakterisieren, das auf einer thermischen 360°-Kauterisierung des limbalen Gefäßplexus basiert und eine subakute okuläre Hypertonie induziert.
Abstract
Das Glaukom, die zweithäufigste Erblindungsursache weltweit, ist eine heterogene Gruppe von Augenerkrankungen, die durch eine strukturelle Schädigung des Sehnervs und eine Degeneration der retinalen Ganglienzellen (RGC) gekennzeichnet sind, die zu einer Sehstörung führt, indem die Übertragung visueller Informationen vom Auge zum Gehirn unterbrochen wird. Ein erhöhter Augeninnendruck ist der wichtigste Risikofaktor; Daher wurden mehrere Modelle der okulären Hypertonie bei Nagetieren entweder durch genetische oder experimentelle Ansätze entwickelt, um die Ursachen und Auswirkungen der Krankheit zu untersuchen. Unter diesen wurden einige Einschränkungen berichtet, wie z. B. chirurgische Invasivität, unzureichende funktionelle Beurteilung, die Notwendigkeit einer umfangreichen Ausbildung und eine sehr variable Ausdehnung der Netzhautschäden. Die vorliegende Arbeit charakterisiert eine einfache, kostengünstige und effiziente Methode zur Induktion von okulärer Hypertonie bei Nagetieren, die auf der Kauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei niedriger Temperatur, einer Hauptkomponente der Kammerwasserdrainage, basiert. Das neue Modell bietet eine technisch einfache, nicht-invasive und reproduzierbare subakute okuläre Hypertonie, die mit einer progressiven RGC und einer Degeneration des Sehnervs einhergeht, sowie eine einzigartige postoperative klinische Genesungsrate, die in vivo funktionelle Studien sowohl mit elektrophysiologischen als auch mit verhaltenstherapeutischen Methoden ermöglicht.
Introduction
In der medizinischen Literatur wird das Glaukom als eine heterogene Gruppe von Optikusneuropathien verstanden, die durch eine fortschreitende Degeneration von retinalen Ganglienzellen (RGCs), Dendriten, Soma und Axonen gekennzeichnet sind, was zu einem strukturellen Schröpfen (Exkavation) der Papille und einer funktionellen Verschlechterung des Sehnervs führt, was in unkontrollierten Fällen zu einer Amaurose führt, indem die Übertragung visueller Informationen vom Auge zum Gehirn unterbrochen wird1. Das Glaukom ist derzeit weltweit die häufigste Ursache für irreversible Erblindung und wird im Jahr 2040 voraussichtlich etwa 111,8 Millionen Menschen erreichen2, was die Lebensqualität der Patienten stark beeinträchtigt und zu erheblichen sozioökonomischen Problemen führt3.
Ein erhöhter Augeninnendruck (IOD) ist einer der wichtigsten und einzigen modifizierbaren Risikofaktoren für die Entstehung und das Fortschreiten des Glaukoms. Unter den verschiedenen Arten von Glaukom sind alle, mit Ausnahme des Normaldruckglaukoms (NTG), mit einem erhöhten Augeninnendruck zu einem bestimmten Zeitpunkt in der klinischen Geschichte der Krankheit verbunden. Trotz bemerkenswerter klinischer und chirurgischer Fortschritte, um den Augeninnendruck zu bekämpfen und das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen oder zu stoppen, verlieren Patienten aufgrund eines Glaukoms immer noch ihr Augenlicht 4,5. Daher ist ein gründliches Verständnis der komplexen und multifaktoriellen Pathophysiologie dieser Krankheit unerlässlich für die Entwicklung wirksamerer Behandlungen, insbesondere zur Neuroprotektion von RGCs.
Unter einer Vielzahl von experimentellen Ansätzen zum Verständnis von Krankheitsmechanismen ähneln Tiermodelle, die auf okulärer Hypertonie (OHT) basieren, am ehesten dem menschlichen Glaukom. Nagetiermodelle sind besonders nützlich, da sie kostengünstig sind, einfach zu handhaben sind, genetisch manipuliert werden können, eine kurze Lebensdauer haben und anatomische und physiologische Merkmale aufweisen, die mit denen des Menschen vergleichbar sind, wie z. B. Kammerwasserproduktion und -drainage 6,7,8,9,10,11,12,13 . Zu den derzeit verwendeten Modellen gehören die Sklerose des Trabekelwerks nach Injektion von hypertoner Kochsalzlösung in episklerale Venen14, die intrakamerale Injektion von Mikrokügelchen 15 oder viskoelastischen Substanzen 16, die Kauterisierung von Wirbelvenen17, die Photokoagulation des Trabekelwerks mit dem Argonlaser 18, die zirkumlimbale Naht 19 und die Verwendung eines transgenen Modells der altersabhängigen OHT (DBA/2J-Mäuse)8. Invasivität, postoperative Trübung der Hornhaut, Störung des vorderen Augenabschnitts, umfangreiche Lernkurven, teure Geräte und stark schwankende postoperative IOPs gehören jedoch zu den berichteten Fallstricken, die mit den aktuellen Modellen verbunden sind, so dass die Entwicklung eines alternativen OHT-Modells erforderlich ist, um diese Probleme zu überwinden20,21,22.
