Summary
Qui presentiamo un protocollo per l'arricchimento delle fosfatasi fosfoproteine endogene e delle loro proteine interagenti da cellule e tessuti e la loro identificazione e quantificazione mediante proteomica basata sulla spettrometria di massa.
Abstract
La maggior parte dei processi cellulari sono regolati dalla fosforilazione dinamica delle proteine. Più di tre quarti delle proteine sono fosforilate e le fosfoproteine fosfatasi (PPP) coordinano oltre il 90% di tutta la defosforilazione cellulare di serina/treonina. La deregolazione della fosforilazione proteica è stata implicata nella fisiopatologia di varie malattie, tra cui il cancro e la neurodegenerazione. Nonostante la loro attività diffusa, i meccanismi molecolari che controllano i PPP e quelli controllati dai PPP sono scarsamente caratterizzati. Qui, viene descritto un approccio proteomico chiamato perline inibitrici della fosfatasi e spettrometria di massa (PIB-MS) per identificare e quantificare i PPP, le loro modifiche post-traduzionali e i loro interattori in appena 12 ore utilizzando qualsiasi linea cellulare o tessuto. PIB-MS utilizza un inibitore PPP non selettivo, microcistina-LR (MCLR), immobilizzato su perline di sefarosio per catturare e arricchire i PPP endogeni e le loro proteine associate (chiamate PPPome). Questo metodo non richiede l'espressione esogena di versioni marcate di PPP o l'uso di anticorpi specifici. PIB-MS offre un modo innovativo per studiare i PPP evolutivamente conservati ed espandere la nostra attuale comprensione della segnalazione di defosforilazione.
Introduction
La fosforilazione proteica controlla la maggior parte dei processi cellulari, tra cui, ma non solo, la risposta al danno al DNA, la segnalazione del fattore di crescita e il passaggio attraverso la mitosi 1,2,3. Nelle cellule di mammifero, la maggior parte delle proteine sono fosforilate in uno o più residui di serina, treonina o tirosina ad un certo punto nel tempo, con fosfosine e fosfotreonine che costituiscono circa il 98% di tutti i siti di fosforilazione 2,3. Mentre le chinasi sono state ampiamente studiate nella segnalazione cellulare, il ruolo dei PPP nella regolazione dei processi cellulari dinamici sta ancora emergendo.
Le dinamiche di fosforilazione sono controllate dall'interazione dinamica tra chinasi e fosfatasi. Nelle cellule di mammifero, ci sono più di 400 protein chinasi che catalizzano la fosforilazione di serina / treonina. Oltre il 90% di questi siti sono defosforilati dalle fosfatasi fosfoproteiche (PPP), una piccola famiglia di enzimi costituita da PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT e PPZ 2,3. PP1 e PP2A sono responsabili della maggior parte della fosfoserina e della fosfotreonina defosforilazione all'interno di una cellula 2,3,4. La notevole differenza di numero tra chinasi e fosfatasi e la mancanza di specificità delle subunità catalitiche PPP in vitro hanno portato alla convinzione che le chinasi siano il principale determinante della fosforilazione 2,3. Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato che le fosfatasi stabiliscono la specificità del substrato attraverso la formazione di oloenzimi multimerici 5,6,7,8,9. Ad esempio, PP1 è un eterodimero costituito da una subunità catalitica e, in un dato momento, una delle oltre 150 subunità regolatorie 6,7,8. Al contrario, PP2A è un eterotrimero formato da un'impalcatura (A), una subunità regolatoria (B) e una catalitica (C) 2,3,9. Esistono quattro famiglie distinte di subunità regolatorie PP2A (B55, B56, PR72 e striatina), ognuna con più geni, varianti di giunzione e modelli di localizzazione 2,3,9. La natura multimerica dei PPP colma il divario nel numero di chinasi e subunità catalitiche PPP. Tuttavia, crea sfide analitiche per lo studio della segnalazione PPP. Per analizzare in modo completo la segnalazione PPP, è fondamentale studiare i vari oloenzimi all'interno di una cellula o di un tessuto. Grandi progressi sono stati fatti nello studio del kinome umano attraverso l'uso di perline inibitrici della chinasi, chiamate perle o kinobeadi inibitori multiplex, una strategia proteomica chimica in cui gli inibitori della chinasi sono immobilizzati su perline e la spettrometria di massa viene utilizzata per identificare chinasi arricchite e i loro interattori 10,11,12,13.
