Summary
原子間力顕微鏡インデンテーションプロトコルは、正常または制約された成長中(すなわち、水不足下)の組織または器官の特定の細胞の細胞壁の物理的特性の役割を解剖する可能性を提供する。
Abstract
ここでは、原子間力顕微鏡(AFM)と光学倒立蛍光顕微鏡を組み合わせたナノインデンテーションにより、生きているシロイヌナズナの根の表皮細胞の細胞壁の物理的特性を特徴付ける方法について説明します。この方法は、サンプルの変形を測定しながら制御された力を加えることで構成され、細胞壁の見かけのヤング率などのパラメータを細胞内分解能で定量化できます。サンプルの慎重な機械的固定化と、圧子とくぼみの深さの正しい選択が必要です。外部組織でのみ使用できますが、この方法は、発生中の植物細胞壁の機械的変化を特徴付けることを可能にし、これらの微視的変化と臓器全体の成長との相関を可能にします。
Introduction
植物細胞は、細胞の種類や成長段階に応じて厚さが0.1から数μmまで変化する多糖類、タンパク質、代謝物、水の相互作用ネットワークで構成される複雑な構造である細胞壁に囲まれています1,2。細胞壁の機械的特性は、植物の成長に不可欠な役割を果たします。細胞壁の低い剛性値は、細胞増殖と細胞壁拡張の前提条件として提案されており、すべての細胞がその機能を実行するために機械的な力を感知するという証拠が増えています。しかし、細胞壁の物理的性質の変化が細胞の運命を決定するかどうかはまだ議論されています2,3,4。植物細胞は発生中に動かないため、臓器の最終的な形状は、細胞がどれだけ遠く、どの方向に拡大するかによって異なります。したがって、シロイヌナズナの根は、根の異なる領域で異なるタイプの増殖が起こるため、細胞増殖における細胞壁の物理的特性の影響を研究するための優れたモデルです。例えば、異方性拡大は伸長帯において、特に表皮細胞5において顕著に顕著である。
ここで説明した方法は、倒立蛍光位相顕微鏡6と組み合わせた原子間力顕微鏡(AFM)を使用して、生きているシロイヌナズナの根のナノスケールでの表皮細胞の細胞壁の物理的特性を特徴付けるために使用されました。AFM技術の広範な改訂については、7,8,9を読んでください。
このプロトコルは、植物細胞壁のAFMベースの弾性測定のための基本的なサンプル調製方法と一般的な方法を概説しています。
図1:原子間力顕微鏡(AFM)を用いたシロイヌナズナの根の力押し込み実験の概略図。このスキームは、根のサンプルをしっかりと固定するための基質の準備(1-2)、ヨウ化プロピジウム染色による根の生存率の確認(3)、一次根の細長い表皮細胞の表面へのカンチレバーの位置決め(4-5)、力曲線の測定(6)、および見かけのヤング率を計算するための力曲線処理(7-8)からの力-押し込み実験の手順の概要を示しています。EZ:伸びゾーン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1.植物材料の調製と成長条件
- 必要な植物材料を生成するには、シロイヌナズナ野生型の種子と目的の変異株を滅菌します。
注:このプロトコルでは、以下を使用しました:ttl1:T-DNA挿入ラインSalk_063943(TTL1の場合;AT1G53300) - コロンビア-0(Col-0)野生型;Procuste1(prc1-1)変異体は、10,11で前述したように、CESA6遺伝子(AT5G64740)のノックアウト変異(Q720stop)からなる。およびTTL1 x PRC1-1二重変異体。- 約50μLの種子をマイクロチューブに入れます。室温で500 μLの70%エタノール+ 0.01%トゥイーン溶液を加えます。混合して7分間インキュベートします。
- エタノール溶液を注ぎ、500μLの20%次亜塩素酸ナトリウムを加える。混合して7分間インキュベートします。
- 次亜塩素酸ナトリウム溶液を注ぎ、滅菌水で種子を3〜4回洗います。
- 鍍金
- 基礎ムラシゲおよびスクーグ(MS)培地12 +1.5%スクロース+1%寒天(pH 5.7)を予め調製する( 材料表参照)。培地をオートクレーブします。無菌環境で動作するように層流フードを準備し、実験に必要な正方形のペトリ皿にラベルを付けます。培地をペトリ皿に注ぎ、培地を固化させます。
