Summary
Aqui, introduzimos um método de imersão detalhado da interferência de RNA em Bursaphelenchus xylophilus para facilitar o estudo das funções genéticas.
Abstract
O nematode de pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é uma das espécies invasoras mais destrutivas do mundo, causando a murcha e eventual morte de pinheiros. Apesar do reconhecimento de sua significância econômica e ambiental, até agora tem sido impossível estudar as funções genéticas detalhadas dos nematoides parasiticos vegetais (PPNs) utilizando genética convencional para a frente e métodos transgênicos. No entanto, como uma tecnologia genética reversa, a interferência de RNA (RNAi) facilita o estudo dos genes funcionais de nematoides, incluindo B. xylophilus.
Este artigo descreve um novo protocolo para RNAi do gene ppm-1 em B. xylophilus, que tem sido relatado para desempenhar papéis cruciais no desenvolvimento e reprodução de outros nematoides patogênicos. Para o RNAi, o promotor T7 foi ligado ao 5′-terminal do fragmento alvo por reação em cadeia de polimerase (PCR), e o RNA de dupla cadeia (dsRNA) foi sintetizado por transcrição in vitro . Posteriormente, a entrega de dsRNA foi realizada absorvendo os nematoides em uma solução dsRNA misturada com neuroestimulantes sintéticos. Os jovens sincronizados de B. xylophilus (aproximadamente 20.000 indivíduos) foram lavados e encharcados em dsRNA (0,8 μg/mL) no tampão de imersão por 24 h no escuro a 25 °C.
A mesma quantidade de nematoides foi colocada em um tampão de imersão sem dsRNA como controle. Enquanto isso, outra quantidade idêntica de nematoides foi colocada em um tampão de imersão com proteína fluorescente verde (gfp) gene dsRNA como controle. Após a imersão, o nível de expressão das transcrições de destino foi determinado por meio de PCR quantitativo em tempo real. Os efeitos da RNAi foram então confirmados utilizando-se observação microscópica dos fenótipos e comparação do tamanho do corpo dos adultos entre os grupos. O protocolo atual pode ajudar a avançar a pesquisa para entender melhor as funções dos genes de B. xilophilus e outros nematoides parasitas para o desenvolvimento de estratégias de controle através da engenharia genética.
Introduction
Os nematoides parasiticos vegetais (PPNs) são uma ameaça contínua à segurança alimentar e aos ecossistemas florestais. Eles causam cerca de 100 bilhões de USD em perdas econômicas a cadaano 1, dos quais os mais problemáticos são principalmente nematoides de nó raiz, nematoides de cisto e nematoides de pinheiros. O nematoide de pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é um nematoide migratório e endoparasitário, que é o patógeno causal da doençade murchar pinheiro 2. Causou grandes danos às florestas de pinheiros em todo o mundo3. Usando a terminologia de Van Megen et al.4, B. xylophilus é um membro do Parasitaphelenchidae e pertence ao clade 10, enquanto a maioria dos outros grandes parasitas vegetais pertencem ao clade 12.
Como um parasita vegetal independente e recentemente evoluído, B. xylophilus é um modelo atraente para estudos comparativos. Até o momento, tem havido pesquisas substanciais sobre nematoides de nó radicular e nematoides de cisto pertencentes ao clade 12, que são endoparasitas obrigatórias e sedentárias e são alguns dos nematoides mais intensamente estudados. No entanto, a realização de novas pesquisas nessa importante área vem com um grande desafio: a função dos genes do parasitismo é um gargalo de pesquisa. Estudos funcionais geralmente incluem expressões ectópicas e experimentos de knockdown/out, mas dependem de protocolos eficazes de transformação genética para o nematoide. Como resultado, a genética reversa em PPNs depende quase exclusivamente do silenciamento genético pela RNAi.
