Summary
يوفر بروتوكول المسافة البادئة المجهرية للقوة الذرية إمكانية تشريح دور الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية لخلية معينة من نسيج أو عضو أثناء النمو الطبيعي أو المقيد (أي تحت عجز الماء).
Abstract
يتم وصف طريقة هنا لتوصيف الخصائص الفيزيائية للجدار الخلوي لخلايا البشرة لجذور Arabidopsis الحية من خلال المسافات البادئة النانوية باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) إلى جانب مجهر مضان بصري مقلوب. تتكون الطريقة من تطبيق قوى مضبوطة على العينة أثناء قياس تشوهها ، مما يسمح بتحديد المعلمات مثل معامل يونغ الظاهر لجدران الخلايا بدقة تحت خلوية. يتطلب تجميدا ميكانيكيا دقيقا للعينة والاختيار الصحيح للمسافة البادئة وأعماق المسافة البادئة. على الرغم من أنه لا يمكن استخدامه إلا في الأنسجة الخارجية ، إلا أن هذه الطريقة تسمح بتوصيف التغيرات الميكانيكية في جدران الخلايا النباتية أثناء التطور وتمكن من ارتباط هذه التغييرات المجهرية بنمو عضو بأكمله.
Introduction
الخلايا النباتية محاطة بجدار خلوي عبارة عن بنية معقدة تتكون من شبكات متفاعلة من السكريات والبروتينات والمستقلبات والماء الذي يختلف سمكه من 0.1 إلى عدة ميكرومتر حسب نوع الخلية ومرحلة النمو 1,2. تلعب الخواص الميكانيكية لجدار الخلية دورا أساسيا في نمو النباتات. تم اقتراح قيم صلابة منخفضة لجدار الخلية كشرط مسبق لنمو الخلايا وتوسيع جدار الخلية ، وهناك أدلة متزايدة على أن جميع الخلايا تستشعر القوى الميكانيكية لأداء وظائفها. ومع ذلك ، لا يزال هناك جدل حول ما إذا كانت التغييرات في الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية تحدد مصير الخلية2،3،4. ونظرا لأن الخلايا النباتية لا تتحرك أثناء النمو، فإن الشكل النهائي للعضو يعتمد على مدى تمدد الخلية وفي أي اتجاه. وبالتالي ، فإن جذر Arabidopsis هو نموذج جيد لدراسة تأثير الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية في تمدد الخلية لأن أنواعا مختلفة من التوسع تحدث في مناطق مختلفة من الجذر. على سبيل المثال ، يتضح التوسع متباين الخواص في منطقة الاستطالة وخاصة بشكل ملحوظ في خلايا البشرة5.
تم استخدام الطريقة الموصوفة هنا لتوصيف الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية لخلايا البشرة على المستوى النانوي لجذور Arabidopsis الحية باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) إلى جانب مجهر طور مضان مقلوب6. للحصول على مراجعة شاملة لتقنية AFM ، اقرأ7،8،9.
يحدد هذا البروتوكول طريقة تحضير العينة الأساسية وطريقة عامة لقياسات المرونة القائمة على AFM لجدران الخلايا النباتية.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية لتجربة المسافة البادئة للقوة في جذور Arabidopsis باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM). يعطي المخطط نظرة عامة على خطوات تجربة القوة البادئة من تحضير الركيزة لشل حركة عينة الجذر بإحكام (1-2) ، وتأكيد صلاحية الجذر من خلال تلطيخ يوديد البروبيديوم (3) ، ووضع الكابولي على سطح خلية بشرة ممدودة من الجذر الأساسي (4-5) ، وقياس منحنيات القوة (6) ، ومعالجة منحنى القوة لحساب معامل يونغ الظاهر (7-8). EZ: منطقة استطالة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحضير المواد النباتية وظروف النمو
- لتوليد المواد النباتية اللازمة ، قم بتعقيم بذور نوع Arabidopsis البري وخطوط الاهتمام الطافرة.
