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Biology

क्रोमैटिन पर एकल-सेल फैक्टर स्थानीयकरण लक्ष्य के तहत अल्ट्रा-लो इनपुट क्लीवेज का उपयोग करके और न्यूक्लिएज का उपयोग करके रिलीज करें

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63536
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

CUT&RUN और इसके वेरिएंट का उपयोग क्रोमैटिन पर प्रोटीन अधिभोग निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि एकल-सेल यूलिकट एंड रन का उपयोग करके क्रोमैटिन पर प्रोटीन स्थानीयकरण कैसे निर्धारित किया जाए।

Abstract

क्रोमैटिन पर एक प्रोटीन के बाध्यकारी स्थानों का निर्धारण इसके कार्य और संभावित नियामक लक्ष्यों को समझने के लिए आवश्यक है। क्रोमैटिन इम्युनोप्रिसिपिटेशन (CHIP) 30 से अधिक वर्षों के लिए प्रोटीन स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए सोने का मानक रहा है और इसे सोनिकेटेड या एंजाइमेटिक रूप से पचे हुए क्रोमैटिन से ब्याज के प्रोटीन को बाहर निकालने के लिए एंटीबॉडी के उपयोग से परिभाषित किया गया है। हाल ही में, एंटीबॉडी टेदरिंग तकनीकक्रोमैटिन पर प्रोटीन स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए लोकप्रिय हो गई है क्योंकि उनकी बढ़ी हुई संवेदनशीलता के कारण। क्लीवेज अंडर टारगेट एंड रिलीज अंडर न्यूक्लिएज (CUT&RUN) क्रोमैटिन इम्युनोक्लेवेज (CHIC) का जीनोम-वाइड व्युत्पन्न है और पुनः संयोजक प्रोटीन A का उपयोग करता है जो माइक्रोकोकल न्यूक्लिएज (पीए-MNase) से जुड़ा होता है ताकि एंटीबॉडी के आईजीजी स्थिर क्षेत्र की पहचान की जा सके, जो ब्याज के प्रोटीन को लक्षित करता है, इसलिए ब्याज के प्रोटीन को फ्लैंक करने वाले डीएनए की साइट-विशिष्ट दरार को सक्षम करता है। CUT &RUN का उपयोग हिस्टोन संशोधनों, प्रतिलेखन कारकों और अन्य क्रोमैटिन-बाइंडिंग प्रोटीन जैसे न्यूक्लियोसोम रीमॉडलिंग कारकों को प्रोफ़ाइल करने के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, CUT &RUN का उपयोग या तो यूक्रोमैटिक- या हेटरोक्रोमैटिक-संबद्ध प्रोटीन और हिस्टोन संशोधनों के स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इन कारणों से, CUT &RUN प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के बाध्यकारी प्रोफाइल को निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। हाल ही में, CUT&RUN को कोशिकाओं और एकल कोशिकाओं की कम आबादी में प्रतिलेखन कारक प्रोफाइलिंग के लिए अनुकूलित किया गया है और अनुकूलित प्रोटोकॉल को अल्ट्रा-लो इनपुट CUT&RUN (uliCUT &RUN) कहा जाता है। यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक मैनुअल 96-वेल प्रारूप में यूलिकट एंड रन का उपयोग करके एकल-सेल कारक प्रोफाइलिंग के लिए प्रस्तुत किया गया है।

Introduction

कई परमाणु प्रोटीन डीएनए-टेम्पलेट गतिविधियों को बढ़ावा देने या रोकने के लिए क्रोमैटिन के साथ बातचीत करके कार्य करते हैं। इन क्रोमैटिन-इंटरैक्टिंग प्रोटीन के कार्य को निर्धारित करने के लिए, उन जीनोमिक स्थानों की पहचान करना महत्वपूर्ण है जिन पर ये प्रोटीन बाध्य हैं। 1985 में इसके विकास के बाद से, क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिसिपेशन (CHIP) यह पहचानने के लिए सोने का मानक रहा है कि एक प्रोटीन क्रोमैटिन 1,2 से कहां बांधता है। पारंपरिक CHIP तकनीक में निम्नलिखित बुनियादी वर्कफ़्लो होता है: कोशिकाओं को काटा जाता है और क्रॉसलिंक किया जाता है (आमतौर पर फॉर्मेल्डिहाइड के साथ), क्रोमैटिन को कतरनी की जाती है (आमतौर पर कठोर sonication विधियों के साथ, क्रॉसलिंकिंग की आवश्यकता होती है), ब्याज के प्रोटीन को एक एंटीबॉडी का उपयोग करके immunoprecipitated किया जाता है जो प्रोटीन (या टैग किए गए प्रोटीन) को लक्षित करता है, इसके बाद एक माध्यमिक एंटीबॉडी (agarose या चुंबकीय मोतियों के लिए युग्मित), क्रॉसलिंकिंग को उलट दिया जाता है, प्रोटीन और आरएनए को डीएनए को शुद्ध करने के लिए पचाया जाता है, और इस CHIP समृद्ध-डीएनए का उपयोग विश्लेषण के लिए टेम्पलेट के रूप में किया जाता है (रेडियोलेबल जांच 1,2, qPCR3, माइक्रोएरे 5,6, या अनुक्रमण4 का उपयोग करके)। माइक्रोएरे और बड़े पैमाने पर समानांतर गहरी अनुक्रमण के आगमन के साथ, CHIP-चिप 5,6 और CHIP-seq4 को हाल ही में विकसित किया गया है और क्रोमैटिन पर प्रोटीन स्थानीयकरण की जीनोम-व्यापी पहचान के लिए अनुमति देता है। क्रॉसलिंकिंग CHIP CHIP-exo7 और CHIP-Nexus8 द्वारा संकल्प में प्रमुख प्रगति के साथ अपने आगमन के बाद से एक शक्तिशाली और विश्वसनीय तकनीक रही है। CHIP-seq के विकास के समानांतर, CHIP (N-CHIP) के लिए देशी (गैर-क्रॉसलिंकिंग) प्रोटोकॉल स्थापित किए गए हैं, जो क्रोमैटिन को खंडित करने के लिए न्यूक्लिएज पाचन (अक्सर माइक्रोकोकल न्यूक्लिएज या MNase का उपयोग करके) का उपयोग करते हैं, जैसा कि पारंपरिक क्रॉसलिंकिंग CHIP तकनीकों में किए गए sonication के विपरीतहै। हालांकि, क्रॉसलिंकिंग CHIP और N-CHIP प्रौद्योगिकियों दोनों के लिए एक प्रमुख खामी प्रयोगात्मक हेरफेर के बाद कम डीएनए उपज के कारण उच्च सेल संख्या की आवश्यकता रही है। इसलिए, हाल के वर्षों में, कम सेल इनपुट के लिए CHIP प्रौद्योगिकियों को अनुकूलित करने की दिशा में कई प्रयास किए गए हैं। इन प्रयासों के परिणामस्वरूप कई शक्तिशाली CHIP-आधारित प्रौद्योगिकियों का विकास हुआ है जो उनकी प्रयोज्यता और इनपुट आवश्यकताओं में भिन्न होते हैं 10,11,12,13,14,15,16,17,18। हालांकि, एकल-सेल CHIP-seq आधारित प्रौद्योगिकियों की कमी रही है, विशेष रूप से गैर-हिस्टोन प्रोटीन के लिए।

