Summary
हम क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस का उपयोग करके कम सीओ2 के साथ उपचार के बाद पौधों में प्रकाश संश्लेषक दक्षता में परिवर्तन को मापने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।
Abstract
प्रकाश संश्लेषण और फोटोरेस्पिरेशन पौधे के प्राथमिक चयापचय में सबसे बड़े कार्बन फ्लक्स का प्रतिनिधित्व करते हैं और पौधे के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं। प्रकाश संश्लेषण और फोटोरेस्पिरेशन के लिए महत्वपूर्ण कई एंजाइमों और जीनों का दशकों से अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, लेकिन इन जैव रासायनिक मार्गों के कुछ पहलुओं और कई उपकोशिकीय प्रक्रियाओं के साथ उनके क्रॉसस्टॉक को अभी तक पूरी तरह से समझा नहीं गया है। पौधे के चयापचय में महत्वपूर्ण जीन और प्रोटीन की पहचान करने वाले अधिकांश काम अत्यधिक नियंत्रित वातावरण के तहत आयोजित किए गए हैं जो प्राकृतिक और कृषि वातावरण के तहत प्रकाश संश्लेषण और फोटोरेस्पिरेशन कार्य कैसे करते हैं, इसका सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं। यह देखते हुए कि अजैविक तनाव के परिणामस्वरूप बिगड़ा हुआ प्रकाश संश्लेषक दक्षता होती है, एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन का विकास जो अजैविक तनाव और प्रकाश संश्लेषण पर इसके प्रभाव दोनों की निगरानी कर सकता है, आवश्यक है।
इसलिए, हमने प्रकाश संश्लेषक दक्षता में अजैविक तनाव-प्रेरित परिवर्तनों की जांच करने के लिए एक अपेक्षाकृत तेज़ विधि विकसित की है जो क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस विश्लेषण और कम सीओ 2 स्क्रीनिंग का उपयोग करके फोटोरेस्पिरेशन में भूमिकाओं के साथ अज्ञात जीनकी पहचान कर सकती है। यह पेपर एराबिडोप्सिस थैलियाना में स्थानांतरित डीएनए (टी-डीएनए) नॉकआउट म्यूटेंट में प्रकाश संश्लेषक दक्षता में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इसी विधि का उपयोग एथिल मीथेनसल्फोनेट (ईएमएस) -प्रेरित उत्परिवर्ती या शमन स्क्रीनिंग की स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है। इस पद्धति का उपयोग करने से पौधे के प्राथमिक चयापचय और अजैविक तनाव प्रतिक्रियाओं में आगे के अध्ययन के लिए जीन उम्मीदवारों की पहचान की जा सकती है। इस पद्धति से डेटा जीन फ़ंक्शन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है जिसे बढ़े हुए तनाव वातावरण के संपर्क में आने तक पहचाना नहीं जा सकता है।
Introduction
आमतौर पर किसान के खेतों में देखी जाने वाली अजैविक तनाव की स्थिति प्रकाश संश्लेषक दक्षता को कम करके फसल की पैदावार को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है। हानिकारक पर्यावरणीय परिस्थितियां जैसे गर्मी की लहरें, जलवायु परिवर्तन, सूखा और मिट्टी की लवणता अजैविक तनाव पैदा कर सकती है जो सीओ2 उपलब्धता को बदल देती है और उच्च प्रकाश तनाव के लिए पौधे की प्रतिक्रिया को कम करती है। दो सबसे बड़े स्थलीय कार्बन फ्लक्स प्रकाश संश्लेषण और फोटोरेस्पिरेशन हैं, जो पौधे के विकास और फसल की पैदावार के लिए आवश्यक हैं। इन प्रक्रियाओं में शामिल कई महत्वपूर्ण प्रोटीन और एंजाइमों को प्रयोगशाला स्थितियों के तहत विशेषता दी गई है और आनुवंशिक स्तर 1 पर पहचाना गयाहै। यद्यपि प्रकाश संश्लेषण और फोटोरेस्पिरेशन को समझने में बहुत प्रगति हुई है, पौधों के ऑर्गेनेल के बीच परिवहन सहित कई कदम अज्ञात हैं।