ملاحظة: في هذا البروتوكول ، استخدمنا ما يلي: ttl1: خطوط إدخال T-DNA Salk_063943 (ل TTL1; AT1G53300) - كولومبيا-0 (Col-0) من النوع البري ؛ طفرة Procuste1 (prc1-1) ، والتي تتكون من طفرة خروج المغلوب (Q720stop) في جين CESA6 (AT5G64740) ، كما هو موضح سابقا في10,11 ؛ و TTL1 X PRC1-1 متحولة مزدوجة.- ضع حجما تقريبيا يبلغ 50 ميكرولتر من البذور في أنبوب صغير. أضف 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول + 0.01٪ محلول توين في درجة حرارة الغرفة. تخلط وتحتضن لمدة 7 دقائق.
- صب محلول الإيثانول وإضافة 500 ميكرولتر من 20 ٪ هيبوكلوريت الصوديوم. تخلط وتحتضن لمدة 7 دقائق.
- صب محلول هيبوكلوريت الصوديوم وغسل البذور ثلاث إلى أربع مرات بالماء المعقم.
- تصفيح
- تحضير مقدما القاعدية Murashige و Skoog (MS) المتوسطة12 + 1.5 ٪ السكروز + 1 ٪ أجار (درجة الحموضة 5.7) (انظر جدول المواد). الأوتوكلاف المتوسطة. قم بإعداد غطاء تدفق رقائقي للعمل في بيئة معقمة وقم بتسمية أطباق بتري المربعة اللازمة للتجربة. صب الوسط في أطباق بتري واترك الوسط يصلب.
- ضع البذور المعقمة باستخدام أطراف ماصة معقمة على أطباق بتري مربعة تحتوي على الوسط. توزيع البذور بالتساوي في صفين. عندما تجف البذور ، أغلق الأغطية وأغلق الألواح. طبقي البذور عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 4 أيام.
ملاحظة: هناك حاجة إلى التقسيم الطبقي لمزامنة الإنبات. - ضع الألواح عموديا في حجرة النمو في نظام يوم طويل (16 ساعة من الضوء / 8 ساعات من الظلام) مع شدة ضوء 25 ميكرومول م2 ثانية − 1 و 23 درجة مئوية (ليلا ونهارا). تنمو الشتلات لمدة 7 أيام.
2. علاج الإجهاد التناضحي (اختياري)
ملاحظة: يقدم هذا القسم تفاصيل عن نمو جذور Arabidopsis في الجهد التناضحي -1.2 ميجا باسكال كما هو مقدر بواسطة مقياس التناضح بالمنظار (جدول المواد). يمكن حذف هذا الجزء أو تغييره اعتمادا على السؤال التجريبي المطروح.
- تحضير القاعدية MS المتوسطة + 1.5 ٪ السكروز + 400 mM مانيتول + 1 ٪ أجار (درجة الحموضة 5.7). الأوتوكلاف المتوسطة. صب الوسط في أطباق بتري مربعة في غطاء التدفق الصفحي واترك الوسط يصلب.
- مع ملاقط (جدول المواد) ، ضع الشتلات القديمة لمدة 5 أيام المزروعة مسبقا في MS القاعدية + 1.5 ٪ وسط السكروز في أطباق بتري مربعة تحتوي على الوسط تستكمل مع 400 mM مانيتول. ضع الألواح عموديا في غرفة النمو في نفس الظروف كما في الخطوة 1.2.3. تنمو الشتلات تحت هذه الحالة الإجهاد التناضحي لمدة 7 أيام.
ملاحظة: لتقييم تكيف نمو الجذر للجذر الأساسي أثناء الإجهاد التناضحي الشديد ، يقترح استخدام الشتلات بعد 5 أيام من الإنبات المزروع في ظروف خاضعة للرقابة للتأكد من أن حجم جذر meristem قد تم تحديده بالفعل13. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء التحليل في كل مرحلة من مراحل التطوير لتحديد التأثير التنموي لعمل الإجهاد التناضحي.