2004 में, क्रोमैटिन पर प्रोटीन अधिभोग निर्धारित करने के लिए एक वैकल्पिक तकनीक विकसित की गई थी जिसे क्रोमैटिन अंतर्जात दरार (सीएचईसी) और क्रोमैटिन इम्युनोक्लीवेज (सीएचआईसी) 19 कहा जाता है। ये एकल-लोकस तकनीकें ब्याज के प्रोटीन से सटे डीएनए के सीधे काटने के लिए या तो ब्याज के प्रोटीन (सीएचईसी) या प्रोटीन ए (जीएचआईसी) के लिए एमएनेस के संलयन का उपयोग करती हैं। हाल के वर्षों में, सीएचईसी और एचआईसी दोनों को क्रोमैटिन पर जीनोम-वाइड प्रोटीन प्रोफाइलिंग के लिए अनुकूलित किया गया है (CHEC-seq और CUT & RUN, क्रमशः) 20,21। जबकि CHEC-seq कारक स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, इसे प्रत्येक लक्ष्य के लिए MNase-fusion प्रोटीन विकसित करने की आवश्यकता होती है, जबकि CHIC और इसके जीनोम-वाइड भिन्नता, CUT & RUN, ब्याज के प्रोटीन की ओर निर्देशित एंटीबॉडी पर भरोसा करते हैं (CHIP के साथ) और पुनः संयोजक प्रोटीन A-MNase, जहां प्रोटीन ए एंटीबॉडी के आईजीजी स्थिर क्षेत्र को पहचान सकता है। एक विकल्प के रूप में, एक संलयन प्रोटीन ए / प्रोटीन जी-एमएनेज (पीए / जी-एमएनेज) विकसित किया गया है जो एंटीबॉडी निरंतर क्षेत्रों की एक व्यापक श्रृंखला को पहचान सकताहै। CUT&RUN तेजी से क्रोमैटिन जीनोम-वाइड पर प्रोटीन स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए CHIP-seq के लिए एक लोकप्रिय विकल्प बन गया है।

अल्ट्रा-लो इनपुट CUT&RUN (uliCUT&RUN), CUT&RUN की एक भिन्नता है जो कम और एकल-सेल इनपुट के उपयोग को सक्षम बनाती है, 201923 में वर्णित की गई थी। यहां, मैन्युअल 96-वेल फॉर्मेट सिंगल-सेल एप्लिकेशन के लिए पद्धति का वर्णन किया गया है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि uliCUT & RUN के विकास के बाद से, हिस्टोन प्रोफाइलिंग, CUT & Tag और iACT-seq के लिए दो विकल्प विकसित किए गए हैं, जो हिस्टोन प्रोटीन24,25 की मजबूत और अत्यधिक समानांतर प्रोफाइलिंग प्रदान करते हैं। इसके अलावा, scCUT &Tag को एक ही सेल (multiCUT & Tag) में कई कारकों को प्रोफाइल करने और गैर-हिस्टोन प्रोटीन26 के लिए आवेदन के लिए अनुकूलित किया गया है। साथ में, CUT&RUN कम इनपुट CHIP-seq के लिए एक आकर्षक विकल्प प्रदान करता है जहां uliCUT & RUN को किसी भी आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला में किया जा सकता है जिसमें सेल सॉर्टर और मानक उपकरण तक पहुंच है।

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Protocol

नैतिकता कथन: सभी अध्ययनों को पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में अनुसंधान संरक्षण के संस्थागत जैव सुरक्षा कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. चुंबकीय मोतियों तैयार

नोट: सेल सॉर्टिंग से पहले प्रदर्शन करें और उपयोग करने तक बर्फ पर रखें।

  1. कोना-संयुग्मित पैरामैग्नेटिक माइक्रोस्फीयर के पिपेट 30 μL एक ताजा 1.5 mL microfuge ट्यूब के लिए प्रतिक्रिया प्रति प्रतिक्रिया घोल मिश्रण और बाइंडिंग बफर के 850 μL जोड़ें, मिश्रण करने के लिए धीरे से pipetting।
    नोट: कोना-संयुग्मित पैरामैग्नेटिक माइक्रोस्फियर लेक्टिन-लेपित चुंबकीय मोती हैं जो लिपिड झिल्ली बंधन की अनुमति देते हैं।
  2. ट्यूब को चुंबकीय रैक पर रखें और मोतियों को 1-2 मिनट के लिए चुंबकीय बनाने की अनुमति दें। एक बार supernatant साफ हो गया है, निकालें और मोतियों को परेशान किए बिना supernatant त्याग.
  3. चुंबकीय रैक से ट्यूब निकालें और बाइंडिंग बफर के 1 मिलीलीटर में resuspending द्वारा मोतियों को धोएं।
  4. चरण 1.2 और 1.3 को दोहराएँ।
  5. 2 मिनट के लिए मोतियों magnetize और supernatant को हटाने के लिए त्यागने के लिए.
  6. चुंबकीय रैक से ट्यूब को निकालें और प्रति प्रतिक्रिया बाइंडिंग बफर के 30 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  7. बर्फ पर धोया मनका मिश्रण पकड़ो जब तक कि कोशिकाओं को क्रमबद्ध नहीं किया जाता है।

2. हार्वेस्ट कोशिकाओं

नोट: यह चरण पालन की गई कोशिकाओं के लिए लिखा गया है और मुरीन E14 भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए अनुकूलित है। कोशिकाओं को संवर्धित करना और काटना कोशिका प्रकार पर निर्भर करता है।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटा दें और गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत उनकी जांच करें।
  2. सेल प्लेट से मीडिया aspirate और 1x PBS के 5 mL के साथ कुल्ला।
  3. प्लेट से एस्पिरेट पीबीएस और कोशिकाओं की कटाई (पारंपरिक सेल कटाई विधियों का उपयोग करके जो सेल प्रकार से भिन्न होंगे)। यदि आवश्यक हो तो संस्कृति पकवान के खिलाफ एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके एकल-सेल निलंबन प्राप्त करें।
  4. सेल निलंबन को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 200 x g पर नीचे स्पिन करें।
  5. पीबीएस + 1% एफबीएस के 5 एमएल के साथ सेल पैलेट को छोड़ने और धोने के लिए मीडिया को बंद करें।
  6. 5 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें, supernatant को त्याग दें, और PBS + 1% FBS के 5 mL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
  7. कोशिकाओं की गणना करें और एक ताजा 1.5 mL microfuge ट्यूब में 1 x 106 कोशिकाओं के 1 mL स्थानांतरित करें।
  8. 7-एमिनो-एक्टिनोमाइसिन डी (7-एएडी) के 5 μL जोड़ें, मिश्रण करने के लिए ट्यूब वेल को उलटें, और फिर 96-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में लाइव एकल कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए सेल सॉर्टर पर नमूना लागू करें।
    नोट: 7-AAD डाई को लाइव कोशिकाओं से बाहर रखा गया है, और इसलिए लाइव-सेल सॉर्टिंग में उपयोग किया जा सकता है।

3. सेल छँटाई और lysis

  1. सेल सॉर्टिंग से पहले प्रत्येक अच्छी तरह से परमाणु निष्कर्षण (एनई) बफर के 100 μL के साथ एक सेल सॉर्टर-संगत 96-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें।
  2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में सॉर्ट करें।
  3. जल्दी से प्लेट स्पिन (30 s के लिए 600 x g ) कोशिकाओं को आश्वस्त करने के लिए कुओं के भीतर बफर में हैं.
    नोट: यह एक प्रारंभिक प्रयोग में परीक्षण के लायक है कि क्या उपयोग की जा रही कोशिकाओं को मज़बूती से कुओं के तल पर लाया जाता है।
  4. 15 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों को पकड़ो।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 x g पर नमूनों को नीचे स्पिन करें और supernatant को हटाने के लिए सावधानीपूर्वक पिपेट (5 μL के पीछे छोड़कर)।
  6. एनई बफर के 55 μL में प्रत्येक नमूने को फिर से निलंबित करें और प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए पूर्व-धुले हुए कोना-संयुग्मित पैरामैग्नेटिक माइक्रोसेफर्स (चरण 1.7 से; बाइंडिंग बफर में) के 30 μL जोड़ें।
  7. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।

