살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포의 물리적 특성을 연구하기 위한 원자력 현미경

Summary

원자력 현미경 압입 프로토콜은 정상 또는 제한된 성장 (즉, 물 부족 상태) 동안 조직 또는 기관의 특정 세포의 세포벽의 물리적 특성의 역할을 해부 할 수있는 가능성을 제공합니다.

Abstract

광학 도립 형광 현미경과 결합 된 원자력 현미경 (AFM)으로 나노 압입을 통해 살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포 세포벽의 물리적 특성을 특성화하는 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법은 변형을 측정하는 동안 샘플에 제어된 힘을 가하는 것으로 구성되어 세포 내 분해능에서 세포벽의 겉보기 영률과 같은 파라미터를 정량화할 수 있습니다. 샘플의 신중한 기계적 고정과 압자 및 압입 깊이의 올바른 선택이 필요합니다. 외부 조직에서만 사용할 수 있지만이 방법을 사용하면 발달 중 식물 세포벽의 기계적 변화를 특성화 할 수 있으며 이러한 미세한 변화와 전체 장기의 성장의 상관 관계를 가능하게합니다.

Introduction

식물 세포는 세포 유형과 성장 단계에 따라 두께가 0.1에서 수 μm까지 다양한 다당류, 단백질, 대사 산물 및 물의 상호 작용 네트워크로 구성된 복잡한 구조 인 세포벽으로 둘러싸여 있습니다 ^1,2. 세포벽의 기계적 특성은 식물의 성장에 필수적인 역할을 합니다. 세포벽의 낮은 강성 값은 세포 성장 및 세포벽 확장의 전제 조건으로 제안되었으며 모든 세포가 기능을 수행하기 위해 기계적 힘을 감지한다는 증거가 증가하고 있습니다. 그러나 세포벽의 물리적 특성의 변화가 세포 운명 ^2,3,4를 결정하는지 여부는 여전히 논쟁의 여지가 있습니다. 식물 세포는 발달 중에 움직이지 않기 때문에 장기의 최종 모양은 세포가 얼마나 멀리 그리고 어떤 방향으로 확장되는지에 달려 있습니다. 따라서, 애기장대 뿌리는 뿌리의 다른 영역에서 다른 유형의 확장이 발생하기 때문에 세포 확장에서 세포벽 물리적 특성의 영향을 연구하기에 좋은 모델입니다. 예를 들어, 이방성 확장은 신장 영역에서 그리고 특히 표^{피 세포에서} 두드러지게 나타난다5.

여기에 설명 된 방법은 도립 형광 위상 현미경 6과 결합 된 원자력 현미경 (AFM)을 사용하여 살아있는 애기장대 뿌리의 나노 스케일에서 표피 세포의 세포벽의 물리적 특성을 특성화하는 데^{사용되었습니다.} AFM 기술의 광범위한 개정판은 ^7,8,9를 참조하십시오.

이 프로토콜은 식물 세포벽의 AFM 기반 탄성 측정을 위한 기본 샘플 준비 방법과 일반적인 방법을 간략하게 설명합니다.

그림 1: 원자력 현미경(AFM)을 사용한 애기장대 뿌리의 힘 압입 실험의 개략적인 개요. 이 계획은 뿌리 샘플을 단단히 고정하기 위한 기질 준비(1-2), 요오드화 프로피듐 염색을 통한 뿌리 생존력 확인(3), 1차 뿌리의 길쭉한 표피 세포 표면에 캔틸레버 위치(4-5), 힘 곡선 측정(6) 및 겉보기 영률을 계산하기 위한 힘 곡선 처리(7-8). EZ: 신장 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Protocol

