Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di caratterizzare un nuovo modello di neurodegenerazione glaucomatosa basato sulla cauterizzazione termica a 360° del plesso vascolare limbare, inducendo ipertensione oculare subacuta.
Abstract
Il glaucoma, la seconda causa di cecità in tutto il mondo, è un gruppo eterogeneo di disturbi oculari caratterizzati da danni strutturali al nervo ottico e degenerazione delle cellule gangliari retiniche (RGC), con conseguente disfunzione visiva interrompendo la trasmissione delle informazioni visive dall'occhio al cervello. L'elevata pressione intraoculare è il fattore di rischio più importante; Pertanto, diversi modelli di ipertensione oculare sono stati sviluppati nei roditori con approcci genetici o sperimentali per indagare le cause e gli effetti della malattia. Tra questi, sono stati segnalati alcuni limiti come l'invasività chirurgica, l'inadeguata valutazione funzionale, la necessità di una formazione approfondita e l'estensione altamente variabile del danno retinico. Il presente lavoro caratterizza un metodo semplice, a basso costo ed efficiente per indurre l'ipertensione oculare nei roditori, basato sulla cauterizzazione a bassa temperatura e a cerchio completo del plesso vascolare limbare, una componente importante del drenaggio dell'umore acqueo. Il nuovo modello fornisce un'ipertensione oculare subacuta tecnicamente facile, non invasiva e riproducibile, associata a RGC progressiva e degenerazione del nervo ottico, e un tasso di recupero clinico post-operatorio unico che consente studi funzionali in vivo con metodi sia elettrofisiologici che comportamentali.
Introduction
La letteratura medica comprende il glaucoma come un gruppo eterogeneo di neuropatie ottiche caratterizzate da una progressiva degenerazione delle cellule gangliari retiniche (RGC), dendriti, soma e assoni, con conseguente coppettazione strutturale (scavo) del disco ottico e deterioramento funzionale del nervo ottico, che porta all'amaurosi nei casi non controllati interrompendo la trasmissione delle informazioni visive dall'occhio al cervello1. Il glaucoma è attualmente la causa più comune di cecità irreversibile in tutto il mondo, e si prevede che raggiungerà circa 111,8 milioni di persone nel 20402, influenzando così profondamente la qualità della vita dei pazienti (QoL) e portando a significative preoccupazioni socioeconomiche3.
L'elevata pressione intraoculare (IOP) è uno dei più importanti e l'unico fattore di rischio modificabile per lo sviluppo e la progressione del glaucoma. Tra i molteplici tipi di glaucoma, tutti, ad eccezione del glaucoma tensivo normale (NTG), sono associati a IOP elevata in qualche momento della storia clinica della malattia. Nonostante i notevoli progressi clinici e chirurgici per indirizzare la IOP e rallentare o arrestare la progressione della malattia, i pazienti perdono ancora la vista a causa del glaucoma 4,5. Pertanto, una comprensione approfondita della fisiopatologia complessa e multifattoriale di questa malattia è indispensabile per lo sviluppo di trattamenti più efficaci, in particolare per fornire neuroprotezione alle RGC.
Tra una varietà di approcci sperimentali per la comprensione dei meccanismi della malattia, i modelli animali basati sull'ipertensione oculare (OHT) assomigliano più da vicino al glaucoma umano. I modelli di roditori sono particolarmente utili in quanto sono a basso costo, sono facili da maneggiare, possono essere manipolati geneticamente, hanno una breve durata di vita e presentano caratteristiche anatomiche e fisiologiche oculari paragonabili a quelle umane, come la produzione di umore acqueo e il drenaggio 6,7,8,9,10,11,12,13 . I modelli attualmente utilizzati includono la sclerosi del trabecolato a seguito di iniezione di soluzione salina ipertonica nelle vene episclerali 14, l'iniezione intracamerale di microsfere15 o sostanze viscoelastiche 16, la cauterizzazione delle vene a vortice17, la fotocoagulazione del trabecolato con laser ad argon 18, la sutura circumlimbale 19 e l'uso di un modello transgenico di OHT legato all'età (topi DBA/2J)8. Tuttavia, l'invasività, l'opacizzazione post-operatoria della cornea, l'interruzione del segmento anteriore, le ampie curve di apprendimento, le attrezzature costose e le IOP postoperatorie altamente variabili, sono tra le insidie segnalate associate ai modelli attuali, rendendo lo sviluppo di un modello alternativo di OHT una richiesta per superare questi problemi20,21,22.