4. पूर्व ब्लॉक नमूने MNase द्वारा जल्दी पाचन को रोकने के लिए

  1. प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें, मोतियों को कम से कम 5 मिनट के लिए बांधने की अनुमति दें, और फिर supernatant को हटा दें और छोड़ दें।
  2. नाभिक-बाध्य मोतियों के लिए बफर को अवरुद्ध करने के 100 μL जोड़ें और कोमल पिपेटिंग के साथ मिश्रण करें।
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

5. प्राथमिक एंटीबॉडी के अलावा

  1. प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें, supernatant को कम से कम 5 मिनट के लिए साफ करने की अनुमति दें, और फिर मोतियों को परेशान किए बिना supernatant को हटा दें और त्याग दें।
  2. चुंबकीय रैक से प्लेट निकालें और कोमल pipetting के साथ प्रतिक्रिया प्रति प्रतिक्रिया वॉश बफर के 100 μL में मोतियों resuspend.
  3. प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर वापस रखें, supernatant को साफ करने की अनुमति दें, और फिर supernatant को हटा दें और छोड़ दें।
  4. कोमल pipetting के साथ प्रतिक्रिया प्रति वॉश बफर के 25 μL में मोतियों resuspend.
  5. एक प्राथमिक एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण बनाएं: वॉश बफर के 25 μL + प्रति प्रतिक्रिया एंटीबॉडी के 0.5 μL।
  6. नाभिक-बाध्य मोतियों को धीरे-धीरे घुमाते हुए, ब्याज के प्रोटीन को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी के साथ इलाज किए जा रहे प्रत्येक नमूने में प्राथमिक एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण के 25 μL जोड़ें (आमतौर पर 1: 100 अंतिम कमजोर पड़ने)। कोई एंटीबॉडी के साथ धोने बफर के 25 μL जोड़ें, यदि एक नियंत्रण प्रदर्शन.
  7. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. नमूनों को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें, supernatant को कम से कम 5 मिनट के लिए साफ करने की अनुमति दें, और फिर मोतियों को परेशान किए बिना supernatant को हटा दें और छोड़ दें।
  9. चुंबकीय रैक से प्लेट निकालें और वॉश बफर के 100 μL के साथ मोतियों को धोएं, पिपेटिंग द्वारा पुन: निलंबित करें।

6. पीए-MNase या पीए / जी-MNase के अलावा

नोट: प्रोटीन ए में खरगोशों जैसी कुछ प्रजातियों से आईजीजी अणुओं के लिए एक उच्च आत्मीयता है, लेकिन चूहों या चूहों जैसी अन्य प्रजातियों के आईजीजी के लिए उपयुक्त नहीं है। वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन ए / जी-एमएनेज का उपयोग किया जा सकता है। यह हाइब्रिड खरगोश, माउस और चूहे आईजीजी को बांधता है, जब माउस या चूहे के प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है तो द्वितीयक एंटीबॉडी की आवश्यकता से बचता है।

  1. प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर वापस रखें, supernatant को कम से कम 5 मिनट के लिए साफ करने की अनुमति दें, और फिर मोतियों को परेशान किए बिना supernatant को हटा दें और छोड़ दें।
  2. चुंबकीय रैक से प्लेट निकालें और धोने बफर के 25 μL में प्रत्येक नमूने resuspend.
  3. एक पीए-MNase मास्टर मिश्रण (वॉश बफर के 25 μL + प्रतिक्रिया प्रति पीए-MNase की अनुकूलित राशि) बनाओ।
  4. जबकि धीरे भंवर, नियंत्रण नमूने सहित प्रत्येक नमूने के लिए पीए-MNase मास्टर मिश्रण के 25 μL जोड़ें।
    नोट: पीए-एमएनेज की एकाग्रता तैयारी पर भिन्न होती है, यदि घर का बना है, और प्रत्येक स्वतंत्र शुद्धिकरण पर उपयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए। पीए / जी-एमएनेज के लिए, 20x स्टॉक के 2.5 μL का उपयोग किया जाना चाहिए।
  5. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  6. प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें, supernatant को कम से कम 5 मिनट के लिए साफ करने की अनुमति दें, और फिर मोतियों को परेशान किए बिना supernatant को हटा दें और त्याग दें।
  7. चुंबकीय रैक से प्लेट निकालें और धोने के बफर के 100 μL के साथ मोतियों को धोएं, कोमल pipetting द्वारा resuspending।

7. निर्देशित डीएनए पाचन

  1. प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें, supernatant को कम से कम 5 मिनट के लिए साफ करने की अनुमति दें, और फिर supernatant को हटा दें और छोड़ दें।
  2. चुंबकीय रैक से नमूनों को निकालें और कोमल pipetting द्वारा धोने बफर के 50 μL में मोतियों resuspend.
  3. 5 मिनट के लिए एक बर्फ / पानी के मिश्रण में नमूनों को 0 डिग्री सेल्सियस तक संतुलित करें।
  4. 0 °C बर्फ / पानी के स्नान से नमूनों को निकालें और एक multichannel पिपेट का उपयोग कर 100 mM CaCl2 के 1 μL जोड़ें। एक बड़ी मात्रा multichannel पिपेट का उपयोग कर कोमल pipetting के साथ अच्छी तरह से (3-5 बार) मिश्रण, और फिर 0 डिग्री सेल्सियस करने के लिए नमूनों को वापस।
    नोट: यहां अच्छी तरह से मिश्रण करना आवश्यक है। CaCl2 को डीएनए के MNase पाचन को सक्रिय करने के लिए जोड़ा जाता है जो ब्याज के प्रोटीन को फ्लैंक करता है।
  5. जैसे ही प्लेट बर्फ / पानी के स्नान में वापस आ जाती है, 10 मिनट का टाइमर शुरू करें।
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से 2XRSTOP + बफर के 50 μL pipetting द्वारा प्रतिक्रिया को रोकें, उसी क्रम में जैसा कि CaCl2 जोड़ा गया था।
    नोट: 10 मिनट के पाचन से पहले 2XRSTOP + बफर बनाएं ताकि पाचन को रोका जा सके।

8. नमूना फ्रैक्शनेशन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,000 x g पर प्लेट स्पिन करें।
  3. प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें, supernatant को कम से कम 5 मिनट के लिए साफ करने की अनुमति दें, और supernatants को एक ताजा 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें। मोतियों को त्याग दें।

9. डीएनए निष्कर्षण

  1. प्रत्येक नमूने के लिए 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 1 μL और 20 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीनेज के 0.83 μL जोड़ें।
    सावधानी: एसडीएस पाउडर हानिकारक है यदि साँस ली जाती है। उपयोगकर्ताओं को चश्मे, दस्ताने, और एक N95-ग्रेड श्वसन यंत्र पहने हुए अच्छी तरह से हवादार स्थानों में उपयोग करना चाहिए, जो देखभाल के साथ संभालता है।
  2. कोमल pipetting द्वारा नमूनों को मिलाएं।
  3. 70 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  4. प्लेट को कमरे के तापमान पर वापस लाएं और 5 M NaCl के 46.6 μL और 50% PEG 4000 के 90 μL जोड़ें। कोमल पिपेटिंग द्वारा मिलाएं।
  5. प्रत्येक नमूने के लिए polystyrene-मैग्नेटाइट मोतियों के 33 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: कमरे के तापमान (~ 30 मिनट) के लिए polystyrene-मैग्नेटाइट मोती लाने के लिए सुनिश्चित करें और उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से मिश्रण।
  6. प्लेट को चुंबकीय रैक पर रखें और supernatant को ~ 5 मिनट के लिए साफ करने की अनुमति दें, और फिर ध्यान से मोतियों को परेशान किए बिना supernatant को त्याग दें।
  7. मोतियों को परेशान किए बिना 80% इथेनॉल के 150 μL के साथ 2x कुल्ला।
    सावधानी: इथेनॉल अत्यधिक ज्वलनशील है और त्वचा, आंख और फेफड़ों की जलन का कारण बनता है। उचित प्रयोगशाला कपड़ों के साथ और एक वेंटेड हुड में इस चरण को निष्पादित करें।
  8. प्लेट को 30 सेकंड के लिए 1000 x g पर संक्षेप में स्पिन करें। प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर वापस रखें और मोतियों को परेशान किए बिना सभी अवशिष्ट EtOH को हटा दें।
  9. एयर सूखी ~ 2-5 मिनट के लिए नमूनों.
    नोट: 5 मिनट से अधिक समय तक मोतियों को न सुखाएं। यदि ईटीओएच को हटाने के बारे में परिश्रमी, सुखाने का 2-3 मिनट पर्याप्त है।
  10. 10 mM Tris-HCl (pH 8) के 37.5 μL के साथ मोतियों को फिर से निलंबित करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  11. प्लेट को चुंबकीय रैक पर रखें और मोतियों को 5 मिनट के लिए बांधने की अनुमति दें।
  12. एक ताजा thermocycler संगत 96-अच्छी तरह से प्लेट के लिए supernatant के 36.5 μL स्थानांतरण. मोतियों को त्याग दें।
    नोट:: प्रयोग -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने संग्रहीत करके यहाँ रोका जा सकता है या लायब्रेरी बिल्ड (चरण 10-15) के साथ जारी रख सकते हैं।