1. 식물 재료의 준비 및 성장 조건

1. 필요한 식물 재료를 생성하려면 Arabidopsis 야생형과 돌연변이 관심 라인의 씨앗을 살균하십시오.
   참고: 이 프로토콜에서는 다음을 사용했습니다: ttl1: T-DNA 삽입 라인 Salk_063943(TTL1의 경우; AT1G53300) - 콜롬비아-0(Col-0) 야생형; 앞서 ^10,11에 기술된 바와 같이 CESA6 유전자(AT5G64740)의 녹아웃 돌연변이(Q720stop)로 구성된 Procuste1(prc1-1⁾ 돌연변이; 및 TTL1 x PRC1-1 이중 돌연변이체.
   1. 대략 50μL의 씨앗을 마이크로 튜브에 넣습니다. 실온에서 70% 에탄올 + 0.01% 트윈 용액 500μL를 추가합니다. 7 분 동안 혼합하고 배양하십시오.
   2. 에탄올 용액을 붓고 20% 차아염소산나트륨 500μL를 추가합니다. 7 분 동안 혼합하고 배양하십시오.
   3. 차아 염소산 나트륨 용액을 부어 멸균 수로 씨앗을 3-4 회 씻으십시오.
2. 도금
   1. 미리 기초 무라시게 및 스쿠그(MS) 배지¹² + 1.5% 수크로스 + 1% 한천(pH 5.7)을 준비한다( 재료 표 참조). 매체를 오토 클레이브하십시오. 멸균 환경에서 작동하도록 층류 후드를 준비하고 실험에 필요한 사각형 페트리 접시에 라벨을 붙입니다. 배지를 페트리 접시에 붓고 배지가 고형화되도록 합니다.
   2. 멸균 피펫 팁을 사용하여 멸균 된 씨앗을 배지가 들어있는 사각형 페트리 접시에 접시에 담습니다. 씨앗을 두 줄로 골고루 분배하십시오. 씨앗이 마르면 뚜껑을 닫고 판을 밀봉하십시오. 씨앗을 4 일 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 층화하십시오.
      참고 : 발아를 동기화하려면 층화가 필요합니다.
   3. 플레이트를 25μmol m ^2s-1 광도 및²³°C(낮/밤)의 긴 하루 체제(16시간의 빛/8시간의 어둠)에서 성장 챔버에 수직으로 놓습니다. 묘목을 7 일 동안 재배하십시오.

2. 삼투압 스트레스 치료(선택 사항)

참고: 이 섹션에서는 극저온 삼투압계(재료 표)로 추정한 -1.2MPa의 삼투압 잠재력에서 애기장대 뿌리의 성장에 대한 세부 정보를 제공합니다. 이 부분은 당면한 실험 질문에 따라 생략하거나 변경할 수 있습니다.

1. 기저 MS 배지 + 1.5% 수크로스 + 400 mM 만니톨 + 1% 한천 (pH 5.7)을 준비한다. 매체를 오토 클레이브하십시오. 층류 후드의 사각형 페트리 접시에 매체를 붓고 매체가 고형화되도록 합니다.
2. 핀셋 (재료 표)을 사용하여 400mM 만니톨이 보충 된 배지를 포함하는 정사각형 페트리 접시에 기초 MS + 1.5 % 자당 배지에서 미리 자란 5 일 된 묘목을 놓습니다. 플레이트를 1.2.3 단계와 동일한 조건으로 성장 챔버에 수직으로 놓습니다. 이 삼투압 스트레스 조건에서 7 일 동안 묘목을 재배하십시오.
   참고 : 심한 삼투압 스트레스 동안 1 차 뿌리의 뿌리 성장 적응을 평가하려면 뿌리 분열 조직 크기가 이미 설정되어 있는지 확인하기 위해 통제 된 조건에서 자란 발아 5 일 후 묘목을 사용하는 것이 좋습니다¹³. 대안적으로, 삼투압 스트레스 작용의 발달 효과를 결정하기 위해 발달의 모든 단계에서 분석을 수행 할 수있다.