3. تجارب الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM)
- تحضير العينة لتجارب المسافة البادئة النانوية
ملاحظة: هذه خطوة حاسمة لتطبيق AFM لدراسة العينات البيولوجية الحية. يجب أن تكون العينة متصلة بإحكام بالركيزة لتكون مستقرة ميكانيكيا أثناء قياسات المسافة البادئة. في الوقت نفسه ، يجب الحفاظ على الصفات الهيكلية للعينة. تتمثل الإستراتيجية الفعالة لتثبيت عينة كبيرة ل AFM في استخدام المواد اللاصقة. يجب أن تجف المادة اللاصقة بسرعة ويجب ألا تكون سامة أو متفاعلة مع الوسط المحيط. في هذا البروتوكول ، تم استخدام أطباق البوليسترين بتري كركيزة وتم استخدام غراء السيليكون غير الحمضي (جدول المواد) لربط شتلات Arabidopsis.- انشر طبقة رقيقة من غراء السيليكون في طبق بتري باستخدام غطاء. اترك الغراء في الهواء لمدة 45 ثانية.
- باستخدام الملقط ، ضع الشتلات على الغراء ، وقم بتوجيهها في اتجاه يتجنب التلامس بين الأجزاء البارزة للشتلات والكابولي. ثم اضغط على الجذر برفق إلى طبقة غراء السيليكون لربطها بإحكام. اترك الشتلات على اتصال بالغراء لمدة 45 ثانية قبل متابعة الخطوات التالية من البروتوكول.
- احتضان الشتلات المرفقة ب 2 ميكروغرام / مل من يوديد البروبيديوم (PI; جدول المواد) لمدة 5 دقائق في الظلام واغسلها بعناية ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات (PBS) (جدول المواد).
- ضع الشتلات المحتضنة PI في مجهر مضان مقلوب مقترن ب AFM. لمراقبة التألق ، اضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث على 572 نانومتر و 617 نانومتر على التوالي. يؤكد غياب التألق داخل خلايا البشرة على صلاحية الجذور.
- قم بتغطية الشتلات بمحلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات (PBS).
- بروتوكول المسافة البادئة
ملاحظة: قم بإجراء جميع قياسات AFM في غضون 1 ساعة بعد تثبيت العينة على دعمها في درجة حرارة الغرفة. يجب الحفاظ على الغرفة التي يوجد بها AFM عند 25 درجة مئوية باستخدام مكيف هواء. يجب أن يكون حل PBS في نفس درجة الحرارة.- قم بتركيب ناتئ نيتريد السيليكون القياسي بطرف هرمي (انظر جدول المواد) في حامل مسبار AFM للسائل (جدول المواد).
- قم بمحاذاة الليزر على الكابولي بالقرب من موضع الحافة. بعد ذلك ، حرك الصمام الثنائي الضوئي لوضع بقعة الليزر في مركز الكاشف.
- لمعايرة حساسية الانحراف ، ضع طبق بتري من البوليسترين مع 1x PBS تحت AFM.
ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة لحساب المسافة البادئة. عندما يتم إجراء قياس القوة على سطح صلب ، لا توجد مسافة بادئة في السطح ، لذا فإن أي تغيير في إزاحة الماسح الضوئي z يتوافق مع انحراف الكابولي. لذلك ، من المهم جدا معايرة حساسية الانحراف على سطح صلب. سيؤدي استخدام سطح ناعم إلى المبالغة في تقدير حساسية الانحراف ، مما سيؤدي إلى ثوابت زنبركية منخفضة جدا. - اضبط الكاشف الضوئي بحيث يكون انحراف عدم الاتصال قريبا من 0 فولت. قم بمعايرة حساسية الانحراف عن طريق إجراء مسافة بادئة (منحنى القوة) ، بحجم منحدر يبلغ 3 ميكرومتر ، ومعدل مسافة بادئة وسحب يبلغ 0.6 ميكرومتر / ثانية ، وعتبة تشغيل تبلغ 0.5 فولت.