Abbiamo stabilito un approccio simile per studiare la biologia PPP. Questa tecnica prevede la cattura di affinità di subunità catalitiche PPP utilizzando perline con un inibitore PPP immobilizzato e non selettivo chiamato microcistin-LR (MCLR) chiamato sfere inibitrici della fosfatasi (PIB)14,15. A differenza di altri metodi che richiedono la marcatura endogena o l'espressione di subunità PPP esogene che potrebbero alterare l'attività o la localizzazione delle proteine, PIB-MS consente l'arricchimento di subunità catalitiche PPP endogene, le loro subunità regolatorie e di impalcatura associate e le proteine interagenti (chiamate PPPome) da cellule e tessuti in un dato momento o in condizioni di trattamento specifiche. MCLR inibisce PP1, PP2A, PP4-6, PPT e PPZ a concentrazioni nanomolari, rendendo i PIB altamente efficaci nell'arricchimento per il PPPome16. Questo metodo può essere scalato per l'uso su qualsiasi materiale di partenza dalle cellule ai campioni clinici. Qui, descriviamo in dettaglio l'uso di PIB e spettrometria di massa (PIB-MS) per catturare, identificare e quantificare in modo efficiente il PPPome endogeno e i suoi stati di modifica.
Figura 1: Riepilogo visivo del protocollo PIB-MS. In un esperimento PIB-MS, i campioni possono essere ottenuti in varie forme, dalle cellule ai tumori. Il campione viene raccolto, lisato e omogeneizzato prima dell'arricchimento PPP. Per arricchire i PPP, il lisato viene incubato con PIB con o senza un inibitore PPP, come MCLR. I PIB vengono quindi lavati e i PPP vengono eluiti in condizioni di denaturazione. I campioni vengono preparati per l'analisi della spettrometria di massa mediante la rimozione di detergenti attraverso l'arricchimento proteico SP3, la digestione triptica e la desalinizzazione. I campioni possono quindi essere facoltativamente etichettati TMT prima dell'analisi della spettrometria di massa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
PIB-MS comporta lisi e chiarificazione di cellule o tessuti, incubazione del lisato con PIB, eluizione e analisi dell'eluato tramite western blotting o approcci basati sulla spettrometria di massa (Figura 1). L'aggiunta di MCLR libero può essere utilizzata come controllo per distinguere specifici leganti PIB da interattori non specifici. Per la maggior parte delle applicazioni, un approccio senza etichette può essere utilizzato per identificare direttamente le proteine negli eluati. Nei casi in cui è necessaria una maggiore precisione nella quantificazione o nell'identificazione di specie a bassa abbondanza, è possibile utilizzare un'ulteriore elaborazione con etichettatura TMT (Tandem Mass-Tag) per aumentare la copertura e ridurre l'input.
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Protocol
NOTA: La generazione di PIB viene effettuata come descritto da Moorhead et al., dove 1 mg di microcistina e circa 6 mL di sefarosio sono accoppiati per generare PIB con una capacità di legame fino a 5 mg/mL17.
1. Preparazione del campione
NOTA: Una quantità iniziale tipica per PIB-MS è di 1 mg di proteina totale per condizione. Per questo esperimento, circa 2,5 x 106 cellule HeLa sono state utilizzate per estrarre 1 mg di proteine. Questo calcolo deve essere eseguito per ogni linea cellulare o tessuto utilizzato in un esperimento18. Se il campione è limitato e non è possibile ottenere 1 mg, la quantità di input può essere ridotta con una piccola perdita di rilevamento della subunità PPP. In alternativa, l'etichettatura TMT può essere utilizzata per consentire la miscelazione di tutte le condizioni in un campione, aumentando la sensibilità di rilevamento come mostrato nel passaggio 9.
- Raccogliere campioni di tessuto o pellet cellulari. Per i pellet cellulari, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 277 x g per 2 minuti a temperatura ambiente (RT), rimuovere i fluidi e lavare le cellule con 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). I pellet cellulari possono essere conservati a -80 °C per diversi mesi.
- Preparare il tampone di lisi (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5% Triton X-100 (vol/vol), 5 mM di acido beta-glicerofosforico sale disodico pentaidrato, 1:500 (vol/vol) cocktail inibitore della proteasi III) e conservare sul ghiaccio. Fai abbastanza per lisare e lavare tutti i campioni. Se si inizia con 1 mg di proteine per condizione, fare circa 3 ml di tampone per campione per lisi e lavaggi.