Das vorliegende Protokoll formalisiert ein neuartiges chirurgisches Verfahren zur Induktion von OHT als Stellvertreter für das Glaukom, basierend auf der Kauterisierung des Limbusplexus (LPC) bei Nagetieren23. Dies ist ein einfaches, reproduzierbares, zugängliches und nicht-invasives Modell, das eine hohe Effizienz und geringe Variabilität der IOD-Erhöhung bietet, verbunden mit einer einzigartig hohen Rate der vollständigen klinischen Genesung, und somit eine In-vivo-Funktionsbewertung bei einer reduzierten Anzahl von Tieren ermöglicht, die in jedem Experiment verwendet werden. Die Operationstechnik induziert eine subakute OHT mit einer allmählichen Rückkehr zum Ausgangswert innerhalb weniger Tage, was den hypertensiven Anfall beim akuten Winkelverschlussglaukom modelliert. Darüber hinaus folgt auf die IOD-Erholung im Modell eine kontinuierliche glaukomatöse Neurodegeneration, die für zukünftige mechanistische Studien der sekundären Degeneration von RGCs nützlich ist, die in mehreren Fällen von humanem Glaukom trotz adäquater Kontrolle des IOD auftritt.
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Protocol
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) durchgeführt und von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren in wissenschaftlichen Experimenten des Zentrums für Gesundheitswissenschaften der Bundesuniversität Rio de Janeiro genehmigt (Protokoll 083/17). In der vorliegenden Arbeit wurden Lister Hooded Ratten beiderlei Geschlechts im Alter von 2-3 Monaten und mit einem Gewicht von 180-320 g verwendet. Das Verfahren kann jedoch an verschiedene Rattenstämme unterschiedlichen Alters angepasst werden.
1. Okuläre Hypertonie-Operation und klinische Nachsorge
- Haustiere in einer Umgebung mit kontrollierter Temperatur und 12-stündigem Hell-Dunkel-Zyklus (6 Uhr: Licht an/ 18 Uhr: Licht aus) mit pelletiertem gammabestrahltem Standardfutter (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brasilien) und Wasser (Dreifachfilter, mit ungiftiger Aktivkohle) nach Belieben verfügbar.
- Bereiten Sie eine Anästhesie-Cocktailmischung vor, die aus drei Teilen 10%igem Ketaminhydrochlorid und einem Teil 2%igem Xylazinhydrochlorid (Verdünnungsmittel: steriles Wasser) besteht.
- Das Tier wird vorsichtig zurückgehalten, indem die Rückenhaut festgehalten wird, und durch intraperitoneale Verabreichung von 1 μl/g Körpergewicht der Mischung (Ketamin: 75 mg/kg; Xylazin: 5 mg/kg) wird eine Anästhesie eingeleitet. Überprüfen Sie nach ca. 5 Minuten die richtige Anästhesie, indem Sie eine Zehenkneifreaktion durchführen.
- Topische Betäubung beider Augenoberflächen durch Instillation von Proxymetacainhydrochlorid 0,5% Augentropfen. Warten Sie 30-60 Sekunden und entfernen Sie die restliche Lösung von der vorderen Seite der Kugel, indem Sie die nasale oder laterale bulbäre Bindehaut vorsichtig mit einem kleinen sterilen Wattestäbchen berühren.
- Messen Sie den Ausgangswert sowohl der experimentellen als auch der kontralateralen Kontrollaugen, indem Sie das Tier in eine ventrale Dekubitusposition auf die Tischplatte legen, so dass die Hornhautoberfläche für die Spitze des Tonometers leicht zugänglich ist.
- Verwenden Sie entweder ein Applanations- oder ein Rebound-Handtonometer (Abbildung 1A). Positionieren Sie die Tonometerspitze so, dass sie die zentrale Hornhautzone senkrecht leicht berührt. Erfassen und mitteln Sie 3-5 zuverlässige, maschinell generierte Durchschnittswerte. Jeder Mittelwert wird vom Gerät nach sechs erfolgreichen Einzelmessungen automatisch berechnet.
- Beladen Sie das Zugstufentonometer mit einer Sonde und drücken Sie einmal die Messtaste, um es einzuschalten, während Sie die Spitze des Geräts nach oben legen, um ein Herunterfallen der Sonde zu vermeiden. Nach dem Einschalten zeigt das Display 00 an, um anzuzeigen, dass das Gerät messbereit ist.
- Positionieren Sie das Gerät mit der Spitze der Sonde in einem Abstand von 1-4 mm von der Hornhaut und erfassen Sie die Messwerte durch schnelles und vorsichtiges Drücken der Messtaste, ohne das Gerät zu bewegen. Jede erfolgreiche Messung wird durch einen kurzen Piepton identifiziert und nach sechsmal wird der Mittelwert auf dem Bildschirm des Geräts angezeigt.
HINWEIS: Trotz langjähriger Erfahrung mit Applanationstonometern empfehlen die Autoren zur Optimierung des gesamten Verfahrens die Verwendung eines Rückpralltonometers, das eine einfachere Erfassung einer zuverlässigen IOD-Messung ermöglicht.
- Legen Sie das Tier unter ein Stereomikroskop in eine leichte seitliche Dekubitusposition und planen Sie die Operation sorgfältig, indem Sie das Versuchsauge mit 40-facher Vergrößerung untersuchen. Vergessen Sie nicht, das kontralaterale Kontrollauge während des Eingriffs befeuchtet zu halten, indem Sie einen Tropfen Carmellose-Natrium oder Natriumhyaluronat einträufeln.
- Schieben Sie den experimentellen Augapfel mit Hilfe einer gekrümmten Pinzette vorsichtig nach vorne, um das Gefäßsystem freizulegen, das 360° des Limbus13 umgibt. Auf der anderen Seite werden die Gefäße rund um die Hornhaut vorsichtig mit einem Augenkauter bei niedriger Temperatur (1.300 °F; Bovie Medical, USA) (Abbildung 1B-E).