Il presente protocollo formalizza una nuova procedura chirurgica per indurre l'OHT come proxy del glaucoma, basata sulla cauterizzazione del plesso limbare (LPC) nei roditori23. Si tratta di un modello facile, riproducibile, accessibile e non invasivo che fornisce un'elevata efficienza e una bassa variabilità dell'aumento della IOP, associata a un tasso eccezionalmente elevato di recupero clinico completo, fornendo quindi una valutazione funzionale in vivo in un numero ridotto di animali utilizzati in ciascun esperimento. La tecnica chirurgica induce OHT subacuta con un graduale ritorno ai livelli basali in pochi giorni, che modella l'attacco ipertensivo osservato nel glaucoma acuto ad angolo chiuso. Inoltre, il recupero della IOP nel modello è seguito da una continua neurodegenerazione glaucomatosa, utile per futuri studi meccanicistici sulla degenerazione secondaria delle RGC, che si verifica in diversi casi di glaucoma umano nonostante un adeguato controllo della IOP.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la Dichiarazione per l'Uso degli Animali nella Ricerca Oftalmica e Visiva dell'Associazione per la Ricerca sulla Visione e l'Oftalmologia (ARVO) e approvate dal Comitato Etico per l'Uso degli Animali nella Sperimentazione Scientifica del Centro di Scienze della Salute dell'Università Federale di Rio de Janeiro (protocollo 083/17). Nel presente lavoro sono stati utilizzati ratti Lister Hooded di entrambi i sessi, di età compresa tra 2 e 3 mesi e del peso di 180-320 g. Tuttavia, la procedura può essere adattata a diversi ceppi di ratti di varie fasce d'età.
1. Chirurgia dell'ipertensione oculare e follow-up clinico
- Animali di stabulazione in ambiente a temperatura controllata e ciclo luce/buio di 12 ore (6 ore: luce accesa/ 18: luce spenta) con mangime standard pellettizzato irradiato con raggi gamma (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brasile) e acqua (triplo filtro, con carbone attivo atossico) disponibile ad libitum.
- Preparare una miscela di cocktail anestetico di riserva composta da tre parti di ketamina cloridrato al 10% e una parte di cloridrato di xilazina al 2% (diluente: acqua sterile).
- Trattenere delicatamente l'animale tenendo la pelle dorsale e indurre l'anestesia mediante somministrazione intraperitoneale di 1 μL/g di peso corporeo della miscela (ketamina: 75 mg/kg; xilazina: 5 mg/kg). Verificare la corretta anestesia dopo circa 5 minuti eseguendo una risposta di pizzicamento delle dita dei piedi.
- Anestetizzare localmente entrambe le superfici oculari instillando un collirio di proxymetacaina cloridrato allo 0,5%. Attendere 30-60 s e rimuovere la soluzione rimanente dalla faccia anteriore del globo, toccando delicatamente la congiuntiva bulbare nasale o laterale con un piccolo batuffolo di cotone sterile.
- Misurare la IOP basale degli occhi di controllo sperimentali e controlaterali posizionando l'animale in una posizione di decubito ventrale sul banco in modo che la superficie corneale sia facilmente accessibile alla punta del tonometro.
- Utilizzare un tonometro portatile ad applanazione o a rimbalzo (Figura 1A). Posizionare la punta del tonometro in modo che tocchi leggermente perpendicolarmente la zona corneale centrale. Acquisisci e calcola la media di 3-5 medie affidabili generate dalla macchina. Ogni media viene calcolata automaticamente dal dispositivo dopo sei misurazioni individuali riuscite.
- Caricare il tonometro a rimbalzo con una sonda e premere una volta il pulsante di misurazione per accenderlo, posizionando la punta del dispositivo verso l'alto, per evitare che la sonda cada. Dopo l'accensione, il display visualizzerà 00 indicando che l'apparecchiatura è pronta per la misurazione.
- Posizionare il dispositivo con la punta della sonda a una distanza di 1-4 mm dalla cornea e acquisire le misurazioni premendo rapidamente e con attenzione il pulsante di misurazione, senza spostare l'apparecchiatura. Ogni misura riuscita viene identificata da un breve segnale acustico e, dopo sei volte, la media viene visualizzata sullo schermo del dispositivo.
NOTA: Nonostante una lunga esperienza con il tonometro ad applanazione, per ottimizzare l'intera procedura gli autori raccomandano l'uso di un tonometro a rimbalzo, che fornisce una più facile acquisizione di una misurazione affidabile della IOP.
- Posizionare l'animale in una posizione di decubito leggermente laterale sotto uno stereomicroscopio e pianificare attentamente l'intervento chirurgico ispezionando l'occhio sperimentale con un ingrandimento di 40x. Non dimenticare di mantenere lubrificato l'occhio di controllo controlaterale durante la procedura instillando una goccia di carmellosa sodica o ialuronato di sodio.
- Con l'aiuto di una pinza curva, spingere delicatamente in avanti il bulbo oculare sperimentale in modo da esporre la vascolarizzazione che circonda 360° del limbus13. Con l'altra mano, cauterizzare delicatamente i vasi sanguigni intorno alla cornea con un cauterizzatore oftalmico a bassa temperatura (1.300 °F; Bovie Medical, USA) (Figura 1B-E).