- لمعايرة ثابت الزنبرك للناتئ ، استخدم الأداة المساعدة Thermal Tune لبرنامج AFM (جدول المواد) الموصى به للمجسات ذات ثوابت الزنبرك أقل من 5 نيوتن / م تقريبا أو استخدم الطريقة الموضحة في المرجع14. قبل تنشيط Thermal Tune في البرنامج ، تأكد من عدم تفاعل المسبار مع العينة.
- أدخل درجة حرارة الكابولي. انقر فوق معايرة > Thermal Tune أو على أيقونة Thermal Tune في شريط أدوات NanoScope . حدد نطاق تردد (1-100 هرتز).
- انقر فوق الحصول على البيانات في لوحة Thermal Tune. انتظر حتى يحصل AFM على البيانات ، ثم انقر فوق الزر "مذبذب توافقي بسيط" (سائل).
- اضبط متوسط عرض المرشح على 3. اضبط عرض حاوية PSD لتقليل الضوضاء في البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق حساب المتوسط. ضع حدودا مناسبة حول ذروة الرنين الأولى.
- انقر فوق حساب ثابت الربيع k ، ثم انقر فوق نعم في النافذة المنبثقة التي تسأل عما إذا كان المستخدم يريد استخدام هذه القيمة.
- كرر الخطوات الموضحة أعلاه ثلاث مرات وخذ يدويا متوسط قيم الربيع الثابتة. أدخل متوسط القيمة هذا في المربع ثابت الربيع في قائمة معلمات المنحدر في طريقة عرض PicoForce . تنتهي المعايرة عند هذه النقطة.
- باستخدام المجهر الضوئي المقلوب عند تكبير العدسة 10x و 20x و 40x ، ضع مسبار AFM على سطح خلية البشرة الرابعة الممدودة للجذر الأساسي ، مع ضمان وضعها في وسط الخلية.
- باستخدام قيمة ثابت الزنبرك المحسوبة (الخطوة 3.2.5.5) ، احصل على منحنيات قوة بحجم منحدر يبلغ 3 ميكرومتر ، وعتبة تشغيل تبلغ 11 نانونيوتن ، ومعدل مسافة بادئة وسحب يبلغ 0.6 ميكرومتر / ثانية عند نقاط محددة.
ملاحظة: وجد العمل السابق15,16 أن التردد المنخفض للمسافة البادئة والتراجع يساعد على تقليل التباطؤ وقوة السحب. - الحصول على منحنيات القوة من ثلاث خلايا لكل جذر لكل علاج (استخدم ثلاث نسخ بيولوجية لكل علاج). التقط ما لا يقل عن 150 منحني قوة لكل جذر.
4. قياس معامل يونغ الظاهر
- قم بملاءمة كل منحنى قوة مع النموذج التالي للمسافة البادئة الهرمية17:
، حيث E هو معامل يونغ الظاهر للعينة ، هو معامل بواسون للعينة ، 
α هو نصف الزاوية إلى الرأس. تجاهل الملاءمة مع معامل الارتباط (r2) < 0.99. ضع في اعتبارك نسبة Poisson للمواد غير القابلة للضغط تماما: = 0.5 وهندسة المسافة البادئة التي قدمتها الشركات المصنعة.
