Summary
CUT&RUN og dets varianter kan bruges til at bestemme proteinbelægning på kromatin. Denne protokol beskriver, hvordan man bestemmer proteinlokalisering på kromatin ved hjælp af enkeltcelle uliCUT & RUN.
Abstract
Bestemmelse af bindingsstederne for et protein på kromatin er afgørende for at forstå dets funktion og potentielle lovgivningsmæssige mål. Kromatinimmunfældning (ChIP) har været guldstandarden til bestemmelse af proteinlokalisering i over 30 år og defineres ved anvendelse af et antistof til at trække proteinet af interesse ud af sonikeret eller enzymatisk fordøjet kromatin. For nylig er antistofbindingsteknikker blevet populære til vurdering af proteinlokalisering på kromatin på grund af deres øgede følsomhed. Spaltning under mål og frigivelse under nuklease (CUT &RUN) er det genom-brede derivat af Chromatin Immunocleavage (ChIC) og anvender rekombinant protein A bundet til mikrokoknuklease (pA-MNase) til at identificere IgG-konstantområdet af antistoffet rettet mod et protein af interesse, hvilket muliggør stedsspecifik spaltning af DNA'et, der flankerer proteinet af interesse. CUT & RUN kan bruges til at profilere histonmodifikationer, transkriptionsfaktorer og andre kromatinbindende proteiner såsom nukleosomombygningsfaktorer. Det er vigtigt, at CUT&RUN kan bruges til at vurdere lokaliseringen af enten eukromatiske eller heterokromatiske associerede proteiner og histonmodifikationer. Af disse grunde er CUT&RUN en kraftfuld metode til bestemmelse af bindingsprofilerne for en lang række proteiner. For nylig er CUT&RUN blevet optimeret til transkriptionsfaktorprofilering i lave populationer af celler og enkeltceller, og den optimerede protokol er blevet betegnet ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN). Her præsenteres en detaljeret protokol til enkeltcellefaktorprofilering ved hjælp af uliCUT &RUN i et manuelt 96-brønds format.
Introduction
Mange nukleare proteiner fungerer ved at interagere med kromatin for at fremme eller forhindre DNA-skabelonerede aktiviteter. For at bestemme funktionen af disse kromatin-interagerende proteiner er det vigtigt at identificere de genomiske steder, hvor disse proteiner er bundet. Siden udviklingen i 1985 har Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) været guldstandarden til at identificere, hvor et protein binder sig til kromatin 1,2. Den traditionelle ChIP-teknik har følgende grundlæggende arbejdsgang: celler høstes og tværbundes (normalt med formaldehyd), kromatin skæres (normalt med hårde sonikeringsmetoder, hvilket nødvendiggør tværbinding), proteinet af interesse immunudfældes ved hjælp af et antistof, der er målrettet mod proteinet (eller mærket protein) efterfulgt af et sekundært antistof (koblet til agarose eller magnetiske perler), tværbinding vendes, protein og RNA fordøjes for at rense DNA, og dette ChIP-berigede DNA bruges som skabelon til analyse (ved hjælp af radioaktivt mærkede sonder 1,2, qPCR3, mikroarrays 5,6 eller sekventering4). Med fremkomsten af mikroarrays og massivt parallel dyb sekventering er ChIP-chip 5,6 og ChIP-seq4 for nylig blevet udviklet og giver mulighed for genom-bred identifikation af proteinlokalisering på kromatin. Crosslinking ChIP har været en kraftfuld og pålidelig teknik siden dens fremkomst med store fremskridt inden for opløsning af ChIP-exo7 og ChIP-nexus8. Parallelt med udviklingen af ChIP-seq er der etableret indfødte (ikke-tværbindende) protokoller for ChIP (N-ChIP), som udnytter nukleasefordøjelsen (ofte ved hjælp af mikrokoknuklease eller MNase) til at fragmentere kromatinen i modsætning til sonikering udført i traditionelle tværbinding ChIP-teknikker9. En stor ulempe ved både tværbinding af ChIP- og N-ChIP-teknologier har imidlertid været kravet om høje celletal på grund af lavt DNA-udbytte efter den eksperimentelle manipulation. Derfor har mange bestræbelser i de senere år været rettet mod at optimere ChIP-teknologier til lavt celleinput. Disse bestræbelser har resulteret i udviklingen af mange kraftfulde ChIP-baserede teknologier, der varierer i deres anvendelighed og inputkrav 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Imidlertid har enkeltcellede ChIP-seq-baserede teknologier manglet, især for ikke-histonproteiner.
I 2004 blev der udviklet en alternativ teknologi til bestemmelse af proteinbelægning på kromatin betegnet Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) og Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Disse single-locus teknikker udnytter en fusion af MNase til enten proteinet af interesse (ChEC) eller til protein A (ChIC) til direkte skæring af DNA ved siden af proteinet af interesse. I de senere år er både ChEC og ChIC blevet optimeret til genom-dækkende proteinprofilering på kromatin (henholdsvis ChEC-seq og CUT&RUN)20,21. Mens ChEC-seq er en kraftfuld teknik til bestemmelse af faktorlokalisering, kræver det udvikling af MNase-fusionsproteiner til hvert mål, mens ChIC og dets genom-brede variation, CUT&RUN, er afhængige af et antistof rettet mod proteinet af interesse (som med ChIP) og rekombinant protein A-MNase, hvor protein A kan genkende IgG-konstantområdet af antistoffet. Som et alternativ er der udviklet et fusionsprotein A/protein G-MNase (pA/G-MNase), der kan genkende en bredere vifte af antistofkonstantområder22. CUT&RUN er hurtigt blevet et populært alternativ til ChIP-seq til bestemmelse af proteinlokalisering på kromatingenomet.
Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), en variation af CUT&RUN, der gør det muligt at bruge lave og enkeltcellede input, blev beskrevet i 201923. Her beskrives metoden til en manuel enkeltcelleapplikation i 96-brønds format. Det er vigtigt at bemærke, at der siden udviklingen af uliCUT&RUN er udviklet to alternativer til histonprofilering, CUT&Tag og iACT-seq, hvilket giver robust og meget parallel profilering af histonproteiner24,25. Desuden er scCUT&Tag optimeret til profilering af flere faktorer i en enkelt celle (multiCUT&Tag) og til påføring på ikke-histonproteiner26. Tilsammen udgør CUT&RUN et attraktivt alternativ til ChIP-seq med lavt input, hvor uliCUT&RUN kan udføres i ethvert molekylærbiologisk laboratorium, der har adgang til cellesortering og standardudstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk erklæring: Alle undersøgelser blev godkendt af Institutional Biosafety Office of Research Protections ved University of Pittsburgh.
1. Forbered magnetiske perler
BEMÆRK: Udfør før cellesortering og hold på is indtil brug.
- Pipette 30 μL ConA-konjugerede paramagnetiske mikrosfærer perleopslæmning blandes pr. reaktion på et frisk 1,5 ml mikrofugerør og tilsættes 850 μL bindingsbuffer, pipetteres forsigtigt for at blande.
BEMÆRK: ConA-konjugerede paramagnetiske mikrosfærer er lektinbelagte magnetiske perler, der tillader lipidmembranbinding. - Placer røret på et magnetisk stativ og lad perlerne magnetisere i 1-2 min. Når supernatanten er ryddet, skal du fjerne og kassere supernatanten uden at forstyrre perlerne.
- Fjern røret fra magnetstativet, og vask perlerne ved at genbruge i 1 ml bindingsbuffer.
- Gentag trin 1.2 og 1.3.
- Magnetiser perlerne i 2 min og fjern supernatanten for at kassere.
- Fjern røret fra magnetstativet, og ophænd perlerne igen i 30 μL bindingsbuffer pr. reaktion.
- Hold den vaskede perleblanding på is, indtil cellerne er sorteret.
2. Høstceller
BEMÆRK: Dette trin er skrevet til klæbende celler og optimeret til murine E14 embryonale stamceller. Dyrkning og høst af cellerne afhænger af celletypen.
- Fjern cellerne fra 37 °C-inkubatoren, og undersøg dem under et mikroskop for at sikre kvaliteten.
- Aspirer mediet fra cellepladen og skyl med 5 ml 1x PBS.
- Aspirat PBS fra pladen og høst cellerne (ved hjælp af traditionelle cellehøstningsmetoder, som vil variere efter celletype). Opnå enkeltcellesuspension ved forsigtigt at pipettere op og ned med en serologisk pipette mod kulturskålen, hvis det er nødvendigt.
- Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør og drej ned ved 200 x g i 5 minutter.
- Aspirer medierne for at kassere og vaske cellepillen med 5 ml PBS + 1% FBS.
- Spin ned cellerne ved 200 x g i 5 minutter, kassér supernatanten, og genophænd cellepillen i 5 ml PBS + 1% FBS.
- Tæl cellerne og overfør 1 ml 1 x 106 celler til et nyt 1,5 ml mikrofugerør.
- Tilsæt 5 μL 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD), inverter røret godt for at blande, og påfør derefter prøven på cellesorteringen for at sortere levende enkeltceller i individuelle brønde i en 96-brønds plade.
BEMÆRK: 7-AAD-farvestof er udelukket fra levende celler og kan derfor anvendes til levende cellesortering.
3. Cellesortering og lysis
- Forbered en cellesorteringskompatibel 96-brønds plade med 100 μL Nuclear Extraction (NE) Buffer i hver brønd inden cellesortering.
- Sorter cellerne i plader med 96 brønde efter producentens anvisninger.
- Drej hurtigt pladen (600 x g i 30 s) for at sikre, at cellerne er i bufferen i brøndene.
BEMÆRK: Det er værd at teste i et indledende eksperiment, om de celler, der anvendes, bringes pålideligt til bunden af brøndene. - Hold prøverne på is i 15 min.
- Prøverne drejes ned ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C, og pipetter forsigtigt for at fjerne supernatanten (efterlader 5 μL).
- Resuspend hver prøve i 55 μL NE buffer og tilsæt 30 μL af de forvaskede ConA-konjugerede paramagnetiske mikrosfærer (fra trin 1.7; i bindingsbuffer) til hver reaktion.
- Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter.
4. Forbloker prøver for at forhindre tidlig fordøjelse af MNase
- Placer pladen på et magnetisk stativ med 96 brønde, lad perlerne binde i mindst 5 minutter, og fjern og kassér derefter supernatanten.
- Tilsæt 100 μL blokeringsbuffer til de kernebundne perler og bland med skånsom pipettering.
- Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
5. Tilsætning af primært antistof
- Placer pladen på et magnetisk stativ med 96 brønde, lad supernatanten rydde i mindst 5 minutter, og fjern og kassér derefter supernatanten uden at forstyrre perlerne.