RNAi, um mecanismo amplamente presente em células eucarióticas, silencia a expressão genética introduzindo RNA de dupla cadeia (dsRNA)5. Até o momento, o mecanismo de silenciamento de genes pós-transcrição induzido pelo dsRNA foi encontrado em todos os eucariotes estudados, e a tecnologia RNAi, como uma ferramenta de pesquisa de genômica funcional e outras aplicações, desenvolveu-se rapidamente em muitos organismos. Desde a descoberta do maquinário RNAi em Caenorhabditis elegans em 19986, as técnicas RNAi tornaram-se métodos eficazes para identificar a função genética dos nematoides e são propostas como uma nova maneira de controlar efetivamente os nematoides patogênicos7.
RNAi é tecnicamente fácil de absorver os jovens no dsRNA pode ser suficiente; no entanto, a eficácia e a reprodutibilidade dessa abordagem variam amplamente com a espécie nematoide e o gene alvo8. O silenciamento de 20 genes envolvidos nas vias RNAi do nematode do nó radicular, Meloidogyne incognita, foi investigado usando dsRNAs longas como gatilhos, resultando em respostas diversas, incluindo um aumento e nenhuma mudança na expressão de alguns genes9. Esses resultados mostram que os genes-alvo podem responder ao knockdown da RNAi de forma diferente, exigindo uma avaliação exaustiva de sua adequação como alvos para o controle de nematoide via RNAi. No entanto, há atualmente uma escassez de pesquisas sobre a biologia do desenvolvimento e reprodutiva de B. xilophilus.
Como continuação do trabalho anterior 10,11,12,13, descrevemos aqui um protocolo para a aplicação da RNAi para estudar a função do gene ppm-1 de B. xylophilus, incluindo a síntese de dsRNA, imersão neuroestimulante sintética e detecção quantitativa de reação em cadeia polimerase (qPCR). O conhecimento adquirido com essa abordagem experimental provavelmente contribuirá significativamente para a compreensão dos sistemas biológicos básicos e a prevenção da doença do verrinho.
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Protocol
O estudo foi aprovado pelo conselho para experimentação animal da Zhejiang Agricultural & Forestry University. O b . xylophilus isolante NXY61 foi originalmente extraído de uma massoniana pinus doente na área de Ningbo da província de Zhejiang, China11.
1. Clonagem de genes
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os primers utilizados neste protocolo.
- Colecionar nematoides.
- Cultura a cepa B. xylophilus na micelia de Botrytis cinerea em pratos de Dextrose Agar de Batata (PDA) a 25 °C por 3-5 dias.
- Colete os nematoides usando o método do funil Bellman14.
- Coloque um tubo de borracha preso abaixo de um funil e coloque duas camadas de papel filtro na boca do funil. Transfira as culturas fúngicas para o funil e adicione água para imergir o tapete fúngico. Espere por 2h, depois pegue os nematoides.
- Extrair o RNA total dos nematoides utilizando um reagente de extração total de RNA (ver a Tabela de Materiais)11 de acordo com as etapas seguintes.
- Adicione 500 μL de reagente de extração e 100 μL de contas magnéticas a um tubo de centrífuga de 2 mL. Aspire 20 μL dos nematoides e transfira a amostra para um moedor para moagem a 9.000 × g para 30 s. Incubar por 5 min e depois centrífuga por 10 min a 12.000 × g e 4 °C.
- Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga. Adicione 100 μL de clorofórmio, tampa o tubo e misture invertendo o tubo várias vezes. Incubar por 3 min e depois centrífuga por 10 min a 12.000 × g a 4 °C.
- Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga. Adicione 250 μL de álcool isopropílico e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 12.000 × g por 10 min.
- Descarte o supernatante. Adicione 500 μL de 75% de etanol para lavar o RNA e, em seguida, vórtice da amostra. Centrifuá-lo por 5 min a 12.000 × g e 4 °C.
- Seque a pelota de RNA por 5 minutos.