NOTA: Il tampone di lisi indicato in questa fase è una soluzione detergente delicata, che potrebbe non essere sufficiente per solubilizzare la membrana insolubile o le proteine associate al citoscheletro. Altri detergenti potrebbero essere esplorati per migliorare la solubilizzazione. È stata testata una gamma di concentrazioni di NaCl e Triton-X-100 e le concentrazioni di cui sopra sono risultate ottimali per il legame delle subunità a basso fondo e ad alto contenuto di fosfatasi. - Aggiungere il tampone di lisi refrigerato ai campioni. Per la lisi di 1 mg di proteine, utilizzare 1 mL di tampone. Se il campione è congelato, aggiungere il tampone di lisi e lasciare che il campione si scongeli sul ghiaccio nel tampone.
- Per le cellule, omogeneizzare i campioni tramite sonificazione, mantenendo le cellule sul ghiaccio tra gli impulsi. Sonicare i campioni al 15% di ampiezza con tre impulsi da 15 s. Questo può variare in base al sonicatore utilizzato (vedi Tabella dei materiali).
- Per i tessuti, omogeneizzare prima i campioni usando una smerigliatrice di tessuto Dounce per macinare il tessuto fino a quando non viene liquefatto prima della sonicazione, come descritto nella fase 1.3.1.
- Chiarire il campione omogeneizzato di detriti insolubili mediante centrifugazione a 21.130 x g per 15 min a 4 °C. Quindi, senza disturbare i pellet o i lipidi formati che si sono raccolti sul lato dei tubi, trasferire i lisati in nuovi tubi. Rimuovere 100 μL del campione di pre-arricchimento del lisato chiarificato, se lo si desidera, e conservare a -20 °C. Assicurati di mantenere i lisati sul ghiaccio.
- Determinare il contenuto proteico totale in ciascun campione eseguendo un test di quantificazione proteica, come un saggio di acido bicinchoninico (BCA), su una piccola aliquota di ciascun campione, secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che i lisati siano mantenuti sul ghiaccio durante il test BCA.
- Dopo aver eseguito il test BCA, trasferire una quantità equivalente di proteine in nuovi tubi e diluire con tampone di lisi per garantire che ogni tubo abbia la stessa concentrazione di proteine (ad esempio, 1 mg / mL). Se l'esperimento richiede un controllo con inibitori PPP, preparare due aliquote di ciascun campione che hanno lo stesso contenuto proteico e procedere alla fase 1.7. Se i controlli degli inibitori PPP non sono necessari, andare al passaggio 2. Assicurarsi che i campioni siano conservati sul ghiaccio.
NOTA: È fondamentale che in un'analisi PIB-MS vengano utilizzate concentrazioni proteiche uguali per condizione. I controlli degli inibitori PPP vengono utilizzati per distinguere specifici leganti ai PIB dal background non specifico. - Per il controllo dell'inibitore PPP, trattare un campione con MCLR libero (1 μM) e l'altro con un volume uguale di DMSO come controllo. Ruotare delicatamente i campioni e incubarli sul ghiaccio per 15 minuti.
NOTA: il trattamento MCLR dei lisati blocca il legame delle subunità catalitiche PPP ma non delle proteine che si legano in modo non specifico ai PIB nei campioni. Prestare attenzione quando si maneggia MCLR in quanto è tossico. Fare riferimento alle precauzioni di manipolazione nella Tabella dei materiali.
2. Preparazione dei PIB
- Determinare la quantità di PIB necessari per l'esperimento. Per 1 mg di proteine, si possono ottenere 1-3 μg di PPP e proteine interagenti; utilizzare almeno 10 μL di resina PIB solida per campione per ridurre al minimo la perdita di perline. La capacità di legame dei PIOB è di 3-5 mg/mL14,17.
- Trasferire la quantità appropriata di PIB in un tubo da 1,5 ml e lavarli 3 volte con 0,5 mL di tampone di lisi ruotando delicatamente e quindi centrifugando a 376 x g per 30 s a RT tra un lavaggio e l'altro. Evitare di pipettare le perline quando si rimuove il tampone di lisi tra i lavaggi.
- Creare una soluzione PIB/tampone al 50% (vol/vol) aggiungendo una quantità appropriata di tampone di lisi ai PIB lavati. Pipettare delicatamente su e giù e ruotare la punta del pipetto nel liquame per risospescere i PIB.
- Trasferire 20 μL del liquame in un nuovo tubo da 1,5 mL già contenente 0,5 mL di tampone di lisi. Il tampone di lisi nel tubo aiuta a espellere le perline dalla punta della pipetta. Fallo fino a quando non ci sono abbastanza provette contenenti una quantità uguale di PIB per ciascun campione.
- Ruotare i tubi a 376 x g per 30 s a RT. Assicurarsi che tutti i tubi contengano una quantità uguale di resina di perline. Scartare qualsiasi surnatante, lasciando solo resina solida e un massimo di 50 μL di tampone di lisi in ciascun tubo.