- Fjern pladen fra magnetstativet, og ophæd perlerne igen i 100 μL vaskebuffer pr. reaktion med skånsom pipettering.
- Placer pladen tilbage på det magnetiske stativ med 96 brønde, lad supernatanten rydde, og fjern og kassér derefter supernatanten.
- Resuspend perlerne i 25 μL vaskebuffer pr. reaktion med skånsom pipettering.
- Lav en primær antistofmasterblanding: 25 μL vaskebuffer + 0,5 μL antistof pr. Reaktion.
- Mens du forsigtigt hvirvler de kernebundne perler, tilsættes 25 μL af den primære antistofmasterblanding til hver prøve, der behandles med et antistof rettet mod proteinet af interesse (typisk 1:100 endelig fortynding). Tilsæt 25 μL vaskebuffer uden antistof, hvis du udfører en kontrol.
- Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
- Læg prøverne på et magnetisk stativ med 96 brønde, lad supernatanten rydde i mindst 5 minutter, og fjern og kassér derefter supernatanten uden at forstyrre perlerne.
- Fjern pladen fra magnetstativet, og vask perlerne med 100 μL vaskebuffer, der genbruges ved pipettering.
6. Tilsætning af pA-MNase eller pA/G-MNase
BEMÆRK: Protein A har en høj affinitet for IgG-molekyler fra visse arter såsom kaniner, men er ikke egnet til IgG'er fra andre arter såsom mus eller rotter. Alternativt kan Protein A/G-MNase anvendes. Denne hybrid binder kanin-, muse- og rotte-IgG'er og undgår behovet for sekundære antistoffer, når der anvendes primære antistoffer fra mus eller rotter.
- Placer pladen tilbage på et magnetisk stativ med 96 brønde, lad supernatanten rydde i mindst 5 minutter, og fjern og kassér derefter supernatanten uden at forstyrre perlerne.
- Fjern pladen fra magnetristen, og ophæns hver prøve igen i 25 μL vaskebuffer.
- Lav en pA-MNase master mix (25 μL Wash Buffer + optimeret mængde pA-MNase pr. Reaktion).
- Mens du forsigtigt hvirvler, tilsættes 25 μL af pA-MNase masterblandingen til hver prøve, inklusive kontrolprøverne.
BEMÆRK: Koncentrationen af pA-MNase varierer efter tilberedning, hvis den er hjemmelavet, og bør testes inden brug ved hver uafhængig rensning. For pA/G-MNase bør der anvendes 2,5 μL af 20x-bestanden. - Inkuber prøverne i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Placer pladen på et magnetisk stativ med 96 brønde, lad supernatanten rydde i mindst 5 minutter, og fjern og kassér derefter supernatanten uden at forstyrre perlerne.
- Fjern pladen fra magnetstativet, og vask perlerne med 100 μL vaskebuffer, og genbrug ved skånsom pipettering.
7. Rettet DNA-fordøjelse
- Placer pladen på et magnetisk stativ med 96 brønde, lad supernatanten rydde i mindst 5 minutter, og fjern og kassér derefter supernatanten.
- Fjern prøverne fra magnetstativet, og ophænd perlerne igen i 50 μL vaskebuffer ved skånsom pipettering.
- Prøverne udlignes til 0 °C i en is/vand-blanding i 5 minutter.
- Prøverne fjernes fra is-/vandbadet på 0 °C, og der tilsættes 1 μL 100 mMCaCl2 ved hjælp af en flerkanalspipette. Bland godt (3-5 gange) med skånsom pipettering ved hjælp af en flerkanalspipette med større volumen, og returner derefter prøverne til 0 °C.
BEMÆRK: Det er vigtigt at blande godt her. CaCl2 tilsættes for at aktivere MNase fordøjelse af DNA, der flankerer proteinet af interesse. - Start en 10 min timer, så snart pladen er tilbage i is/vandbadet.
- Stop reaktionen ved at pipettere 50 μL 2XRSTOP+ Buffer i hver brønd i samme rækkefølge som CaCl2 blev tilsat.
BEMÆRK: Lav 2XRSTOP+ Buffer, før 10 minutters fordøjelse er overstået for at forhindre overfordøjelse.
8. Prøvefraktionering
- Inkubere prøverne i 20 minutter ved 37 °C.
- Drej pladen ved 16.000 x g i 5 min ved 4 °C.
- Placer pladen på et magnetisk stativ med 96 brønde, lad supernatanten rydde i mindst 5 minutter, og overfør supernatanter til en frisk plade med 96 brønde. Kassér perlerne.
9. DNA-ekstraktion
- Der tilsættes 1 μL 10 % natriumdodecylsulfat (SDS) og 0,83 μL 20 mg/ml proteinase K til hver prøve.
FORSIGTIG: SDS-pulver er skadeligt ved indånding. Brugere skal bruge i godt ventilerede rum iført beskyttelsesbriller, handsker og en N95-grade åndedrætsværn, håndtering med omhu. - Bland prøverne ved blid pipettering.
- Inkubere prøverne i 10 minutter ved 70 °C.
- Returner pladen til stuetemperatur, og tilsæt 46,6 μL 5 M NaCl og 90 μL 50% PEG 4000. Bland ved blid pipettering.
- Tilsæt 33 μL polystyrenmagnetitperler til hver prøve og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Sørg for at bringe polystyrenmagnetitperler til stuetemperatur (~ 30 minutter) og bland godt inden brug. - Placer pladen på et magnetisk stativ, og lad supernatanten rydde i ~ 5 minutter, og kassér derefter forsigtigt supernatanten uden at forstyrre perlerne.