प्रकाश संश्लेषण के बाद पौधों में दूसरा सबसे बड़ा कार्बन प्रवाह, फोटोरेस्पिरेशन तब शुरू होता है जब एंजाइम रूबिस्को कार्बन डाइऑक्साइड के बजाय ऑक्सीजन को रिबुलोज 1,5 बिस्फोस्फेट (आरयूबीपी) में ठीक करता है, जिससे निरोधात्मक यौगिक 2-फॉस्फोग्लाइकोलेट (2पीजी)1 उत्पन्न होता है। 2पीजी के निरोधात्मक प्रभावों को कम करने और पहले से तय कार्बन को रीसायकल करने के लिए, सी 3 पौधों ने फोटोरेस्पिरेशन की बहु-ऑर्गेनेलर प्रक्रिया विकसित की है। फोटोरेस्पिरेशन 2पीजी के दो अणुओं को 3-फॉस्फोग्लिसरेट (3पीजीए) के एक अणु में परिवर्तित करता है, जो सी 3 कार्बन निर्धारण चक्र1 में फिर से प्रवेश कर सकता है। इस प्रकार, फोटोरेस्पिरेशन केवल 2पीजी की पीढ़ी से पहले से तय कार्बन के 75% को परिवर्तित करता है और इस प्रक्रिया में एटीपी का उपभोग करता है। नतीजतन, फोटोरेस्पिरेशन की प्रक्रिया पानी की उपलब्धता और बढ़तेमौसम के तापमान के आधार पर प्रकाश संश्लेषक प्रक्रिया पर एक महत्वपूर्ण 10% -50% ड्रैग है।
फोटोरेस्पिरेशन में शामिल एंजाइम दशकों से अनुसंधान फोकस का एक क्षेत्र रहे हैं, लेकिन आनुवंशिक स्तर पर केवल थोड़ी संख्या में परिवहन प्रोटीन की विशेषता है, भले ही प्रक्रिया 5,6,7 में कम से कम25 परिवहन चरण शामिल हों। दो परिवहन प्रोटीन जो सीधे फोटोरेस्पिरेशन प्रक्रिया में उत्पन्न कार्बन के आंदोलन में शामिल होते हैं, वे प्लास्टिडिक ग्लाइकोलेट / ग्लाइसरेट ट्रांसपोर्टर पीएलजीजी 1 और पित्त एसिड सोडियम सिम्पोरेटर बीएएसएस 6 हैं, जो दोनों क्लोरोप्लास्ट 5,6 से ग्लाइकोलेट के निर्यात में शामिल हैं।
परिवेश [सीओ2] के तहत, रूबिस्को एक ऑक्सीजन अणु को आरयूबीपी में लगभग 20% समय 1 में ठीक करताहै। जब पौधों को कम [सीओ2] के अधीन किया जाता है, तो फोटोरेस्पिरेशन की दर बढ़ जाती है, जिससे कम [सीओ2] उत्परिवर्ती के लिए परीक्षण करने के लिए एक आदर्श वातावरण बन जाता है जो ऊंचा फोटोरेस्पिरेशन तनाव के तहत महत्वपूर्ण हो सकता है। 24 घंटे के लिए कम सीओ 2 के तहत अतिरिक्त कथित क्लोरोप्लास्ट परिवहन प्रोटीन टी-डीएनए लाइनों का परीक्षण और क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस में परिवर्तन को मापने से बास 6-1 पौधे लाइनों की पहचान हुई जो एक फोटोरेस्पिरेशन उत्परिवर्ती फेनोटाइप5 का प्रदर्शन करते थे। आगे के लक्षण वर्णन से पता चला है कि बीएएसएस 6 क्लोरोप्लास्ट की आंतरिक झिल्ली में एक ग्लाइकोलेट ट्रांसपोर्टर है।
यह पेपर एक प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करता है जो शुरू में बीएएसएस 6 को फोटोरेस्पिरेशन ट्रांसपोर्टर के रूप में पहचानने के लिए उपयोग किया गया था, जो क्लोरोप्लास्ट झिल्ली के भीतर स्थित कथित परिवहन प्रोटीन की एक सूची से आया था8 इस प्रोटोकॉल का उपयोग एराबिडोप्सिस टी-डीएनए उत्परिवर्ती या ईएमएस-जनित उत्परिवर्ती पौधों की विशेषता वाले उच्च-थ्रूपुट प्रयोग में किया जा सकता है, जो गर्मी जैसे अजैविक तनावों की एक श्रृंखला के तहत प्रकाश संश्लेषक दक्षता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण जीन की पहचान करने का एक तरीका है। उच्च प्रकाश तनाव, सूखा, और सीओ2 उपलब्धता। क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस का उपयोग करके स्क्रीनिंग प्लांट म्यूटेंट का उपयोग अतीत में प्राथमिक