NOTA: Il cauterizzazione menzionato ha una punta rotonda che dovrebbe toccare longitudinalmente la vascolarizzazione limbare. - Fare attenzione a non cauterizzare la periferia corneale, in quanto ciò potrebbe causare un'opacizzazione corneale post-operatoria, che preclude la valutazione in vivo della funzione retinica.
- Osservare l'emergere di piccoli segni circolari di cauterizzazione sul limbus sclerale, l'obliterazione della vascolarizzazione limbare e la dilatazione della pupilla nell'occhio operato, che sono segni di una procedura chirurgica riuscita.
NOTA: Poiché la vascolarizzazione limbare di ratti e topi è anatomicamente simile13,24 e il cauterizzazione utilizzato ha una piccola punta delicata, questo protocollo può funzionare anche per l'occhio del topo senza alcun adattamento. - Dopo l'intervento chirurgico, controllare la IOP post-operatoria immediata in entrambi gli occhi, come descritto al punto 1.5.
- Applicare una goccia di prednisolone acetato oftalmico (1,2 mg/mL) e mantenerla a contatto con la superficie anteriore dell'occhio sperimentale per circa 40 s, quindi sostituirla con un unguento oftalmico di antibiotici (ossitetraciclina cloridrato 30 mg/g più polimixina B 10.000 U/g; o ciprofloxacina 3,5 mg/g). Eseguire un'iniezione intramuscolare di tramadolo cloridrato (dose singola; 2 mg/kg) per prevenire il dolore dopo la procedura.
- Seguire da vicino il recupero dell'animale dall'anestesia, preferibilmente in un ambiente caldo come un termoforo o all'interno della sua gabbia di stabulazione con lettiera adeguata. Prestare attenzione al modello respiratorio.
- Eseguire un follow-up clinico quotidiano dell'occhio sperimentale con farmaci topici composti da un farmaco antinfiammatorio non steroideo (FANS, ad es. ketorolac trometamolo 0,5% collirio) e unguento antibiotico (preferibilmente lo stesso utilizzato subito dopo l'intervento chirurgico).
NOTA: Si raccomanda l'uso di FANS piuttosto che di colliri antinfiammatori steroidei perché questi ultimi possono indurre OHT e vengono regolarmente applicati per i modelli di glaucoma indotto da glucocorticoidi nei roditori.- Sotto leggera sedazione (ketamina: 18,75 mg/kg; xilazina: 1,25 mg/kg), misurare preferenzialmente la IOP nello stesso periodo della giornata, per evitare distorsioni dovute alla fisiologica fluttuazione circadiana della IOP.
- Durante l'esame oculare, notare rare interazioni cliniche, come ifema, fibrosi corneale o assottigliamento sclerale associato a prolasso uveale. L'edema corneale, la chemosi e l'iperemia congiuntivale sono comuni ma temporanei.
- Notare il pieno recupero clinico intorno al 7° giorno postoperatorio. La rivascolarizzazione limbare di solito inizia nei primi due giorni dopo l'intervento, in linea con il previsto ritorno graduale della IOP al basale.
2. Analisi della risposta optomotoria (OMR)
NOTA: Per questa procedura è stato utilizzato un sistema specifico25.
- Disponi quattro monitor di computer in un quadrilatero, che delimitano un'arena con una piattaforma al centro. Sui monitor viene visualizzata l'immagine di un cilindro virtuale con griglie a onda sinusoidale orientate verticalmente (strisce bianche e nere alternate), che ruota attorno alla piattaforma a velocità (12 gradi/s) e contrasto (100%) fissi.
- Posizionare una videocamera sopra la piattaforma, consentendo allo sperimentatore di osservare i movimenti dell'animale. Eseguire il test in condizioni fotopiche e impostare preferenzialmente il software in modalità manuale/separata per valutare ogni occhio separatamente.
- Lasciare che gli animali si abituino per circa 2 minuti sulla piattaforma. Mantieni il cursore del mirino rosso sul fotogramma video tra gli occhi dell'animale che si muove liberamente, poiché indica il centro del cilindro virtuale (Figura 1G)25.
- Osservare l'OMR, che consiste in un tracciamento riflessivo della testa e del collo dell'animale suscitato dalle grate rotanti. Testare i percorsi visivi sinistro e destro ruotando le direzioni dei reticoli a onda sinusoidale rispettivamente in senso orario e antiorario.
- Inizialmente presentano uno stimolo con bassa frequenza spaziale (0,042 cicli/grado). Quindi, incrementa progressivamente la frequenza fino a quando il movimento di tracciamento non viene più notato. La frequenza spaziale più alta in cui viene suscitato un OMR chiaro corrisponde alla frequenza spaziale di soglia dell'occhio valutato.
- Se l'animale alla fine cade dalla piattaforma durante l'esame, riportarlo immediatamente sulla piattaforma e riprendere il test.
3. Registrazione dell'elettroretinogramma (PERG)
NOTA: L'elettroretinogramma è stato registrato utilizzando un sistema specifico per l'elaborazione del segnale e relativo software per la memorizzazione e l'analisi delle forme d'onda.