- Resuspenque a pelota em 30 μL de água sem RNase.
- Calcule a concentração de RNA utilizando a fórmula: Diluição de × A260 × 40 = Μg RNA/mL. Calcule a razão A260/A280.
NOTA: Uma razão de ~2 é considerada pura.
- Realize a transcrição reversa do RNA de boa qualidade para obter o modelo cDNA.
- Projete e use um par de primers específicos, ppm-1-F/R (ver a Tabela de Materiais), para amplificar a sequência de codificação parcial do gene Bx-ppm-1 em B. xylophilus (número de adesão do GenBank QTZ96795).
- Clone as sequências genéticas ppm-1 no vetor pGEM-Teasy contendo o promotor T7 seguindo um protocolo de clonagem padrão11.
- Configure as reações pcr da seguinte forma: 2 μL de cDNA, 25 μL de 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL de cada primer (10 pmol/l) e água destilada estéril a um volume final de 50 μL.
- Realizar o procedimento de amplificação da seguinte forma: 5 min a 94 °C; seguido por 35 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 55 °C e 1 min a 72 °C; e uma etapa final de extensão a 72 °C por 5 min.
- Clone os produtos amplificados em um vetor pGEM-T Easy para sequenciamento.
2. Síntese de dsRNA
- Prepare o modelo de DNA para síntese de dsRNA usando PCR com primers projetados para adicionar sites de promotores T7 em ambas as extremidades. Adicione a sequência de promotores T7 ao final de 5' dos primers.
- Use o plasmid contendo o fragmento genético ppm-1 (894 bp) como modelo para PCR e recupere o fragmento contendo o promotor T711. Use o procedimento PCR e o sistema descrito acima.
- Use um kit de transcrição in vitro para sintetizar o dsRNA11.
- Descongele os reagentes congelados no gelo.
- Adicione 2 μL de tampão de reação de 10x, 2 μL de mistura de enzimas e 1 μg de DNA a um tubo de centrífuga. Adicione água sem nuclease para produzir uma reação padrão de 4 μL. Em seguida, misture os volumes iguais das quatro soluções de ribonucleotídeos (ATP, CTP, GTP e UTP) juntos e adicione 8 μL da mistura ao tubo. Misture bem e incubar a 37 °C por 4h.
- Adicione 1 μL de DNase, misture bem e incubar por 15 min a 37 °C.
- Pare a reação e adicione 30 μL de água sem nuclease e 30 μL de solução de precipitação licl para precipitar o RNA. Homogeneizar. Incubar a -20 °C durante a noite.
- Centrifugar por 15 min a 12.000 × g e 4 °C. Descarte o supernatante.
- Adicione 1 mL de 75% de etanol para lavar o RNA. Vórtice a amostra e centrífuga por 10 min a 12.000 × g e 4 °C.
- Seque a pelota de RNA por 3 minutos.
- Resuspenque a pelota em 30 μL de água sem RNase.
- Analise a qualidade do dsRNA usando um espectrômetro. Pipeta 1 μL da amostra dsRNA no pedestal de medição e definir o comprimento de onda para 340 nm. Visualize os produtos em um gel de 1,0% agarose.
3. RNAi por imersão
- Misture 4 μL de tampão de imersão de 5x (0,05% de gelatina, 5,5 mM KH2PO4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH4Cl, 3 mM de espermatozoide) com o dsRNA e ddH2O para produzir um volume total de 20 μL e uma concentração final de RNA de 0,8 μg/mL.
- Adquira larvas J2.
- Recolhe os nematoides das culturas fúngicas e transfere-os para uma placa de vidro Petri de 6 cm de diâmetro. Adicione 10 mL de água ao prato para garantir que os nematoides possam nadar livremente. Mantenha os nematoides no prato por 30 minutos e espere os ovos aderirem ao fundo.