- 滅菌ピペットチップを使用して滅菌種子を培地を含む正方形のペトリ皿にプレートします。種子を2列に均等に分配します。種子が乾いたら、蓋を閉めてプレートを密封します。種子を暗所で4°Cで4日間層別化する。
注:発芽を同期させるには層別化が必要です。 - プレートを成長チャンバーに垂直に配置し、25 μmolm 2 s−1 の光強度と23 °C(昼/夜)の長日体制(16時間の光/8時間の暗)で置きます。7日間苗を育てます。
2.浸透圧ストレス治療(オプション)
注:このセクションでは、凍結鏡浸透圧計によって推定された-1.2MPaの浸透電位でのシロイヌナズナの根の成長について詳しく説明します(材料の表)。この部分は、手元の実験的な質問に応じて省略または変更できます。
- 基礎MS培地+ 1.5%スクロース+ 400 mMマンニトール+ 1%寒天(pH 5.7)を調製します。培地をオートクレーブします。層流フード内の正方形のペトリ皿に培地を注ぎ、培地を固化させます。
- ピンセット(Table of Materials)を用いて、基礎MS+1.5%スクロース培地で予め生育させた5日齢の苗を、400mMマンニトールを添加した培地を含む正方形のシャーレに入れる。ステップ1.2.3と同じ条件でプレートを成長チャンバーに垂直に置きます。この浸透圧ストレス条件下で7日間苗を育てます。
注:重度の浸透圧ストレス時の一次根の根の成長適応を評価するには、発芽の5日後に制御された条件で成長した苗を使用して、根の分裂組織のサイズがすでに確立されていることを確認することをお勧めします13。あるいは、浸透圧ストレス作用の発生効果を決定するために、発達のすべての段階で分析を実行することができます。
3. 原子間力顕微鏡(AFM)ナノインデンテーション実験
- ナノインデンテーション実験用試料の作製
注:これは、生きた生物学的サンプルの研究にAFMを適用するための重要なステップです。サンプルは、圧痕測定中に機械的に安定するために、基板にしっかりと取り付けられている必要があります。同時に、サンプルの構造品質を維持する必要があります。AFM用の大きなサンプルを安定させるための効果的な戦略は、接着剤を使用することです。接着剤は迅速に乾燥する必要があり、周囲の媒体と有毒または反応性であってはなりません。このプロトコルでは、ポリスチレンペトリ皿を基質として使用し、非酸性シリコーン接着剤(材料表)を使用してシロイヌナズナの苗を結合しました。- カバーガラスでシリコーン接着剤の薄層をペトリ皿に広げます。接着剤を45秒間空気中に置いておきます。
- ピンセットを使用して、苗を接着剤の上に置き、苗の突出した部分とカンチレバーが接触しないように方向付けます。次に、根元をシリコーン接着剤層にそっと押し付けてしっかりと結合します。プロトコルの次のステップに進む前に、苗を接着剤と45秒間接触させたままにします。
- 添付した苗を2 μg/mLヨウ化プロピジウム(PI; 資料表)暗所で5分間、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で3回注意深く洗浄します(材料の表)。
- PIインキュベートした苗を、AFMと結合した倒立蛍光顕微鏡に入れます。蛍光を観察するには、励起波長と発光波長をそれぞれ572 nmと617 nmに設定します。表皮細胞内に蛍光がないことは、根の生存能力を確認する。
- 苗を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で覆います。
- インデントプロトコル
注:室温でサンプルを支持体に固定化してから1時間以内にすべてのAFM測定を実行してください。AFMが配置されている部屋は、エアコンで25°Cに維持する必要があります。PBS溶液は同じ温度でなければなりません。- 先端がピラミッド型の標準的な窒化ケイ素カンチレバー(材料表を参照)を流体用のAFMプローブホルダー(材料表)に取り付けます。
- カンチレバーのレーザーを先端の位置に近づけます。次に、フォトダイオードを動かして、検出器の中央にレーザースポットを配置します。