- Anestetizzare profondamente gli animali mediante iniezione intramuscolare di ketamina cloridrato e xilazina cloridrato (75 mg/kg e 5 mg/kg, rispettivamente). L'anestesia profonda (piano chirurgico) riduce le possibilità di artefatti dovuti a movimenti muscolari involontari o fonti alternative di rumore durante l'esame. Verificare la corretta anestesia eseguendo una risposta di pizzicamento delle dita dei piedi.
NOTA: Gli agenti anestetici menzionati non influenzano l'ampiezza della risposta26. Poiché un piccolo ago inserito nella cornea è stato utilizzato come elettrodo attivo, l'anestesia intramuscolare è preferita a quella intraperitoneale, in quanto è più facile da reiniettare nel caso in cui il ratto necessiti di una dose di richiamo (1/2 della dose iniziale), con minori possibilità di modificare la posizione dell'elettrodo e quindi portando a registrazioni più riproducibili durante l'intero esperimento. che può durare fino a 60 min. - Anestetizzare localmente la cornea con una goccia di cloridrato di proxymetacaina 0,5% e mantenere l'occhio inumidito con lubrificanti oftalmici.
- Inserire con cautela l'elettrodo attivo (ago in acciaio inossidabile da 0,25 mm × 15 mm) alla periferia temporale della cornea. Inoltre, inserire gli elettrodi di riferimento e di terra (ago in acciaio inossidabile da 0,4 mm × 37 mm) rispettivamente nel tessuto sottocutaneo del canto temporale omolaterale e in uno degli arti posteriori (Figura 1I).
- Per il PERG, impostare lo stimolo su una scacchiera di riserva in bianco e nero, alternata a 15 inversioni/s con luminanza media costante (250 cd/m2). Impostare il filtro passa-banda su 1 Hz-100 Hz.
NOTA: Lo stimolo a rapida inversione genera il PERG allo stato stazionario, una sinusoide stabile e riproducibile che raccoglie la componente d'onda più probabilmente associata alla risposta bioelettrica RGC: la deflessione NII del PERG allo stato transitorio. - Posizionare l'animale a 20 cm dallo schermo dello stimolo (monitor LCD 0,58 m; Figura 1I), monitorare la linea di base del segnale e avviare l'acquisizione PERG premendo il pulsante Analisi sul sistema di acquisizione.
- Durante la procedura, mantenere gli animali adattati alla luce ambientale (luce bianca di ~140 lux). Qui, sei frequenze spaziali distinte (in cicli per grado: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) sono state presentate in sequenza casuale.
NOTA: Il software utilizzato per l'elaborazione del segnale esegue automaticamente la media. La media di 200-300 singole onde è stata considerata adeguata per distinguersi dal rumore e analizzare l'ampiezza dell'onda.
4. Quantificazione delle cellule gangliari retiniche somas
NOTA: La seguente procedura è per la quantificazione dei somi RGC, basata sulla colorazione immunoistochimica di retine flat-mount con un anticorpo contro la proteina 3A del dominio omeobox/POU specifica del cervello (Brn3a).
- Sottoporre animali da esperimento all'eutanasia della lussazione cervicale, preceduta dall'inalazione di anidride carbonica per indurre perdita di coscienza.
- Subito dopo l'eutanasia, sezionare entrambi gli occhi con uno stereomicroscopio, usando pinze dentate e forbici ricurve.
- Eseguire un'attenta dissezione in modo che sia la porzione distale dei muscoli extraoculari che la caruncola rimangano attaccate al globo, in quanto sono importanti punti di riferimento per l'orientamento topografico della retina (descritto al punto 4.5). Cerca di conservare un tratto del nervo ottico attaccato al globo il più a lungo possibile per analisi future.
- Dopo l'enucleazione, immergere gli occhi in una soluzione da 1 mL di paraformaldeide al 4% (PFA al 4%) in tampone fosfato 0,1 M (PBS) e tenerlo per 24 ore per una corretta fissazione chimica.
- Separare la retina dal resto dei tessuti oculari.
- Sotto un microscopio da dissezione, posizionare il bulbo oculare in una capsula di Petri ricoperta da PBS 1x e prestare attenzione a punti di riferimento importanti come la caruncola nasale, le fessure coroidie e le impronte sclerali delle vene del vortice per un corretto orientamento topografico27.
- Penetrare nella camera anteriore dalla cornea centrale utilizzando una pinza dentata e forbici curve (westcott). Praticare due tagli radiali sulla faccia superiore (dorsale) della sclera, verso il forame sclerale del nervo ottico, in modo da delimitare il quadrante dorsale del bulbo oculare.
- Separare la cornea dal resto del globo attraverso un taglio longitudinale a 360° in corrispondenza del limbus sclerale. Rimuovere il cristallino e l'iride e delimitare il quadrante retinico dorsale utilizzando le stesse demarcazioni radiali sclerali sopra descritte (passaggio 4.5.2).