- Skyl 2x med 150 μL 80% ethanol uden at forstyrre perlerne.
FORSIGTIG: Ethanol er meget brandfarligt og forårsager hud-, øjen- og lungeirritation. Udfør dette trin med passende laboratoriebeklædning og i en udluftet hætte. - Drej pladen kort ved 1000 x g i 30 s. Placer pladen tilbage på et magnetisk stativ med 96 brønde, og fjern alle resterende EtOH uden at forstyrre perlerne.
- Lufttør prøverne i ~2-5 min.
BEMÆRK: Tør ikke perlerne i mere end 5 min. Hvis du er omhyggelig med at fjerne EtOH, er 2-3 minutters tørring tilstrækkelig. - Resuspend perlerne med 37,5 μL 10 mM Tris-HCl (pH 8) og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Placer pladen på et magnetisk stativ og lad perlerne binde i 5 min.
- Overfør 36,5 μL af supernatanten til en frisk termocyklistkompatibel 96-brønds plade. Kassér perlerne.
BEMÆRK: Eksperimentet kan stoppes her ved at opbevare prøver ved -20 °C eller kan fortsætte med biblioteksopbygningen (trin 10-15).
10. Afslut reparation, fosforylering, adenylering
BEMÆRK: Reagenserne er hentet som refereret i materialetabellen. Nedenstående protokol følger en lignende metode som det kommercielle kit, såsom NEBNext Ultra DNA II-kit.
- Fortynd 5 U/μL T4 DNA-polymerase 1:20 i 1x T4 DNA-ligasebuffer.
- Der fremstilles en slutreparations-/3'A-masterblanding: 2 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer, 2,5 μL 10 mM dNTP'er, 1,25 μL 10 mM ATP, 3,13 μL 40% PEG 4000, 0,63 μL 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL fortyndet T4-DNA-polymerase, 0,5 μL 5U/μL Taq DNA-polymerase med et samlet volumen på 13,5 μL pr. reaktion.
BEMÆRK: Sørg for at bringe 40% PEG 4000 til stuetemperatur inden pipettering. - Tilsæt 13,5 μL slutreparation/3'A master mix til 36,5 μL DNA.
- Bland reaktionen ved hurtig hvirvel, og derefter en hurtig drejning (500 x g i 10 s).
- Inkuberes under anvendelse af følgende reaktionsbetingelser i en forkølet termocyklist med opvarmet låg ved temperaturer >20 °C. Anvend reaktionsbetingelserne: 12 °C i 15 minutter, 37 °C i 15 minutter, 72 °C i 20 minutter, hold ved 4 °C.
11. Adapter ligering
BEMÆRK: Opbevar prøverne på is, mens du opretter følgende reaktion. Lad ligasebufferen komme til stuetemperatur inden pipettering. Fortynd adapteren (se materialetabellen) i en opløsning på 10 mM Tris-HCl indeholdende 10 mM NaCl (pH 7,5). På grund af det lave udbytte må du ikke forudkvantificere det CUT&RUN-berigede DNA. I stedet genereres 25 gange fortyndinger af adapteren ved hjælp af en endelig arbejdsadapterkoncentration på 0,6 μM.
- Lav en ligationsmasterblanding: 55 μL ligasebuffer (2x), 5 μL T4 DNA-ligase og 5 μL fortyndet adapter med et samlet volumen på 65 μL pr. Reaktion.
- Tilsæt 65 μL af masterligationsblandingen til 50 μL DNA fra trin 10.5.
- Bland ved hurtig hvirvelstrømning efterfulgt af hurtig spinding (500 x g i 10 s).
- Inkuber ved 20 °C i en termocyklist (uden opvarmet låg) i 15 min.
BEMÆRK: Fortsæt straks til følgende trin.
12. BRUGER fordøjelse
- Tilsæt 3 μL USER-enzym til hver prøve, hvirvel og spin (500 x g i 10 s).
- Inkuber i termisk cyktur ved 37 °C i 15 minutter (opvarmet låg indstillet til 50 °C).
13. Oprydning af polystyrenmagnetitperler efter ligeringsreaktion
BEMÆRK: Lad polystyrenmagnetitperler udligne ved stuetemperatur (~ 30 min). Vortex til homogenisering af perleopløsningen inden brug. Udfør følgende trin ved stuetemperatur.
- Tilsæt 39 μL (0,33x) polystyrenmagnetitperleopløsning til hver brønd, der indeholder adaptor-ligeret DNA.
- Bland grundigt ved pipettering, og inkuber derefter prøverne ved stuetemperatur i 15 minutter for at lade DNA binde sig til perlerne.
- Læg prøverne på et magnetisk stativ med 96 brønde og inkuber i 5 minutter, indtil supernatanten er klar.
- Opbevar pladen på magnetstativet og fjern forsigtigt og kassér supernatanten uden at forstyrre perlerne.
- Skyl perlerne med 200 μL 80% EtOH uden at forstyrre perlerne.
- Inkuber i 30 s på et magnetisk stativ med 96 brønde, så opløsningen kan ryddes.
- Fjern og kassér supernatanten uden at forstyrre perlerne.
- Gentag trin 13.5-13.7 for i alt to vaske.
- Drej pladen kort ved 500 x g i 10 s, læg pladen tilbage på et magnetisk stativ med 96 brønde, og fjern resterende EtOH uden at forstyrre perlerne.