10. अंत मरम्मत, फॉस्फोराइलेशन, adenylation

नोट:: अभिकर्मकों को सामग्री की तालिका में संदर्भित के रूप में सोर्स किया जाता है। नीचे दिया गया प्रोटोकॉल वाणिज्यिक किट जैसे NEBNext अल्ट्रा डीएनए II किट के लिए एक समान विधि का अनुसरण करता है।

  1. 1x T4 डीएनए ligase बफर में T4 डीएनए पोलीमरेज़ 1:20 के 5 U / μL पतला।
  2. एक अंत-मरम्मत / 3'A मास्टर मिश्रण तैयार करें: 10x T4 डीएनए लिगाज़ बफर का 2 μL, 10 mM dNTPs का 2.5 μL, 10 mM एटीपी का 1.25 μL, 40% PEG 4000 का 3.13 μL, 10 U/ μL T4 PNK का 0.63 μL, पतला T4 DNA पोलीमरेज़ का 0.5 μL, 5U/
    नोट: पिपेटिंग से पहले कमरे के तापमान पर 40% पीईजी 4000 लाना सुनिश्चित करें।
  3. डीएनए के 36.5 μL करने के लिए अंत मरम्मत / 3'A मास्टर मिश्रण के 13.5 μL जोड़ें।
  4. त्वरित भंवर द्वारा प्रतिक्रिया को मिलाएं, और फिर एक त्वरित स्पिन (10 सेकंड के लिए 500 x g )।
  5. तापमान >20 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्म ढक्कन के साथ एक पूर्व-ठंडा थर्मोसाइकलर में निम्नलिखित प्रतिक्रिया स्थितियों का उपयोग करके इनक्यूबेट करें। प्रतिक्रिया की स्थिति का उपयोग करें: 15 मिनट के लिए 12 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।

11. एडाप्टर बंधाव

नोट:: निम्न प्रतिक्रिया सेट करते समय नमूने बर्फ पर रखें। ligase बफर pipetting से पहले कमरे के तापमान पर आने के लिए अनुमति दें। 10 mM Tris-HCl के एक समाधान में Adaptor ( सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें जिसमें 10 mM NaCl (pH 7.5) शामिल है। कम उपज के कारण, CUT & RUN-समृद्ध डीएनए को पूर्व-परिमाणित न करें। इसके बजाय, 0.6 μM के अंतिम काम करने वाले एडाप्टर एकाग्रता का उपयोग करके, एडेप्टर के 25-गुना कमजोर पड़ने उत्पन्न करें।

  1. एक बंधाव मास्टर मिश्रण बनाएं: लिगाज़ बफर (2x) के 55 μL, T4 डीएनए लिगेज़ के 5 μL, और पतला एडाप्टर के 5 μL, प्रति प्रतिक्रिया 65 μL की कुल मात्रा के साथ।
  2. चरण 10.5 से डीएनए के 50 μL करने के लिए मास्टर बंधाव मिश्रण के 65 μL जोड़ें।
  3. त्वरित भंवर द्वारा मिश्रण, त्वरित कताई (10 एस के लिए 500 x जी ) के बाद।
  4. 15 मिनट के लिए एक थर्मोसाइकलर (एक गर्म ढक्कन के बिना) में 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट:: निम्न चरण के लिए तुरंत आगे बढ़ें।

12. उपयोगकर्ता पाचन

  1. प्रत्येक नमूने, भंवर, और स्पिन (10 s के लिए 500 x g ) के लिए USER एंजाइम के 3 μL जोड़ें।
  2. थर्मल साइकलर में 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (गर्म ढक्कन 50 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें)।

13. Polystyrene-मैग्नेटाइट मनका सफाई-अप बंधाव प्रतिक्रिया के बाद

नोट: polystyrene-मैग्नेटाइट मोतियों को कमरे के तापमान (~ 30 मिनट) पर संतुलित करने की अनुमति दें। भंवर का उपयोग करने से पहले मनका समाधान homogenize करने के लिए. कमरे के तापमान पर निम्नलिखित चरणों का पालन करें।

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से एडाप्टर-लिगेटेड डीएनए युक्त करने के लिए polystyrene-मैग्नेटाइट मनका समाधान के 39 μL (0.33x) जोड़ें।
  2. पिपेटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, और फिर डीएनए को मोतियों से बांधने की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  3. एक 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर नमूनों को रखें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि supernatant स्पष्ट न हो।
  4. चुंबकीय रैक पर प्लेट रखें और ध्यान से निकालें और मोतियों को परेशान किए बिना supernatant त्याग.
  5. मोतियों को परेशान किए बिना 80% EtOH के 200 μL के साथ मोतियों कुल्ला।
  6. समाधान को साफ करने की अनुमति देने के लिए 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर 30 एस के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. निकालें और मोतियों को परेशान किए बिना supernatant त्याग.
  8. कुल दो धोने के लिए चरण 13.5-13.7 को दोहराएँ।
  9. प्लेट को 10 s के लिए 500 x g पर संक्षेप में स्पिन करें, प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर वापस रखें, और मोतियों को परेशान किए बिना अवशिष्ट EtOH को हटा दें।
  10. प्लेट को चुंबकीय रैक पर रखें और 2 मिनट के लिए नमूनों को हवा से सुखाएं।
    नोट: मोतियों को अधिक न सुखाएं।
  11. चुंबकीय रैक से प्लेट को हटा दें और 10 mM Tris-HCl (pH 8) के 28.5 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें।
    सावधानी: हाइड्रोक्लोरिक एसिड बहुत संक्षारक है। उपयोगकर्ताओं को इसे चश्मे, दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट पहने हुए एक रासायनिक धुएं के हुड में देखभाल के साथ संभालना चाहिए।
  12. अच्छी तरह से pipetting द्वारा मोतियों resuspend, बुलबुले का उत्पादन नहीं करने के लिए ध्यान रखना.
  13. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  14. प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें और समाधान को 5 मिनट के लिए साफ करने की अनुमति दें।
  15. एक नई पीसीआर प्लेट के लिए supernatant के 27.5 μL स्थानांतरण और मोतियों को त्याग.