- Staccare accuratamente il tessuto retinico dalla coroide e dalla sclera, evitando sia lacerazioni casuali in tutto il tessuto che l'eventuale perdita di orientamento topografico.
- Separare il corpo ciliare dalla retina o serrata. Rimuovere con cautela il vitreo rimanente dalla coppa retinica utilizzando sia una pinza curva non dentata che forbici curve (tirare il vitreo e sezionarlo vicino alla membrana limitante interna) e un piccolo spazzolino.
NOTA: La rimozione dell'umor vitreo è un passo importante per ottenere un segnale immunoistochimico forte e pulito.
- Trasferire le retine isolate in una piastra di coltura a 24 pozzetti (una retina per pozzetto) contenente 1 mL di PBS 1x e tenere la retina interna rivolta verso l'alto.
- Permeabilizzare il tessuto lavando 3 volte per 10 minuti con un tensioattivo non ionico diluito allo 0,5% in 1x PBS (0,3 mL). Quindi agitare delicatamente il tessuto in albumina sierica bovina al 5% (BSA) in tensioattivo non ionico al 2% e 1x PBS (soluzione bloccante; 0,25 ml) per 60 minuti a temperatura ambiente.
- Durante la fase 4.7, preparare la soluzione di anticorpi primari Brn3a diluendo 1:200 in tensioattivo non ionico allo 0,5% e 1x PBS più 5% di BSA e conservarla a 4 °C.
- Dopo 60 minuti di blocco tissutale, incubare le retine in 0,2 mL di soluzione anticorpale primaria a 4 °C per 72 ore agitando delicatamente.
- Lavare il tessuto 3 volte per 10 minuti con 1x PBS, quindi incubare il tessuto per 2 ore a temperatura ambiente in 0,2 mL della soluzione anticorpale secondaria diluita 1:750 in 1x PBS più il 5% di BSA.
- Inoltre, incubare il tessuto per 10 minuti in soluzione di controcolorante nucleare per la colorazione dei nuclei fluorescenti. Concludere l'immunoistochimica con una fase finale di lavaggio con 1x PBS (0,3 mL) ripetuto 3 volte.
- Trasferire le retine con l'aiuto di due piccoli spazzolini su vetrini da microscopio, mantenendo il lato vitreo rivolto verso l'alto. Posizionare il quadrante retinico dorsale verso l'alto sui vetrini del microscopio (precedentemente delimitato al punto 4.5.3). Eseguire altri due tagli radiali verso la testa del nervo ottico per delimitare gli altri 3 quadranti (nasale, ventrale e temporale).
NOTA: Le quote di taglio non sono fisse. Non devono essere troppo corti da compromettere un efficiente appiattimento della retina sul vetrino e non devono essere troppo lunghi in modo che raggiunga il forame del nervo ottico e separi completamente il quadrante retinico delimitato dal resto del tessuto. - Infine, applicare 0,2 mL di terreno di montaggio antisbiadimento su un vetrino coprioggetto e posizionarlo sulla retina piatta per l'analisi microscopica dei tessuti. Per stimare la densità delle RGC, esaminare le montature piatte con un microscopio a epifluorescenza confocale utilizzando un obiettivo 40x/1,3.
- Per ogni quadrante della retina, scatta otto foto: due dalla retina centrale (~0,9 mm dal disco ottico), tre dalla retina media (~2,0 mm dal disco ottico) e tre dalla retina periferica (~3,7 mm dal disco ottico), per un totale di 32 foto per retina. Utilizzare il software FIJI per contare le cellule Brn3a-positive e stimare la densità cellulare media.
5. Esame del nervo ottico
- Dopo l'eutanasia e l'enucleazione del bulbo oculare (passaggi 4.1-4.3), rimuovere il segmento prossimale della porzione intraorbitale del nervo ottico (1-2 mm), compresa parte della porzione intraoculare, e posizionare immediatamente i campioni in fiale/provette contenenti 0,2-0,3 mL di fissativo freddo (soluzione di glutaraldeide al 2,5% in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,4)) per 2 ore.
NOTA: I seguenti passaggi per l'elaborazione del nervo ottico vengono eseguiti nelle stesse fiale/provette del passaggio 5.1 - Lavare il materiale 3 volte per 5 minuti con tampone freddo di cacodilato di sodio 0,1 M. Postfissare il tessuto per 1 ora sotto agitazione delicata in una soluzione di tetrossido di osmio all'1,0% in ferrocianuro di potassio allo 0,8% e cloruro di calcio 5 nM diluito in tampone cacodilato di sodio 0,1 M a 4 °C (0,1-0,2 mL).
- Lavare i frammenti del nervo ottico 3 volte per 5 minuti con tampone di cacodilato di sodio a freddo 0,1 M e successivamente con acqua distillata fredda, 3 volte per 1 minuto. Conservare il materiale per una notte sotto agitazione delicata in una soluzione di acetato di uranile all'1,0% in acqua distillata per la colorazione a 4 °C (0,1-0,2 mL). Lavare i frammenti 3 volte con acqua distillata fredda.