चयापचय के लिए महत्वपूर्ण जीन की तेजी से पहचान करने के लिए किया गयाहै। एराबिडोप्सिस जीनोम के 30% तक जीन होते हैं जो अज्ञात या खराब विशेषता वाले कार्य के प्रोटीन के लिए कोड करते हैं, प्रकाश संश्लेषक दक्षता का तनाव-प्रेरित विश्लेषण उत्परिवर्तीपौधों में नियंत्रित परिस्थितियों में नहीं देखे गए आणविक कार्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इस विधि का लक्ष्य कम सीओ2 स्क्रीनिंग का उपयोग करके फोटोरेस्पिरेटरी मार्ग के उत्परिवर्ती की पहचान करना है। हम उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो कम सीओ2 के संपर्क में आने के बाद फोटोरेस्पिरेशन को बाधित करते हैं। इस विधि का एक लाभ यह है कि यह रोपाई के लिए एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग है जिसे अपेक्षाकृत कम समय में किया जा सकता है। वीडियो प्रोटोकॉल अनुभाग बीज तैयार करने और नसबंदी, पौधे की वृद्धि और कम सीओ2 उपचार, प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली के विन्यास, उपचारित नमूनों की क्वांटम उपज का माप, प्रतिनिधि परिणाम और निष्कर्ष पर विवरण प्रदान करते हैं।
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Protocol
1. बीज तैयार करना और नसबंदी
नोट: बीज तैयार करने में बीज आत्मसात और बीज नसबंदी शामिल है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन सभी चरणों को बाँझ स्थितियों को बनाए रखने के लिए एक लामिनार प्रवाह हुड में किया जाना है। सभी आवश्यक सामग्री, अभिकर्मकों और विकास मीडिया को आटोक्लेव किया जाना चाहिए ( सामग्री की तालिका देखें)।
- बीज का अवशोषण और स्तरीकरण
नोट: उपयोग की जाने वाली बीज लाइनें plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232), और जंगली प्रकार (WT, Col-0) हैं।- बीज को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में वितरित करें। बीजों को बाँझ पानी में एक लामिनार प्रवाह हुड में आत्मसात करें और 2 दिनों के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर करें।
- बीज नसबंदी
- बाँझ परिस्थितियों में, 50% (v / v) ब्लीच समाधान का 10 एमएल तैयार करें और लगभग 20 μL ट्वीन 20 जोड़ें। बीज नसबंदी के लिए, आत्मसात बीज से पानी निकालें, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1 एमएल ब्लीच घोल जोड़ें, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
- पिपेट से ब्लीच का घोल निकालें।
- बीज को 1 एमएल बाँझ पानी में फिर से चार्ज करने के लिए धो लें। बीज के तल पर बसने के बाद पानी निकालें। चरण 1.6 और चरण 1.7 को सात बार दोहराएं।
- बीज को बाँझ 0.1% एगारोस घोल में पुन: निलंबित करें।
- बीज चढ़ाना
- 500 एमएल आसुत जल में 5.43 ग्राम पाउडर जोड़कर विटामिन के साथ मुराशिगे और स्कूग बेसल मीडियम की 1 एल मात्रा और 2-(एन-मोरफोनियो) ईथेनसल्फोनिक एसिड (एमएस) का 1.0 ग्राम / एल बनाएं। पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (KOH) का उपयोग करके पीएच को 5.6 से 5.8 के बीच समायोजित करें। आसुत जल का उपयोग करके 1 लीटर तक भरें।
- तरल घोल को 500 एमएल में विभाजित करें और प्रत्येक आधे हिस्से को चुंबकीय हलचल पट्टी वाले 1 एल फ्लास्क में रखें। प्रत्येक फ्लास्क के लिए 1% एगर डब्ल्यू / वी समाधान प्राप्त करने के लिए 5 ग्राम अगर पाउडर जोड़ें।