14. पुस्तकालय संवर्धन

नोट: प्राइमर को एडाप्टर के समान समाधान के साथ पतला किया जाता है। इस पुस्तकालय के निर्माण के लिए, 0.6 μM की अंतिम कार्यशील प्राइमर एकाग्रता का उपयोग करें।

  1. प्रत्येक नमूने के लिए पतला अनुक्रमित प्राइमर के 5 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट:: प्रत्येक नमूने अनुक्रमण के बाद पहचाना जा करने के लिए एक अलग अनुक्रमणिका की आवश्यकता है।
  2. एक पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें: 5x उच्च निष्ठा पीसीआर बफर के 10 μL, 10 mM dNTPs के 1.5 μL, पतला यूनिवर्सल प्राइमर के 5 μL, 1 U गर्म शुरू उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ के 1 μL, प्रति नमूना 17.5 μL की कुल मास्टर मिश्रण मात्रा के साथ।
  3. शुद्ध एडाप्टर-लिगेटेड डीएनए के 32.5 μL में 17.5 μL पीएफ पीसीआर मिश्रण जोड़ें (अनुक्रमित प्राइमर के 5 μL इस मात्रा में शामिल है)।
  4. पिपेटिंग द्वारा घोल को मिलाएं।
  5. 3 °C/s की अधिकतम रैंप दर के साथ निम्नलिखित प्रतिक्रिया स्थितियों का उपयोग करके थर्मोसाइकलर में इनक्यूबेट करें: 45 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 45 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, दूसरे और तीसरे चरण को 21 बार दोहराएं, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ें।
    नोट: नमूनों को अल्पकालिक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।

15. Polystyrene-मैग्नेटाइट मनका सफाई अप

  1. प्रत्येक नमूने के लिए polystyrene-मैग्नेटाइट मोतियों के 60 μL (1.2x) जोड़ें।
  2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पिपेटिंग और इनक्यूबेट करके मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  3. प्लेट को 5 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखें जब तक कि समाधान स्पष्ट न हो जाए।
  4. supernatant त्यागें और मोतियों को परेशान किए बिना 80% EtOH के 200 μL के साथ मोतियों कुल्ला.
  5. दो 80% EtOH धोने की कुल के लिए धोने के चरण को दोहराएँ।
  6. प्लेट को 10 सेकंड के लिए 500 x g पर स्पिन करें, प्लेट को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय रैक पर रखें, और मोतियों को 5 मिनट के लिए बांधने की अनुमति दें।
  7. पिपेट मोतियों को परेशान किए बिना अतिरिक्त ईटीओएच को हटाने और मोतियों को 2 मिनट के लिए हवा से सूखने की अनुमति देता है।
    नोट: मोतियों को अधिक न सुखाएं।
  8. न्यूक्लिएज मुक्त पानी के 21 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. प्लेट को चुंबकीय रैक पर रखें और समाधान को 5 मिनट के लिए साफ करने की अनुमति दें।
  10. एक नई प्लेट के लिए supernatant के 20 μL स्थानांतरण.
    नोट: प्रयोग -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना संग्रहीत करके यहाँ रोका जा सकता है।
  11. एक फ्लोरोमीटर के साथ पुस्तकालय सांद्रता को मापें ( सामग्री की तालिका देखें), एक 1x एचएस अभिकर्मक का उपयोग करके।
  12. यदि एकाग्रता अनुमति देती है, तो कल्पना करने के लिए कम आणविक वजन सीढ़ी के साथ 1.5% एगरोज जेल पर 30 एनजी नमूना चलाएं। वैकल्पिक रूप से, एक टुकड़ा विश्लेषक या संबंधित उपकरण पर कल्पना करें।
  13. ~ 50,000-100,000 अद्वितीय रूप से मैप किए गए रीड्स प्राप्त करने के लिए एक Illumina प्लेटफ़ॉर्म पर अनुक्रम पुस्तकालयों।

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Representative Results

यहां, क्रोमैटिन पर एकल-सेल प्रोटीन प्रोफाइलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, जिसमें 96-अच्छी तरह से मैनुअल प्रारूप यूलिकट एंड रन का उपयोग किया गया है। जबकि परिणाम प्रोटीन प्रोफाइल किए जाने के आधार पर भिन्न होंगे (प्रोटीन बहुतायत और एंटीबॉडी की गुणवत्ता के कारण), सेल प्रकार, और अन्य योगदान कारक, इस तकनीक के लिए प्रत्याशित परिणामों पर यहां चर्चा की गई है। सेल गुणवत्ता (सेल उपस्थिति और व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत) और एकल-सेल सॉर्टिंग का मूल्यांकन एनई बफर में लाइव-सेल सॉर्टिंग से पहले या समय किया जाना चाहिए। ईएस सेल कॉलोनियों और सेल सॉर्टिंग का एक उदाहरण चित्र 2 ए, बी में दिखाया गया है। विशेष रूप से, कम गुणवत्ता वाली कोशिकाओं का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, और यदि गुणवत्ता एक मुद्दा है, तो विशिष्ट सेल प्रकार के लिए दिशानिर्देशों का पालन करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, सेल सॉर्टिंग इंस्ट्रूमेंट द्वारा सटीक सेल सॉर्टिंग का मूल्यांकन प्रयोग से पहले किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, परीक्षण कोशिकाओं को होचस्ट 33342 दाग का उपयोग करके क्रमबद्ध और दाग दिया जा सकता है और प्रत्येक कुएं में 0 या 1 सेल पाया जाता है। यदि एकल कक्ष नहीं मिले हैं, तो सॉर्टिंग शर्तों को ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए. पुस्तकालय की तैयारी के बाद, नमूनों का मूल्यांकन या तो एक एगारोज़ जेल पर किया जा सकता है (यदि एकाग्रता 30 एनजी या उससे अधिक के लोडिंग के लिए अनुमति देती है, क्योंकि एक एगारोज़ जेल पर डीएनए विज़ुअलाइज़ेशन की कम सीमा होती है) या एक फ्रैगमेंट एनालाइज़र (या इसी तरह के डिवाइस जैसे कि टेपस्टेशन या बायोएनालाइज़र) अनुक्रमण और उदाहरण परिणामों से पहले चित्रा 2 सी में दिखाए गए हैं, विशेष रूप से, अपेक्षित आकार वितरण ~ 150 से ~ 500 बीपी तक है। उच्च सेल मात्रा में, बड़े प्रोटीन (जैसे हिस्टोन) पर किए गए कट एंड रन में एक दाएं तरफा आकार का वितरण होगा, जहां अधिकांश डीएनए ~ 270 बीपी देखा जाएगा; हालांकि, यह कंधे आमतौर पर एकल-सेल प्रयोगों में नहीं देखा जाता है।

अनुक्रमण के बाद, अनुक्रमण पढ़ने की गुणवत्ता का मूल्यांकन FASTQC का उपयोग करके किया जाना चाहिए। विशिष्ट रूप से मैपिंग पढ़ने का प्रतिशत निर्धारित किया जाना चाहिए। आमतौर पर, 0.5% -10% विशिष्ट रूप से मैपिंग पढ़ता है एकल-सेल प्रयोगों में मनाया जाता है। ये मानचित्रण प्रतिशत अन्य डीएनए-आधारित एकल-सेल तकनीकोंके समान हैं। इसके बाद, मानचित्रण के बाद पढ़ने का आकार वितरण यह सुनिश्चित करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए कि प्रोफ़ाइल पूर्व-अनुक्रमण के समान है (एडेप्टर अनुक्रम अब पढ़ने के आकार में योगदान नहीं देता है)।

