엽록소 형광 분석에 의한 광호흡 돌연변이체의 광합성 효율 평가

농부의 밭에서 흔히 볼 수있는 비 생물 적 스트레스 조건은 광합성 효율을 감소시켜 작물 수확량에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 열파, 기후 변화, 가뭄 및 토양 염분과 같은 해로운 환경 조건은 CO₂ 가용성을 변경하고 높은 빛 스트레스에 대한 식물의 반응을 감소시키는 비 생물 적 스트레스를 유발할 수 있습니다. 가장 큰 두 개의 육상 탄소 플럭스는 식물 성장과 작물 수확량에 필수적인 광합성과 광호흡입니다. 이러한 과정에 관여하는 많은 중요한 단백질과 효소는 실험실 조건에서 특성화되었으며 유전 수준¹에서 확인되었습니다. 광합성과 광호흡을 이해하는 데 많은 진전이 있었지만 식물 세포 기관 간의 수송을 포함한 많은 단계가 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다 ^2,3.

광합성 후 식물에서 두 번째로 큰 탄소 플럭스 인 광호흡은 효소 Rubisco가 이산화탄소 대신 산소를 리불 로스 1,5 비스 포스페이트 (RuBP)에 고정시켜 억제 화합물 2- 포스 포 글리콜 레이트 (2PG)¹. 2PG의 억제 효과를 최소화하고 이전에 고정 된 탄소를 재활용하기 위해 C3 식물은 광호흡의 다중 세포 기관 과정을 진화 시켰습니다. 광호흡은 2PG의 두 분자를 3-포스포글리세레이트(3PGA)의 한 분자로 변환하여 C3 탄소 고정 주기¹에 다시 들어갈 수 있습니다. 따라서 광호흡은 75PG 생성에서 이전에 고정 된 탄소의 2 % 만 변환하고 그 과정에서 ATP를 소비합니다. 결과적으로, 광호흡 과정은 물 가용성 및 성장기 온도에 따라 광합성 과정에서 상당한 10%-50% 드래그입니다⁴.

광호흡에 관여하는 효소는 수십 년 동안 연구 초점의 영역이었지만 과정 ^5,6,7에 최소 25개의 수송 단계가 관련되어 있음에도 불구하고 유전적 수준에서 소수의 수송 단백질만 특성화되었습니다. 광호흡 과정에서 생성 된 탄소의 이동에 직접 관여하는 두 가지 수송 단백질은 색소체 글리콜 레이트 / 글리세 레이트 수송 체 PLGG1과 담즙산 나트륨 symporter BASS6이며, 둘 다 엽록체 ^5,6에서 글리콜 레이트의 수출에 관여합니다.

주변 [_CO2]하에서, 루비스코는 산소 분자^{를 시간의 약} 20%의 RuBP에 고정시킨다1. 식물이 낮은 [CO2]에 노출되면 광호흡 속도가 증가하여 낮은 [_CO2]가 높은 광호흡 스트레스 하에서 중요할 수 있는 돌연변이를 테스트하기에 이상적인 환경이 됩니다. 24시간 동안 낮은_CO2 하에서 추가적인 추정 엽록체 수송 단백질 T-DNA 라인을 테스트하고 엽록소 형광의 변화를 측정하여 광호흡 돌연변이 표현형⁵를 입증한 bass6-1 식물 라인을 식별했습니다. 추가 특성화는 BASS6가 엽록체의 내막에있는 글리콜 레이트 수송 체임을 입증했습니다.