ملاحظة: استخدم أول 100 نانومتر من نقطة التلامس لمنحنى التحميل حتى يكون التركيب حساسا قدر الإمكان لميكانيكا جدار الخلية ولتقليل تأثير الضغط الانتفاخي على قيم معامل يونغ الظاهرة8. تم التركيب باستخدام برنامج MATLAB مخصص (متاح بناء على طلب شخصي عن طريق الكتابة إلى J. C. B) والذي يسمح بتعيين عمق مسافة بادئة محددة من نقطة الاتصال لمنحنى التحميل. - قم بإنشاء مدرج تكراري طبيعي مع بيانات معامل يونغ الظاهرة وتناسبه مع توزيع غاوسي. تجاهل نقاط البيانات خارج فاصل الثقة 95٪ وإعادة حساب كل من الرسم البياني وملاءمة Gaussian. احسب وأبلغ عن المتوسط والانحراف المعياري لمعامل يونغ الظاهر.
- تحديد أهمية المقارنات بين المجموعات من خلال اختبارات مقارنة متعددة مثل ANOVA.
، حيث E هو معامل يونغ الظاهر للعينة ، هو معامل بواسون للعينة ، 
α هو نصف الزاوية إلى الرأس. تجاهل الملاءمة مع معامل الارتباط (r2) < 0.99. ضع في اعتبارك نسبة Poisson للمواد غير القابلة للضغط تماما: Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تجارب القوة البادئة
يعرض النص التالي بعض النتائج المتوقعة عند إجراء تجربة المسافة البادئة للقوة لإظهار الناتج النموذجي المتوقع عند تنفيذ البروتوكول بشكل جيد.
منحنيات إزاحة القوة
يتم عرض مخططات المسافة البادئة للقوة التمثيلية التي تم الحصول عليها لوضع مسافة بادئة للعينات الحية في موضع موضوع في وسط خلية منطقة استطالة الجذر في الشكل 2. عندما يبدأ طرف AFM في وضع مسافة بادئة لسطح جدار الخلية ، تبدأ القوة في الزيادة (المشار إليها بالرقم 1 في الشكل 2 أ) بسبب معارضة جدار الخلية للتشوه. تستمر زيادة القوة (التحميل) حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى لقيمة القوة (المشار إليها بالرقم 2 في الشكل 2 أ) ؛ بعد هذه النقطة ، يبدأ جزء التفريغ من المسافة البادئة.
الشكل 2: منحنيات إزاحة القوة التي تم الحصول عليها في تجارب المسافة البادئة التي أجريت في الجدران الخلوية لخلايا منطقة استطالة الجذر الحية. أ: منحنى إزاحة القوة النموذجي. في الموضع المميز ب 1 ، تبدأ القوة في الزيادة ؛ يبدأ طرف AFM في وضع مسافة بادئة لجدار الخلية. تستمر زيادة القوة (التحميل) حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى لقيمة القوة ، كما هو موضح ب 2 ؛ بعد هذه النقطة ، يبدأ جزء التفريغ من المسافة البادئة. (ب) مثال على منحنى إزاحة القوة حيث يستحيل اكتشاف موضع سطح الخلية قبل المسافة البادئة (المشار إليها ب a) ، ويكون كل من منحنيات التحميل والتفريغ صاخبة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
ستظهر منحنيات إزاحة القوة المتوقعة في جزء المسافة البادئة أن القوة تنمو بعد القطع المكافئ ، كما تنبأ النموذج (الموضح في الخطوة 4.1) (الشكل 2 أ). معلمة مناسبة أخرى هي موضع نقطة الاتصال ؛ يجب أن يتوافق مع سطح جدار الخلية قبل المسافة البادئة ويعتبر أصل إزاحة طرف AFM. يجب التخلص من منحنيات القوة التي يستحيل فيها اكتشاف نقطة الاتصال قبل المسافة البادئة (الشكل 2 ب). يجب أن يكون منحنى التحميل والتفريغ لتجربة المسافة البادئة للقوة خاليا من الضوضاء. يجب التخلص من المنحنيات الصاخبة مثل تلك الممثلة في الشكل 2B .