- Opbevar pladen på magnetristen og lufttør prøverne i 2 min.
BEMÆRK: Overtør ikke perlerne. - Fjern pladen fra magnetstativet, og ophæng perlerne igen i 28,5 μL på 10 mM Tris-HCl (pH 8).
FORSIGTIG: Saltsyre er meget ætsende. Brugere skal håndtere det med omhu i en kemisk røghætte iført beskyttelsesbriller, handsker og en laboratoriefrakke. - Resuspend perler grundigt ved pipettering, og pas på ikke at producere bobler.
- Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Placer pladen på et magnetisk stativ med 96 brønde, og lad opløsningen rydde i 5 minutter.
- Overfør 27,5 μL supernatant til en ny PCR-plade og kassér perlerne.
14. Bibliotek berigelse
BEMÆRK: Primere fortyndes med samme opløsning som adapteren. Til denne biblioteksopbygning skal du bruge en endelig fungerende grundkoncentration på 0,6 μM.
- Der tilsættes 5 μL fortyndet indekseret primer (se materialetabel) til hver prøve.
BEMÆRK: Hver prøve har brug for et andet indeks, der skal identificeres efter sekventering. - Forbered en PCR-masterblanding: 10 μL 5x PCR-buffer med høj nøjagtighed, 1,5 μL 10 mM dNTP'er, 5 μL fortyndet Universal-primer, 1 μL 1 U hot start high fidelity-polymerase med et samlet mastermixvolumen på 17,5 μL pr. prøve.
- Tilsæt 17,5 μL pf PCR-blanding til 32,5 μL renset adaptor-ligeret DNA (5 μL indekseret primer er inkluderet i dette volumen).
- Bland opløsningen ved pipettering.
- Inkuberes i en termocyklist under anvendelse af følgende reaktionsbetingelser med en maksimal rampehastighed på 3 °C/s: 98 °C i 45 s, 98 °C i 45 s, 60 °C i 10 s, gentages det andet og tredje trin 21 gange, 72 °C i 1 min., ved 4 °C.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares ved 4 °C til kortvarig opbevaring eller -20 °C til langtidsopbevaring.
15. Oprydning af polystyrenmagnetitperler
- Der tilsættes 60 μL (1,2x) polystyrenmagnetitperler til hver prøve.
- Resuspend perlerne ved pipettering og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Anbring pladen på et magnetisk stativ i 5 minutter, indtil opløsningen er klar.
- Kassér supernatanten og skyl perlerne med 200 μL 80% EtOH uden at forstyrre perlerne.
- Gentag vasketrinnet for i alt to 80% EtOH vaske.
- Drej pladen ved 500 x g i 10 s, læg pladen på et magnetisk stativ med 96 brønde, og lad perlerne binde i 5 minutter.
- Pipette for at fjerne overskydende EtOH uden at forstyrre perlerne og lade perlerne lufttørre i 2 min.
BEMÆRK: Overtør ikke perlerne. - Resuspend perlerne i 21 μL nukleasefrit vand og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Anbring pladen på et magnetisk stativ, og lad opløsningen rydde i 5 minutter.
- Overfør 20 μL af supernatanten til en ny plade.
BEMÆRK: Forsøget kan stoppes her ved at opbevare prøven ved -20 °C. - Kvantificer bibliotekskoncentrationer med et fluorometer (se Tabel over materialer) ved hjælp af et 1x HS-reagens.
- Hvis koncentrationen tillader det, skal du køre 30 ng prøve på 1,5% agarosegel med en lavmolekylær stige for at visualisere. Alternativt kan du visualisere på en fragmentanalysator eller et relateret instrument.
- Sekvensbiblioteker på en Illumina-platform for at opnå ~ 50.000-100.000 unikt kortlagte læsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her præsenteres en detaljeret protokol for enkeltcelleproteinprofilering på kromatin ved hjælp af et 96-brønds manuelt format uliCUT & RUN. Mens resultaterne vil variere afhængigt af det protein, der profileres (på grund af proteinoverflod og antistofkvalitet), celletype og andre bidragende faktorer, diskuteres forventede resultater for denne teknik her. Cellekvalitet (celleudseende og procentdel af levedygtige celler) og enkeltcellesortering bør vurderes før eller på tidspunktet for levende cellesortering i NE-bufferen. Et eksempel på ES-cellekolonier og cellesortering er vist i figur 2A,B. Specifikt bør celler af lav kvalitet ikke anvendes, og hvis kvaliteten er et problem, skal man sørge for at følge retningslinjerne for den specifikke celletype. Desuden bør nøjagtig cellesortering ved hjælp af cellesorteringsinstrumentet vurderes forud for forsøget. For eksempel kan testceller sorteres og farves ved hjælp af Hoechst 33342-plet og tælles for at sikre, at enten 0 eller 1 celle findes i hver brønd. Hvis der ikke findes enkeltceller, skal sorteringsbetingelserne optimeres. Efter biblioteksforberedelse kan prøver vurderes på enten en agarosegel (hvis koncentrationen tillader belastning på 30 ng eller mere, da der er en nedre grænse for DNA-visualisering på en agarosegel) eller en fragmentanalysator (eller lignende enhed såsom en båndstation eller bioanalytiker) inden sekventering, og eksempelresultater er vist i figur 2C, D. Specifikt er den forventede størrelsesfordeling fra ~ 150 til ~ 500 bp. I højere cellemængder vil CUT&RUN udført på store proteiner (såsom histoner) have en højresidet størrelsesfordeling, hvor størstedelen af DNA vil blive set ~ 270 bp; denne skulder observeres dog typisk ikke i enkeltcelleforsøg.