3. Incubazione di PIB con lisati
- Trasferire i lisati dal passaggio 1.6. o Passo 1.7. al tubo opportunamente etichettato contenente PIB della fase 2. Ruotare il lisato a 8 giri/min con i PIB per 1 ora a 4 °C.
4. Lavaggio dei PIB
- Centrifugare i PIB a 376 x g per 30 s a 4 °C per raccogliere le perline. Rimuovere ed eliminare il surnatante, risparmiando un'aliquota di 100 μL per l'analisi post-arricchimento, se lo si desidera.
- Lavare i PIB 3x aggiungendo 0,5 mL di tampone di lisi alle perline, invertendo i tubi (vortice sconsigliato), raccogliendo le perline mediante centrifugazione a 376 x g per 30 s a 4 °C e rimuovendo il tampone di lisi dalle perline depositate, facendo attenzione a non disturbare il pellet di perline.
5. Eluizione dei PPP dai PIB
- Dopo il lavaggio finale, rimuovere il più possibile il tampone di lisi senza pipettare nessuno dei PIB. Creare un tampone di eluizione contenente il 2% di SDS (vol/vol) ed eluire i PPP dai PIB aggiungendo un volume sufficiente di tampone di eluizione da essere 4x-5 volte il volume dei PIB. Ad esempio, se vengono utilizzati 10 μL di PIB, utilizzare 50 μL di tampone di eluizione. Incubare i PIB con il tampone di eluizione a 65 °C per 1 ora per eluire i PPP dai PIB.
- Dopo l'eluizione, raccogliere l'eluato centrifugando i tubi a 376 x g per 30 s a RT e pipettare l'eluato in un tubo separato, facendo attenzione a non trasferire alcun PIB. Utilizzare l'eluato per l'analisi western blot o per le analisi di spettrometria di massa. Gli eluiti possono essere conservati a -20 °C per un massimo di diversi mesi.
- Per rigenerare i PIB per un ulteriore utilizzo, incubare le perline in SDS al 2% (vol/vol), ruotando a 8 rpm a RT per 1 h. Lavali 3x-5x in 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) con rotazione per 30 min per lavaggio. Dopo tutti i lavaggi, conservare i PIB in un tampone di stoccaggio Tris-HCl (pH 7,5) da 25 mM con azide di sodio (0,05% wt/vol).
- Analizza gli eluati mediante western blotting o spettrometria di massa. L'analisi della spettrometria di massa degli eluati PIB è descritta di seguito.
6. Rimozione dei detergenti
NOTA: è possibile utilizzare vari approcci per rimuovere il detergente dai campioni di eluato per l'analisi della SM. Abbiamo scoperto che la preparazione del campione (SP3) a vaso singolo, potenziata in fase solida, descritta da Hughes et al., funziona bene19.
- Aggiungere 0,5 μL di perline SP3 a 50 μL di eluato dal passaggio 5.2 precedente. Utilizzare perline SP3 con un rapporto di 10:1 (μg:μg) o almeno 0,5 μg/μL (la soluzione madre è di 50 μg/μL). Ruota delicatamente le perline ed eluare.
- Aggiungere un volume di eluizione di etanolo al 100% alla miscela di perline-eluato (ad esempio, se sono stati utilizzati 50 μL di eluato, utilizzare 50 μL di etanolo al 100%). Incubare i campioni per 5 minuti in un bimbyxer impostato per agitare a 1000 giri / min a 24 ° C.
- Per raccogliere tutte le perline, mettile in un rack magnetico per tubi. Una volta raccolte le perline, scartare il surnatante e lavare le perline con 0,5 ml di etanolo all'80% (vol/vol) 3x. Per il lavaggio, risospese le perline vorticosamente, raccogliere le perline posizionandole nel rack magnetico del tubo e scartare il surnatante tra i lavaggi.
- Lavare ancora una volta le perline con 0,5 ml di acetonitrile al 100% (ACN) per rimuovere tutte le tracce di etanolo, rimuovendo il più possibile aCN.
7. Digestione delle proteine
- Effettuare una diluizione 1:100 di tripsina (concentrazione finale di 0,004 μg/μL) in 166 mM HEPES (pH 8,5) e aggiungere 30 μL di questa soluzione di tripsina a ciascun tubo con le perline, riesposte mediante vortice.
- Incubare la miscela di perline SP3-tripsina nel bimbyxer a 1000 giri/min a 37 °C per 5 ore o durante la notte a 30 °C. Posizionare i tubi nel rack magnetico per raccogliere le perline e rimuovere i digest in nuovi tubi.