HINWEIS: Der erwähnte Kauter hat eine runde Spitze, die das limbale Gefäßsystem in Längsrichtung berühren sollte. - Achten Sie darauf, die Hornhautperipherie nicht zu veröden, da dies zu einer postoperativen Hornhauttrübung führen kann, die eine In-vivo-Beurteilung der Netzhautfunktion ausschließt.
- Beobachten Sie das Auftreten kleiner kreisförmiger Kauterisationsspuren am Sklerallimbus, die Verödung des limbalen Gefäßsystems und die Pupillenerweiterung im operierten Auge, die Anzeichen für einen erfolgreichen chirurgischen Eingriff sind.
HINWEIS: Da das limbale Gefäßsystem von Ratten und Mäusen anatomisch ähnlich ist13,24 und der verwendete Kauter eine sanfte kleine Spitze hat, kann dieses Protokoll auch für das Mausauge ohne Anpassung funktionieren. - Überprüfen Sie nach der Operation den unmittelbaren postoperativen Augeninnendruck in beiden Augen, wie in Schritt 1.5 beschrieben.
- Tragen Sie einen Tropfen ophthalmisches Prednisolonacetat (1,2 mg/ml) auf und halten Sie diesen etwa 40 s lang in Kontakt mit der vorderen Oberfläche des Versuchsauges, dann ersetzen Sie ihn durch eine augenärztliche Salbe mit Antibiotika (Oxytetracyclinhydrochlorid 30 mg/g plus Polymyxin B 10.000 U/g oder Ciprofloxacin 3,5 mg/g). Führen Sie eine intramuskuläre Injektion von Tramadolhydrochlorid (Einzeldosis; 2 mg/kg) durch, um Schmerzen nach dem Eingriff zu vermeiden.
- Verfolgen Sie die Genesung des Tieres aus der Narkose genau, vorzugsweise in einer warmen Umgebung wie einem Heizkissen oder in seinem Käfig mit geeigneter Einstreu. Achten Sie auf das Atemmuster.
- Führen Sie eine tägliche klinische Nachuntersuchung des experimentellen Auges mit topischen Medikamenten durch, die aus einem nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAID, z. B. Ketorolac-Trometamol 0,5% Augentropfen) und einer antibiotischen Salbe (vorzugsweise die gleiche, die unmittelbar nach der Operation verwendet wird) bestehen.
HINWEIS: Die Verwendung von NSAID anstelle von steroidalen entzündungshemmenden Augentropfen wird empfohlen, da letztere OHT induzieren können und regelmäßig bei Glukokortikoid-induzierten Glaukommodellen bei Nagetieren angewendet werden.- Unter leichter Sedierung (Ketamin: 18,75 mg/kg; Xylazin: 1,25 mg/kg) wird der Augeninnendruck vorzugsweise zur gleichen Tageszeit gemessen, um eine Verzerrung aufgrund physiologischer zirkadianer IOD-Schwankungen zu vermeiden.
- Achten Sie bei der Augenuntersuchung auf seltene klinische Interzidive wie Hyphäm, Hornhautfibrose oder Skleraausdünnung im Zusammenhang mit Aderhautprolaps. Hornhautödeme, Chemose und Bindehauthyperämie sind häufig, aber vorübergehend.
- Beachten Sie die vollständige klinische Genesung etwa am 7. postoperativen Tag. Die limbale Revaskularisation beginnt in der Regel in den ersten zwei Tagen nach der Operation, im Einklang mit der erwarteten allmählichen Rückkehr des Augeninnendrucks zum Ausgangswert.
2. Analyse der optomotorischen Reaktion (OMR)
HINWEIS: Für dieses Verfahren wurde ein spezielles Systemverwendet 25.
- Ordnen Sie vier Computermonitore in einem Viereck an, die eine Arena mit einer Plattform in der Mitte begrenzen. Auf den Monitoren wird das Bild eines virtuellen Zylinders mit vertikal ausgerichteten Sinusgittern (abwechselnd schwarze und weiße Streifen) angezeigt, der sich mit einer festen Geschwindigkeit (12 Grad/s) und einem festen Kontrast (100 %) um die Plattform dreht.
- Positionieren Sie eine Videokamera über der Plattform, damit der Versuchsleiter die Bewegungen des Tieres beobachten kann. Führen Sie den Test unter photopischen Bedingungen durch und stellen Sie die Software bevorzugt auf manuellen/separaten Modus ein, um jedes Auge separat zu bewerten.
- Lassen Sie die Tiere ca. 2 Minuten auf der Plattform gewöhnen. Halten Sie den roten Fadenkreuz-Cursor auf dem Videobild zwischen den Augen des sich frei bewegenden Tieres, da er die Mitte des virtuellen Zylinders anzeigt (Abbildung 1G)25.
- Beobachten Sie die OMR, die aus einer reflexiven Verfolgung von Kopf und Hals des Tieres besteht, die durch die rotierenden Gitter hervorgerufen wird. Testen Sie die linke und die rechte Sehbahn, indem Sie die Richtungen der Sinuswellengitter im Uhrzeigersinn bzw. gegen den Uhrzeigersinn drehen.
- Präsentieren Sie zunächst einen Stimulus mit niedriger Ortsfrequenz (0,042 Zyklen/Grad). Erhöhen Sie dann die Frequenz progressiv, bis die Tracking-Bewegung nicht mehr bemerkt wird. Die höchste Ortsfrequenz, in der eine deutliche OMR hervorgerufen wird, entspricht der Schwellenortfrequenz des ausgewerteten Auges.