이 논문은 엽록체 막 내에 위치한 추정 수송 단백질 목록에서 나온 BASS6를 광호흡 수송체로 식별하기 위해 처음에 사용 된 것과 유사한 프로토콜을 자세히 설명합니다.⁸ 이 프로토콜은 열과 같은 다양한 비 생물 적 스트레스 하에서 광합성 효율을 유지하는 데 중요한 유전자를 식별하는 방법으로 Arabidopsis T-DNA 돌연변이 체 또는 EMS 생성 돌연변이 식물을 특성화하는 고 처리량 실험에 사용될 수 있습니다. 높은 가벼운 스트레스, 가뭄 및 CO₂ 가용성. 엽록소 형광을 이용한 식물 돌연변이체 스크리닝은 1차 대사에 중요한 유전자를 신속하게 식별하기 위해 과거에 사용되어^{왔습니다9.} Arabidopsis 게놈의 30 %가 알려지지 않았거나 잘 특성화되지 않은 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고 있기 때문에 광합성 효율의 스트레스 유도 분석은 돌연변이 식물¹⁰에서 통제 된 조건에서 관찰되지 않은 분자 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 방법의 목표는 낮은_CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡 경로의 돌연변이체를 확인하는 것이다. 우리는 낮은_CO2에 노출 된 후 광호흡을 방해하는 돌연변이를 확인하는 방법을 제시합니다. 이 방법의 장점은 비교적 짧은 시간에 수행 할 수있는 묘목에 대한 고 처리량 스크리닝이라는 것입니다. 비디오 프로토콜 섹션은 종자 준비 및 살균, 식물 성장 및 낮은_CO2 처리, 형광 이미징 시스템의 구성, 처리된 샘플의 양자 수율 측정, 대표 결과 및 결론에 대한 세부 정보를 제공합니다.

1. 종자 준비 및 살균

알림: 종자 준비는 종자 흡수와 종자 살균으로 구성됩니다. 이러한 모든 단계는 멸균 상태를 유지하기 위해 층류 후드에서 수행되어야한다는 점에 유의해야합니다. 필요한 모든 재료, 시약 및 성장 배지는 오토클레이브되어야 합니다( 재료 표 참조).

1. 종자 흡수 및 층화
   참고: 사용된 시드 라인은 plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) 및 와일드형(WT, Col-0)입니다.
   1. 씨앗을 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 분주합니다. 층류 후드의 멸균 된 물에 씨앗을 흡수하고 어둠 속에서 4 ° C에서 2 일 동안 층화합니다.
2. 종자 살균
   1. 멸균 조건에서 50%(v/v) 표백제 용액 10mL를 준비하고 트윈 20 약 20μL를 추가합니다. 종자 살균을 위해 흡수 된 종자에서 물을 제거하고 표백제 용액 1mL를 미세 원심 분리기 튜브에 넣고 실온에서 5 분 동안 배양합니다.
   2. 피펫으로 표백제를 제거하십시오.
   3. 씨앗을 멸균수 1mL로 헹구어 재현탁합니다. 씨앗이 바닥에 가라 앉으면 물을 제거하십시오. 1.6단계와 1.7단계를 7번 반복합니다.
   4. 종자를 멸균 된 0.1 % 아가 로스 용액에 재현 탁시킨다.
3. 종자 도금
   1. 증류수 500mL에 분말 5.43g을 첨가하여 비타민과 1.0g/L의 2-(N-모르포니오)에탄술폰산(MS)이 함유된 1L 부피의 Murashige & Skoog 기초 배지를 만듭니다. 수산화 칼륨 (KOH)을 사용하여 pH를 5.6에서 5.8 사이로 조정하십시오. 증류수를 사용하여 1L까지 채 웁니다.
      1. 액체 용액을 500mL로 나누고 각 반쪽을 자석 교반 막대가 들어 있는 1L 플라스크에 넣습니다. 한천 분말 5g을 추가하여 각 플라스크에 대해 1% 한천 w/v 용액을 얻습니다.
      2. 121°C 및 15psi에서 30분 동안 오토클레이브; 그런 다음 천천히 저으면서 실온에 두십시오. 냉각되면 MS 한천 25mL를 정사각형 페트리 접시에 붓습니다. 굳어지도록 허용하십시오.
         참고: 이 Murashige & Skoog 기초 배지 플레이트에는 비타민이 함유된 1% MS 배지와 테스트 돌연변이체 배양을 위한 1% 한천이 포함되어 있습니다.
   2. 면도날로 200μL 피펫 팁을 자릅니다. 200μL 마이크로피펫을 사용하여 정사각형 MS 플레이트(그림 1)의 각 테스트 돌연변이체 또는 유전자형(1cm² 정사각형)에 대해 지정된 정사각형 그리드의 중앙에 하나의 시드를 놓습니다.
      참고: 1cm x 1cm 정사각형 그리드는 묘목 사이의 균일한 거리를 유지하고 겹치는 것을 방지하는 데 도움이 되며, 이는 나중에 형광 이미징 및 분석에 중요합니다.
   3. 씨앗이 도금되면 뚜껑 주위에 수술 용 테이프로 감싸서 밀봉하고 아래 설명 된 조건으로 성장 챔버에 놓습니다.