- Per l'analisi senza etichetta, spegnere la reazione aggiungendo il 20% di acido trifluoroacetico (TFA) (vol/vol) a una concentrazione finale dello 0,2% di TFA (vol/vol). Controllare che il pH di ciascun campione sia compreso tra 2-3 con una carta a pH. In caso contrario, aggiungere piccole aliquote aggiuntive del 20% di TFA fino a quando ciò non viene raggiunto. I campioni devono essere opportunamente acidificati prima della desalinizzazione. Continuare con il passaggio 8.
- Per l'etichettatura TMT dei campioni, non acidificare e continuare con la fase 9.
8. Dissalazione del digest
- Preparare una punta di fase per ogni campione imballando una punta compatibile con solvente MS da 200 μL con resina C18 come descritto da Rappsilber et al.20. Utilizzare un ago smussato per premere due dischi di materiale C18, assicurandosi che i dischi rimangano nell'ago. Trasferire i dischi nella punta compatibile con il solvente MS utilizzando uno stantuffo a filo sottile per espellere i dischi dall'ago.
NOTA: è fondamentale utilizzare punte compatibili con i solventi MS da questo punto del protocollo poiché altre punte di pipetta possono lisciviare sostanze chimiche nei campioni che possono essere rilevate tramite spettrometria di massa. - Equilibrare ogni punta di stadio con 30 μL di MeOH al 100%, quindi con 30 μL di MeOH al 60% (vol/vol), seguiti da 30 μL di TFA allo 0,1% (vol/vol). Spingere ogni soluzione attraverso la punta del palco con una siringa. Fissare una punta di pipetta all'estremità di una siringa con una pellicola trasparente per aumentare il contatto tra la siringa e la punta del palco, se necessario. Assicurati di non lasciare mai asciugare il materiale C18 all'interno della punta del palco.
- Aggiungere il digest peptidico acidificato dal passaggio 7.3 alla punta dello stadio etichettato e spingere attraverso la punta del palco con una siringa, facendo nuovamente attenzione a non lasciare asciugare completamente la punta del palco.
- Lavare ogni campione 2 volte con 30 μL di TFA allo 0,1% (vol/vol). Eluire i peptidi da ogni punta dello stadio aggiungendo 30 μL di MeOH al 60% (vol / vol) a ciascuna punta dello stadio ed espellendo tutto dalla punta con la pressione della siringa in un nuovo tubo etichettato. Questo è l'unico passaggio in cui il materiale C18 è completamente asciugato.
- Asciugare ogni campione mediante centrifugazione sottovuoto. I peptidi essiccati possono essere conservati a -20 ° C per diversi mesi. I campioni sono ora pronti per l'analisi di spettrometria di massa senza etichetta. Utilizzare solo metà del campione per l'analisi sullo spettrometro di massa e l'altra metà per la reiniezione, se necessario. Garantire l'uso di un metodo di spettrometro di massa appropriato per l'analisi.
9. Etichettatura TMT
NOTA: l'etichettatura dei tag di massa tandem viene utilizzata per multiplexare i campioni per l'analisi quantitativa. Un flaconcino da 0,8 mg di reagente TMT è sufficiente per etichettare fino a 0,8 mg di proteina21. In un esperimento di pulldown PIB che inizia con 1 mg di proteine, si ottengono 1-3 μg di subunità fosfoproteiche. Il protocollo riportato di seguito è ottimale per un massimo di 10 μg di proteine.
- Ricostituire un flaconcino da 0,8 mg di reagente TMT in 80 μL di ACN anidro.
- Etichettare ogni campione dal passaggio 7.4 con un'etichetta TMT diversa per un massimo di 18 canali. Assicurarsi di annotare quale etichetta TMT viene aggiunta a ciascun campione. Aggiungere 2 μL del reagente TMT e 2 μL di ACN al digest del peptide, vortice delicatamente per mescolare, centrifugare a 376 x g per 30 s a RT per raccogliere il campione e incubare a RT per 1 ora per etichettare il campione.
- Per testare l'efficienza di marcatura TMT, creare un campione di controllo dell'etichetta combinando 1 μL di ciascuna reazione di etichettatura in un tubo da 0,5 ml contenente 9 μL di acqua di grado LC-MS e 1 μL di idrossilammina al 10% (vol / vol) per spegnere la reazione. Posizionare i restanti campioni etichettati non inestinguibili in un congelatore a -80 °C. I campioni possono essere conservati per diversi giorni mentre viene valutata l'efficienza dell'etichettatura.