- 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 15 पीएसआई पर ऑटोक्लेव; फिर, धीरे-धीरे हिलाते हुए कमरे के तापमान पर रखें। ठंडा होने पर, एक चौकोर पेट्री डिश में 25 एमएल एमएस एगर डालें। इसे जमने दें।
नोट: इन मुराशिगे और स्कूग बेसल मीडियम प्लेटों में विटामिन के साथ 1% एमएस माध्यम और परीक्षण उत्परिवर्ती की खेती के लिए 1% आगर होता है।
- रेजर ब्लेड के साथ एक 200 μL पिपेट टिप काटें। 200 μL माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एक वर्ग एमएस प्लेट (चित्रा 1) के प्रत्येक परीक्षण उत्परिवर्ती या जीनोटाइप (1 सेमी 2 वर्ग) के लिए नामित वर्ग ग्रिड के केंद्र में एक बीज रखें।
नोट: 1 सेमी x 1 सेमी वर्ग ग्रिड रोपाई के बीच एक समान दूरी रखने और ओवरलैपिंग से बचने में मदद करता है, जो बाद में फ्लोरेसेंस इमेजिंग और विश्लेषण में महत्वपूर्ण होगा। - एक बार जब बीज चढ़ा दिए जाते हैं, तो सील करने के लिए ढक्कन के चारों ओर सर्जिकल टेप के साथ लपेटें, और इसे नीचे वर्णित स्थितियों में विकास कक्ष में रखें।
- 500 एमएल आसुत जल में 5.43 ग्राम पाउडर जोड़कर विटामिन के साथ मुराशिगे और स्कूग बेसल मीडियम की 1 एल मात्रा और 2-(एन-मोरफोनियो) ईथेनसल्फोनिक एसिड (एमएस) का 1.0 ग्राम / एल बनाएं। पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (KOH) का उपयोग करके पीएच को 5.6 से 5.8 के बीच समायोजित करें। आसुत जल का उपयोग करके 1 लीटर तक भरें।
2. पौधे की वृद्धि और कम सीओ2 उपचार
- पौधों को 7-9 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 120 μmol.m-2 s-1के 8 घंटे के प्रकाश चक्र और 18 °C पर 16 घंटे के अंधेरे के तहत उगाएं। यह निर्धारित करने के लिए 6 वें दिन पौधों की जांच करें कि क्या वे इमेजिंग के लिए पर्याप्त बड़े हैं। चढ़ाना के बाद 8 वें दिन, पौधों को कम सीओ2 के लिए उजागर करें।
- कम सीओ2 उपचार
- 7-9 दिनों के बाद, परिवेश विकास कक्ष की स्थितियों से आठ प्लेटों में से चार को 20 डिग्री सेल्सियस की फोटोरेस्पिरेटरी स्थितियों में रखें, 200 μmol.m-2 s-1के निरंतर प्रकाश स्तर, और 12 घंटे के लिए कमCO2 ।
- कंटेनर के तल में रखे 100 ग्राम सोडा चूने के साथ एक एयरटाइट पारदर्शी कंटेनर का उपयोग करके कम सीओ2 स्थिति का निर्माण करें। कंटेनर को नियंत्रण के समान विकास कक्ष के भीतर रखें। नियंत्रण संयंत्रों को 12 घंटे के लिए परिवेश CO2 में 120 μmol.m-2 s-1 के तहत रखें।
3. फ्लोरेसेंस इमेजिंग सिस्टम को कॉन्फ़िगर करना
- फ्लोरेसेंस इमेजिंग सिस्टम में एक निश्चित दूरी पर कैमरे के नीचे केंद्रित एक परीक्षण प्लेट (खंड 1 और खंड 2 के अनुसार तैयार) रखें।
- उपकरण के सॉफ्टवेयर के भीतर, लाइव विंडो पर नेविगेट करें और गैर-एक्टिनिक मापने वाले फ्लैश पर स्विच करने के लिए बॉक्स फ्लैश की जांच करें।
- जूम और फोकस टूल पर तब तक क्लिक करें जब तक कि एक पूर्ण और तेज छवि दिखाई न दे। इसके लिए, पौधों और कैमरे के बीच की दूरी को समायोजित करने के लिए एक मंच या शेल्फ का उपयोग करें। पूरे प्रयोग के लिए ज़ूम, फोकस और कैमरे से दूरी को स्थिर रखें।
- शटर का मान 0 पर सेट करें और 200-500 डिजिटल इकाइयों की सीमा में फ्लोरोसेंट सिग्नल प्राप्त करने के लिए संवेदनशीलता को समायोजित करें।
शटर मान (0-1) यह सुनिश्चित करेगा कि मापने वाली चमक गैर-एक्टिनिक है, जबकि एक उच्च मान (2) छवि के रिज़ॉल्यूशन में सुधार करेगा। - कैमरा सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही स्थिति में एक प्रकाश मीटर रखें।
