Summary
Här introducerar vi en detaljerad blötläggningsmetod för RNA-interferens i Bursaphelenchus xylophilus för att underlätta studien av genfunktioner.
Abstract
Tallvedsnematoden, Bursaphelenchus xylophilus, är en av de mest destruktiva invasiva arterna i världen och orsakar vissnande och eventuell död av tallar. Trots erkännandet av deras ekonomiska och miljömässiga betydelse har det hittills varit omöjligt att studera de detaljerade genfunktionerna hos växtparasitiska nematoder (PPN) med hjälp av konventionell framåtgenetik och transgena metoder. Men som en omvänd genetikteknik underlättar RNA-interferens (RNAi) studien av de funktionella generna av nematoder, inklusive B. xylophilus.
Detta dokument beskriver ett nytt protokoll för RNAi av ppm-1-genen i B. xylophilus, som har rapporterats spela avgörande roller i utvecklingen och reproduktionen av andra patogena nematoder. För RNAi var T7-promotorn kopplad till 5′-terminalen i målfragmentet genom polymeraskedjereaktion (PCR), och dubbelsträngat RNA (dsRNA) syntetiserades genom in vitro-transkription. Därefter åstadkoms dsRNA-leverans genom blötläggning av nematoderna i en dsRNA-lösning blandad med syntetiska neurostimulanter. Synkroniserade ungar av B. xylophilus (cirka 20 000 individer) tvättades och blötläggdes i dsRNA (0,8 μg/ml) i blötläggningsbufferten i 24 timmar i mörker vid 25 °C.
Samma mängd nematoder placerades i en blötläggningsbuffert utan dsRNA som kontroll. Under tiden placerades en annan identisk mängd nematoder i en blötläggningsbuffert med grön fluorescerande protein (gfp) gen dsRNA som kontroll. Efter blötläggning bestämdes uttrycksnivån för måltranskriptionerna med hjälp av kvantitativ PCR i realtid. Effekterna av RNAi bekräftades sedan med hjälp av mikroskopisk observation av fenotyperna och en jämförelse av kroppsstorleken hos de vuxna bland grupperna. Det nuvarande protokollet kan hjälpa till att främja forskning för att bättre förstå funktionerna hos generna av B. xylophilus och andra parasitiska nematoder mot att utveckla kontrollstrategier genom genteknik.
Introduction
Växtparasitära nematoder (PPN) är ett fortsatt hot mot livsmedelstryggheten och skogsekosystemen. De orsakar uppskattningsvis 100 miljarder USD i ekonomiska förluster varje år1, varav de mest problematiska främst är rotknutnematoder, cystnematoder och tallvedsnematoder. Pinewoodnematoden, Bursaphelenchus xylophilus, är en migrerande, endoparasitisk nematod, som är den kausala patogenen av tallvisssjukdom2. Det har orsakat stor skada på tallskogar över hela världen3. Med hjälp av terminologin i Van Megen et al.4 är B. xylophilus medlem av Parasitaphelenchidae och tillhör klad 10, medan de flesta andra stora växtparasiter tillhör klad 12.
Som en oberoende och nyligen utvecklad växtparasit är B. xylophilus en attraktiv modell för jämförande studier. Hittills har det gjorts omfattande forskning om rotknutnematoder och cystnematoder som tillhör klad 12, som är obligatoriska, stillasittande endoparasiter och är några av de mest intensivt studerade nematoderna. Att bedriva ytterligare forskning inom detta viktiga område kommer dock med en stor utmaning: parasitismgenernas funktion är en flaskhals i forskningen. Funktionella studier inkluderar i allmänhet ektopiskt uttryck och knockdown / out-experiment men förlitar sig på effektiva genetiska transformationsprotokoll för nematoden. Som ett resultat är omvänd genetik i PPN nästan uteslutande beroende av gendämpning av RNAi.