- Retire a água e os nematoides cuidadosamente, certificando-se de não perturbar os ovos. Repita os passos até que todas as larvas e adultos sejam removidos, deixando apenas os ovos no prato.
- Eclode os ovos coletados por 24 h no escuro a 25 °C para obter larvas J2. Recolher as larvas J2, colocá-las em um tubo e lavá-las três vezes com ddH2O para o experimento RNAi15.
- Transfira as larvas J2 para o tubo de 2 mL contendo a solução dsRNA e adicione solução resorcinol (embrulhada em papel alumínio e dissolvida em água) para produzir uma concentração final de 1,0%. Incubar as larvas com centrifugação a 15 × g em uma mesa de agitação por 24 h a 25 °C para garantir que as larvas absorvam efetivamente o dsRNA.
- Mergulhe a mesma quantidade de nematoides no tampão de imersão sem a sonda dsRNA ou com uma sonda DSRNA GFP como controle. Use o gene GFP (gfp, M62653.1) como um controle não endógeno e sintetize o dsRNA de gfp usando primers específicos de genes T7-GFP-F/R.
4. detecção qPCR
- Limpe as larvas J2 com ddH2O, incluindo aquelas com interferência genética alvo, interferência genética GFP e o grupo de controle não perturbado. Extrair o total de RNAs de cada grupo utilizando o método descrito acima.
- Inicie o qPCR.
- Projete os primers q-ppm-1-F/R usando o software desejado (veja a Tabela de Materiais).
- Configure a reação qPCR em 12 μL contendo 1 μL de cDNA, 6 μL de precário fluorescente, 0,4 μL de cada primer (10 pmol/l) e água destilada estéril.
- Realizar qPCR da seguinte forma: 2 min a 95 °C; seguido por 40 ciclos de 10 s a 95 °C, 30 s a 55 °C e 1 min a 72 °C.
- Use o gene actb (número de adesão do GenBank EU100952) e o gene tbb-2 (número de adesão do GenBank MT769316), ou outros genes, como genes de referência interna para avaliar as mudanças no nível de expressão genética após o RNAi15.
- De acordo com o valor do limiar de ciclo (TC) e a curva de dissolução, use o método 2-ΔΔCt para estimar o nível de expressão relativa do gene alvo e verificar a eficiência da interferência.
- Subtraia o valor ct do gene de referência interna de cada amostra a partir do valor ct do gene alvo para obter o valor ΔCt. Em seguida, subtraia o valor ΔCt do grupo de interferência do valor ΔCt do grupo de controle para obter o valor ΔΔCt.
NOTA: Um valor ΔΔT maior que 0 indica que a interferência é eficaz.
- Subtraia o valor ct do gene de referência interna de cada amostra a partir do valor ct do gene alvo para obter o valor ΔCt. Em seguida, subtraia o valor ΔCt do grupo de interferência do valor ΔCt do grupo de controle para obter o valor ΔΔCt.
5. Avalie o comprimento do corpo dos adultos nematoides seguindo rnai
- Depois da RNAi, cultura as larvas J2 até a idade adulta em gramados B. cinerea em placas PDA por 60 h a 25 °C15.
- Colete os adultos usando o método do funil Bellman (ver passo 1.1.2.1)14.
- Adquira imagens dos nematoides adultos sob um microscópio e use o software ImageJ (ou outro software de medição) para medir os comprimentos do corpo.
- Meça o comprimento usando ImageJ selecionando Analisar | Definir escala. Se a distância for conhecida, digite o valor de comprimento da linha reta desenhada. Digite a unidade de comprimento.
- Verifique a caixa de seleção Global (use este padrão para todas as imagens) e clique em OK para selecionar o comprimento a ser medido com uma linha reta na imagem a ser medida.
- Use o comando Ctrl+M (medição) para exibir os resultados e gravá-los na janela de resultados .
- Faça medições de 50 nematoides masculinos e 50 femininos para análise estatística12.