- Disidratare progressivamente il tessuto con una serie di acetoni graduati (0,5 mL ciascuno), con successive sostituzioni delle seguenti diluizioni in acqua distillata: 2 incubazioni di 7 minuti in acetone ghiacciato al 15%; 2 incubazioni di 7 minuti in acetone ghiacciato al 30%; 2 incubazioni di 7 minuti in acetone ghiacciato al 50%; 2 incubazioni di 7 minuti in acetone ghiacciato al 70%; 2 incubazioni di 7 minuti in acetone ghiacciato all'80%; 2 incubazioni di 7 minuti in acetone ghiacciato al 90%; 2 incubazioni di 15 minuti in acetone al 100% a temperatura ambiente (RT).
- Eseguire 3 fasi di infiltrazione/inclusione, con successiva sostituzione delle seguenti soluzioni: 1 parte di resina epossidica: 2 parti di acetone (volume totale: 0,5 mL), a RT per 12 h; 1 parte di resina epossidica: 1 parte di acetone (volume totale: 0,5 mL), a RT per 12 ore; 2 parti di resina epossidica: 1 parte di acetone (volume totale: 0,5 mL), a RT per 12 ore. Infine, infiltrare il tessuto in resina epossidica pura a RT per 24 ore.
- Rimuovere i campioni dal portacampioni, trasferirli negli stampi di inclusione e lasciarli polimerizzare per 48 ore a 60 °C. Tagliare sezioni trasversali semisottili (300-400 nm) dei frammenti del nervo ottico utilizzando un ultramicrotomo, raccoglierli e trasferirli su un vetrino da microscopio. Colorare le sezioni con blu di toluidina e ottenere l'immagine utilizzando il microscopio ottico con un ingrandimento di 100x.
- Per l'analisi ultrastrutturale, eseguire sezioni trasversali ultrasottili (70 nm), raccoglierle su griglie di rame e colorarle con acetato di uranile e citrato di piombo. Esamina le sezioni in un microscopio elettronico a trasmissione.
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Representative Results
Le variabili quantitative sono espresse come media ± errore standard della media (SEM). Fatta eccezione per il confronto delle dinamiche IOP tra OHT e gruppi di controllo (Figura 1F), l'analisi statistica è stata eseguita utilizzando l'ANOVA a due vie seguita dal test di confronto multiplo di Sidak. Un valore p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
La Figura 1 illustra le fasi chirurgiche del modello di cauterizzazione del plesso limbare a cerchio completo (LPC), con importanti punti di riferimento come la scomparsa indotta termicamente a 360° dei vasi limbari, nonché la midriasi da lieve a moderata nell'occhio operato alla fine della procedura.
Nell'attuale serie di 131 ratti, la cauterizzazione del plesso limbare a cerchio completo (LPC) ha indotto un aumento della IOP immediatamente dopo l'intervento chirurgico da 13,0 ± 0,2 mmHg al basale a 22,7 ± 0,4 mmHg. Il picco di IOP postoperatoria è stato osservato il primo giorno dopo l'intervento chirurgico (25,3 ± 0,6 mmHg), seguito da un graduale ritorno ai livelli basali al 6° giorno postoperatorio (analisi statistica: t-test multiplo corretto per confronti multipli utilizzando il metodo Holm-Sidak; Figura 1F). La fibrosi corneale o l'edema erano complicazioni cliniche che potevano potenzialmente compromettere l'accurata misurazione della IOP. La prima, da un lato, è stata rara, interessando il 3,92% degli animali e rilevata tardivamente durante il follow-up postoperatorio, risparmiando così i primi 5 giorni di ipertensione oculare e preservando il profilo OHT subacuto descritto23. L'edema corneale, d'altra parte, è stata una complicanza più comune osservata durante i primi giorni dopo l'intervento chirurgico (1-3 giorni), ma per lo più lieve e temporanea, quindi non ha influenzato in modo robusto la IOP23.
La funzione retinica è stata valutata sia dal punto di vista comportamentale che elettrofisiologico utilizzando rispettivamente il riflesso optomotore e il pattern-ERG (Figura 1G-J). Entrambi i parametri hanno mostrato due fasi di compromissione: una fase acuta di ipertensione oculare al 3° giorno post-operatorio e una fase di degenerazione secondaria al 30° giorno post-operatorio (Figura 1H, Figura J e Tabella 1). Nel mezzo, è stato rilevato un periodo di recupero funzionale, come già discusso altrove23.