2. 식물 성장 및 낮은_CO2 처리

1. 120 μmol·^{m-2 s-1}의 8시간 빛 주기와 18 °C에서 16시간의 어둠 속에서 20°C에서 7-9일 동안 식물을 재배합니다. 6 일째에 식물을 확인하여 이미징하기에 충분히 큰지 확인하십시오. 도금 후 8 일째에 식물을 낮은_CO2에 노출시킵니다.
2. 낮은 CO₂ 처리
   1. 7-9 일 후, 주변 성장 챔버 조건에서 8 개의 플레이트 중 4 개를 20 ° C의 광호흡 조건, 200 μmol · m-2 ^s-1의 연속 광 수준 및 12 시간 동안 낮은 CO ²에 놓습니다.
   2. 용기의 바닥에 100g의 소다 석회를 놓은 밀폐 된 투명 용기를 사용하여 낮은 CO₂ 조건을 구성하십시오. 용기를 대조군과 동일한 성장 챔버 내에 놓습니다. 제어 플랜트를 120 시간 동안 주변 CO 2에서₂ μmol · m-1 ^s-1미만으로 유지하십시오.

3. 형광 이미징 시스템 구성

1. 형광 이미징 시스템에서 고정된 거리에 카메라 아래 중앙에 테스트 플레이트(섹션 1 및 섹션 2에 따라 준비됨)를 놓습니다.
2. 계측기 소프트웨어 내에서 라이브 창 으로 이동하고 깜박임 상자를 선택하여 비화학선 측정 플래시를 켭니다.
3. 완전하고 선명한 이미지가 표시될 때까지 확대/축소 및 초점 도구를 클릭합니다. 이를 위해 무대 나 선반을 사용하여 식물과 카메라 사이의 거리를 조정하십시오. 전체 실험 동안 확대/축소, 초점 및 카메라와의 거리를 일정하게 유지합니다.
4. El. 셔터 값을 0으로 설정하고 감도를 조정하여 200-500 디지털 단위 범위의 형광 신호를 얻습니다.
   참고: 셔터 값(0-1)이 낮을수록 측정 플래시가 무광체가 되고 값(2)이 높을수록 이미지 해상도가 향상됩니다.
5. 카메라 설정을 조정하는 데 사용된 것과 동일한 위치에 조도계를 놓습니다.
6. 라이브 창에서 슈퍼 상자를 선택하여 800ms 동안 지속되는 포화 펄스를 시작합니다. 매번 새 펄스가 있는지 확인란을 선택하는 것을 잊지 마십시오.
7. 슬라이더를 사용하여 조도계가 6,000-8,000 μmol·m−²s⁻¹을 읽을 때까지 슈퍼 펄스의 상대 전력 백분율을 조정합니다.