الرسم البياني الطبيعي لمعامل يونغ الظاهر
يوضح الشكل 3 الرسوم البيانية التي توضح توزيع تكرار القيم التي تم الحصول عليها لمعامل يونغ الظاهر لمجموعة من 201 مسافة بادئة ناجحة على تسع خلايا مختلفة لثلاثة نباتات مختلفة من Col-0 نمت في ظروف التحكم. يوضح الشكل مثالا تم فيه حساب المتوسط والانحراف المعياري لمعامل يونغ الظاهر (88.12 ± 2.79 كيلو باسكال) من الرسوم البيانية المزودة بمنحنى غاوسي6.
الشكل 3: مثال على رسم بياني لمعامل يونغ الظاهري الذي سمح بإجراء تحليل إحصائي مناسب للنتائج. تم الحصول على البيانات من منحنيات القوة على تسع خلايا مختلفة من ثلاثة نباتات مختلفة من Col-0 نمت في ظروف التحكم. تم تركيب البيانات التي تم الحصول عليها من منحنيات القوة 201 على توزيع Gaussian. يشير التردد النسبي إلى عدد منحنيات القوة المجهزة التي تتوافق مع كل معامل ظاهر محسوب ليونغ. تم الحصول على قيم المتوسط والانحراف المعياري لهذا الشرط من نوبات Gaussian. RF: التردد النسبي. AEM: معامل يونغ الظاهر. تم تعديل هذا الرقم من المرجع6يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
قد يكون من الصعب جدا وضع مسافة بادئة لبعض الأنماط الجينية بسبب مورفولوجيا الجذر. كان هذا هو الحال بالنسبة للمتحولة prc1-1 و ttl1 prc1-1 الطافرة المزدوجة التي نمت في إجهاد تناضحي شديد. في هذه الحالة ، كان لهذه الطفرات عدد قليل من الخلايا الممدودة في منطقة استطالة الجذر وطورت شعيرات جذر طويلة جدا ، والتي تتداخل مع الكابولي الذي ينتج حركة العينة. يقدم الشكل 4 الرسوم البيانية التي توضح التوزيع الاحتمالي للقيم التي تم الحصول عليها لمعامل يونغ الظاهر على تسع خلايا مختلفة من الطافر المزدوج ttl1 prc1-1. يوضح الشكل مثالا لم تسمح فيه منحنيات القوة التي تم الحصول عليها بالتحليل المناسب. فقط الرسم البياني H الذي يتوافق مع خلية واحدة يمكن تركيبه على توزيع Gaussian6.
الشكل 4: مثال على الرسوم البيانية لمعامل يونغ الظاهري الذي لم يسمح بإجراء تحليل سليم. تم الحصول على البيانات من منحنيات القوة على تسع خلايا مختلفة لثلاثة نباتات مختلفة من الطفرة المزدوجة ttl1prc1-1 . يشير التردد النسبي إلى عدد منحنيات القوة المجهزة التي تتوافق مع كل معامل ظاهر محسوب ليونغ. يمكن تركيب الرسم البياني H فقط على توزيع Gaussian. RF: التردد النسبي. AEM: معامل يونغ الظاهر. تم تعديل هذا الرقم من المرجع6. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أصبحت ميكانيكا الخلايا والجدران الخلوية ذات صلة بشكل متزايد لاكتساب نظرة ثاقبة حول كيفية تأثير الميكانيكا على عمليات النمو. مع انتشار القوى الفيزيائية على مسافات كبيرة في الأنسجة الصلبة ، أصبحت دراسة التغيرات في الخصائص الفيزيائية للجدار الخلوي وكيفية استشعارها والتحكم فيها وضبطها وتأثيرها على نمو النبات مجالا مهما للدراسة2،3،8.
يتم تقديم طريقة هنا لدراسة الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية للخلايا في منطقة استطالة جذر Arabidopsis. يمكن دمج تقنية AFM بسهولة مع تقنيات أخرى ، مثل دراسات معدل النمو ، لفهم تأثير الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية في نمو الجذر.