- लाइव विंडो में, 800 एमएस तक चलने वाली एक संतृप्त पल्स शुरू करने के लिए बॉक्स सुपर को चेक करें। एक नई पल्स के लिए हर बार बॉक्स की जांच करना याद रखें।
- सुपर पल्स के लिए सापेक्ष शक्ति के प्रतिशत को समायोजित करने के लिए स्लाइडर का उपयोग करें जब तक कि प्रकाश मीटर 6,000-8,000 μmol.m-2 s-1नहीं पढ़ता है।
4. क्वांटम उपज कार्यक्रम डिजाइन करें
- इमेजिंग सिस्टम के लिए मानक ऑपरेटिंग उपकरण आयात करें।
default.inc शामिल करें
light.inc शामिल करें
नोट: इस प्रयोग में संदर्भ के लिए उपयोग किया जाने वाला प्रोग्राम सिंटैक्स एक फ्लोरकैम इमेजिंग सिस्टम के लिए है। - कॉन्फ़िगर की गई प्रकाश सेटिंग्स के अनुसार निम्न वैश्विक चर निर्धारित करें:
शटर = 0
संवेदनशीलता = 40
सुपर = 65 - डेटा लॉग करने के लिए समय-चरण शामिल करें:
TS = 20ms - अंधेरे-अनुकूलित अवस्था में प्रतिदीप्ति का नमूना लेकर फो माप एकत्र करें।
F0 अवधि = 2s;
F0 अवधि = 200m;
नोट: एफ0ड्यूरेशन उस समय सीमा को परिभाषित करता है जिस पर अंधेरे-अनुकूलित प्रतिदीप्ति दर्ज की जाती है। एफ 0 अवधि उस समय अंतराल को परिभाषित करती है जिस पर अंधेरे-अनुकूलित प्रतिदीप्ति माप दोहराया जाता है। - डेटा तालिकाओं में फो माप रिकॉर्ड करें।
<0,F0 अवधि.. F0ड्यूरेशन>= >mfmsub
<0s>->चेकपॉइंट "startFo"= >चेकपॉइंट," endFo";
जहां <, > समय द्वारा अनुक्रमित प्रतिदीप्ति मूल्यों के सेट का प्रतिनिधित्व करता है; = > सिस्टम फ़ाइल में माप संग्रहीत करता है; mfmsub प्रयोग के लिए निर्धारित पूरे डेटा का प्रतिनिधित्व करता है; और चेकपॉइंट स्टार्टफो जैसे विशिष्ट मापों के डेटा के लिए एक उप-समूह बनाता है। - एक संतृप्त नाड़ी के बाद प्रतिदीप्ति का नमूना लेकर एफएम माप को इकट्ठा और संग्रहीत करें।
पल्स ड्यूरेशन = 960 एम; ##
a1= F0 अवधि + 40m
a2 = a1 + 480m;=>सैटपल्स (पल्सड्यूरेशन); =>mfmsub = >mfmsub; =>चेकपॉइंट"startFm" = >चेकपॉइंट," endFm" = >चेकपॉइंट," टाइमविज़ुअल";
जहां ए 1 और ए 2 संतृप्त पल्स के साथ नमूना समय का समन्वय करने के लिए चर हैं; ए 1 एफएम माप के शुरुआती समय का प्रतिनिधित्व करता है; और ए 2 नाड़ी के मध्य बिंदु समय का प्रतिनिधित्व करता है।
5. उपचारित नमूनों की क्वांटम उपज को मापना
- उपचार के बाद, अंधेरे अनुकूलन के लिए 15 मिनट के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेटों को कवर करें। पल्स आयाम-संशोधित फ्लोरोमीटर के साथ फोटोसिस्टम II की क्वांटम उपज को मापने के लिए पन्नी को हटा दें। फिर, सीडलिंग प्लेट को सीधे कैमरे के नीचे रखें और गिटहब रिपॉजिटरी में पाए जाने वाले क्वांटम उपज प्रोटोकॉल को चलाएं।
- GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) से quantum_yield प्रोटोकॉल डाउनलोड करें या अनुभाग 4 से समान रूप से डिज़ाइन किए गए प्रोग्राम का उपयोग करें। फ़ोल्डर आइकन पर क्लिक करके और फ़ाइल स्थान पर नेविगेट करके प्रोग्राम फ़ाइल खोलने के लिए फ्लोरोमीटर के सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
- लाल बिजली आइकन पर क्लिक करके क्वांटम उपज कार्यक्रम चलाएं।