- たわみ感度を校正するには、1x PBSのポリスチレンペトリ皿をAFMの下に配置します。
注: この手順は、インデントを計算するために必要です。硬い表面で力を測定する場合、表面にくぼみがないため、zスキャナーの変位の変化はカンチレバーのたわみに対応します。したがって、硬い表面でのたわみ感度を校正することは非常に重要です。柔らかい表面を使用すると、たわみ感度が過大評価され、ばね定数が低すぎます。 - 非接触たわみが0 Vに近づくように光検出器を調整します。ランプサイズ3 μm、圧擢および収縮率0.6 μm/s、トリガーしきい値0.5 Vのインデンテーション(フォースカーブ)を実行して、たわみ感度を校正します。
- カンチレバーのバネ定数を校正するには、スプリング定数が約5 N / m未満のプローブに推奨されるAFMソフトウェア(材料表)のサーマルチューンユーティリティを使用するか、参考文献14で説明されている方法を使用します。ソフトウェアでサーマルチューンをアクティブにする前に、プローブがサンプルと相互作用しないことを確認してください。
- カンチレバー温度を入力します。温度調整>キャリブレーションまたはナノスコープツールバーの熱調整アイコンをクリックします。周波数範囲(1〜100 Hz)を選択します。
- サーマルチューンパネルの[データの取得]をクリックします。AFMがデータを取得するのを待ってから、シンプルハーモニックオシレーター(流体)ボタンをクリックします。
- [ フィルターの幅の中央値] を 3 に調整します。 PSDビン幅 を調整して、平均化によって集録データのノイズを低減します。最初の共振ピークの周囲にフィット境界を設定します。
- [ ばね定数kの計算]をクリックし、ポップアップウィンドウで[ はい ]をクリックして、ユーザーがこの値を使用するかどうかを尋ねます。
- 上記の手順を3回繰り返し、手動でばね定数値の平均を取得します。この平均値を、PicoForce ビューの [ランプ] パラメータ リストの [ばね定数] ボックスに入力します。キャリブレーションはこの時点で終了します。
- 接眼レンズ倍率10倍、20倍、および40倍の倒立光学顕微鏡を使用して、AFMプローブを一次根の第4の細長い表皮細胞の表面に配置し、細胞の中心に配置するようにします。
- 計算されたばね定数値(ステップ3.2.5.5)を使用して、ランプサイズが3 μm、トリガーしきい値が11 nN、および選択したポイントでの圧痕および収縮率が0.6 μm/sの力曲線を取得します。
注:以前の研究15,16では、押し込みと収縮の頻度が低いと、ヒステリシスと抗力を最小限に抑えるのに役立つことがわかりました。 - 各処理について、根ごとに3つの細胞から力曲線を取得します(処理ごとに3つの生物学的複製を使用します)。各ルートの少なくとも150の力曲線をキャプチャします。
4.見かけのヤング率を測定します
- 各力曲線をピラミッド圧子17の次のモデルに適合させます:
ここで、 E はサンプルの見かけのヤング率、 
α はサンプルのポアソン係数、頂点に対する半角です。相関係数(r2)が0.99<当てはめを破棄します。完全に非圧縮性材料のポアソン比= 0.5と、メーカーによって与えられた圧子の形状を考えてみましょう。
注: 荷重曲線の接触点から最初の100 nmを使用して、フィッティングが細胞壁の力学にできるだけ敏感になり、見かけのヤング率値に対する膨圧の影響を減らします8。フィッティングは、荷重曲線の接触点から特定のくぼみの深さを設定できるカスタムMATLABプログラム(J.C.Bへの書き込みによる個人的な要求に応じて利用可能)を使用して行われました。 - 見かけのヤング率データを使用して正規化されたヒストグラムを作成し、ガウス分布に適合させます。95%信頼区間外のデータポイントを破棄し、ヒストグラムとガウス適合値の両方を再計算します。見かけのヤング率の平均と標準偏差を計算して報告します。
- ANOVAのような多重比較検定によってグループ間の比較の有意性を判断します。
ここで、 E はサンプルの見かけのヤング率、 