- Acidificare il campione di controllo dell'etichetta TMT aggiungendo 30 μL di TFA allo 0,1% (vol/vol). Controllare che il pH sia compreso tra 2-3. In caso contrario, aggiungere il 20% di TFA (vol/vol) fino al raggiungimento di questo pH. Dissalare il campione di controllo dell'etichetta tramite il ribaltamento dello stadio, come descritto nei passaggi 8.1.-8.5.
- Analizzare il campione di controllo dell'etichetta TMT sullo spettrometro di massa per valutare l'efficienza dell'etichettatura. Filtrare i risultati della ricerca a un tasso di falsa scoperta (FDR) dell'1% a livello di peptide e determinare l'efficienza di etichettatura21,22.
- I peptidi completamente marcati con TMT hanno reagente TMT al N-terminus e a tutte le lisine. Quantificare le intensità ioniche del reporter TMT e confrontare la loro somma totale su tutti i canali. Il campione è sufficientemente etichettato quando >95% di tutti i peptidi sono etichettati e le intensità della somma ionica del reporter TMT sono comparabili
NOTA: Oltre all'etichettatura incompleta, le differenze nelle intensità iioni del reporter TMT sommate potrebbero essere il risultato di un pipettaggio impreciso del campione di prova da 1 μL. Potrebbe anche riflettere una vera osservazione biologica, nel qual caso tutte le repliche dovrebbero mostrare lo stesso comportamento. - Rimuovere i campioni inestinguibili dallo stoccaggio a -80 °C e scongelarli. Se non sono completamente etichettati, aggiungere 1 μL del reagente TMT appropriato al campione come indicato sopra, incubare per 1 ora e ripetere il controllo dell'etichetta TMT. Se i campioni sono completamente etichettati, andare al passaggio 9.8.
- Quando è completamente etichettato, aggiungere 2 μL di idrossilammina al 10% (vol/vol) alle reazioni TMT per estinguere l'etichettatura. Incubare i campioni a RT per 15 min. Una volta spenti, i campioni possono essere conservati a -80 °C per diversi mesi.
- Combinare tutti i canali TMT spenti e aggiungere 2 μL di TFA al 20% (vol/vol) per acidificare la reazione. Controllare il pH della reazione combinata, assicurandosi che sia compreso tra pH 2-3. In caso contrario, aggiungere piccole aliquote del 20% di TFA fino al raggiungimento del pH desiderato. Questo è fondamentale per una corretta desalinizzazione.
- Rimuovere ACN mediante centrifugazione sottovuoto per 30 minuti e desassalare il campione come descritto di seguito.
10. Dissalazione del campione combinato con etichetta TMT
- Utilizzare una piastra di dissalazione SPE C18 con la capacità proteica appropriata (2 mg di assorbente sono solitamente sufficienti per questa applicazione) per dissalare il reagente TMT combinato. Equilibrare il pozzo con 200 μL di 60% MeOH (vol/vol) e 200 μL di 10% MeOH/0,1% TFA (vol/vol).
- Caricare i peptidi acidificati marcati con TMT dal passaggio 9.10. sulla piastra di dissalazione. Lavare i pozzetti del campione 2x con 200 μL di 10% MeOH/0,1% TFA (vol/vol).
- Eluire i peptidi con 100 μL di MeOH al 60% (vol/vol). Asciugare i campioni mediante centrifugazione sottovuoto. Il campione essiccato con etichetta TMT può essere conservato a -80 °C per diversi mesi.
- Per l'analisi della spettrometria di massa del campione marcato TMT, iniettare metà del campione e salvare l'altra metà se è necessaria la reiniezione.
NOTA: le quantità di iniezione sulla spettrometria di massa variano a seconda della colonna specifica, della configurazione dello strumento e del tipo di campione.
11. Analisi dei dati
NOTA: i metodi di filtraggio e analisi dei dati variano e non rientrano nell'ambito di questo protocollo, ma le seguenti note sull'analisi sono incluse per fornire indicazioni specifiche per il tipo di dati risultanti da questo protocollo.
- Cerca i dati grezzi della spettrometria di massa rispetto a un database di proteoma specifico per specie in base all'origine delle cellule campione o del tessuto utilizzato. Qui, Comet è stato utilizzato come algoritmo di ricerca23.
- Filtra i risultati della ricerca con un FDR dell'1% regolando i parametri specifici dell'algoritmo di ricerca22. Per una quantificazione senza etichetta, utilizzare le misurazioni dell'area di picco MS1 per quantificare i dati. Per i campioni marcati con TMT, utilizzare le intensità ioniche reporter derivate da MSn per la quantificazione. Per la significatività statistica, analizzare i campioni in triplicati biologici.