- प्रोटोकॉल पूरा होने के बाद, पूर्वविश्लेषण विंडो पर नेविगेट करें। प्लेट छवि पर प्रत्येक अंकुर के लिए सभी पिक्सेल को उजागर करने के लिए चयन उपकरण का उपयोग करके प्लेट को अलग-अलग रोपाई में विभाजित करें। किसी भी हाइलाइट किए गए पृष्ठभूमि पिक्सेल को हटाने के लिए पृष्ठभूमि बहिष्करण पर क्लिक करें, केवल अंकुर क्षेत्र को छोड़ दें।
- प्लेट छवि पर प्रत्येक अंकुर के लिए प्रतिदीप्ति डेटा उत्पन्न करने के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें। सभी प्लेटों के बीच सुसंगत न्यूनतम और अधिकतम मान प्रदर्शित करने के लिए प्रतिदीप्ति मान सीमा को मैन्युअल रूप से समायोजित करें।
- प्रयोग टैब से न्यूमेरिकल-एवरेज पर क्लिक करें | निर्यात | संख्यात्मक. सभी डेटा और कॉलम द्वारा चुनें और प्रत्येक अंकुर के लिए QY माप वाली पाठ फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए ठीक क्लिक करें।
6. डेटा फ़ाइल खोलना
- विश्लेषण के लिए स्प्रैडशीट में पाठ फ़ाइल खोलें। क्षेत्र संख्या, पिक्सेल का आकार, एफएम, एफटी, एफक्यू और क्यूवाई दिखाने वाले शीर्षकों में से, कोर जीनोटाइप (डब्ल्यूटी या टेस्ट म्यूटेंट) और क्यूवाईमैक्स के लिए क्षेत्र संख्या की पहचान करें। महत्व निर्धारित करने के लिए जंगली प्रकार के संबंध में एक जोड़ीवार टी-टेस्ट करें। जब पी-मान 0.05 से नीचे होते हैं तो डेटा को काफी अलग माना जाता है।
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Representative Results
परिणाम डब्ल्यूटी और टेस्ट म्यूटेंट के परिवेश और कम सीओ2 स्क्रीनिंग से कच्चे और प्रतिदीप्ति छवियों की प्लेट छवियां दिखाते हैं। प्रत्येक प्लांटलेट को क्षेत्र संख्या द्वारा लेबल किया जाता है, जिसमें क्यूवाई के रूप में दिए गए संबंधित प्रतिदीप्ति रीडिंग होते हैं। डेटा को पाठ फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जाता है और विश्लेषण के लिए स्प्रेडशीट में खोला जा सकता है (पूरक तालिका एस 1 देखें)। उत्परिवर्ती लाइनों plgg1-1 और abcb26 को फोटोरेस्पिरेटरी तनाव से जुड़े जीन की सकारात्मक और नकारात्मक पहचान प्रदर्शित करने के लिए चुना गया था। पीएलजीजी 1 को आरयूबीपी6 के ऑक्सीकरण के बाद मार्ग में पहले ट्रांसपोर्टर के लिए कोड माना जाता है, जबकि एबीसीबी 26 को एक एंटीजन ट्रांसपोर्टर के लिए कोड माना जाता है जो फोटोरेस्पिरेशन11 में शामिल नहीं है। डब्ल्यूटी और म्यूटेंट की अंधेरे-अनुकूलित एफवी / एफएम क्यूवाई क्षमता को बॉक्स और मूंछ भूखंडों द्वारा देखा जाता है। डब्ल्यूटी और परीक्षण उत्परिवर्ती के बीच सांख्यिकीय अंतर का परीक्षण करने के लिए, 0.05 < पी-मान के साथ एक जोड़ीवार टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। यहां, हमने स्क्रीनिंग विधि की दक्षता की जांच करने के लिए परीक्षण उत्परिवर्ती के रूप में कम क्यूवाई एफवी / एफएम के साथ फोटोरेस्पिरेटरी म्यूटेंट लाइनों का उपयोग किया। परिणाम बताते हैं कि परीक्षण उत्परिवर्ती में डब्ल्यूटी की तुलना में काफी कम क्यूवाई दक्षता है। चित्रा 3 बी पीएलजी 1-1 के लिए चर से अधिकतम प्रतिदीप्ति (एफवी / एफएम) के अनुपात में महत्वपूर्ण कमी दिखाता है, लेकिन कम सीओ 2 पर एबीसीबी 26 नहीं। यह परिणाम फोटोरेस्पिरेशन में शामिल ट्रांसपोर्टर के रूप में पीएलजीजी 1 की भूमिका के अनुरूप है, जबकि एबीसीबी 26 कम सीओ2 स्थितियों के तहत डब्ल्यूटी नियंत्रण से अलग फेनोटाइप का प्रदर्शन नहीं करता है। इस प्रकार, यह स्क्रीनिंग विधि कम सीओ2 स्क्रीनिंग का उपयोग करके फोटोरेस्पिरेटरी म्यूटेंट की पहचान कर सकती है।