Rispetto ai nervi ottici compagni di controllo, la conta assonale nelle sezioni semisottili del nervo ottico trasversale ha mostrato una progressiva diminuzione dopo l'intervento chirurgico (3° giorno: 68,3% ± 0,9%; 7° giorno: 59,2% ± 2,6%; 14° giorno: 45,4% ± 2,2%; 30° giorno: 28,2% ± 3,0%; ANOVA bidirezionale: p < 0,0001; Figura 2A). A livello ultra-strutturale, i nervi ottici degli occhi di controllo presentavano fibre mieliniche densamente impacchettate, separate da sottili processi di cellule gliali, ed evidenti microtubuli assonali e neurofilamenti (Figura 2B). Al contrario, a 3 giorni dopo l'OHT, abbiamo riscontrato la rottura focale dei fasci assonali, alcune fibre degenerate, vacuolizzazione citoplasmatica nei processi delle cellule gliali e cromatina condensata nei nuclei delle cellule gliali. Dopo 7 giorni di induzione OHT, c'è stato un aumento delle fibre assonali degenerate, processi ipertrofici delle cellule gliali e gonfiore e vuoti nelle singole fibre assonali. A 14 giorni, uno dei cambiamenti più importanti è stato un maggiore disordine delle fibre del nervo ottico, associato all'invasione dei processi delle cellule gliali tra gli assoni. I fasci di filamenti riempivano questi processi e le fibre scure degenerate, e la rottura della mielina era più comune, associata a lamelle staccate e vacuolizzate (Figura 2B).
La densità dei profili Brn3a+ è diminuita nel tempo (Figura 2C), principalmente nei quadranti retinici dorsale e temporale, scendendo rispettivamente al 32,4% ± al 9,6% e al 35,7% ± al 9,1% dopo 30 giorni (Figure 2D-G e Tabella 2).
Figura 1: Cauterizzazione termica del plesso vascolare limbare e conseguenze sulla funzione retinica in vivo. (A) Metodi alternativi per misurare la IOP nei ratti: tonometria di rimbalzo (superiore) e tonometria ad applanazione (inferiore). (B-E) Procedura chirurgica; punta di freccia: plesso vascolare limbare; freccia: pinza curva utilizzata per esporre la superficie anteriore del bulbo oculare e ottimizzare la valutazione chirurgica ai vasi limbari; hashish: la punta rotonda del cauterizzazione oftalmica a bassa temperatura; Asterisco: segno di cauterizzazione. Barra graduata: 2 mm. L'inserto in (D) mostra a un ingrandimento maggiore la vascolarizzazione limbare da cauterizzare. (F) Andamento temporale delle misurazioni della IOP negli occhi OHT (rosso) e di controllo (nero) (n = 131). Freccia verticale verso il basso: chirurgia LPC. * = p < 0,05 (G) Arena per l'analisi della risposta optomotoria, composta da quattro monitor di computer disposti in un quadrilatero, con una piattaforma al centro. I monitor visualizzano l'immagine di un cilindro virtuale composto da strisce verticali alternate in bianco e nero che si muovono intorno all'animale con velocità di rotazione costante e frequenze spaziali variabili. Il mirino rosso corrisponde al centro del cilindro virtuale. (H) Risposte optomotorie. Al follow-up chirurgico si distinguono due fasi distinte: la fase OHT (0-5 giorni) e la fase di degenerazione secondaria (6-30 giorni). = p < 0,0001. (I) Elettrodi e posizionamento animale per l'acquisizione di pattern-ERG (PERG): l'elettrodo attivo alla periferia temporale della cornea, e gli elettrodi di riferimento e di massa nel tessuto sottocutaneo del canto temporale omolaterale e di uno degli arti posteriori, rispettivamente. L'animale è posizionato a 20 cm dallo schermo dello stimolo. (J) Ampiezza PERG su stimoli con diverse frequenze spaziali. Analogamente alla risposta optomotoria, la valutazione PERG mostra anche due fasi distinte di risposte dopo l'intervento chirurgico: ipertesi oculare a 3 giorni dall'intervento, seguita da recupero al giorno 7 e 14, anche se ancora statisticamente inferiore alle risposte naive, e una successiva diminuzione al giorno 30 dopo l'intervento. c/d = cicli per grado. Gruppo ingenuo: occhi di animali non esposti a precedenti manipolazioni sperimentali. (H) e (J) mostrano la media ± SEM, più le singole repliche in (H). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione strutturale della retina e del nervo ottico dopo cauterizzazione del plesso vascolare limbare (LPC) con cauterizzazione oftalmica a bassa temperatura. (A) Conteggi degli assoni in momenti distinti dopo OHT (n = 3). = p = 0,0005, **** = p < 0,0001. (B) Micrografie elettroniche della degenerazione del nervo ottico in seguito a OHT. L'immagine a sinistra mostra il nervo ottico di controllo e le immagini seguenti illustrano la degenerazione progressiva dopo 3, 7 e 14 giorni di OHT. Punta di freccia: fibre mieliniche normali; frecce sottili: fibre degenerate; asterisco: vacuolizzazione citoplasmatica; hash: processo delle cellule gliali; e Nu: nucleo di cellule gliali. (C) Fotomicrografie di campi di conteggio rappresentativi di RGC marcati con un anticorpo contro nuclei marcati con Brn3a (rosso) e TO-PRO3 (blu); barra della scala: 50μm. (D-G) Distribuzione della densità cellulare media di Brn3a+ nei quattro quadranti della retina dopo 3-30 giorni dall'intervento. I grafici mostrano le medie individuali delle densità RGC per 3-11 animali per volta dopo la procedura. * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001; = p < 0,0001. I dati quantitativi sono medi ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Tabella 1: Analisi statistica dei dati PERG. ANOVA a due vie seguita dal test di confronto multiplo di Sidak. Il valore P inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. c/d = cicli per grado. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Perdita regionale di RGC dopo LPC. SEM: errore standard della media. Controllo: compagno di occhio. I valori P inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi (*). Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