RNAi, en mekanism som är allmänt närvarande i eukaryota celler, tystar genuttryck genom att införa dubbelsträngat RNA (dsRNA)5. Hittills har den posttranskriptionella gendämpningsmekanismen inducerad av dsRNA hittats i alla studerade eukaryoter, och RNAi-teknik, som ett verktyg för funktionell genomikforskning och andra applikationer, har utvecklats snabbt i många organismer. Sedan upptäckten av RNAi-maskineriet i Caenorhabditis elegans 19986 har RNAi-tekniker blivit effektiva metoder för att identifiera genfunktionen hos nematoder och föreslås som ett nytt sätt att effektivt kontrollera patogena nematoder7.
RNAi är tekniskt lättblöt ungarna i dsRNA kan räcka; Effekten och reproducerbarheten av detta tillvägagångssätt varierar dock mycket med nematodarten och målgenen8. Tystnaden av 20 gener som är involverade i RNAi-vägarna för rotknutnematoden, Meloidogyne incognita, undersöktes med långa dsRNA som utlösare, vilket resulterade i olika svar, inklusive en ökning och ingen förändring i uttrycket av vissa gener9. Dessa resultat visar att målgener kan reagera på RNAi-knockdown annorlunda, vilket kräver en uttömmande bedömning av deras lämplighet som mål för nematodkontroll via RNAi. Emellertid, Det finns för närvarande en brist på forskning om utvecklings- och reproduktionsbiologi av B. xylophilus.
Som en fortsättning på tidigare arbete10,11,12,13 beskriver vi här ett protokoll för att applicera RNAi för att studera funktionen hos ppm-1-genen hos B. xylophilus, inklusive syntesen av dsRNA, syntetisk neurostimulerande blötläggning och kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) detektion. Kunskapen från detta experimentella tillvägagångssätt kommer sannolikt att bidra markant till att förstå grundläggande biologiska system och förebygga tallviltsjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien godkändes av rådet för djurförsök vid Zhejiang Agricultural & Forestry University. B. xylophilus isolera NXY61 extraherades ursprungligen från en sjuk Pinus massoniana i Ningbo-området i Zhejiang-provinsen, Kina11.
1. Genkloning
OBS: Se materialförteckningen för detaljer om de primers som används i detta protokoll.
- Samla nematoder.
- Odla B. xylophilus stam på mycelia av Botrytis cinerea på potatis dextros agar (PDA) plattor vid 25 ° C i 3-5 dagar.
- Samla nematoderna med Bellman-trattmetoden14.
- Placera ett fastspänt gummirör under en tratt och placera två lager filterpapper i trattens mynning. Överför svampkulturerna till tratten och tillsätt vatten för att fördjupa svampmattan. Vänta i 2 h, samla sedan nematoderna.
- Extrahera det totala RNA från nematoderna med hjälp av ett totalt RNA-extraktionsreagens (se materialtabellen)11 enligt följande steg.
- Tillsätt 500 μl extraktionsreagens och 100 μl magnetiska pärlor till ett 2 ml centrifugrör. Aspirera 20 μl av nematoderna och överför provet till en kvarn för malning vid 9 000 × g i 30 s. Inkubera i 5 minuter och centrifugera sedan i 10 min vid 12 000 × g och 4 °C.
- Överför supernatanten till ett nytt centrifugrör. Tillsätt 100 μl kloroform, täck röret och blanda genom att invertera röret flera gånger. Inkubera i 3 minuter och centrifugera sedan i 10 min vid 12 000 × g vid 4 °C.
- Överför supernatanten till ett nytt centrifugrör. Tillsätt 250 μl isopropylalkohol och virvel kraftigt. Centrifugera vid 12 000 × g i 10 minuter.
- Kassera supernatanten. Tillsätt 500 μl 75% etanol för att tvätta RNA och virvla sedan provet. Centrifugera den i 5 minuter vid 12 000 × g och 4 °C.
- Lufttorka RNA-pelleten i 5 min.
- Återsuspendera pelleten i 30 μl RNas-fritt vatten.
- Beräkna RNA-koncentrationen med formeln: A260 × utspädning × 40 = μg RNA/ml. Beräkna förhållandet A260/A280.
OBS: Ett förhållande på ~ 2 anses vara rent.