واحدة من أهم الخطوات التجريبية هي الشلل الميكانيكي للعينة. يجب إرفاق العينة بإحكام لتجنب حركة العينة أثناء وضع مسافة بادئة لها. يجب أن تكون طبقة غراء السيليكون رقيقة بما يكفي للسماح لها بالجفاف بسرعة. يجب أن يكون التلاعب بغراء السيليكون والعينة حريصا للتأكد من أن السيليكون لا يغطي مناطق العينة التي سيتم قياسها. علاوة على ذلك ، يجب إكمال التحضير بسرعة (في غضون دقيقة) للحفاظ على الخصائص اللاصقة لغراء السيليكون ومنع جفاف الجذور. من الأهمية بمكان منع تلف الأنسجة. سيؤدي الجفاف وتلف أنسجة البشرة إلى تغييرات لا رجعة فيها في الخواص الميكانيكية لجدار الخلية. طرق أخرى تستخدم الشلل في 1 ٪ agarose على شريحة زجاجية. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تواجه أيضا تحديا يتمثل في الحاجة إلى معالجة سريعة وخطوة إضافية لإعداد الشرائح الزجاجية لمنع العينات من التحرك في المحورين X و Y أثناء التحليل. لمزيد من المعلومات ، انظر المراجع8،18. نقطة أخرى ذات صلة بهذا البروتوكول هي العد باستخدام مجهر ضوئي مع تألق فوقي مقترن ب AFM له أهداف مختلفة (10x و 20x و 40x). هذا يسمح بتحديد منطقة المسافة البادئة بدقة.
أحد الجوانب الصعبة للبروتوكول هو اختيار إعدادات المسافات البادئة AFM. تقدم أعماق المسافة البادئة والمسافة البادئة المختلفة دقة مختلفة ويمكن استخدامها للإجابة على أسئلة البحث المختلفة8. أظهرت العديد من الدراسات أن حجم الطرف وهندسته من الاعتبارات المهمة لتمييز النتائج المرجوة. يتم الحصول على معلومات مختلفة بأشكال طرف مختلفة7. على سبيل المثال ، يمكن للطرف المخروطي التمييز بين الخواص الميكانيكية على المستوى دون الخلوي ، ويمكن للطرف الكروي أن يمثل بشكل أفضل الخواص الميكانيكية للخلية بأكملها19 ، وتسمح النصائح الهرمية بالحصول على صور عالية الدقة وخصائص ميكانيكية في نفس الوقت 7,20. يعد اختيار نصف قطر الطرف الهرمي (20-60 نانومتر) أمرا مهما لمنع الطرف من الغرق ، مما يسمح بعملية المسافة البادئة المناسبة. لكل تطبيق ، يجب على الباحث اختيار نوع الكابولي (والطرف) الأنسب للعينة ونوع القياسات التي يجب إجراؤها8.
تحتوي الطريقة على بعض القيود: يمكن قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الموجودة على سطح الأعضاء فقط ، ويصعب التعامل مع الأنسجة ذات الطبوغرافيا المتغيرة. على سبيل المثال ، قد تجعل الشعيرات الجذرية من الصعب الوصول إلى خلايا البشرة باستخدام طرف AFM 8,18. أخيرا ، بينما تقيس الطريقة المقدمة المرونة ، تم استخدام المسافة البادئة النانوية أيضا للإبلاغ عن اللزوجة وضغط التورم في النباتات والحيوانات 8,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح. يتوفر البرنامج النصي MATLAB المستخدم لتركيب البيانات بناء على طلب شخصي عن طريق الكتابة إلى J. C. B.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل CSIC I + D 2018 ، المنحة رقم 95 (ماريانا سوتيلو سيلفيرا). CSIC Grupos (عمر بورساني) و PEDECIBA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
- Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
- Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
- Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L.
- Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236 (2021).
- Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
- Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
- Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).
- Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).
- Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
- Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
- Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
- Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916 (2012).