- Wenn das Tier während der Untersuchung von der Plattform fällt, bringen Sie es sofort auf die Plattform zurück und setzen Sie den Test fort.
3. Aufnahme des Muster-Elektroretinogramms (PERG)
HINWEIS: Das Elektroretinogramm wurde mit einem speziellen System zur Signalverarbeitung und zugehöriger Software zur Speicherung und Analyse der Wellenformen aufgezeichnet.
- Die Tiere werden durch intramuskuläre Injektion von Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid (75 mg/kg bzw. 5 mg/kg) tief betäubt. Die Tiefenanästhesie (Operationsebene) verringert die Wahrscheinlichkeit von Artefakten durch unwillkürliche Muskelbewegungen oder alternative Geräuschquellen während der Untersuchung. Überprüfen Sie, ob die Anästhesie richtig ist, indem Sie eine Zehenkneifreaktion durchführen.
ANMERKUNG: Die erwähnten Anästhetika beeinflussen nicht die Amplitude der Reaktion26. Da eine kleine Nadel, die in die Hornhaut eingeführt wurde, als aktive Elektrode verwendet wurde, wird die intramuskuläre Anästhesie der intraperitonealen vorgezogen, da sie leichter zu injizieren ist, falls die Ratte eine Auffrischungsdosis (1/2 der ursprünglichen Dosis) benötigt, mit geringeren Chancen, die Elektrodenposition zu verändern, was zu reproduzierbareren Aufzeichnungen während des gesamten Experiments führt. die bis zu 60 Minuten dauern kann. - Betäuben Sie die Hornhaut topisch mit einem Tropfen Proxymetacainhydrochlorid 0,5% und halten Sie das Auge mit ophthalmologischen Gleitmitteln befeuchtet.
- Führen Sie die aktive Elektrode (Edelstahlnadel 0,25 mm × 15 mm) vorsichtig am Schläfenumfang der Hornhaut ein. Zusätzlich werden die Referenz- und Masseelektroden (Edelstahlnadel 0,4 mm × 37 mm) in das Unterhautgewebe des ipsilateralen Schläfenkanthus bzw. in eine der Hintergliedmaßen eingeführt (Abbildung 1I).
- Für PERG stellen Sie den Stimulus auf ein schwarz-weißes Reserve-Schachbrett ein, das sich mit 15 Umkehrungen/s bei konstanter mittlerer Leuchtdichte (250 cd/m2) abwechselt. Stellen Sie den Bandpassfilter auf 1 Hz bis 100 Hz ein.
ANMERKUNG: Der schnell umkehrende Stimulus erzeugt den stationären PERG, eine stabile und reproduzierbare Sinuskurve, die die Wellenkomponente sammelt, die am wahrscheinlichsten mit der bioelektrischen Reaktion von RGC verbunden ist: die NII-Ablenkung des transienten PERG. - Positionieren Sie das Tier in einem Abstand von 20 cm zum Stimulusbildschirm (LCD-Monitor 0,58 m; Abbildung 1I), überwachen Sie die Signalbasislinie und starten Sie die PENG-Erfassung, indem Sie die Analysetaste am Erfassungssystem drücken.
- Halten Sie die Tiere während des Eingriffs an das Umgebungslicht angepasst (weißes Licht von ~140 Lux). Hier wurden sechs unterschiedliche Ortsfrequenzen (in Zyklen pro Grad: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) in zufälliger Reihenfolge dargestellt.
HINWEIS: Die für die Signalverarbeitung verwendete Software führt automatisch die Mittelwertbildung durch. Der Durchschnitt von 200-300 Einzelwellen wurde als ausreichend angesehen, um sich vom Rauschen abzuheben und die Wellenamplitude zu analysieren.
4. Quantifizierung von retinalen Ganglienzellen, Somas
ANMERKUNG: Das folgende Verfahren dient zur Quantifizierung von RGC-Somas und basiert auf der immunhistochemischen Färbung von retinalen Flat-Mounts mit einem Antikörper gegen das hirnspezifische Homöobox/POU-Domänenprotein 3A (Brn3a).
- Versuchstiere werden einer Euthanasie der Gebärmutterhalsverrenkung unterzogen, der eine Kohlendioxid-Inhalation vorausgeht, um Bewusstlosigkeit herbeizuführen.
- Unmittelbar nach der Euthanasie werden beide Augen unter einem Stereomikroskop mit einer Zahnzange und einer gebogenen Schere präpariert.
- Führen Sie eine sorgfältige Dissektion durch, so dass sowohl der distale Teil der extraokularen Muskeln als auch der Karunkel mit der Kugel verbunden bleiben, da sie wichtige Orientierungspunkte für die topografische Orientierung der Netzhaut sind (beschrieben in Schritt 4.5). Versuchen Sie, einen Abschnitt des Sehnervs, der mit dem Globus verbunden ist, so lange wie möglich für zukünftige Analysen aufzubewahren.
- Nach der Enukleation werden die Augen in eine 1-ml-Lösung mit 4 % Paraformaldehyd (4 % PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (PBS) gelegt und 24 Stunden lang aufbewahrt, um eine ordnungsgemäße chemische Fixierung zu gewährleisten.
- Trennen Sie die Netzhaut vom Rest des Augengewebes.
- Legen Sie den Augapfel unter einem Präpariermikroskop in eine Petrischale, die mit 1x PBS bedeckt ist, und achten Sie auf wichtige Orientierungspunkte wie Nasenkarunkel, Aderhautfissuren und Skleraabdrücke von Wirbelvenen für die richtige topografische Orientierung27.