डेटा की गुणवत्ता का आकलन करने के बाद, प्रोटीन अधिभोग को विभिन्न तरीकों का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है: एकल लोकस जीनोम ब्राउज़र छवियों को यूसीएससी जीनोम ब्राउज़र या आईजीवी (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है और विशिष्ट जीनोमिक निर्देशांक पर जीनोम-वाइड ऑक्यूपेंसी पैटर्न को मेटाप्लॉट्स (चित्रा 3 बी, नीचे), हीटमैप्स (चित्रा 3 बी, शीर्ष), या 1 डी हीटमैप (चित्रा 3 सी) का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। डेटा विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पैटी और हैनर27 द्वारा किए गए अध्ययन को देखें। एक द्विगुणित सेल से एकल-सेल डेटा के परिणामस्वरूप प्रत्येक लोकस में योगदान करने वाले चार पढ़ने तक होंगे (चार पढ़ता है यदि सेल माइटोसिस में था), लेकिन अधिक बार एक या दो पढ़ता है। इसलिए, डेटा बाइनरी है, और उच्च सेल प्रयोगों के सापेक्ष, अधिभोग के लिए एक उच्च पृष्ठभूमि को अधिक आसानी से गलत किया जा सकता है। इसलिए, यदि संभव हो तो, ब्याज के प्रोटीन के लिए सभी संभावित बाध्यकारी स्थानों को प्राप्त करने के लिए एक उच्च सेल संख्या (5,000 से 100,000 कोशिकाओं) पर एक समानांतर CUT &RUN प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है। फिर, एकल-कक्ष डेटा की तुलना संभावित बाइंडिंग स्थानों से की जा सकती है। चित्र 3 में दिखाए गए उदाहरणों में, एकल-कक्ष CTCF uliCUT&RUN परिणामों की तुलना उच्च कक्ष CTCF uliCUT&RUN (चित्रा 3A) या CHIP-seq (चित्रा 3B,C) से की जाती है। जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था, CTCF, SOX2, और NANOG एकल-सेल uliCUT &RUN चोटियों ने बड़े पैमाने पर उच्च सेल CHIP-seq डेटासेट23 से मजबूत चोटियों का प्रतिनिधित्व किया।

Figure 1
चित्रा 1: uliCUT &RUN प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध. कोशिकाओं को काटा जाता है और एनई बफर युक्त 96-अच्छी तरह से प्लेट में क्रमबद्ध किया जाता है। व्यक्तिगत नाभिक तब कोना-संयुग्मित पैरामैग्नेटिक माइक्रोस्फियर से बंधे होते हैं, और क्रमिक रूप से एक एंटीबॉडी (ब्याज के प्रोटीन को लक्षित करते हुए) और पीए-एमएनेज या पीए / जी-एमएनेस को जोड़ा जाता है। प्रोटीन-आसन्न डीएनए को MNase के माध्यम से क्लीव किया जाता है, और डीएनए को फिर पुस्तकालय की तैयारी में उपयोग के लिए शुद्ध किया जाता है। यह आंकड़ा Biorender.com के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: उदाहरण uliCUT &RUN पुस्तकालयों के सेल सॉर्टिंग और गुणवत्ता नियंत्रण के परिणामस्वरूप होता है। (A) उच्च गुणवत्ता वाले मुरीन भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं की छवि. स्केल बार: 200 μm. (बी) काटा ईएस कोशिकाओं के लिए 7AAD जोड़ने और एक FACS उपकरण पर छँटाई के बाद एकल सेल छँटाई से आउटपुट। (सी) एथिडियम ब्रोमाइड-सना हुआ एगरोज जेल पूर्ण यूलिकट एंड रन पुस्तकालयों को दर्शाता है। लेन 1 एक कम आणविक वजन सीढ़ी है और लेन 2-21 अनुक्रमण से पहले सफल व्यक्तिगत एकल-सेल यूलिकट और रन पुस्तकालयों के उदाहरण हैं। (डी) एथिडियम ब्रोमाइड-दाग वाले एगारोज़ जेल जो उप-इष्टतम और इष्टतम पूर्ण यूलिकट एंड रन पुस्तकालयों को दर्शाता है। लेन 1 एक कम आणविक वजन सीढ़ी है, लेन 2 अक्षम MNase पाचन के कारण एक उप-इष्टतम पुस्तकालय है, और लेन 3 उचित पाचन के साथ एक सफल पुस्तकालय है। (ई) अनुक्रमण से पहले एक एकल सेल यूलिकट एंड रन लाइब्रेरी का फ्रैगमेंट विश्लेषक वितरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एकल ES सेल uliCUT&RUN डेटा के लिए अपेक्षित परिणामों का उदाहरण. (ए) उच्च सेल संख्या (5,000 कोशिकाओं) सीटीसीएफ या नकारात्मक नियंत्रण (कोई एंटीबॉडी, कोई एबी नहीं) यूलीकट एंड रन (शीर्ष दो पटरियों) और एकल-सेल सीटीसीएफ यूलिकट एंड रन का ब्राउज़र ट्रैक। छवि reproduced है, अनुमति के साथ, पैटी और हैनर27 से. (बी) हीटमैप (ऊपर) और मेटाप्लॉट्स (नीचे) एकल-सेल सीटीसीएफ या नकारात्मक नियंत्रण (कोई एबी) यूलिकट एंड रन पहले प्रकाशित सीटीसीएफ सीआईपी-सेक साइटों (जीएसई 11724) पर। छवि reproduced है, अनुमति के साथ, Hainer et al.23 से. (सी) एकल-सेल सीटीसीएफ या नकारात्मक नियंत्रण (कोई एबी) यूलिकट एंड रन के 1 डी हीटमैप पहले से प्रकाशित सीटीसीएफ सीआईपी-सेक साइटों (जीएसई 11724) पर। छवि reproduced है, अनुमति के साथ, Hainer et al.23 से. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न बफ़र्स की संरचना। आवश्यक स्टॉक समाधान की मात्रा कोष्ठक में लिखी गई अंतिम एकाग्रता के साथ सूचीबद्ध है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

CUT&RUN क्रोमैटिन पर प्रोटीन स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी प्रोटोकॉल है। इसके अन्य प्रोटोकॉल के सापेक्ष कई फायदे हैं, जिनमें शामिल हैं: 1) उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात, 2) तेजी से प्रोटोकॉल, और 3) कम अनुक्रमण पठन कवरेज की आवश्यकता होती है, जिससे लागत बचत होती है। प्रोटीन ए- या प्रोटीन ए / जी-एमएनेज का उपयोग किसी भी उपलब्ध एंटीबॉडी के साथ लागू होने के लिए कट एंड रन को सक्षम बनाता है; इसलिए, इसमें कई प्रोटीनों को जल्दी और आसानी से प्रोफ़ाइल करने की क्षमता है। हालांकि, क्रोमैटिन पर किसी भी प्रोटीन प्रोफाइलिंग के लिए एकल-सेल के लिए अनुकूलन मुश्किल रहा है, खासकर जब एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक्स (यानी, एससीआरएनए-सेक) की तुलना में, आरएनए के सापेक्ष डीएनए की कम प्रतिलिपि संख्या के कारण (डीएनए की दो से चार प्रतियां बनाम संभावित हजारों आरएनए प्रतियां)।

ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल में, कई महत्वपूर्ण चरणों पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, कोशिकाओं की उपयुक्त छँटाई सेल (या ऊतक) प्रकार पर निर्भर करती है, और सटीक छँटाई के लिए देखभाल की जानी चाहिए। यह परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है कि किसी भी प्रयोग से पहले उपकरण के साथ एकल-सेल सॉर्टिंग कितनी प्रभावी है। दूसरा, प्रभावी एंटीबॉडी विकल्प आवश्यक है। एकल-सेल अनुप्रयोग पर आगे बढ़ने से पहले, एक उच्च सेल नंबर प्रयोग में एंटीबॉडी का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है (साथ ही साथ अन्य मानक एंटीबॉडी परीक्षण, जैसे कि नॉकडाउन के बाद पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके विशिष्टता की पुष्टि करना, CUT & RUN प्रयोगों में एंटीबॉडी का अनुमापन, आदि)। तीसरा, एक नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें, जैसे कि आईजीजी या कोई प्राथमिक एंटीबॉडी नहीं, क्योंकि प्रयोगात्मक नमूनों की एक उपयुक्त तुलना डेटा गुणवत्ता और जैविक परिणामों की व्याख्या के लिए आवश्यक है। एक उच्च सेल संख्या डेटासेट के लिए एकल-सेल प्रयोगात्मक परिणामों की तुलना करते समय, नकारात्मक नियंत्रण एकल-सेल प्रयोगों को उच्च सेल प्रयोग में पहचाने गए उन बाध्यकारी साइटों पर कम पढ़ा कवरेज होना चाहिए और इसके बजाय जीनोम में पढ़ने का एक यादृच्छिक वितरण होना चाहिए (क्रोमैटिन के खुले क्षेत्रों के लिए पूर्वाग्रह के साथ)। चौथा, प्रोटीन ए- या प्रोटीन ए / जी-एमएनेज को जोड़ते और सक्रिय करते समय देखभाल की जानी चाहिए ताकि क्रोमैटिन को पचाने के लिए अधिक न हो: अपने हाथों से नमूनों को अधिक गर्म न करें, नमूनों को बर्फ / पानी-स्नान तापमान (0 डिग्री सेल्सियस) में बनाए रखें, और उचित समय पर प्रतिक्रिया को चेलेट करें। पांचवां, कम सामग्री के कारण uliCUT & RUN प्रयोग और पुस्तकालय की तैयारी के दौरान देखभाल की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, मनका बाइंडिंग के दौरान चुंबकीय रैक पर विस्तारित इनक्यूबेशन supernatant को आश्वस्त करने के लिए साफ हो गया है और ध्यान रखना जब supernatant हटाने के लिए मोतियों को परेशान नहीं कर रहे हैं पर्याप्त उपज के लिए आवश्यक हैं. छठा, संबोधित किए जा रहे प्रश्नों के आधार पर, किए जा रहे एकल-सेल प्रयोगों की संख्या एक महत्वपूर्ण विचार है। कुछ एकल-सेल प्रयोग विफल हो जाएंगे (जैसा कि सभी कम-इनपुट प्रयोगों के साथ), और इसलिए, उचित व्याख्या के लिए आवश्यक सकारात्मक प्रयोगात्मक परिणामों की संख्या को प्रयोग शुरू करने से पहले माना जाना चाहिए। प्रयोग में शामिल करने के लिए कोशिकाओं की संख्या अन्वेषक द्वारा आवश्यक प्रयोगात्मक डेटा की मात्रा और एंटीबॉडी की गुणवत्ता पर निर्भर करती है। अंत में, ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल के कई पहलुओं की कम मात्रा के साथ समकक्ष परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं। जिन चरणों में मात्रा 50% तक कम हो गई थी, उनमें एनई बफर की मात्रा, वॉश बफर, प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण (प्राथमिक एंटीबॉडी की मात्रा सहित), पीए-एमएनेज मिश्रण (पीए-एमएनेज की मात्रा सहित) और पुस्तकालय की तैयारी में सभी चरण शामिल हैं।

क्रोमैटिन पर कारक प्रोफाइलिंग की जटिल प्रकृति के आधार पर, मुद्दों और स्थानों के कई संभावित स्रोत हैं जहां समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है। हालांकि ऐसे कई चरण हो सकते हैं जहां मुद्दे उत्पन्न हो सकते हैं, तीन प्रमुख मुद्दों को देखा गया है: 1) पुस्तकालय निर्माण में इनपुट के लिए कम डीएनए उपज; 2) प्रयोगात्मक नमूनों में उच्च पृष्ठभूमि संकेत, और 3) पुस्तकालय के निर्माण के बाद कम उपज। यदि पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण (बिंदु 1) के लिए अपर्याप्त डीएनए है, तो निम्नलिखित समस्या निवारण सलाह पर ध्यान दें: ए) अपूर्ण झिल्ली लाइसिस हो सकता है और इसलिए एनई बफर के साथ लाइसिस समय बढ़ाया जा सकता है; ख) कोना-संयुग्मित पैरामैग्नेटिक माइक्रोस्फियर के लिए नाभिक का अक्षम बंधन हो सकता है और इन मोतियों को जोड़ने पर उचित मिश्रण के माध्यम से इसका इलाज किया जा सकता है; ग) बहुत कम एंटीबॉडी जोड़ा गया हो सकता है, और इसलिए सबसे प्रभावी राशि की पहचान करने के लिए एंटीबॉडी का अनुमापन करने की सिफारिश की जाती है; घ) या तो प्राथमिक एंटीबॉडी या प्रोटीन ए- या प्रोटीन ए / जी-एमएनेज के साथ इनक्यूबेशन बार या तो बहुत कम हैं (यानी, बाध्यकारी की अनुमति देने के लिए पर्याप्त समय नहीं) या बहुत लंबा है (ये देशी, अनक्रॉसलिंककिए गए नमूने हैं), और अनुकूलित किया जा सकता है; ई) क्रोमैटिन के साथ लक्ष्य प्रोटीन की बातचीत देशी परिस्थितियों में कैप्चर करने के लिए बहुत क्षणिक हो सकती है और इसलिए क्रॉसलिंकिंग कट एंड रन28 किया जा सकता है। जबकि एकल-सेल डेटासेट उच्च पृष्ठभूमि उत्पन्न करेंगे, अत्यधिक उच्च पृष्ठभूमि हो सकती है जहां संकेत पृष्ठभूमि (बिंदु 2) से व्याख्या करना मुश्किल है। इस समस्या के लिए, निम्न सलाह पर ध्यान दें: a) EDTA के साथ ब्लॉकिंग चरण को रोकने के लिए pre-emptive MNase पाचन को रोकने के लिए बढ़ाया या अनुकूलित किया जा सकता है; बी) यदि अत्यधिक कटौती होती है, तो यह बहुत अधिक प्रोटीन ए- या प्रोटीन ए / जी-एमएनेस होने के कारण हो सकता है, और इसलिए उचित मात्रा में अनुमापन किया जा सकता है; ग) MNase द्वारा पाचन पर उच्च पृष्ठभूमि में परिणाम हो सकता है, और इसलिए इसके अलावा और MNase पाचन समय के लिए अनुकूलन पर कैल्शियम क्लोराइड के उचित मिश्रण का आकलन किया जाना चाहिए. अंत में, कुशल uliCUT और RUN-समृद्ध डीएनए को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन पुस्तकालय की कम मात्रा को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है (बिंदु 3)। इस मुद्दे के लिए, निम्नलिखित की सिफारिश की जाती है: ए) सही शुद्धिकरण और कोई डीएनए हानि का आश्वासन देने के लिए पॉलीस्टीरीन-मैग्नेटाइट मोतियों का उचित हैंडलिंग और उपयोग; विशेष रूप से, नुकसान को रोकने के लिए मोतियों को चुंबकीय बनाने के लिए 15 मिनट के ऊष्मायन और कम से कम 5 मिनट की सिफारिश की जाती है; ख) पीसीआर चरण में पुस्तकालय के कम प्रवर्धन के परिणामस्वरूप कम उपज होगी और इसलिए उचित चक्रों को क्यूपीसीआर का उपयोग करके निर्धारित किया जाना चाहिए (जैसा कि पहले ATAC-seq पुस्तकालयों के लिए स्थापितकिया गया था 29)।

सभी प्रौद्योगिकियों के साथ, uliCUT & RUN की सीमाएं हैं जिन्हें किसी भी प्रयोग को शुरू करने से पहले विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, इन प्रयोगों को देशी स्थितियों के लिए डिज़ाइन और अनुकूलित किया गया है, और इसलिए यदि कोई प्रोटीन केवल क्रोमैटिन के साथ क्षणिक रूप से बातचीत कर रहा है, तो इंटरैक्शन की वसूली सुनिश्चित करने के लिए एक क्रॉसलिंकिंग दृष्टिकोण आवश्यक हो सकता है। दूसरा, सभी एंटीबॉडी-आधारित तकनीकों के साथ, एंटीबॉडी की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। किसी भी प्रयोग को करने से पहले एंटीबॉडी की गुणवत्ता और स्थिरता को सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए। तीसरा, MNase पृष्ठभूमि काटने हो सकता है और, जबकि अन्य प्रयोगों के सापेक्ष CUT & RUN में लगातार कम पृष्ठभूमि संकेत है, पृष्ठभूमि संकेत एकल-सेल प्रयोगों में उच्च हो सकता है और इसलिए उचित नियंत्रण और विश्लेषण किया जाना चाहिए। जबकि एकल-सेल प्रोफाइलिंग डेटा की बाइनरी प्रकृति विज़ुअलाइज़ेशन को सीमित करती है, अधिक उन्नत कम्प्यूटेशनल जीनोमिक प्रौद्योगिकियां, जैसे कि आयामी कमी और अन्य का प्रदर्शन किया जा सकता है (जैसा कि पहले वर्णित27)। अंत में, जबकि एकल-सेल प्रोफाइलिंग को यहां 96-अच्छी तरह से प्रारूप में विस्तारित किया गया है, यह अन्य एकल-सेल प्रौद्योगिकियों के सापेक्ष कम थ्रूपुट है जो 10xGenomics या अन्य प्रारूपों का उपयोग करते हैं।