4. 양자 수율 프로그램 설계

1. 이미징 시스템을 위한 표준 운영 도구를 가져옵니다.
   기본값 포함
   라이트.inc 포함
   참고: 이 실험에서 참조용으로 사용된 프로그램 구문은 FluorCam 이미징 시스템용입니다.
2. 구성된 조명 설정에 따라 다음 전역 변수를 정의합니다.
   셔터 = 0
   민감도 = 40
   슈퍼 = 65
3. 데이터 로깅을 위한 시간 단계를 포함합니다.
   TS = 20ms
4. 어두운 적응 상태에서 형광을 샘플링하여 Fo 측정값을 수집합니다.
   F0지속 시간 = 2초;
   F0기간 = 200ms;
   참고: F0duration 은 어둠에 적응된 형광이 기록되는 시간 범위를 정의합니다. F0period 는 다크 적응 형광 측정이 반복되는 시간 간격을 정의합니다.
5. Fo 측정값을 데이터 테이블에 기록합니다.
   <0,F0기간.. F0duration>=>mfmsub
   <0s>->checkpoint,"startFo"
   =>체크포인트,"엔드포";
   여기서 < , > 는 시간에 의해 인덱싱된 형광 값의 세트를 나타내고; =>는 측정값을 시스템 파일에 저장합니다. MFMSUB 는 실험에 대한 전체 데이터 세트를 나타냅니다. 체크포인트 는 startFo와 같은 특정 측정값의 데이터에 대한 하위 집합을 만듭니다.
6. Fm 측정값을 수집하여 포화 펄스 후에 형광을 샘플링하여 저장한다.
   펄스 지속 시간 = 960ms; ##
   a1=F0기간 + 40ms
   a2 = a1 + 480ms;
   =>SatPulse(PulseDuration);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>체크포인트,"시작Fm"
   =>체크포인트,"endFm"
   =>체크포인트,"타임비주얼";
   여기서 a1 및 a2 는 포화 펄스와 샘플링 시간을 조정하는 변수입니다. a1 은 Fm 측정의 시작 시간을 나타내고; A2 는 펄스의 중간 시점 시간을 나타냅니다.

5. 처리된 샘플의 양자 수율 측정

1. 치료 직후, 어두운 적응을 위해 15 분 동안 알루미늄 호일로 판을 덮으십시오. 호일을 제거하여 펄스 진폭 수정 형광계로 광계 II의 양자 수율을 측정했습니다. 그런 다음 묘목 플레이트를 카메라 바로 아래에 놓고 GitHub 리포지토리에 있는 퀀텀 수율 프로토콜을 실행합니다.
2. GitHub(https://github.com/South-lab/fluorescent-screen)에서 quantum_yield 프로토콜을 다운로드하거나 섹션 4에서 유사하게 설계된 프로그램을 사용합니다. 형광계의 소프트웨어를 사용하여 폴더 아이콘을 클릭하고 파일 위치로 이동하여 프로그램 파일을 엽니 다.
3. 빨간색 번개 아이콘을 클릭하여 양자 수율 프로그램을 실행합니다.
4. 프로토콜이 완료되면 사전 분석 창으로 이동합니다. 선택 도구를 사용하여 플레이트 이미지에서 각 묘목의 모든 픽셀을 강조 표시하여 플레이트를 개별 묘목으로 분할합니다. 배경 제외를 클릭하여 강조 표시된 배경 픽셀을 제거하고 묘목 영역만 남깁니다.
5. 분석을 클릭하여 플레이트 이미지의 각 묘목에 대한 형광 데이터를 생성합니다. 형광 값 범위를 수동으로 조정하여 모든 플레이트에서 일관된 최소값과 최대값을 표시합니다.
6. 클릭 수치-평균 탭에서 실험 | 수출 | 숫자. 모든 데이터 및 열별을 선택하고 확인을 클릭하여 각 묘목에 대한 QY 측정값이 포함된 텍스트 파일을 생성합니다.

6. 데이터 파일 열기

1. 분석을 위해 스프레드시트에서 텍스트 파일을 엽니다. 영역 번호, 픽셀 크기, Fm, Ft, Fq 및 QY를 나타내는 제목 중에서 핵심 유전자형(WT 또는 테스트 돌연변이체) 및 QYmax에 대한 영역 번호를 식별합니다. 유의성을 확인하기 위해 야생형에 대해 쌍별 t-검정을 수행합니다. 데이터는 p-값이 0.05 미만일 때 유의하게 다른 것으로 해석됩니다.