- Die vordere Augenkammer wird von der zentralen Hornhaut aus mit einer Zahnzange und einer gebogenen Schere (Westcott) durchdrungen. Machen Sie zwei radiale Schnitte zum oberen (dorsalen) Aspekt der Sklera in Richtung des Foramen skleralis des Sehnervs, um den dorsalen Quadranten des Augapfels zu begrenzen.
- Trennen Sie die Hornhaut vom Rest des Globus durch einen 360°-Längsschnitt am Sklerallimbus. Entfernen Sie die Linse und die Iris und begrenzen Sie den dorsalen Netzhautquadranten mit den oben beschriebenen radialen Abgrenzungen der Sklera (Schritt 4.5.2).
- Lösen Sie vorsichtig das Netzhautgewebe von der Aderhaut und der Sklera und vermeiden Sie sowohl zufällige Risse im gesamten Gewebe als auch einen eventuellen topografischen Orientierungsverlust.
- Trennen Sie den Ziliarkörper von der retinalen Ora serrata. Entfernen Sie vorsichtig den verbliebenen Glaskörper aus der Netzhautpfanne, indem Sie sowohl eine gebogene, nicht gezahnte Pinzette als auch eine gebogene Schere (Glaskörper ziehen und in der Nähe der inneren Begrenzungsmembran präparieren) und eine kleine Bürste verwenden.
HINWEIS: Die Entfernung des Glaskörpers ist ein wichtiger Schritt, um ein starkes und sauberes immunhistochemisches Signal zu erhalten.
- Übertragen Sie isolierte Netzhäute in eine 24-Well-Kulturplatte (eine Netzhaut pro Well), die 1 ml 1x PBS enthält, und halten Sie die innere Netzhaut nach oben.
- Permeabilisieren Sie das Gewebe, indem Sie das Gewebe 3x für 10 Minuten mit einem nichtionischen Tensid 0,5% verdünnt in 1x PBS (0,3 ml) waschen. Halten Sie dann das Gewebe vorsichtig geschüttelt in 5 % Rinderserumalbumin (BSA), in 2 % nichtionischem Tensid und 1x PBS (Blockierungslösung; 0,25 ml) für 60 Minuten bei Raumtemperatur.
- In Schritt 4.7 wird die Brn3a-Primärantikörperlösung durch Verdünnung von 0,5 % und 1x PBS plus 5 % BSA im Verhältnis 1:200 in nichtionisches Tensid hergestellt und bei 4 °C gelagert.
- Nach 60 Minuten Gewebeblockierung werden die Netzhäute in 0,2 ml primärer Antikörperlösung bei 4 °C für 72 Stunden unter leichtem Schütteln inkubiert.
- Waschen Sie das Gewebe 3x für 10 min mit 1x PBS, dann inkubieren Sie das Gewebe für 2 h bei Raumtemperatur in 0,2 mL der Sekundärantikörperlösung, verdünnt 1:750 in 1x PBS plus 5% BSA.
- Des Weiteren wird das Gewebe 10 Minuten lang in einer nuklearen Gegenfärbungslösung für die Färbung fluoreszierender Kerne inkubiert. Beenden Sie die Immunhistochemie mit einem abschließenden Waschschritt mit 1x PBS (0,3 ml), der 3x wiederholt wird.
- Übertragen Sie die Netzhaut mit Hilfe von zwei kleinen Pinseln auf Objektträger aus Glas, wobei die Glaskörperseite nach oben gerichtet bleibt. Positionieren Sie den dorsalen Netzhautquadranten nach oben auf den Objektträgern (zuvor in Schritt 4.5.3 abgegrenzt). Machen Sie zwei weitere radiale Schnitte in Richtung des Sehnervenkopfes, um die anderen 3 Quadranten (nasal, ventral und temporal) abzugrenzen.
HINWEIS: Die Schnittmaße sind nicht festgelegt. Sie sollten nicht zu kurz sein, um eine effiziente Abflachung der Netzhaut auf dem Objektträger zu beeinträchtigen und nicht zu lang, damit sie das Foramen des Sehnervs erreichen und den abgegrenzten Netzhautquadranten vollständig vom restlichen Gewebe trennen. - Tragen Sie zum Schluss 0,2 ml Antifade-Eindeckmedium auf ein Deckglas auf und legen Sie dieses zur gewebemikroskopischen Analyse auf die flach montierte Netzhaut. Um die RGC-Dichte abzuschätzen, untersuchen Sie die flachen Montierungen unter einem konfokalen Epifluoreszenzmikroskop mit einem 40x/1,3-Objektiv.
- Machen Sie für jeden Quadranten der Netzhaut acht Fotos: zwei von der zentralen Netzhaut (~0,9 mm von der Papille), drei von der mittleren Netzhaut (~2,0 mm von der Papille) und drei von der peripheren Netzhaut (~3,7 mm von der Papille), insgesamt 32 Fotos pro Netzhaut. Verwenden Sie die FIJI-Software, um Brn3a-positive Zellen zu zählen und die mittlere Zelldichte zu schätzen.
5. Untersuchung des Sehnervs
- Nach der Euthanasie und der Enukleation des Augapfels (Schritte 4.1-4.3) wird das proximale Segment des intraorbitalen Teils des Sehnervs (1-2 mm), einschließlich eines Teils des intraokularen Anteils, entfernt und die Proben sofort 2 h lang in Fläschchen/Röhrchen mit 0,2-0,3 ml kaltem Fixiermittel (2,5 % Glutaraldehydlösung in 0,1 M Natriumkacodylatpuffer (pH 7,4)) gegeben.