3. 원자력 현미경(AFM) 나노인덴테이션 실험

1. 나노인덴테이션 실험을 위한 시료의 제조
   참고 : 이것은 살아있는 생물학적 샘플 연구에 AFM을 적용하기위한 중요한 단계입니다. 샘플은 압입 측정 중에 기계적으로 안정되도록 기판에 단단히 부착되어야 합니다. 동시에 샘플 구조적 품질을 보존해야합니다. AFM에 대한 큰 샘플을 안정화하는 효과적인 전략은 접착제를 사용하는 것입니다. 접착제는 빠르게 건조되어야 하며 독성이 있거나 주변 매체와 반응하지 않아야 합니다. 이 프로토콜에서는 폴리스티렌 페트리 접시를 기질로 사용하고 비산성 실리콘 접착제 (재료 표)를 사용하여 애기장 묘목을 묶었습니다.
   1. 커버 슬립으로 페트리 접시에 실리콘 접착제의 얇은 층을 펼칩니다. 접착제를 공기 중에 45 초 동안 그대로 두십시오.
   2. 핀셋을 사용하여 묘목을 접착제 위에 놓고 묘목의 튀어 나온 부분과 캔틸레버 사이의 접촉을 피하는 방향으로 향하게하십시오. 그런 다음 뿌리를 실리콘 접착제 층에 부드럽게 눌러 단단히 묶습니다. 프로토콜의 다음 단계를 계속하기 전에 묘목을 접착제와 45초 동안 접촉시키십시오.
   3. 부착 된 묘목을 2 μg / mL 요오드화 프로피듐 (PI; 재료 표) 어두운 곳에서 5 분 동안 조심스럽게 1x 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액 (재료 표)으로 세 번 씻으십시오.
   4. PI 배양 된 묘목을 AFM과 결합 된 도립 형광 현미경에 넣습니다. 형광을 관찰하려면 여기 및 방출 파장을 각각 572nm 및 617nm로 설정하십시오. 표피 세포 내부에 형광이 없으면 뿌리의 생존 가능성이 확인됩니다.
   5. 묘목을 1x 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액으로 덮으십시오.
2. 들여쓰기 프로토콜
   알림: 실온에서 지지대에 샘플을 고정한 후 1시간 이내에 모든 AFM 측정을 수행하십시오. AFM이있는 방은 에어컨으로 25 ° C로 유지해야합니다. PBS 용액은 동일한 온도에 있어야합니다.
   1. 피라미드 팁이 있는 표준 실리콘 질화물 캔틸레버(재료 표 참조)를 유체용 AFM 프로브 홀더(재료 표)에 장착합니다.
   2. 캔틸레버의 레이저를 팁의 위치에 가깝게 정렬합니다. 그런 다음 포토 다이오드를 움직여 레이저 스폿을 검출기 중앙에 놓습니다.
   3. 편향 감도를 보정하려면 AFM 아래에 1x PBS가 있는 폴리스티렌 페트리 접시를 놓습니다.
      참고: 이 단계는 들여쓰기를 계산하는 데 필요합니다. 단단한 표면에서 힘을 측정할 때 표면에 압입이 없으므로 z 스캐너 변위의 변화는 캔틸레버 처짐에 해당합니다. 따라서 단단한 표면에서 편향 감도를 보정하는 것이 매우 중요합니다. 부드러운 표면을 사용하면 편향 감도가 과대 평가되어 스프링 상수가 너무 낮아집니다.
   4. 비접촉 편향이 0V에 가까워지도록 광검출기를 조정합니다. 램프 크기가 3μm, 압입 및 수축률이 0.6μm/s, 트리거 임계값이 0.5V인 압입(힘 곡선)을 수행하여 편향 감도를 보정합니다.
   5. 캔틸레버의 스프링 상수를 교정하려면 스프링 상수가 약 5N/m 미만인 프로브에 권장되는 AFM 소프트웨어(재료 표)의 열 조정 유틸리티를 사용하거나 참조¹⁴에 설명된 방법을 사용하십시오. 소프트웨어에서 Thermal Tune을 활성화하기 전에 프로브가 샘플과 상호 작용하지 않는지 확인하십시오.
      1. 캔틸레버 온도를 입력하십시오. > 열 튜닝 보정 또는 NanoScope 도구 모음의 열 튜닝 아이콘을 클릭합니다. 주파수 범위(1-100Hz)를 선택합니다.
      2. Thermal Tune 패널에서 데이터 수집을 클릭합니다. AFM이 데이터를 수집할 때까지 기다린 다음 단순 고조파 발진기(유체) 버튼을 클릭합니다.
      3. 중앙값 필터 너비를 3으로 조정합니다. PSD Bin 너비를 조정하여 평균화하여 수집된 데이터의 노이즈를 줄입니다. 첫 번째 공진 피크 주위에 맞춤 경계를 설정합니다.
      4. 스프링 상수 k 계산을 클릭한 다음 사용자가 이 값을 사용할 것인지 묻는 팝업 창에서 예를 클릭합니다.
      5. 위에서 설명한 단계를 세 번 반복하고 수동으로 스프링 상수 값의 평균을 취하십시오. PicoForce 보기의 램프 매개변수 리스트에 있는 스프링 상수 상자에 이 평균값을 입력합니다. 이 시점에서 보정이 종료됩니다.
   6. 10x, 20x 및 40x 접안 렌즈 배율의 도립 광학 현미경을 사용하여 AFM 프로브를 1 차 뿌리의 네 번째 길쭉한 표피 세포 표면에 배치하여 세포 중앙에 위치시킵니다.
   7. 계산된 스프링 상수 값(단계 3.2.5.5)을 사용하여 선택한 지점에서 램프 크기 3μm, 트리거 임계값 11nN, 압입 및 수축 속도 0.6μm/s의 힘 곡선을 얻습니다.
      참고 : 이전 작업^15,16은 낮은 빈도의 압입 및 수축이 히스테리시스와 항력을 최소화하는 데 도움이된다는 것을 발견했습니다.
   8. 각 처리에 대해 뿌리당 3개의 세포에서 힘 곡선을 얻습니다(처리당 3개의 생물학적 복제물 사용). 각 루트에 대해 최소 150개의 힘 곡선을 캡처합니다.