- Analise os dados calculando a média e o desvio padrão de cada amostra. Compare os meios das amostras dos diferentes grupos que utilizam o teste t do Aluno.
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Representative Results
Análise da expressão ppm-1 de B. xylophilus após RNAi
O nível de expressão relativa do gene ppm-1 de B. xylophilus encharcado com DSRNA GFP e que encharcado com gene alvo dsRNA foi de 0,92 e 0,52, respectivamente (o nível de expressão genética ppm-1 do grupo de controle tratado ddH2O foi definido para 1) (Figura 1). Assim, o dsRNA exógeno não tem efeito na expressão ppm-1 de B. xylophilus; no entanto, ppm-1 dsRNA pode efetivamente inibir a expressão do gene alvo.
Efeito da expressão ppm-1 sobre o crescimento e desenvolvimento de B. xylophilus
Após a RNAi, o tamanho dos adultos diminuiu significativamente (Figura 2), resultando no fenótipo mutante SMA (pequeno tamanho do corpo). Embora os indivíduos tratados com RNAi tenham se desenvolvido até a maturidade sexual, seu comprimento corporal foi substancialmente menor do que os adultos normais. Especificamente, após o RNAi em nematoides em estágio J2, o comprimento médio do corpo de fêmeas e machos foi de 544,61 μm e 526,24 μm, respectivamente. Em contrapartida, o comprimento médio do corpo de fêmeas e machos no grupo controle foi de 971,86 μm e 912,31 μm, respectivamente (Figura 3), representando diferenças significativas (P = 0,0322).
Figura 1: Expressão do gene ppm-1 seguindo RNAi de Bursaphelenchus xylophilus. **P < 0,001. Abreviaturas: RNAi = interferência de RNA; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Redução do comprimento do corpo de adultos após a interferência do PPM-1 em Bursaphelenchus xylophilus. Imagens de um homem adulto (A) e uma fêmea (C) do grupo RNAi. Imagens de um homem adulto (B) e feminino (D) do grupo controle. Barras de escala = 50 μm. Abreviação: RNAi = Interferência de RNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação e análise estatística do comprimento corporal dos adultos de Bursaphelenchus xylophilus após RNAi do gene ppm-1 . (*P = 0,0322). Abreviação: RNAi = Interferência de RNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora a história de vida e o ambiente parasitítico de B. xilophilus sejam diferentes dos de outros nematoides, tem havido pesquisas limitadas sobre a patogênese molecular deste patógeno vegetal. Apesar dos grandes avanços na aplicação da tecnologia de edição de genomas CRISPR/Cas9 em C. elegans e outros nematoides, apenas a tecnologia RNAi aplicada à B. xylophilus foi publicada atéo momento 17. A RNAi é uma das ferramentas mais poderosas disponíveis para estudar a função genética dos nematoides e tem sido amplamente utilizada em pesquisas que elucidam a função genética B. xilophilus, vias de transdução de sinais e terapia genética 18,19,20. Em contraste com as abordagens de nocaute genético usadas em modelos invertebrados, o knockdown mediado pela RNAi de genes-alvo em nematoides permite a rápida avaliação da função genética.
Existem três maneiras de conduzir RNAi em C. elegans: injeção6, imersão21 e alimentação6. Como as larvas J2 só se alimentam após a infecção, o método de imersão é tipicamente usado para o RNAi de nematoides parasiticos vegetais. O passo chave no método de imersão é adicionar um agente nervoso para estimular os nematoides a se alimentarem. Urwin usou pela primeira vez a octopamina para estimular o J2 de duas espécies de nematoides de cisto oral, Globodera pallida, e glicinas heterodera, resultando na absorção de dsRNA da solução de imersão22. O mesmo método foi usado com sucesso para induzir J2 do nematode Meloidogyne incógnita para absorver dsRNA 23. O resorcinol também pode induzir a absorção de dsRNA por J2 de M. incógnita e pode ser mais eficaz do que a octopamina para este nematodo24. Além disso, a adição de espermidina ao tampão de imersão com um tempo de incubação prolongado melhorou a eficiência do RNAi nos nematoides25. Após 24 h de imersão, o dsRNA entra efetivamente em B. xylophilus, silenciando assim o gene ppm-1 .