HINWEIS: Die folgenden Schritte für die Verarbeitung des Sehnervs werden in denselben Fläschchen/Röhrchen aus Schritt 5.1 durchgeführt - Waschen Sie das Material 3x für 5 min mit kaltem 0,1 M Natriumcacodylat-Puffer. Nach der Fixierung des Gewebes für 1 Stunde unter leichtem Schütteln in einer Lösung von 1,0 % Osmiumtetroxid in 0,8 % Kaliumferrocyanid und 5 nM Calciumchlorid, verdünnt in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer bei 4 °C (0,1-0,2 ml).
- Sehnervenfragmente 3x für 5 min mit kaltem 0,1 M Natriumcacodylatpuffer und anschließend mit kaltem destilliertem Wasser 3x für 1 min waschen. Bewahren Sie das Material über Nacht unter leichtem Schütteln in einer Lösung aus 1,0%igem Uranylacetat in destilliertem Wasser auf, um es bei 4 °C (0,1-0,2 ml) zu färben. Bruchstücke 3x mit kaltem destilliertem Wasser waschen.
- Das Gewebe wird schrittweise mit einer abgestuften Acetonreihe (je 0,5 ml) dehydriert, wobei anschließend die folgenden Verdünnungen in destilliertem Wasser ersetzt werden: 2x 7 min Inkubation in 15% eiskaltem Aceton; 2x 7 min Inkubation in 30% eiskaltem Aceton; 2x 7 min Inkubation in 50% eiskaltem Aceton; 2x 7 min Inkubation in 70% eiskaltem Aceton; 2x 7 min Inkubation in 80% eiskaltem Aceton; 2x 7 min Inkubation in 90% eiskaltem Aceton; 2x 15 min Inkubation in 100% Aceton bei Raumtemperatur (RT).
- Führen Sie 3 Infiltrations-/Einbettungsschritte durch, mit anschließendem Austausch der folgenden Lösungen: 1 Teil Epoxidharz: 2 Teile Aceton (Gesamtvolumen: 0,5 ml), bei RT für 12 h; 1 Teil Epoxidharz: 1 Teil Aceton (Gesamtvolumen: 0,5 ml), bei RT für 12 h; 2 Teile Epoxidharz: 1 Teil Aceton (Gesamtvolumen: 0,5 ml), bei RT für 12 h. Zum Schluss wird das Gewebe 24 h lang in reinem Epoxidharz bei RT infiltriert.
- Entnehmen Sie die Proben aus dem Probenträger, überführen Sie sie in Einbettformen und lassen Sie sie 48 Stunden lang bei 60 °C polymerisieren. Mit einem Ultramikrotom werden transversale halbdünne Schnitte (300-400 nm) der Sehnervenfragmente geschnitten, gesammelt und auf einen Objektträger übertragen. Schnitte mit Toluidinblau färben und mit dem optischen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung abbilden.
- Für die ultrastrukturelle Analyse werden ultradünne Querschnitte (70 nm) durchgeführt, auf Kupfergittern gesammelt und mit Uranylacetat und Bleicitrat angefärbt. Untersuchen Sie die Schnitte in einem Transmissionselektronenmikroskop.
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Representative Results
Die quantitativen Variablen werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ausgedrückt. Mit Ausnahme des Vergleichs der IOD-Dynamik zwischen OHT- und Kontrollgruppen (Abbildung 1F) wurde die statistische Analyse mittels Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Abbildung 1 zeigt die chirurgischen Schritte des Modells der Full-Circle-Limbusplexus-Kauterisation (LPC) mit wichtigen Meilensteinen wie dem 360°-thermisch induzierten Verschwinden der limbalen Gefäße sowie der leichten bis mittelschweren Mydriasis im operierten Auge am Ende des Eingriffs.
In der vorliegenden Serie von 131 Ratten führte die Vollkreis-Kauterisation des Limbusplexus (LPC) zu einer Erhöhung des Augeninnendrucks unmittelbar nach der Operation von 13,0 ± 0,2 mmHg zu Studienbeginn auf 22,7 ± 0,4 mmHg. Der postoperative IOD-Spitzenwert wurde am ersten Tag nach der Operation beobachtet (25,3 ± 0,6 mmHg), gefolgt von einer allmählichen Rückkehr zum Ausgangswert am 6. postoperativen Tag (statistische Analyse: multipler t-Test, korrigiert um Mehrfachvergleiche mit der Holm-Sidak-Methode; Abbildung 1F). Hornhautfibrose oder Ödeme waren klinische Interzidiven, die möglicherweise die genaue IOD-Messung beeinträchtigen konnten. Die erste war einerseits selten, betraf 3,92 % der Tiere und wurde erst spät während der postoperativen Nachbeobachtung bemerkt, wodurch die ersten 5 Tage der okulären Hypertonie verschont blieben und das beschriebene subakute OHT-Profil erhalten blieb23. Das Hornhautödem hingegen war eine häufigere Komplikation, die in den ersten Tagen nach der Operation (1-3 Tage) beobachtet wurde, aber meist mild und vorübergehend war und daher den IOD nicht stark beeinflusste23.
Die Netzhautfunktion wurde sowohl verhaltensbezogen als auch elektrophysiologisch anhand des optomotorischen Reflexes bzw. des Muster-ERG bewertet (Abbildung 1G-J). Beide Parameter zeigten zwei Phasen der Beeinträchtigung: eine akute Phase der okulären Hypertonie am 3. Tag nach der Operation und eine sekundäre Degenerationsphase am 30. Tag nach der Operation (Abbildung 1H, Abbildung J und Tabelle 1). Dazwischen wurde eine Periode der funktionellen Erholung festgestellt, wie bereits an anderer Stelle diskutiert23.