Efter sekventering skal kvaliteten af sekventeringslæsningerne vurderes ved hjælp af FASTQC. Procentdelen af entydigt kortlægningslæsninger skal bestemmes. Typisk observeres 0,5%-10% unikt kortlægningslæsninger i enkeltcelleeksperimenter. Disse kortlægningsprocenter svarer til andre DNA-baserede enkeltcelleteknikker30. Dernæst skal størrelsesfordelingen af læsningerne efter kortlægning bestemmes for at sikre, at profilen svarer til forsekventering (hvor adaptersekvensen ikke længere bidrager til læsestørrelserne).
Efter at datakvaliteten er blevet vurderet, kan proteinbelægning visualiseres ved hjælp af forskellige metoder: enkelt locus genom browser billeder kan visualiseres ved hjælp af UCSC genom browser eller IGV (figur 3A) og genom-dækkende belægningsmønstre over specifikke genomiske koordinater kan visualiseres ved hjælp af metaplots (figur 3B, nederst), heatmaps (figur 3B, øverst) eller 1D heatmaps (figur 3C). For mere information om dataanalyse henvises til undersøgelsen af Patty og Hainer27. Enkeltcelledata fra en diploid celle vil resultere i op til fire læsninger, der bidrager til hvert locus (fire læser, hvis cellen var i mitose), men oftere læser en eller to. Derfor er dataene binære, og en høj baggrund kan lettere forveksles med belægning i forhold til højcelleeksperimenter. Derfor anbefales det at udføre et parallelt CUT&RUN-eksperiment på et højt celletal (5.000 til 100.000 celler), hvis det er muligt, for at erhverve alle mulige bindingssteder for proteinet af interesse. Derefter kan enkeltcelledata sammenlignes med mulige bindingssteder. I eksemplerne vist i figur 3 sammenlignes enkeltcellede CTCF uliCUT&RUN-resultater med højcellede CTCF uliCUT&RUN (figur 3A) eller ChIP-seq (figur 3B,C). Som tidligere påvist repræsenterede CTCF-, SOX2- og NANOG-enkeltcellede uliCUT&RUN-toppe stort set stærkere toppe fra højcellede ChIP-seq-datasæt23.
Figur 1: Skematisk oversigt over uliCUT&RUN-protokollen. Celler høstes og sorteres i en 96-brønds plade indeholdende NE-buffer. Individuelle kerner er derefter bundet til ConA-konjugerede paramagnetiske mikrosfærer, og sekventielt tilsættes et antistof (rettet mod proteinet af interesse) og pA-MNase eller pA / G-MNase. Protein-tilstødende DNA spaltes via MNase, og DNA renses derefter til brug i biblioteksforberedelse. Denne figur blev oprettet med Biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempel fra cellesortering og kvalitetskontrol af uliCUT&RUN-biblioteker. (A) Billede af højkvalitets murine embryonale stamceller (ES). Skalabjælke: 200 μm. (B) Output fra enkeltcellesortering efter tilsætning af 7AAD til høstede ES-celler og sortering på et FACS-instrument. (C) Ethidiumbromidfarvet agarosegel, der viser færdige uliCUT&RUN-biblioteker. Bane 1 er en lavmolekylær stige, og bane 2-21 er eksempler på vellykkede individuelle enkeltcelle uliCUT &RUN-biblioteker inden sekventering. (D) Ethidiumbromidfarvet agarosegel, der viser suboptimale og optimale afsluttede uliCUT&RUN-biblioteker. Bane 1 er en stige med lav molekylvægt, bane 2 er et suboptimalt bibliotek på grund af ineffektiv MNase-fordøjelse, og bane 3 er et vellykket bibliotek med passende fordøjelse. (E) Fragmentanalysatorfordeling af et enkelt celle uliCUT&RUN-bibliotek før sekventering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksempel på forventede resultater for enkelt ES-celle uliCUT&RUN-data. (A) Browserspor af højt celletal (5.000 celler) CTCF eller negativ kontrol (Intet antistof, ingen Ab) uliCUT & RUN (top to spor) og enkeltcelle CTCF uliCUT & RUN. Billedet er gengivet, med tilladelse, fra Patty og Hainer27. (B) Heatmaps (øverst) og metaplots (nederst) af enkeltcelleTCF eller negativ kontrol (No Ab) uliCUT&RUN over tidligere offentliggjorte CTCF ChIP-seq-steder (GSE11724). Billedet er gengivet, med tilladelse, fra Hainer et al.23. C) 1D-heatmaps over enkeltcellet CTCF eller negativ kontrol (No Ab) uliCUT&RUN over tidligere offentliggjorte CTCF ChIP-seq-lokaliteter (GSE11724). Billedet er gengivet, med tilladelse, fra Hainer et al.23. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Sammensætning af forskellige buffere, der anvendes i denne protokol. Mængden af krævet stamopløsning er angivet med endelig koncentration skrevet i parentes. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CUT&RUN er en effektiv protokol til bestemmelse af proteinlokalisering på kromatin. Det har mange fordele i forhold til andre protokoller, herunder: 1) højt signal-støj-forhold, 2) hurtig protokol og 3) lav sekventeringsaflæsningsdækning, hvilket fører til omkostningsbesparelser. Brugen af protein A- eller protein A/G-MNase gør det muligt at anvende CUT&RUN med ethvert tilgængeligt antistof; derfor har det potentialet til hurtigt og nemt at profilere mange proteiner. Tilpasning til enkeltcelle til enhver proteinprofilering på kromatin har imidlertid været vanskelig, især sammenlignet med enkeltcelletranskriptomik (dvs. scRNA-seq) på grund af det lave kopiantal DNA i forhold til RNA (to til fire kopier af DNA versus mulige tusinder af RNA-kopier).
