원자력 현미경 압입 프로토콜은 정상 또는 제한된 성장 (즉, 물 부족 상태) 동안 조직 또는 기관의 특정 세포의 세포벽의 물리적 특성의 역할을 해부 할 수있는 가능성을 제공합니다.
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방법 논문
살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포의 물리적 특성을 연구하기 위한 원자력 현미경
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
광학 도립 형광 현미경과 결합 된 원자력 현미경 (AFM)으로 나노 압입을 통해 살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포 세포벽의 물리적 특성을 특성화하는 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법은 변형을 측정하는 동안 샘플에 제어된 힘을 가하는 것으로 구성되어 세포 내 분해능에서 세포벽의 겉보기 영률과 같은 파라미터를 정량화할 수 있습니다. 샘플의 신중한 기계적 고정과 압자 및 압입 깊이의 올바른 선택이 필요합니다. 외부 조직에서만 사용할 수 있지만이 방법을 사용하면 발달 중 식물 세포벽의 기계적 변화를 특성화 할 수 있으며 이러한 미세한 변화와 전체 장기의 성장의 상관 관계를 가능하게합니다.
서론
식물 세포는 세포 유형과 성장 단계에 따라 두께가 0.1에서 수 μm까지 다양한 다당류, 단백질, 대사 산물 및 물의 상호 작용 네트워크로 구성된 복잡한 구조 인 세포벽으로 둘러싸여 있습니다 1,2. 세포벽의 기계적 특성은 식물의 성장에 필수적인 역할을 합니다. 세포벽의 낮은 강성 값은 세포 성장 및 세포벽 확장의 전제 조건으로 제안되었으며 모든 세포가 기능을 수행하기 위해 기계적 힘을 감지한다는 증거가 증가하고 있습니다. 그러나 세포벽의 물리적 특성의 변화가 세포 운명 2,3,4를 결정하는지 여부는 여전히 논쟁의 여지가 있습니다. 식물 세포는 발달 중에 움직이지 않기 때문에 장기의 최종 모양은 세포가 얼마나 멀리 그리고 어떤 방향으로 확장되는지에 달려 있습니다. 따라서, 애기장대 뿌리는 뿌리의 다른 영역에서 다른 유형의 확장이 발생하기 때문에 세포 확장에서 세포벽 물리적 특성의 영향을 연구하기에 좋은 모델입니다. 예를 들어, 이방성 확장은 신장 영역에서 그리고 특히 표피 세포에서....
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프로토콜
1. 식물 재료의 준비 및 성장 조건
- 필요한 식물 재료를 생성하려면 Arabidopsis 야생형과 돌연변이 관심 라인의 씨앗을 살균하십시오.
참고: 이 프로토콜에서는 다음을 사용했습니다: ttl1: T-DNA 삽입 라인 Salk_063943(TTL1의 경우; AT1G53300) - 콜롬비아-0(Col-0) 야생형; 앞서 10,11에 기술된 바와 같이 CESA6 유전자(AT5G64740)의 녹아웃 돌연변이(Q720stop)로 구성된 Procuste1(prc1-1) 돌연변이; 및 TTL1 x PRC1-1 이중 돌연변이체.- 대략 50μL의 씨앗을 마이크로 튜브에 넣습니다. 실온에서 70% 에탄올 + 0.01% 트윈 용액 500μL를 추가합니다. 7 분 동안 혼합하고 배양하십시오.
- 에탄올 용액을 붓고 20% 차아염소산나트륨 500μL를 추가합니다. 7 분 동안 혼합하고 배양하십시오.
- 차아 염소산 나트륨 용액을 부어 멸균 수로 씨앗을 3-4 회 씻으십시오.
- 도....
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결과
힘-압입 실험
다음 텍스트는 프로토콜이 잘 실행될 때 예상되는 일반적인 출력을 보여주기 위해 강제 들여쓰기 실험을 수행할 때 예상되는 몇 가지 결과를 제공합니다.
힘-변위 곡선
루트 신장 영역의 셀 중앙에 배치된 위치에서 살아있는 샘플을 들여쓰기하여 얻은 대표적인 힘 압입 플롯이 그림 2에 나와 있습니다. AFM 팁이 세포벽의 표면을 들여쓰기 시작하면 변형에 대한 세포벽 반대 때문에 힘이 증가하기 시작합니다( 그림 1A에서 2로 표시됨). 힘 (하중)의 증가는 최대 힘 값에 도달 할 때까지 계속됩니다 ( 그림 2A에서 2로 표시). 이 시점이 지나면 들여 쓰기의 언로드 부분이 시작됩니다.
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토론
세포 및 세포벽 역학은 역학이 성장 과정에 미치는 영향에 대한 통찰력을 얻기 위해 점점 더 관련성이 높아지고 있습니다. 물리적 힘이 고형 조직에서 상당한 거리에 걸쳐 전파됨에 따라 세포벽의 물리적 특성 변화와 이러한 특성이 식물의 성장을 감지, 제어, 조정 및 영향을 미치는 방법에 대한 연구가 중요한 연구 분야가 되고 있습니다 2,3,8.
애기장대 뿌리의 신장 영역에서 세포의 세포벽 물리적 특성을 연구하기위한 방법이 여기에 제시됩니다. AFM 기술은 뿌리 성장에서 세포벽 물리적 특성의 효과를 이해하기 위해 성장 속도 연구와 같은 다른 기술과 쉽게 결합 될 수 있습니다.
가장 중요한 실험 단계 중 하나는 샘플의 기계적 고정화입니다. 샘플은 들여쓰기되어 있는 동안 샘플.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다. 데이터를 피팅하는 데 사용되는 MATLAB 스크립트는 개인적인 요청에 따라 J. C. B.에게 편지를 써서 사용할 수 있습니다.
감사의 글
이 연구는 CSIC I + D 2018, 보조금 번호 95 (Mariana Sotelo Silveira)의 자금 지원을 받았습니다.; CSIC 그루포스 (오마르 보르사니) 와 페데시바.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 x 인산염 완충 식염수(PBS) | 는 염화나트륨과 인산염 완충액을 포함하며 삼투압 쇼크를 방지하고 살아있는 세포의 수분 균형을 유지하도록 제조되었습니다. | ||
| AFM 소프트웨어 | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | Bioscope Catalyst용 프로브 홀더로, 접촉 또는 탭핑 모드에서 유체 작동을 위해 설계되었습니다. 공기 작동과도 호환됩니다. |
| 극저온 투압계; 모델 OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Olympus IX81, Miami, FL, USA | 결합된 광학 도립 현미경 | ||
| 성, 비산성 실리콘 접착제 | |||
| 페트리 접시 | Deltalab | 200201.B | 폴리스티렌, 55 x 14mm, 방사선 멸균. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | 뿌리 생존 능력 테스트용. |
| 질화규소 프로브, DNP-10, 캔틸레버 A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | 액체 작동의 힘 조절 현미경용. 프로브 팁 반경 20-60nm. 175-&뮤; M-긴 삼각형 캔틸레버, 0.35 N/m의 스프링 상수. |
| 핀셋 | Sigma | T4537 |
참고문헌
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell.....
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재인쇄 및 허가