4. 겉보기 영률 측정

1. 각 힘 곡선을 피라미드 압자¹⁷에 대한 다음 모형에 피팅합니다. 여기서 E 는 표본의 겉보기 영률이고, 는 표본의 포아송 계수이고, α 는 꼭짓점에 대한 반각입니다. 상관 계수(r²)가 0.99< 피팅을 폐기합니다. 완전히 비압축성 재료에 대한 푸아송의 비율: = 0.5 및 제조업체가 제공한 압자의 형상을 고려하십시오.
   참고: 피팅이 세포벽 역학에 최대한 민감하고 겉보기 영률 값에 대한 팽창 압력의 영향을 줄이기 위해 로딩 곡선의 접촉점에서 처음 100nm를 사용하십시오.⁸. 피팅은 로딩 곡선의 접점에서 특정 압입 깊이를 설정할 수 있는 맞춤형 MATLAB 프로그램(JC B에 쓰기를 통해 개인적인 요청에 따라 사용 가능)을 사용하여 수행되었습니다.
2. 명백한 영률 데이터로 정규화된 히스토그램을 만들고 가우스 분포에 맞춥니다. 95% 신뢰 구간을 벗어난 데이터 점을 버리고 히스토그램과 가우스 피팅을 모두 다시 계산합니다. 겉보기 영률의 평균과 표준 편차를 계산하고 보고합니다.
3. ANOVA와 같은 다중 비교 검정을 통해 그룹 간 비교의 유의성을 결정합니다.

Results

힘-압입 실험
다음 텍스트는 프로토콜이 잘 실행될 때 예상되는 일반적인 출력을 보여주기 위해 강제 들여쓰기 실험을 수행할 때 예상되는 몇 가지 결과를 제공합니다.

힘-변위 곡선
루트 신장 영역의 셀 중앙에 배치된 위치에서 살아있는 샘플을 들여쓰기하여 얻은 대표적인 힘 압입 플롯이 그림 2에 나와 있습니다. AFM 팁이 세포벽의 표면을 들여쓰기 시작하면 변형에 대한 세포벽 반대 때문에 힘이 증가하기 시작합니다( 그림 1A에서 2로 표시됨). 힘 (하중)의 증가는 최대 힘 값에 도달 할 때까지 계속됩니다 ( 그림 2A에서 2로 표시). 이 시점이 지나면 들여 쓰기의 언로드 부분이 시작됩니다.

Discussion

세포 및 세포벽 역학은 역학이 성장 과정에 미치는 영향에 대한 통찰력을 얻기 위해 점점 더 관련성이 높아지고 있습니다. 물리적 힘이 고형 조직에서 상당한 거리에 걸쳐 전파됨에 따라 세포벽의 물리적 특성 변화와 이러한 특성이 식물의 성장을 감지, 제어, 조정 및 영향을 미치는 방법에 대한 연구가 중요한 연구 분야가 되고 있습니다 ^2,3,8.

애기장대 뿌리의 신장 영역에서 세포의 세포벽 물리적 특성을 연구하기위한 방법이 여기에 제시됩니다. AFM 기술은 뿌리 성장에서 세포벽 물리적 특성의 효과를 이해하기 위해 성장 속도 연구와 같은 다른 기술과 쉽게 결합 될 수 있습니다.

가장 중요한 실험 단계 중 하나는 샘플의 기계적 고정화입니다. 샘플은 들여쓰기되어 있는 동안 샘플...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 x 인산염 완충 식염수(PBS)			는 염화나트륨과 인산염 완충액을 포함하며 삼투압 쇼크를 방지하고 살아있는 세포의 수분 균형을 유지하도록 제조되었습니다.
AFM 소프트웨어	Bruker, Billerica, MA, USA
Atomic force microscopy (AFM)	BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA
Catalyst Probe holder-fluid	Bruker, Billerica, MA, USA	CAT-FCH	Bioscope Catalyst용 프로브 홀더로, 접촉 또는 탭핑 모드에서 유체 작동을 위해 설계되었습니다. 공기 작동과도 호환됩니다.
극저온 투압계; 모델 OSMOMAT 030	Gonotech, Berlin, Germany
Murashige & Skoog Medium	Duchess Biochemie	M0221	Original concentration, (1962)
Olympus IX81, Miami, FL, USA			결합된 광학 도립 현미경
			성, 비산성 실리콘 접착제
페트리 접시	Deltalab	200201.B	폴리스티렌, 55 x 14mm, 방사선 멸균.
Propidium iodide	Sigma	P4170	뿌리 생존 능력 테스트용.
질화규소 프로브, DNP-10, 캔틸레버 A	Bruker, Billerica, MA, USA	DNP-10/A	액체 작동의 힘 조절 현미경용. 프로브 팁 반경 20-60nm. 175-&뮤; M-긴 삼각형 캔틸레버,  0.35 N/m의 스프링 상수.
핀셋	Sigma	T4537