I protokollen beskrevet ovenfor bør flere kritiske trin overvejes. For det første er den passende sortering af celler afhængig af celletypen (eller vævstypen), og der skal sørges for nøjagtig sortering. Det anbefales at teste, hvor effektiv enkeltcellesortering er med instrumentet forud for ethvert eksperiment. For det andet er effektivt antistofvalg afgørende. Før du går videre til en enkeltcelleapplikation, anbefales det at teste antistoffet i et eksperiment med højt celletal (såvel som andre standardantistoftests, såsom bekræftelse af specificitet ved hjælp af western blot efter knockdown, titrering af antistoffet i CUT & RUN-eksperimenter osv.). For det tredje skal du bruge en negativ kontrol, såsom IgG eller intet primært antistof, fordi en passende sammenligning med forsøgsprøverne er afgørende for fortolkningen af datakvaliteten og de biologiske resultater. Når man sammenligner enkeltcelleeksperimentale resultater med et datasæt med højt celletal, bør de negative kontrol-enkeltcelleeksperimenter have mindre læsedækning over de bindingssteder, der er identificeret i højcelleeksperimentet, og snarere have en tilfældig fordeling af læsninger på tværs af genomet (med en bias for åbne områder af kromatin). For det fjerde skal man være forsigtig, når proteinet A- eller protein A/G-MNase tilsættes og aktiveres for ikke at overfordøje kromatinet: Overophedes ikke prøverne med hænderne, vedligehold prøverne i en is-/vandbadstemperatur (0 °C), og chelat reaktionen på det rette tidspunkt. For det femte skal der tages hensyn til hele uliCUT &RUN-eksperimentet og biblioteksforberedelsen på grund af lavt materiale. For eksempel er udvidet inkubation på magnetstativet under perlebinding for at sikre, at supernatanten er ryddet og pas på ikke at forstyrre perlerne, når supernatanten fjernes, afgørende for tilstrækkeligt udbytte. For det sjette, afhængigt af de spørgsmål, der behandles, er antallet af enkeltcelleeksperimenter, der udføres, en vigtig overvejelse. Nogle af enkeltcelleforsøgene vil mislykkes (som med alle eksperimenter med lavt input), og derfor bør antallet af positive eksperimentelle resultater, der kræves for passende fortolkning, overvejes, inden forsøget påbegyndes. Antallet af celler, der skal medtages i eksperimentet, afhænger af mængden af eksperimentelle data, som investigator kræver, og kvaliteten af antistoffet. Endelig skal det bemærkes, at der kan opnås tilsvarende resultater med reducerede mængder af mange aspekter af denne protokol. Trin, hvor volumenet blev reduceret med 50%, omfatter volumenet af NE-buffer, vaskebuffer, primær antistofblanding (inklusive mængden af primært antistof), pA-MNase-blanding (inklusive mængden af pA-MNase) og alle trin i biblioteksforberedelsen.
Baseret på den komplicerede karakter af faktorprofilering på kromatin er der mange potentielle kilder til problemer og steder, hvor fejlfinding kan blive nødvendig. Selvom der kan være mange trin, hvor der kan opstå problemer, er der observeret tre store problemer: 1) lavt DNA-udbytte for input til biblioteksopbygning; 2) højt baggrundssignal i forsøgsprøver, og 3) lavt udbytte efter biblioteksopbygning. Hvis der ikke er tilstrækkeligt DNA til biblioteksforberedelse og sekventering (punkt 1), skal du være opmærksom på følgende fejlfindingsråd: a) der kan have været ufuldstændig membranlyse, og derfor kan lyseringstiden med NE-buffer øges; b) der kan have været ineffektiv binding af kernen til de ConA-konjugerede paramagnetiske mikrosfærer, og dette kan afhjælpes ved passende blanding ved tilsætning af disse perler c) der kan have været tilsat for lidt antistof, og derfor anbefales det at udføre en titrering af antistof for at identificere den mest effektive mængde; d) inkubationstider med enten det primære antistof eller proteinet A- eller protein A/G-MNase er enten for korte (dvs. ikke nok tid til at tillade binding) eller for lange (disse er indfødte, ikke-krydsbundne prøver) og kan optimeres; e) interaktionen mellem målproteinet og kromatin kan være for forbigående til at fange under oprindelige forhold, og derfor kan tværbinding af CUT&RUN udføres28. Mens enkeltcelledatasæt giver høj baggrund, kan der være for høj baggrund, hvor signalet er svært at fortolke fra baggrunden (punkt 2). For dette problem skal du være opmærksom på følgende råd: a) blokeringstrinnet med EDTA for at forhindre forebyggende MNase-fordøjelse kan øges eller optimeres; b) hvis der er overdreven skæring, kan det skyldes, at der er for meget protein A- eller protein A/G-MNase, og derfor kan der udføres en titrering af passende mængder; c) overfordøjelse af MNase kan resultere i den høje baggrund, og derfor bør den passende blanding af calciumchlorid ved tilsætning og optimering for MNase fordøjelsestid vurderes. Endelig kan effektivt uliCUT&RUN-beriget DNA være blevet genfundet, men en lav mængde bibliotek kan genvindes (punkt 3). Til dette problem anbefales følgende: a) passende håndtering og anvendelse af polystyrenmagnetitperler for at sikre korrekt rensning og intet DNA-tab; specifikt anbefales det at have 15 minutters inkubationer og mindst 5 minutter til magnetisering af perler for at forhindre tab; b) underforstærkning af biblioteket på PCR-stadiet ville resultere i lavt udbytte, og derfor bør de relevante cyklusser bestemmes ved hjælp af qPCR (som tidligere fastlagt for ATAC-seq-biblioteker29).