- Per identificare de novo le subunità PPP e i loro interattori, assicurarsi che vengano confrontati campioni biologici triplicati di campioni inibiti da MCLR e trattati con DMSO. Per confrontare il PPPome in condizioni diverse o dopo il trattamento farmacologico, assicurarsi che siano stati generati triplicati biologici di ciascuna condizione o trattamento farmacologico.
- Filtrare i dati in modo che siano presenti solo proteine con un numero totale di peptidi >1 in almeno due dei tre campioni trattati con controllo DMSO. La competizione MCLR non sempre compete al di fuori di tutti i leganti catalitici delle subunità. Inoltre, alcune subunità catalitiche PPP potrebbero non aderire specificamente alla resina di sefarosio. Per tenere conto di entrambe le possibilità durante il filtraggio delle proteine che non si legano specificamente alla resina, rimuovere le proteine con un numero totale di peptidi nella condizione trattata con MCLR superiore a quella di qualsiasi subunità catalitica PPP.
- Escludere dall'analisi14 i contaminanti comuni, come la cheratina, il collagene, le proteine ribosomiali 40S e 60S e le ribonucleoproteine nucleari eterogenee che non sono subunità PPP.
- Importa i dati filtrati in Perseus facendo clic su Caricamento matrice generica nella sezione Carica24,25. Log2 trasforma i dati andando su Basic > Transform, selezionando i dati e specificando la funzione di trasformazione, in questo caso log2(x).
- Imputare i valori mancanti da una distribuzione normale andando su Imputazione > Sostituisci valori mancanti dalla distribuzione normale, selezionando i dati e specificando la larghezza (impostazione predefinita 0,3) e lo spostamento verso il basso (impostazione predefinita 1,8) per il calcolo. Eseguire la normalizzazione quantile andando su Normalize > Quantile Normalization.
- Calcola irapporti del log 2 e i valori p del test T dello studente per le rispettive condizioni. Innanzitutto, annotare i dati accedendo a Annot. Righe > Righe di annotazione categoriale. Eseguire il T-test andando su Test > Test a due campioni e selezionando i gruppi da confrontare, il test da eseguire e il metodo per la correzione di test di ipotesi multiple utilizzato per il troncamento.
NOTA: Per l'identificazione de novo , una proteina è considerata una proteina che interagisce con PPP se la sua abbondanza è statisticamente significativa nella condizione di MCLR-trattata rispetto a DMSO, con una variazione log2 volte maggiore della variazione minima di piega di qualsiasi subunità PPP nota specificamente legata.
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Representative Results
Figura 2: Identificazione di specifici leganti PIB. (A) Una varietà di tipi di tessuto o cellule può essere analizzata tramite PIB-MS. Le cellule HeLa nel tripliceto biologico sono state trattate con DMSO o l'inibitore PPP MCLR, incubate con PIB e analizzate tramite LC-MS / MS. (B) Grafico vulcanico dell'analisi PIB-MS in LISATI di cellule HeLa trattati con DMSO e MCLR, con leganti PIB specifici mostrati in rosso. Le subunità catalitiche PPP sono etichettate e mostrate in blu. Nuove subunità PPP candidate o proteine interagenti sono mostrate in nero. I leganti non specifici sono mostrati in grigio. (C) Grafico a dispersione dell'area log2 di due repliche biologiche da lisati cellulari HeLa trattati con DMSO per dimostrare la riproducibilità dell'arricchimento. I leganti specifici ai PIB sono mostrati in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi di rete di tutte le subunità PPP e proteine che interagiscono PPP identificate nelle cellule HeLa. Queste proteine sono risultate essere specifici interattori PIB nel pulldown HeLa PIB con e senza MCLR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per dimostrare le prestazioni dei PIB, abbiamo eseguito un esperimento di pulldown PIB in celle HeLa per identificare i PPP e i loro interattori (Figura 2A). Le cellule HeLa sono state coltivate in triplice copia biologico e lisate. Ogni triplicato lisato è stato diviso a metà, dove la metà è stata trattata con MCLR per 15 minuti per prevenire il legame di subunità catalitiche PPP o DMSO prima che venisse eseguito l'arricchimento PIB. Dopo l'arricchimento del PIB, è stato eseguito un confronto senza etichetta dell'abbondanza di proteine quantificate nei campioni trattati con DMSO e mcLR per distinguere gli interattori specifici da quelli non specifici (Figura 2B). Nell'analisi, abbiamo rilevato tutte le subunità catalitiche PPP sensibili a MCLR PP1ca, PP1cb, PP1cc, PP2Aca, PP2Acb, PP4c, PP5c e PP6c. Nei campioni trattati con DMSO, le abbondanze (log2 aree di quantificazione delle proteine) erano altamente correlate, indicando riproducibilità (Figura 2C), ma dopo il trattamento con MCLR, la subunità catalitica PPP o l'abbondanza di proteine interagenti PPP nei pulldown PIB era notevolmente ridotta (Figura 2B). In questa analisi, abbiamo identificato 92 subunità PPP e specifici interattori PPP (vedi Tabella supplementare 1), che è paragonabile a una precedente analisi PIB-MS nelle cellule HeLa14 (Figura 3).