- Utför omvänd transkription av RNA av god kvalitet för att erhålla cDNA-mallen.
- Designa och använd ett par specifika primers, ppm-1-F/R (se materialtabellen), för att förstärka den partiella kodningssekvensen för Bx-ppm-1-genen i B. xylophilus (GenBank-anslutningsnummer QTZ96795).
- Klona ppm-1-gensekvenserna i pGEM-Teasy-vektorn som innehåller T7-promotorn enligt ett standardkloningsprotokoll11.
- Ställ in PCR-reaktionerna enligt följande: 2 μL cDNA, 25 μL 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL av varje primer (10 pmol/l) och sterilt destillerat vatten till en slutlig volym av 50 μL.
- Utför förstärkningsproceduren enligt följande: 5 min vid 94 °C; följt av 35 cykler på 30 s vid 94 °C, 30 s vid 55 °C och 1 min vid 72 °C, och ett sista förlängningssteg vid 72 °C i 5 minuter.
- Klona de förstärkta produkterna till en pGEM-T Easy-vektor för sekvensering.
2. Syntes av dsRNA
- Förbered DNA-mallen för dsRNA-syntes med PCR med primers som är utformade för att lägga till T7-promotorplatser i båda ändar. Lägg till T7-promotorsekvensen i 5'-änden av primersna.
- Använd plasmiden som innehåller ppm-1-genfragmentet (894 bp) som mall för PCR och återställ fragmentet som innehåller T7-promotorn11. Använd PCR-proceduren och systemet som beskrivs ovan.
- Använd ett in vitro-transkriptionssats för att syntetisera dsRNA11.
- Tina de frusna reagenserna på is.
- Tillsätt 2 μl 10x reaktionsbuffert, 2 μl enzymblandning och 1 μg DNA till ett centrifugrör. Tillsätt nukleasfritt vatten för att producera en standard 4 μl reaktion. Blanda sedan lika stora volymer av de fyra ribonukleotidlösningarna (ATP, CTP, GTP och UTP) tillsammans och tillsätt 8 μL av blandningen till röret. Blanda noggrant och inkubera vid 37 °C i 4 timmar.
- Tillsätt 1 μl DNas, blanda väl och inkubera i 15 minuter vid 37 °C.
- Stoppa reaktionen och tillsätt 30 μl nukleasfritt vatten och 30 μl LiCl-utfällningslösning för att fälla ut RNA. Blanda noggrant. Inkubera vid -20 °C över natten.
- Centrifugera i 15 minuter vid 12 000 × g och 4 °C. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml 75% etanol för att tvätta RNA. Virvla provet och centrifugera det i 10 minuter vid 12 000 × g och 4 °C.
- Lufttorka RNA-pelleten i 3 min.
- Återsuspendera pelleten i 30 μl RNas-fritt vatten.
- Analysera kvaliteten på dsRNA med hjälp av en spektrofotometer. Pipettera 1 μL av dsRNA-provet på mätpiedestalen och ställ in våglängden till 340 nm. Visualisera produkterna på en 1,0% agarosgel.
3. RNAi genom blötläggning
- Blanda 4 μL 5x blötläggningsbuffert (0,05% gelatin, 5,5 mM KH 2 PO 4, 2,1 mM NaCl,4,7 mMNH4Cl, 3 mM spermidin) med dsRNA och ddH2O för att producera en total volym på 20 μL och en slutlig RNA-koncentration på 0,8 μg / ml.
- Skaffa J2 larver.
- Samla nematoderna från svampkulturerna och överför dem till en petriskål i glas 6 cm i diameter. Tillsätt 10 ml vatten i skålen för att säkerställa att nematoderna kan simma fritt. Håll nematoderna i skålen i 30 min och vänta tills äggen fäster vid botten.
- Ta bort vattnet och nematoderna försiktigt och se till att inte störa äggen. Upprepa stegen tills alla larver och vuxna har tagits bort och lämna bara äggen i skålen.
- Kläck de uppsamlade äggen i 24 timmar i mörker vid 25 °C för att få J2-larver. Samla J2-larverna, placera dem i ett rör och tvätta dem tre gånger med ddH2O för RNAi-experimentet15.