α はサンプルのポアソン係数、頂点に対する半角です。相関係数(r2)が0.99<当てはめを破棄します。完全に非圧縮性材料のポアソン比= Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
フォースインデンテーション実験
次のテキストは、プロトコルが適切に実行されたときに予想される典型的な出力を示すために、フォースインデント実験を実施したときに予想されるいくつかの結果を示しています。
力-変位曲線
根伸長ゾーンの細胞の中心に配置された位置で生きたサンプルをインデントして得られた代表的な力押し込みプロットを 図2に示します。AFMチップが細胞壁の表面をくぼみ始めると、変形に対する細胞壁の反対のために力が増加し始めます( 図2Aの1で示されています)。力(荷重)の増加は、最大力値に達するまで続きます( 図2Aの2で示されています)。この時点以降、インデントのアンロード部分が始まります。
図2:生きた根伸長帯細胞の細胞壁に作られた圧痕実験で得られた力-変位曲線。 (A)典型的な力-変位曲線。1でマークされた位置では、力が増加し始めます。AFMチップが細胞壁をインデントし始めます。力(荷重)の増加は、2で示されるように、最大力値に達するまで続きます。この時点以降、インデントのアンロード部分が始まります。(B)押し込み前の細胞表面の位置を検出できず、荷重曲線と除荷曲線の両方にノイズが多い力-変位曲線の例。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
予想される力-変位曲線は、モデルによって予測されたように、放物線に続いて力が大きくなることをくぼみ部分に示しています(ステップ4.1で説明)(図2A)。別の継ぎ手パラメータは接触点の位置です。これは、くぼみ前の細胞壁表面に対応する必要があり、AFMチップ変位の原点と見なされます。くぼみを破棄する前に接触点を検出できない力曲線(図2B)。力-圧痕実験の荷重曲線と除荷曲線にはノイズがあってはなりません。 図2B に示すようなノイズの多い曲線は破棄する必要があります。
見かけのヤング率の正規化ヒストグラム
対照条件で生育したCol−0の3つの異なる植物の9つの異なる細胞に対する201個の成功したくぼみのセットについて得られた見かけのヤング率の頻度の頻度の分布を示すヒストグラムを 図3に示す。図は、見かけのヤング率の平均と標準偏差(88.12 ± 2.79 KPa)をガウス曲線6を当てはめたヒストグラムから計算した例です。
図3:結果の適切な統計分析を可能にした見かけのヤング率のヒストグラムの例。データは、対照条件で生育したCol−0の3つの異なる植物の9つの異なる細胞上の力曲線から得られた。201個の力曲線から得られたデータをガウス分布に適合させた。相対度数は、計算された各見かけのヤング率に対応する適合力曲線の数を示します。この条件の平均値と標準偏差の値は、ガウス適合から得られました。RF: 相対周波数;AEM:見かけのヤング率。この図は参考文献6から修正されました この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
一部の遺伝子型は、根の形態のためにインデントが非常に難しい場合があります。これは、重度の浸透圧ストレスで増殖したprc1-1変異体およびttl1 prc1-1二重変異体の場合でした。この状態では、これらの変異体は根の伸長帯に細長い細胞がほとんどなく、非常に長い根毛を発達させ、カンチレバーがサンプルの動きを生み出すのを妨げました。図4は、ttl1 prc1-1二重変異体の9つの異なる細胞における見かけのヤング率の得られた値の確率分布を示すヒストグラムを示す。図は、得られた力曲線が適切な解析を許さなかった例を示しています。1つのセルに対応するヒストグラムHのみをガウス分布6に適合させることができます。
図4:適切な分析を許さなかった見かけのヤング率のヒストグラムの例。 データは、 ttl1prc1-1 二重変異体の3つの異なる植物の9つの異なる細胞の力曲線から得られた。相対度数は、計算された各見かけのヤング率に対応する適合力曲線の数を示します。ヒストグラムHのみをガウス分布に適合させることができました。RF: 相対周波数;AEM: 見かけのヤング率。この図は参考文献6から修正されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