Som med alle teknologier er der begrænsninger for uliCUT &RUN, der bør overvejes, før du påbegynder eksperimenter. For det første er disse eksperimenter designet og optimeret til indfødte forhold, og hvis et protein kun forbigående interagerer med kromatin, kan en tværbindingsmetode være nødvendig for at sikre genopretning af interaktionen. For det andet, som med alle antistofbaserede teknikker, er kvaliteten af antistoffet vigtig. Der skal sørges for at sikre antistoffets kvalitet og konsistens forud for udførelsen af forsøg. For det tredje kan MNase-baggrundsskæring forekomme, og selvom der er et konsekvent lavere baggrundssignal i CUT&RUN i forhold til andre eksperimenter, kan baggrundssignalet være højt i enkeltcelleforsøg, og der bør derfor udføres passende kontroller og analyser. Mens den binære karakter af enkeltcelleprofileringsdata begrænser visualiseringen, kan mere avancerede beregningsmæssige genomiske teknologier, såsom dimensionel reduktion og andre, udføres (som tidligere beskrevet27). Endelig, mens enkeltcelleprofilering er blevet udvidet her til 96-brøndformat, er dette lav gennemstrømning i forhold til andre enkeltcelleteknologier, der bruger 10xGenomics eller andre formater.
Tethering-baserede profileringsteknologier som ChEC-seq20, CUT&Tag24, CUT&RUN21 og uliCUT&RUN23 kan bestemme faktorlokalisering på kromatin med en hurtigere eksperimentel tidslinje, lavere baggrund og lavere omkostninger end traditionelle profileringsteknologier, såsom ChIP-seq. Derfor er disse meget spændende teknologier til anvendelse på dyrebare prøver såsom patientprøver eller tidlige udviklingsprøver. Desuden kan anvendelse på enkeltceller tilvejebringe komplementære undersøgelser udført ved hjælp af andre enkeltcelleeksperimenter såsom scRNA-seq og scATAC-seq30. Som beskrevet ved hjælp af disse mere bredt anvendte enkeltcelleteknologier kan der opnås ny indsigt i forhold til bulkcelleeksperimenter. Enkeltcelleproteinprofilering på kromatin forventes at blive mere regelmæssigt anvendt, da teknologierne fortsætter med at forbedre og tillade mere parallelisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser i forbindelse med dette projekt.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer af Hainer Lab for at have læst og kommenteret en tidligere version af dette manuskript. Dette projekt brugte NextSeq500 tilgængelig på University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core på UPMC Children's Hospital of Pittsburgh til sekventering med særlig tak til sin direktør, William MacDonald. Denne forskning blev delvist støttet af University of Pittsburgh Center for Research Computing gennem de leverede computerressourcer. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (til S.J.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL clear microfuge tubes | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| 1.5 mL tube magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| 1.5 mL tube-compatible cold centrifuge | Eppendorf | 5404000537 | |
| 10 cm sterile tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-656 | |
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µL PCR tubes | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X quick ligase buffer | New England Biolabs | M2200 | Ligase Buffer |
| 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | 5X high fidelity PCR buffer |
| 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 96-well magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12027 or 12331D | |
| 96-well plate | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions |
| Antibody to protein of interest | varies | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugated paramagnetic microspheres |
| BSA | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Cell sorter | BD FACSAria II cell sorter | Requires training | |
| Cell-specific media for cell culture | Varies | ||
| Chloroform | ThermoFisher Scientific | C298-500 | Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster | For computational analyses of resulting sequencing datasets | ||
| DNA spin columns | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Electrophoresis equipment | varies | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycogen | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in | homemade | Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed. | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ice Bucket | varies | ||
| Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) | Illumina | ||
| Incubator with temperature and atmosphere control | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | hotstart high fidelity polymerase |
| Laminar flow hood | Bakery Company | SG404 | |
| Manganese Chloride (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Micropipette set | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NEB Adaptor | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptor |
| NEB Universal primer | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Indexed Primers |
| Negative control antibody | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Nuclease Free water | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR thermocycler | Eppendorf | 2231000666 | |
| Phase lock tubes | Qiagen | 129046 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Phsophate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Pipette aid | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Protease Inhibitors | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit Assay tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Spermidine | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Standard Inverted Light Microscope | Leica | 11526213 | |
| Standard lab agarose gel materials | Varies | ||
| Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips | Varies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Tabletop vortexer | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternatively, can use a waterbath |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzyme | New England Biolabs | M5505S |
References
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
- Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
- Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
- O'Neill, L. P., Turner, B. M.
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
- Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
- Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
- Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232 (2013).
- Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083 (2015).
- Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S.
- Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
- Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
- Zheng, X. -Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