चित्रा 1: बीज प्लेट लेआउट का उदाहरण योजनाबद्ध। एक पंक्ति में रखे गए छह बीजों के साथ दो तकनीकी प्रतिकृतियां दिखाई जाती हैं। उत्परिवर्ती बीजों के ऊपर रखे गए डब्ल्यूटी नियंत्रण बीज। संक्षिप्त नाम: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: 9-दिन पुराने पौधों की अंधेरे-अनुकूलित एफवी / एफएम छवियां। जंगली प्रकार के नियंत्रण की तुलना परिवेश और कम सीओ 2 पर टी-डीएनए उत्परिवर्ती लाइनों से कीजाती है। रंग पैमाना प्रत्येक अंकुर के औसत Fv/Fm का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 1 सेमी संक्षेप: Fv/Fm = चर का अधिकतम प्रतिदीप्ति से अनुपात; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; plgg1-1 = प्लास्टिडल ग्लाइकोलेट / ग्लाइसरेट ट्रांसलोकेटर 1; abcb26 = एटीपी-बाइंडिंग कैसेट बी 26। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: प्रतिदीप्ति अवलोकन। (ए) परिवेश और (बी) कम सीओ2 स्थितियों में रोपाई पर किए गए अधिकतम क्वांटम उपज (एफवी / एफएम) माप। बक्से आंतरिक चतुर्थकों के बीच की सीमा का प्रतिनिधित्व करते हैं, बक्से के भीतर की रेखाएं माध्यिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं, और मूंछें अधिकतम और न्यूनतम टिप्पणियों का प्रतिनिधित्व करती हैं। * डब्ल्यूटी (एन > 44, पी < 0.05) के सापेक्ष एक जोड़ीवार टी-टेस्ट के आधार पर महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है; पूरक तालिका एस 2)। एफएम = चर का अनुपात अधिकतम प्रतिदीप्ति; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; plgg1-1 = प्लास्टिडल ग्लाइकोलेट / ग्लाइसरेट ट्रांसलोकेटर 1; abcb26 = एटीपी-बाइंडिंग कैसेट बी 26। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक तालिका एस 1: प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले सभी अंकुर प्लेटों से संकलित फ्लोरोसेंट डेटा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक तालिका एस 2: आंकड़े जंगली प्रकार और दोनों उत्परिवर्ती जीनोटाइप के बीच एक टी-परीक्षण से रिपोर्ट किए जाते हैं। म्यूटेंट को जंगली प्रकार से काफी अलग माना जाता है जब पी-वैल्यू 0.05 से कम होती है। तालिका ए परिवेश सीओ2 में उगाए गए पौधों पर किए गए टी-परीक्षणों का प्रतिनिधित्व करती है, जबकि तालिका बी कम सीओ2 में उगाए गए पौधों पर किए गए टी-परीक्षणों का प्रतिनिधित्व करती है। टी-टेस्ट: दो-नमूना समान भिन्नता ओं को मानते हुए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस पेपर में उल्लिखित प्रयोगात्मक तरीके कुछ फायदे और सीमाओं के साथ आते हैं। एक लाभ यह है कि यह विधि कई पौधों के पौधों को स्क्रीन कर सकती है, हालांकि चढ़ाना और बढ़ती प्रक्रिया के दौरान पौधे मीडिया प्लेट के संदूषण को रोकने के लिए कुछ सावधानियां बरतनी चाहिए। इसलिए, एराबिडोप्सिस प्लेटों को सर्जिकल टेप के साथ सील करना महत्वपूर्ण है। इस प्रयोग का एक और लाभ यह है कि इसमें पहले प्रकाशित कार्य 8 की तुलना में कम 12 घंटे फोटोरेस्पिरेटरी तनाव अवधिहै। उपचार के समय में कमी डब्ल्यूटी और चयनित उत्परिवर्ती के बीच एफवी / एफएम में अंतर को बेहतर ढंग से अलग करने के लिए थी। उत्परिवर्ती उपभेदों में फेनोटाइप की गंभीरता और प्रयोगात्मक सेटअप में सीओ2 के स्तर के आधार पर उपचार का समय भिन्न होने की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, एक