- Överför J2-larverna till 2 ml röret som innehåller dsRNA-lösningen och tillsätt resorcinollösning (insvept i tinfoil och upplöst i vatten) för att producera en slutlig koncentration av 1,0%. Inkubera larverna med centrifugering vid 15 × g på ett skakbord i 24 timmar vid 25 °C för att säkerställa att larverna effektivt absorberar dsRNA.
- Blötlägg samma mängd nematoder i blötläggningsbufferten utan dsRNA-sonden eller med en GFP dsRNA-sond som kontroll. Använd GFP-genen (gfp, M62653.1) som en icke-endogen kontroll och syntetisera dsRNA för gfp med hjälp av genspecifika primers T7-GFP-F/R.
4. qPCR-detektering
- Rengör J2-larverna medddH2O, inklusive de med målgeninterferens, GFP-geninterferens och den ostörda kontrollgruppen. Extrahera de totala RNA från varje grupp med hjälp av metoden som beskrivs ovan.
- Starta qPCR.
- Designa q-ppm-1-F/R-primers med önskad programvara (se materialförteckningen).
- Ställ in qPCR-reaktionen i 12 μl innehållande 1 μL cDNA, 6 μL fluorescerande förblandning, 0,4 μL av varje primer (10 pmol/l) och sterilt destillerat vatten.
- Utför qPCR enligt följande: 2 min vid 95 °C; följt av 40 cykler på 10 s vid 95 °C, 30 s vid 55 °C och 1 min vid 72 °C.
- Använd actb-genen (GenBank-anslutningsnummer EU100952) och tbb-2-genen (GenBank-anslutningsnummer MT769316) eller andra gener som interna referensgener för att utvärdera förändringarna i genuttrycksnivå efter RNAi15.
- Enligt cykeltröskelvärdet (Ct) och upplösningskurvan använder du 2-ΔΔCt-metoden för att uppskatta målgenens relativa uttrycksnivå och verifiera interferenseffektiviteten.
- Subtrahera Ct-värdet för den interna referensgenen för varje prov från Ct-värdet för målgenen för att erhålla ΔCt-värdet. Subtrahera sedan ΔCt-värdet för interferensgruppen från ΔCt-värdet för kontrollgruppen för att erhålla ΔΔCt-värdet.
OBS: Ett ΔΔCt-värde större än 0 indikerar att störningen är effektiv.
- Subtrahera Ct-värdet för den interna referensgenen för varje prov från Ct-värdet för målgenen för att erhålla ΔCt-värdet. Subtrahera sedan ΔCt-värdet för interferensgruppen från ΔCt-värdet för kontrollgruppen för att erhålla ΔΔCt-värdet.
5. Utvärdera kroppslängden hos nematodvuxna efter RNAi
- Efter RNAi, odla J2-larverna fram till vuxen ålder på B. cinerea-gräsmattor i PDA-plattor i 60 timmar vid 25 °C15.
- Samla de vuxna med Bellman-trattmetoden (se steg 1.1.2.1)14.
- Skaffa bilder av de vuxna nematoderna under ett mikroskop och använd ImageJ-programvara (eller annan mätprogramvara) för att mäta kroppslängderna.
- Mät längden med ImageJ genom att välja Analysera | Ställ in skala. Om avståndet är känt anger du längdvärdet för den ritade raka linjen. Ange längdenheten.
- Markera kryssrutan Global (använd den här standarden för alla bilder) och klicka på OK för att välja den längd som ska mätas med en rak linje på bilden som ska mätas.
- Använd kommandot Ctrl+M (mätning) för att visa resultaten och registrera dem i resultatfönstret .
- Ta mätningar av 50 manliga och 50 kvinnliga nematoder för statistisk analys12.