Tethering-आधारित प्रोफाइलिंग प्रौद्योगिकियों जैसे ChEC-seq20, CUT&Tag24, CUT&RUN21, और uliCUT&RUN23, क्रोमैटिन पर कारक स्थानीयकरण को तेजी से प्रयोगात्मक समयरेखा, कम पृष्ठभूमि और पारंपरिक प्रोफाइलिंग प्रौद्योगिकियों की तुलना में कम लागत के साथ निर्धारित कर सकते हैं, जैसे कि CHIP-seq। इसलिए, ये रोगी के नमूनों या प्रारंभिक विकास के नमूनों जैसे कीमती नमूनों के लिए आवेदन के लिए बहुत रोमांचक प्रौद्योगिकियां हैं। इसके अलावा, एकल कोशिकाओं के लिए आवेदन अन्य एकल-सेल प्रयोगों जैसे scRNA-seq और scATAC-seq30 का उपयोग करके किए गए पूरक अध्ययन प्रदान कर सकता है। जैसा कि इन अधिक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली एकल-सेल प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके वर्णित किया गया है, उपन्यास अंतर्दृष्टि को थोक सेल प्रयोगों के सापेक्ष प्राप्त किया जा सकता है। क्रोमैटिन पर एकल-सेल प्रोटीन प्रोफाइलिंग को अधिक नियमित रूप से उपयोग किए जाने का अनुमान है क्योंकि प्रौद्योगिकियां अधिक समानांतरीकरण में सुधार और अनुमति देना जारी रखती हैं।

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Disclosures

लेखकइस परियोजना से संबंधित कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि के पिछले संस्करण पर पढ़ने और टिप्पणियों के लिए हैनर लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस परियोजना ने अपने निदेशक विलियम मैकडॉनल्ड्स के लिए विशेष धन्यवाद के साथ अनुक्रमण के लिए पिट्सबर्ग के यूपीएमसी बच्चों के अस्पताल में पिट्सबर्ग के यूपीएमसी बच्चों के अस्पताल में पिट्सबर्ग स्वास्थ्य विज्ञान अनुक्रमण कोर विश्वविद्यालय में उपलब्ध NextSeq500 का उपयोग किया। इस शोध को प्रदान किए गए कंप्यूटर संसाधनों के माध्यम से पिट्सबर्ग सेंटर फॉर रिसर्च कंप्यूटिंग विश्वविद्यालय द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संख्या R35GM133732 (S.J.H. के लिए) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL clear microfuge tubes ThermoFisher Scientific 90410
1.5 mL tube magnetic rack ThermoFisher Scientific 12321D
1.5 mL tube-compatible cold centrifuge Eppendorf 5404000537
10 cm sterile tissue culture plates ThermoFisher Scientific 150464
10X T4 DNA Ligase buffer New England Biolabs B0202S
15 mL conical tubes VWR 89039-656
1X TE buffer ThermoFisher Scientific 12090015
200 µL PCR tubes Eppendorf 951010022
2X quick ligase buffer New England Biolabs M2200 Ligase Buffer
5X KAPA HiFi buffer Roche 7958889001 5X high fidelity PCR buffer
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) Fisher Scientific BDB559925
96-well magnetic rack ThermoFisher Scientific 12027 or 12331D
96-well plate VWR 82006-636
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions
Antibody to protein of interest varies
ATP ThermoFisher Scientific R0441
BioMag Plus Concanavalin A beads Polysciences 86057-10 ConA-conjugated paramagnetic microspheres
BSA
Calcium Chloride (CaCl2) Fisher Scientific AAJ62905AP
Cell sorter BD FACSAria II cell sorter Requires training
Cell-specific media for cell culture Varies
Chloroform ThermoFisher Scientific C298-500 Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster For computational analyses of resulting sequencing datasets
DNA spin columns Epoch Life Sciences 1920-250
dNTP set New England Biolabs N0446S
EGTA Sigma Aldrich E3889
Electrophoresis equipment varies
Ethanol Fisher Scientific 22032601 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA) Fisher Scientific BP2482100
FBS Sigma Aldrich F2442
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Glycogen VWR 97063-256
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in homemade Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.
Hydrochloric Acid  (HCl) Fisher Scientific A144-212 Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ice Bucket varies
Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) Illumina
Incubator with temperature and atmosphere control ThermoFisher Scientific 51030284
KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer Roche 7958889001 hotstart high fidelity polymerase
Laminar flow hood Bakery Company SG404
Manganese Chloride (MnCl2) Sigma Aldrich 244589
Micropipette set Rainin 30386597
Minifuge Benchmark Scientific C1012
NEB Adaptor New England Biolabs E6612AVIAL Adaptor
NEB Universal primer New England Biolabs E6611AVIAL Universal Primer
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit New England Biolabs E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L Indexed Primers
Negative control antibody Antibodies-Online ABIN101961
Nuclease Free water New England Biolabs B1500S
PCR thermocycler Eppendorf 2231000666
Phase lock tubes Qiagen 129046
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) ThermoFisher Scientific 15593049 Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Phsophate buffered saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10814010
Pipette aid Drummond Scientific # 4-000-100
Polyethylene glycol (PEG) 4000 VWR A16151
Potassium Chloride (KCl) Sigma Aldrich P3911
Potassium Hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-1 CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Protease Inhibitors ThermoFisher Scientific 78430
ProteinA/G-MNase Epicypher 15-1016 pA/G-MNase
ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN Addgene 86973
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Scientific Q33230
Qubit Assay tubes ThermoFisher Scientific Q32856
Qubit Fluorometer ThermoFisher Scientific Q33238
Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer New England Biolabs M2200S
RNase A New England Biolabs T3010
Sodium Acetate  (NaOAc) ThermoFisher Scientific BP333-500
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich S5150-1L
Sodium dodecyl sulfate (SDS) ThermoFisher Scientific BP166-500 SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318-1 NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Spermidine Sigma Aldrich S2626
Standard Inverted Light Microscope Leica 11526213
Standard lab agarose gel materials Varies
Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips Varies
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203S
T4 PNK New England Biolabs M0201S
Tabletop vortexer Fisher Scientific 2215414
Taq DNA Polymerase New England Biolabs M0273S
Thermomixer Eppendorf 5384000020 Alternatively, can use a waterbath
Tris base Fisher Scientific BP152-5
Triton X-100 Sigma Aldrich 9002-93-1 Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling
Trypsin Fisher Scientific MT25052
Tube rotator VWR 10136084
USER enzyme New England Biolabs M5505S

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References

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जीव विज्ञान अंक 180
क्रोमैटिन पर एकल-सेल फैक्टर स्थानीयकरण लक्ष्य के तहत अल्ट्रा-लो इनपुट क्लीवेज का उपयोग करके और न्यूक्लिएज का उपयोग करके रिलीज करें
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Lardo, S. M., Hainer, S. J. Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease. J. Vis. Exp. (180), e63536, doi:10.3791/63536 (2022).

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