Este protocolo, portanto, fornece referência para o estudo futuro do RNAi de outros nematoides parasiticos vegetais com comportamento fagocitose. Além disso, o efeito de suspensão da mesa de agitação desempenha um papel importante na maximização da vantagem do método de imersão. Este método pode permitir o tratamento simultâneo de um grande número de nematoides. RnAi é mais fácil de operar quando focado nos genes-alvo para os quais os mutantes não podem ser facilmente obtidos e para avaliar os efeitos em diferentes pontos de desenvolvimento porque nematoides podem ser encharcados em qualquer fase da vida. Assim, o RNAi pode ser usado para estudar a função de um gene específico em um estágio específico de desenvolvimento. Wang et al. analisaram a influência da MAPK sobre a fecundidade de B. xylophilus e seu importante papel no crescimento e desenvolvimento de nematoides usando dsRNA imersão26. Qiu et al. descobriram que a velocidade de migração e fecundidade de B. xilophilus em pinheiros diminuíram após a redução do gene Bxpel1 , o que indica que este gene é um importante fator patogênico de B. xilophilus27.
No entanto, nem todos os RNAi em nematoides funcionam através do dsRNA. Dulovic e Streit aplicaram pequenas RNAs interferentes (siRNAs) em vez das dsRNAs mais longas para interferir com sucesso com Strongyloides ratti28. A limitação do uso de dsRNA para RNAi em Strongyloides pode estar relacionada à ausência de genes como rsd-6, sid-1 ou sid-2 que são conhecidos por estarem envolvidos na absorção de dsRNA. A RNAi também está associada às desvantagens de um efeito posicional e nocaute temporário e incompleto e tem eficácia limitada para alguns genes e tipos celulares (como neurônios)29. No entanto, até que um avanço na tecnologia transgênica de B. xylophilus seja alcançado, a RNAi representa uma estratégia de pesquisa relativamente eficaz.
A RNAi tem mostrado grande potencial para a proteção das culturas. Usando a tecnologia RNAi, batatas transgênicas capazes de produzir dsRNA que visam genes nematoides de nó raiz foram criadas para produzir resistência completa aos nematoides de nó radicular30. Expressão de dsRNAs que visam genes de insetos podem fornecer proteção de culturas na ausência de inseticidas químicos e oferece a vantagem adicional de não produzir proteínas estrangeiras, com um número quase ilimitado degenes-alvo 31. Portanto, pesquisas aceleradas no campo da RNAi aplicada para controle de pragas proporcionarão melhor biossegurança para o controle de nematoides vegetais do que métodos transgênicos ou outros métodos de controle químico.
Em conclusão, este protocolo descreve a preparação do dsRNA do gene ppm-1 para alcançar rnAi, absorvendo diretamente as larvas de B. xylophilus na solução dsRNA. O efeito de interferência foi confirmado com base em uma redução significativa no tamanho do corpo das larvas depois que elas se desenvolveram em adultos em comparação com a do controle, demonstrando que o gene ppm-1 exerce efeitos sobre o crescimento e desenvolvimento de B. xilophilus. Este estudo fornece uma base teórica para revelar ainda mais a função do ppm-1 com valor prático adicional na orientação do controle biológico desse parasita vegetal. Acredita-se que, com a divulgação e melhoria do mecanismo de tecnologia RNAi, sua aplicação no campo do controle B. xylophilus terá amplas perspectivas.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses foi declarado.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31870637, 31200487) e financiada conjuntamente pelo Plano de Pesquisa Chave de Zhejiang (2019C02024, LGN22C160004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
References
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