- Analysera data genom att beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för varje prov. Jämför medlen för proverna från de olika grupperna med hjälp av Students t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analys av ppm-1 uttryck av B. xylophilus efter RNAi
Den relativa uttrycksnivån för ppm-1-genen hos B. xylophilus indränkt med GFP dsRNA och den som blötläggs med målgenen dsRNA var 0,92 respektive 0,52 (ppm-1-genuttrycksnivån för den ddH2 O-behandlade kontrollgruppen sattes till 1) (Figur 1). Således har exogent dsRNA ingen effekt på ppm-1-uttrycket av B. xylophilus; ppm-1 dsRNA kan emellertid effektivt hämma uttrycket av målgenen.
Effekt av ppm-1 uttryck på tillväxt och utveckling av B. xylophilus
Efter RNAi minskade storleken på de vuxna markant (figur 2), vilket resulterade i SMA (liten kroppsstorlek) mutantfenotyp. Även om RNAi-behandlade individer utvecklades till sexuell mognad, var deras kroppslängd betydligt mindre än normala vuxna. Specifikt, efter RNAi i J2-stadium nematoder, var den genomsnittliga kroppslängden hos honor och män 544,61 μm respektive 526,24 μm. Däremot var den genomsnittliga kroppslängden för kvinnor och män i kontrollgruppen 971,86 μm respektive 912,31 μm (figur 3), vilket representerar signifikanta skillnader (P = 0,0322).
Figur 1: Uttryck av ppm-1-genen efter RNAi av Bursaphelenchus xylophilus. **P < 0,001. Förkortningar: RNAi = RNA-interferens; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Minskning av kroppslängd hos vuxna efter interferens av ppm-1 i Bursaphelenchus xylophilus. Bilder av en vuxen man (A) och kvinna (C) i RNAi-gruppen. Bilder av en vuxen man (B) och kvinna (D) i kontrollgruppen. Skalstänger = 50 μm. Förkortning: RNAi = RNA-interferens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvantifiering och statistisk analys av kroppslängden hos vuxna av Bursaphelenchus xylophilus efter RNAi av ppm-1-genen . (*P = 0,0322). Förkortning: RNAi = RNA-interferens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om livshistoria och parasitisk miljö av B. xylophilus skiljer sig från andra nematoder, Det har varit begränsad forskning om molekylär patogenes av denna växtpatogen. Trots stora framsteg som gjorts i tillämpningen av CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknik i C. elegans och andra nematoder, har endast RNAi-teknik som tillämpas på B. xylophilus publicerats hittills17. RNAi är ett av de mest kraftfulla verktygen som finns tillgängliga för att studera genfunktionen hos nematoder och har använts i stor utsträckning i forskning som belyser B. xylophilus genfunktion, signaltransduktionsvägar och genterapi18,19,20. Till skillnad från de genutslagningsmetoder som används i ryggradslösa modeller möjliggör RNAi-medierad knockdown av målgener i nematoder snabb utvärdering av genfunktionen.
Det finns tre sätt att genomföra RNAi i C. elegans: injektion 6, blötläggning21 ochmatning 6. Eftersom J2-larver endast matas efter infektion används blötläggningsmetoden vanligtvis för RNAi av växtparasitiska nematoder. Det viktigaste steget i blötläggningsmetoden är att tillsätta ett nervmedel för att stimulera nematoderna att mata. Urwin använde först oktopamin för att stimulera J2 hos två orala cystnematodarter, Globodera pallida och Heterodera glyciner, vilket resulterade i upptaget av dsRNA från blötläggningslösningen22. Samma metod har framgångsrikt använts för att inducera J2 av rotknutnematoden Meloidogyne incognita att absorbera dsRNA 23. Resorcinol kan också inducera upptaget av dsRNA av J2 av M. incognita och kan vara effektivare än oktopamin för denna nematod24. Dessutom förbättrade tillsatsen av spermidin till blötläggningsbufferten med en förlängd inkubationstid effektiviteten av RNAi i nematoder25. Efter 24 timmars blötläggning kommer dsRNA effektivt in i B. xylophilus och tystar därigenom ppm-1-genen.