細胞および細胞壁の力学は、力学が成長プロセスにどのように影響するかについての洞察を得るためにますます関連性が高まっています。物理的な力が固体組織内でかなりの距離にわたって伝播するにつれて、細胞壁の物理的特性の変化と、それらがどのように感知され、制御され、調整され、植物の成長に影響を与えるかの研究は、重要な研究分野になりつつあります2,3,8。
ここでは、シロイヌナズナの根の伸長帯における細胞の細胞壁物性を調べる方法を紹介します。AFM技術は、根の成長における細胞壁の物理的特性の影響を理解するために、成長率研究などの他の技術と容易に組み合わせることができる。
最も重要な実験ステップの1つは、サンプルの機械的固定化です。サンプルは、インデント中のサンプルの移動を避けるためにしっかりと取り付けられている必要があります。シリコーン接着剤の層は、すばやく乾くのに十分な厚さでなければなりません。シリコーン接着剤とサンプルの操作は、シリコーンが測定されるサンプルの領域を覆わないように注意する必要があります。さらに、シリコーン接着剤の接着特性を維持し、根の脱水を防ぐために、準備を迅速に(1分以内に)完了する必要があります。組織の損傷を防ぐことが重要です。表皮組織の脱水および損傷は、細胞壁の機械的性質に不可逆的な変化をもたらすであろう。他の方法は、スライドガラス上の1%アガロース中での固定化を使用した。ただし、この方法には、分析中にサンプルがX軸とY軸に移動するのを防ぐために、迅速な操作とスライドガラスの準備の追加ステップが必要になるという課題もあります。詳細については、参考文献 8,18 を参照してください。このプロトコルの別の関連ポイントは、異なる対物レンズ(10倍、20倍、および40倍)を有するAFMに結合された落射蛍光を有する光学顕微鏡でカウントすることである。これにより、インデント領域を正確に選択できます。
プロトコルの難しい側面の1つは、AFMインデント設定の選択です。圧子とくぼみの深さが異なれば、解像度も異なり、さまざまな研究の質問に答えるために使用できます8。いくつかの研究は、チップのサイズと形状が望ましい結果を識別するための重要な考慮事項であることを示しています。異なる先端形状で異なる情報が得られる7.例えば、円錐先端は細胞内レベルで機械的特性を弁別することができ、球状先端は細胞19全体の機械的特性をよりよく表すことができ、ピラミッド状先端は高解像度の画像および機械的特性を同時に得ることを可能にする7、20。ピラミッド状の先端半径(20〜60 nm)の選択は、先端が沈むのを防ぎ、適切なくぼみプロセスを可能にするために重要です。各アプリケーションについて、研究者はサンプルにより適したカンチレバー(およびチップ)のタイプと実行する測定の種類を選択する必要があります8。
この方法にはいくつかの制限があります:臓器の表面にある細胞のみの機械的特性を測定することができ、そして可変トポグラフィーを有する組織は扱うのが難しい。例えば、根毛は、AFM先端8,18を有する表皮細胞へのアクセスを困難にする可能性がある。最後に、提示された方法は弾性を測定しますが、ナノインデンテーションは植物や動物の粘度と膨圧を報告するためにも使用されています8,18。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。データのフィッティングに使用されるMATLABスクリプトは、個人的な要求に応じてJ.C.Bに書面で入手できます。
Acknowledgments
この研究は、CSIC I + D 2018、助成金番号95(マリアナソテロシルベイラ)によって資金提供されました。CSICグルポス(オマールボルサニ)とペデシバ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
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