La cauterizzazione del plesso limbare (LPC) è un nuovo modello post-trabecolare con il vantaggio di colpire strutture vascolari facilmente accessibili che non richiedono la dissezione congiuntivale o tenone17,28. A differenza del modello di cauterizzazione delle vene a vortice, un rinomato modello OHT basato sulla compromissione chirurgica del drenaggio venoso coroideo, non si prevede che la congestione venosa influenzi l'aumento della IOP nel modello LPC, poiché le vene limbari sono situate a monte nel deflusso dell'umore acqueo. Inoltre, è tecnicamente facile da imparare e a basso costo, richiedendo principalmente un cauterizzatore termico a bassa temperatura. Inoltre, è associato a un tasso unico di induzione OHT e di recupero clinico completo (> 90%, come riportato in precedenza)23, che riduce il numero di animali necessari per gli esperimenti e consente analisi sia elettrofisiologiche che comportamentali. Infine, la degenerazione glaucomatosa è presente sia nello strato RGC che nel nervo ottico in un lasso di tempo relativamente breve dopo l'intervento chirurgico, consentendo disegni sperimentali a breve o medio termine23. Sono necessari studi futuri per chiarire ulteriormente l'impatto della cauterizzazione della vascolarizzazione limbare a cerchio completo sui singoli strati retinici.
Le fasi critiche del protocollo chirurgico sono: (1) la punta di cauterizzazione deve toccare delicatamente il limbus sclerale parallelamente all'asse del vaso; (2) Il tessuto corneale deve essere risparmiato, non solo durante la cauterizzazione, ma anche durante la manipolazione degli animali. Eseguire regolarmente l'instillazione del collirio e la rimozione della soluzione in eccesso dalla superficie oculare con un batuffolo di cotone (fare attenzione a non strofinare il batuffolo di cotone sulla superficie corneale durante la rimozione di eventuali liquidi, in quanto porta all'abrasione dell'epitelio corneale ed eventuali complicanze post-operatorie); (3) dovrebbe essere visualizzato un cerchio completo di segni di cauterizzazione contigui; (4) Non trascurare il follow-up clinico postoperatorio con un farmaco antinfiammatorio non steroideo e unguento antibiotico, almeno fino al 5° giorno dopo l'intervento.
L'aumento subacuto della IOP osservato nel modello descritto differisce dalla dinamica pressoria del glaucoma ad angolo aperto, ma è simile al glaucoma acuto ad angolo chiuso, al glaucoma neovascolare o a più tipi di glaucoma post-trabecolare con elevata pressione venosa episclerale29. Questo è uno dei principali limiti di questo metodo, poiché il glaucoma ad angolo aperto è il fenotipo più diffuso della malattia, caratterizzato da OHT cronica e degenerazione RGC lentamente progressiva. Ciononostante, l'associazione della progressiva normalizzazione della IOP con la degenerazione continua di RGC rappresenta un'opportunità unica per studiare, nello stesso modello animale, sia i meccanismi biologici che legano l'ipertensione oculare con lo sviluppo e la progressione del glaucoma, sia il processo degenerativo secondario osservato soprattutto nei casi di glaucoma ad angolo aperto, in seguito al quale i pazienti presentano un progresso del glaucoma nonostante il successo clinico o chirurgico nel raggiungere l'obiettivo IOP30. Pertanto, questo modello rappresenta un'opportunità per chiarire meglio questo fenomeno attraverso disegni sperimentali a breve o medio termine e, infine, sviluppare terapie neuroprotettive indipendenti dalla pressione a beneficio dei pazienti che perdono ancora la vista nonostante il miglior trattamento di controllo della IOP.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i nostri tecnici di laboratorio José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza e Luciano Cavalcante Ferreira. Questa ricerca è stata finanziata da FAPERJ, CNPq e CAPES.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | - | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | - | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | - | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | - | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | - | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | - | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | - | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
References
- Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
- Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), Chicago, Ill. 1268-1279 (2002).
- Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1 (2015).
- Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).
- Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
- John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
- Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
- vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N.
- Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G.
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
- Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
- Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
- Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13 (2018).
- Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
- Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).
- vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
- Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).
- Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , Humana Press. 139-157 (2008).
- Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).