Im Vergleich zu den Kontroll-Sehnerven zeigten die axonalen Zählungen in halbdünnen transversalen Sehnervenabschnitten nach der Operation eine fortschreitende Abnahme (3. Tag: 68,3 % ± 0,9 %; 7. Tag: 59,2 % ± 2,6 %; 14. Tag: 45,4 % ± 2,2 %; 30. Tag: 28,2 % ± 3,0 %; bidirektionale ANOVA: p < 0,0001; Abbildung 2A). Ultrastrukturell zeigten die Sehnerven der Kontrollaugen dicht gepackte myelinisierte Fasern, die durch dünne Gliazellfortsätze getrennt waren, sowie deutliche axonale Mikrotubuli und Neurofilamente (Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu fanden wir 3 Tage nach der OHT eine fokale Störung von Axonbündeln, einige degenerierte Fasern, zytoplasmatische Vakuolisierung in Gliazellprozessen und kondensiertes Chromatin in Gliazellkernen. Nach 7-tägiger OHT-Induktion kam es zu einer Zunahme degenerierter axonaler Fasern, hypertropher Gliazellfortsätze sowie Schwellungen und Hohlräume in einzelnen axonalen Fasern. Nach 14 Tagen war eine der auffälligsten Veränderungen eine größere Anordnung der Sehnervenfasern, die mit der Invasion von Gliazellfortsätzen zwischen den Axonen verbunden war. Filamentbündel füllten diese Prozesse und dunkle degenerierte Fasern, und der Myelinabbau war häufiger, verbunden mit abgelösten und vakuolisierten Lamellen (Abbildung 2B).
Die Dichte der Brn3a+-Profile nahm im Laufe der Zeit ab (Abbildung 2C), hauptsächlich in den dorsalen und temporalen Netzhautquadranten, auf 32,4 % ± 9,6 % bzw. 35,7 % ± 9,1 % nach 30 Tagen (Abbildungen 2D-G und Tabelle 2).
Abbildung 1: Thermische Kauterisation des limbalen Gefäßplexus und Konsequenzen für die Netzhautfunktion in vivo. (A) Alternative Methoden zur Messung des Augeninnendrucks bei Ratten: Rebound-Tonometrie (superior) und Applanationstonometrie (inferior). (B-E) Chirurgischer Eingriff; Pfeilspitze: limbaler Gefäßplexus; Pfeil: gekrümmte Pinzette, die verwendet wird, um die vordere Oberfläche des Augapfels freizulegen und die chirurgische Beurteilung der limbalen Gefäße zu optimieren; Haschisch: die runde Spitze des Niedertemperatur-Augenkauters; Sternchen: Kauterisierungsmarke. Maßstab: 2 mm. Der Einsatz in (D) zeigt in höherer Vergrößerung das zu kauterisierende limbale Gefäßsystem. (F) Zeitlicher Verlauf der IOD-Messungen in OHT (rot) und Kontrollaugen (schwarz) (n = 131). Vertikaler Pfeil nach unten: LPC-Chirurgie. * = p < 0,05 (G) Arena für die Analyse der optomotorischen Reaktion, bestehend aus vier Computermonitoren, die in einem Viereck angeordnet sind, mit einer Plattform in der Mitte. Die Monitore zeigen das Bild eines virtuellen Zylinders, der aus vertikalen, abwechselnd schwarzen und weißen Streifen besteht, die sich mit konstanter Rotationsgeschwindigkeit und variablen Ortsfrequenzen um das Tier bewegen. Das rote Fadenkreuz entspricht der Mitte des virtuellen Zylinders. (H) Optomotorische Reaktionen. Bei der chirurgischen Nachsorge werden zwei verschiedene Phasen unterschieden: die OHT-Phase (0-5 Tage) und die sekundäre Degenerationsphase (6-30 Tage). = p < 0,0001. (I) Elektroden und Tierpositionierung für die Muster-ERG-Erfassung (PERG): die aktive Elektrode an der Schläfenperipherie der Hornhaut sowie die Referenz- und Erdungselektroden in das subkutane Gewebe des ipsilateralen Schläfenkanthus bzw. einer der Hintergliedmaßen. Das Tier befindet sich in einem Abstand von 20 cm zum Stimulusschirm. (J) PENG-Amplitude bei Stimuli mit unterschiedlichen Ortsfrequenzen. Ähnlich wie bei der optomotorischen Reaktion zeigt auch die PENG-Auswertung zwei unterschiedliche Phasen des Ansprechens nach der Operation: okuläre Hypertonie 3 Tage nach der Operation, gefolgt von einer Erholung an Tag 7 und 14, obwohl statistisch immer noch niedriger als naive Reaktionen, und eine anschließende Abnahme am Tag 30 nach der Operation. c/d = Zyklen pro Grad. Naive Gruppe: Augen von Tieren, die keiner vorherigen experimentellen Manipulation ausgesetzt waren. (H) und (J) zeigen den Mittelwert ± REM zuzüglich einzelner Replikate in (H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Strukturelle Beurteilung der Netzhaut und des Sehnervs nach limbaler Gefäßplexuskauterisation (LPC) mit Niedertemperatur-Augenkauterisation. (A) Die Axonzählung erfolgt zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der OHT (n = 3). = p = 0,0005, **** = p < 0,0001. (B) Elektronenmikroskopische Aufnahmen der Sehnervendegeneration nach OHT. Das linke Bild zeigt den Kontrollsehnerv, und die folgenden Bilder veranschaulichen die fortschreitende Degeneration nach 3, 7 und 14 Tagen OHT. Pfeilspitze: normale myelinisierte Fasern; dünne Pfeile: degenerierte Fasern; Sternchen: zytoplasmatische Vakuolisierung; Hashes: Prozess der Gliazellen; und Nu: Gliazellkern. (C) Mikrofotografien repräsentativer Zählfelder von RGCs, die mit einem Antikörper gegen Brn3a (rot) und TO-PRO3-markierte Kerne (blau) markiert sind; Maßstab: 50μm. (D-G) Verteilung der durchschnittlichen Brn3a+ Zelldichte in den vier Quadranten der Netzhaut nach 3-30 Tagen Operation. Die Diagramme zeigen individuelle Durchschnittswerte der RGC-Dichten für 3-11 Tiere pro Zeit nach dem Eingriff. * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001; = p < 0,0001. Quantitative Daten sind Mittelwerte ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Statistische Analyse der PENG-Daten. Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. c/d = Zyklen pro Grad. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Regionaler Verlust von RGC nach LPC. SEM: Standardfehler des Mittelwerts. Kontrolle: Mitauge. P-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen (*). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Die Limbus-Plexus-Kauterisation (LPC) ist ein neuartiges posttrabekuläres Modell mit dem Vorteil, dass es auf leicht zugängliche Gefäßstrukturen abzielt, die keine Konjunktival- oder Zapfendissektion erfordern17,28. Anders als beim Vortex-Venen-Kauterisierungsmodell, einem renommierten OHT-Modell, das auf der chirurgischen Beeinträchtigung der Aderhautvenendrainage basiert, ist nicht zu erwarten, dass eine venöse Stauung den IOD-Anstieg im LPC-Modell beeinflusst, da sich Limbusvenen stromaufwärts im Kammerwasserabfluss befinden. Außerdem ist es technisch leicht zu erlernen und kostengünstig, da es meist einen Niedertemperatur-Thermokauter erfordert. Darüber hinaus ist es mit einer einzigartigen Rate der OHT-Induktion und einer vollständigen klinischen Genesung (> 90 %, wie bereits berichtet) verbunden23, was die Anzahl der für Versuche erforderlichen Tiere reduziert und sowohl elektrophysiologische als auch Verhaltensanalysen ermöglicht. Schließlich ist eine glaukomatöse Degeneration sowohl in der RGC-Schicht als auch im Sehnerv in einem relativ kurzen Zeitrahmen nach der Operation vorhanden, was sowohl kurz- als auch mittelfristige Versuchspläne ermöglicht23. Zukünftige Studien sind notwendig, um die Auswirkungen der Kauterisierung des limbalen Gefäßsystems auf einzelne Netzhautschichten weiter aufzuklären.
Kritische Schritte im Operationsprotokoll sind: (1) Die Kauterisierungsspitze muss den Skleralimbus parallel zur Gefäßachse sanft berühren; (2) Hornhautgewebe muss geschont werden, nicht nur während der Kauterisation, sondern auch bei der Manipulation von Tieren. Führen Sie regelmäßig die Instillation von Augentropfen und die Entfernung überschüssiger Lösung von der Augenoberfläche mit einem Wattestäbchen durch (achten Sie darauf, das Wattestäbchen nicht auf der Hornhautoberfläche zu schrubben, während Sie Flüssigkeit entfernen, da dies zu Hornhautepithelabrieb und eventuellen postoperativen Komplikationen führt). (3) Ein vollständiger Kreis zusammenhängender Kauterisierungsmarken sollte visualisiert werden; (4) Vernachlässigen Sie nicht die postoperative klinische Nachsorge mit einem nichtsteroidalen Antirheumatika und einer antibiotischen Salbe, mindestens bis zum 5. Tag nach der Operation.
Die im beschriebenen Modell beobachtete subakute IOD-Erhöhung unterscheidet sich von der Druckdynamik des Offenwinkelglaukoms, ähnelt aber dem akuten Winkelverschlussglaukom, dem neovaskulären Glaukom oder mehreren Arten von posttrabekulärem Glaukom mit erhöhtem episkleralen Venendruck29. Dies ist eine wesentliche Einschränkung dieser Methode, da das Offenwinkelglaukom der häufigste Phänotyp der Krankheit ist, der durch chronische OHT und langsam fortschreitende RGC-Degeneration gekennzeichnet ist. Nichtsdestotrotz stellt die Assoziation der fortschreitenden Normalisierung des Augeninnendrucks mit der kontinuierlichen RGC-Degeneration eine einzigartige Gelegenheit dar, im selben Tiermodell sowohl die biologischen Mechanismen zu untersuchen, die die okuläre Hypertonie mit der Entwicklung und dem Fortschreiten des Glaukoms verbinden, als auch den sekundären degenerativen Prozess, der hauptsächlich bei Offenwinkelglaukomfällen beobachtet wird, woraufhin die Patienten trotz klinischer oder chirurgischer Erfolge beim Erreichen des Ziel-IOD30 ein Glaukomfortschreiten aufweisen. Daher stellt dieses Modell eine Gelegenheit dar, dieses Phänomen durch kurz- oder mittelfristige Versuchsdesigns besser aufzuklären und schließlich druckunabhängige neuroprotektive Therapien zu entwickeln, die Patienten zugute kommen, die trotz bester IOD-Kontrollbehandlung immer noch ihr Augenlicht verlieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken unseren Labortechnikern José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza und Luciano Cavalcante Ferreira. Diese Forschung wurde von FAPERJ, CNPq und CAPES finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | - | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | - | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | - | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | - | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | - | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | - | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | - | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
References
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