결과는 WT 및 시험 돌연변이체의 주변 및 낮은CO2 스크리닝으로부터의 원시 및 형광 이미지의 플레이트 이미지를 보여준다. 각 묘목은 면적 번호로 표시되어 있으며 해당 형광 판독값은 QY로 제공됩니다. 데이터는 텍스트 파일로 내보내지고 분석을 위해 스프레드시트에서 열 수 있습니다(보충 표 S1 참조). 돌연변이 라인 plgg1-1 및 abcb26은 광호흡 스트레스와 관련된 유전자의 양성 및 음성 동정을 입증하기 위해 선택되었습니다. PLGG1은 RuBP6의 산소화 후 경로의 첫 번째 수송 체를 코딩하는 반면, ABCB26은 광호흡11에 관여하는 것으로 알려지지 않은 항원 수송 체를 코딩하는 것으로 생각됩니다. WT 및 돌연변이체의 어두운 적응 Fv/Fm QY 효율은 상자 및 수염 플롯으로 시각화됩니다. WT와 검정 돌연변이체 간의 통계적 차이를 검정하기 위해, p-값 < 0.05와 함께 쌍별 t-검정을 사용하였다. 여기에서는 QY Fv/Fm이 감소된 광호흡 돌연변이 라인을 테스트 돌연변이체로 사용하여 스크리닝 방법의 효율성을 확인했습니다. 결과는 시험 돌연변이체가 WT보다 상당히 낮은 QY 효율을 갖는다는 것을 보여준다. 도 3B는 plgg1-1에 대한 가변 대 최대 형광(Fv/Fm)의 비율의 유의한 감소를 보여주지만, 낮은CO2에서 abcb26은 그렇지 않다. 이러한 결과는 광호흡에 관여하는 수송체로서의 PLGG1의 역할과 일치하는 반면, abcb26은 낮은CO2 조건하에서 WT 대조군과 상이한 표현형을 나타내지 않는다. 따라서, 이러한 스크리닝 방법은 낮은CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡 돌연변이체를 확인할 수 있다.

그림 1: 시드 플레이트 레이아웃의 개략도 예. 6개의 시드가 연속으로 배치된 두 개의 기술 복제가 표시됩니다. 돌연변이 종자 위에 놓인 WT 대조군 종자. 약어 : WT = 야생형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 9일 된 묘목의 어두운 적응 Fv/Fm 이미지. 야생형 대조군은 주변 및 낮은CO2에서 T-DNA 돌연변이 라인과 비교된다. 색상 스케일은 각 묘목의 평균 Fv / Fm 을 나타냅니다. 스케일 바 = 1cm. 약어: Fv/Fm = 최대 형광에 대한 가변 형광의 비율; WT = 야생형; PLGG1-1 = 색소체 글리콜 레이트 / 글리세 레이트 트랜스 로케이터 1; abcb26 = ATP 바인딩 카세트 B26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 형광 관찰. (A) 주변 및 (B) 낮은 CO2 조건에서 묘목에 대한 최대 양자 수율 (Fv / Fm) 측정. 상자는 내부 사분위수 사이의 범위를 나타내고, 상자 안의 선은 중위수를 나타내며, 수염은 최대 관측치와 최소 관측치를 나타냅니다. * WT에 상대적인 쌍별 t-검정에 기초한 유의한 차이를 나타냄(n > 44, p < 0.05; 보충 표 S2). 약어: Fv/Fm = 최대 형광에 대한 가변 형광의 비율; WT = 야생형; PLGG1-1 = 색소체 글리콜 레이트 / 글리세 레이트 트랜스 로케이터 1; abcb26 = ATP 바인딩 카세트 B26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1 : 실험에 사용 된 모든 묘목 플레이트에서 수집 된 형광 데이터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S2: 통계는 야생형과 두 돌연변이 유전자형 간의 t-검정에서 보고됩니다. 돌연변이체는 p-값이 0.05보다 낮을 때 야생형과 유의하게 다른 것으로 간주된다. 표 A 는 주변CO2에서 재배된 식물에 대해 수행된 t-검정을 나타내고, 표 B 는 낮은CO2에서 재배된 식물에 대해 수행된 t-검정을 나타낸다. t-검정: 동일한 분산을 가정한 2표본. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계나 이해 상충이 없습니다.