Detta protokoll ger därför en referens för den framtida studien av RNAi hos andra växtparasitiska nematoder med fagocytosbeteende. Dessutom spelar upphängningseffekten av skakbordet en viktig roll för att maximera fördelen med blötläggningsmetoden. Denna metod kan möjliggöra samtidig behandling av ett stort antal nematoder. RNAi är lättare att använda när det är fokuserat på målgenerna för vilka mutanter inte lätt kan erhållas och för att utvärdera effekterna vid olika utvecklingspunkter eftersom nematoder kan blötläggas i alla livsstadier. Således kan RNAi användas för att studera funktionen hos en specifik gen vid ett specifikt utvecklingsstadium. analyserade påverkan av MAPK på fecunditeten hos B. xylophilus och dess viktiga roll i tillväxten och utvecklingen av nematoder med hjälp av dsRNA-blötläggning26. fann att migrationshastigheten och fecunditeten hos B. xylophilus i tallar minskade efter nedreglering av Bxpel1-genen, vilket indikerar att denna gen är en viktig patogen faktor för B. xylophilus27.
Men inte alla RNAi i nematoder fungerar genom dsRNA. Dulovic och Streit applicerade små störande RNA (siRNA) snarare än de längre dsRNA för att framgångsrikt störa Strongyloides ratti28. Begränsningen av att använda dsRNA för RNAi i Strongyloides kan relateras till frånvaron av gener som rsd-6, sid-1 eller sid-2 som är kända för att vara involverade i dsRNA-upptag. RNAi är också associerat med nackdelarna med en positionseffekt och tillfällig och ofullständig knockout och har begränsad effektivitet för vissa gener och celltyper (såsom neuroner)29. Men tills ett genombrott i den transgena tekniken för B. xylophilus uppnås representerar RNAi en relativt effektiv forskningsstrategi.
RNAi har visat stor potential för växtskydd. Med hjälp av RNAi-teknik har transgena potatisar som kan producera dsRNA som riktar sig mot rotknutnematodgener fötts upp för att producera fullständig resistens mot rotknutnematoder30. Uttryck av dsRNA som riktar sig mot insektsgener kan ge växtskydd i frånvaro av kemiska insekticider och erbjuder den ytterligare fördelen att inte producera främmande proteiner, med ett nästan obegränsat antal målgener31. Därför kommer accelererad forskning inom området tillämpat RNAi för skadedjursbekämpning att ge bättre biosäkerhet för växtnematodbekämpning än transgena metoder eller andra kemiska kontrollmetoder.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll beredningen av dsRNA av ppm-1-genen för att uppnå RNAi genom att direkt blötlägga larverna av B. xylophilus i dsRNA-lösning. Interferenseffekten bekräftades baserat på en signifikant minskning av larvernas kroppsstorlek efter att de utvecklats till vuxna jämfört med kontrollens, vilket visar att ppm-1-genen utövar effekter på tillväxten och utvecklingen av B. xylophilus. Denna studie ger en teoretisk grund för att ytterligare avslöja funktionen av ppm-1 med ytterligare praktiskt värde för att styra den biologiska kontrollen av denna växtparasit. Man tror att med ytterligare avslöjande och förbättring av RNAi-teknikmekanismen kommer dess tillämpning inom B. xylophilus-kontrollen att ha breda utsikter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarades.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) och finansierades gemensamt av Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
References
- Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).
- Kikuchi, T., et al. Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219 (2011).
- Megen, H. V., et al. A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences. Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).
- Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes. African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).
- Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).
- Marmonier, A., et al. In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266 (2019).
- Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes. Frontiers in Plant Science. 11, 328 (2020).
- Zhou, L. F., et al. Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pathology. 51 (1), 12647 (2021).
- Zhou, L. F., et al. The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).
- Tang, J., et al. Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).
- Wang, J. H., et al. Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Forestry Research. , (2021).
- Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications. Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).
- Zhu, N., et al. Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842 (2016).
- Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages. Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).
- Wang, M., et al. Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants. International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).
- Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference. Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).
- Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).
- Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215 (2019).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).
- Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).
- Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).
- Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).
- Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese). Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).
- Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125 (2016).
- Dulovic, A., Streit, A. RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705 (2019).
- Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. Research progress of gene editing technology. Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).
- Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection. Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).
- Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection. Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).