सीमा यह है कि इस विधि को फ्लोरोमीटर को मापने और एफवी / एफएम मूल्यों की गणना करने के लिए पर्याप्त पत्ती क्षेत्र की आवश्यकता होती है। परीक्षण किए गए रोपाई के प्रारंभिक बढ़ते समय को समायोजित करने से यह सुनिश्चित होगा कि फ्लोरोमीटर इमेजर में इमेजिंग के दौरान पत्तियों को ओवरलैप किए बिना प्रत्येक अंकुर के लिए मापने के लिए पर्याप्त पत्ती क्षेत्र है। पत्ती के आकार और पत्ती कोणों को समान रखने के लिए रोपाई को पहली सच्ची पत्तियों पर चित्रित किया जाना चाहिए। कैमरे की शटर गति और संवेदनशीलता को बढ़ाकर छवि के रिज़ॉल्यूशन में सुधार किया जा सकता है। पड़ोसी पिक्सेल बेहतर प्रतिष्ठित होंगे; हालांकि, संवेदनशीलता को बहुत अधिक बढ़ाने से कैमरे को ओवरएक्सपोज किया जाएगा और गलत फ्लोरेसेंस मैक्सिमम हो जाएगा। रिज़ॉल्यूशन और फ्लोरेसेंस मानों को संतुलित करने के लिए ऑप्टिमाइज़ेशन और समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है।
एक मानकीकृत प्रक्रिया में प्रकाश संश्लेषक उत्परिवर्ती के लिए स्क्रीन करने की क्षमता महत्वपूर्ण है। यह प्रकाश संश्लेषण और फोटोरेस्पिरेशन चयापचय के लिए रुचि के जीन के साथ फोटोरेस्पिरेशन म्यूटेंट की पहचान करने के लिए एक सुसंगत, उच्च-थ्रूपुट विधि की अनुमति दे सकता है। कुल मिलाकर, इस विश्लेषण में एफवी / एफएम के लिए स्क्रीनिंग में पौधों के रोपाई की लगभग 30 सेकंड प्रति प्लेट लगती है, जिससे प्रति दिन 1,000 से अधिक रोपाई की स्क्रीनिंग की अनुमति मिलती है। क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस विश्लेषण कम सीओ2 स्क्रीनिंग का उपयोग करके फोटोरेस्पिरेटरी म्यूटेंट की पहचान के लिए अनुमति देता है, जो फोटोरेस्पिरेटरी दक्षता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। फोटोरेस्पिरेशन पाथवे3 में बड़ी संख्या में अज्ञात ट्रांसपोर्टरों को देखते हुए, इस विधि का उपयोग प्रकाश संश्लेषक दक्षता पर जीनोटाइप के प्रभाव का जल्दी से मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोमीटर प्रकाश संश्लेषक दक्षता के अन्य पहलुओं को माप सकते हैं जैसे कि गैर-फोटोकैमिकल शमन और फोटोसिस्टम II ऑपरेटिंग दक्षता। इन अतिरिक्त प्रोटोकॉल में प्रति अंकुर प्लेट में अधिक समय लगता है, लेकिन उत्परिवर्ती की इस त्वरित उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन के विपरीत आगे और अधिक संवेदनशील विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है। यह विधि एराबिडोप्सिस तक ही सीमित नहीं है और प्रकाश संश्लेषण और फोटोरेस्पिरेशन के लिए महत्वपूर्ण जीन की पहचान करने के लिए उच्च और निम्न तापमान, उच्च प्रकाश तनाव और सूखे की स्थिति जैसे अन्य अजैविक तनाव स्थितियों की एक श्रृंखला में टी-डीएनए उत्परिवर्ती के लिए स्क्रीन करने के लिए भी समायोजित किया जा सकता है। किसी भी अतिरिक्त संशोधन को व्यक्तिगत आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।
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Disclosures
लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या हितों का टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को लुइसियाना बोर्ड ऑफ रीजेंट्स (एडब्ल्यूडी-एएम 210544) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
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