Tabella supplementare 1: Dati MS dell'analisi rappresentativa PIB-MS. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
PIB-MS è un approccio di proteomica chimica utilizzato per profilare quantitativamente il PPPome da varie fonti di campioni in un'unica analisi. Molto lavoro è stato fatto usando perline inibitrici della chinasi per studiare il kinome e come cambia nel cancro e in altri statipatologici 10,11,12,13. Tuttavia, lo studio del PPPome è in ritardo. Prevediamo che questo approccio sia in grado di colmare questa lacuna e far luce sulla regolazione della defosforilazione cellulare. Qui, mostriamo che, usando i PIB, possiamo arricchire componenti catalitici e non catalitici di PP1, PP2A, PP4, PP5 e PP6. Siamo anche in grado di identificare nuovi interinatori PPP candidati in una varietà di linee cellulari, tipi di tessuti e organismi.
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo PIB-MS che non dovrebbero essere trascurati. Questi includono l'incorporazione di controlli e repliche appropriati, l'immissione di quantità uguali di proteine in tutti i campioni, il mantenimento di condizioni non denaturanti durante la preparazione del campione, l'incubazione del campione con PIB e il lavaggio dei PIB. Per quanto riguarda i controlli e le repliche, è importante che metà di ogni campione sia trattata con un inibitore PPP se l'obiettivo è identificare nuove subunità e interattori PPP. Questo è necessario per distinguere tra interattori PIB specifici e non specifici. Se si cerca di identificare come l'espressione nota della subunità PPP o dell'interattore PPP cambia tra i tipi di cellule o tessuti e le fasi del ciclo cellulare, o su vari trattamenti farmacologici, è fondamentale curare un elenco di subunità e interattori PPP noti per il confronto. Inoltre, questi esperimenti sono tipicamente fatti in triplice copia biologico per garantire la fiducia statistica. L'apporto proteico uguale per campione è essenziale per la riproducibilità dei dati tra i campioni; assicura inoltre che le differenze nella subunità PPP o nell'abbondanza dell'interattore non siano semplicemente dovute a differenze nell'input proteico. Un test proteico come un BCA deve essere utilizzato per determinare la concentrazione proteica in ciascun campione. Infine, le condizioni non denaturanti nella preparazione del campione, l'arricchimento PIB e il lavaggio PIB sono fondamentali per garantire che le proteine rimangano nel loro stato nativo. Ciò preserva le interazioni delle subunità PPP.
PIB-MS è un potente strumento per interrogare il PPPome, ma presenta diverse limitazioni. I PCB possono arricchirsi per i componenti catalitici e non catalitici di PP1, PP2A, PP4, PP5 e PP6, ma non PP2B o PP7, poiché MCLR non inibisce queste fosfatasi a concentrazioni nanomolari. È importante notare che questo strumento è adatto per facilitare l'identificazione e la quantificazione di oloenzimi PPP endogeni e sensibili alle MCLR, come quelli notati. PIB-MS non è in grado di rilevare oloenzimi PPP inibiti da inibitori endogeni PPP che bloccano il sito attivo PPP, come α4 e SET14. Questa tecnica non richiede l'espressione esogena di subunità PPP marcate o l'uso di anticorpi PPP-specifici. Come altre strategie di arricchimento dell'affinità che utilizzano matrici a base di sefarosio, PIB-MS è incline al legame di proteine non specifiche. Tuttavia, l'aggiunta di MCLR libero come controllo negativo consente di distinguere gli interattori specifici da quelli non specifici, consentendo l'identificazione di nuove subunità PPP e proteine interagenti. Inoltre, gli interattori non specifici possono essere ridotti tramite lavaggi aggiuntivi e l'uso attento della quantità appropriata di PIB.
Abbiamo impiegato PIB-MS per confrontare i modelli di espressione PPP di varie linee cellulari tumorali, tra cui il cancro al seno e il glioblastoma14. Abbiamo scoperto che questi tipi di cancro hanno modelli di espressione PPP unici indicativi della loro origine14. I PPP sono tra gli enzimi più conservati 2,3. Siamo stati in grado di dimostrare che PIB-MS è efficace nell'analisi del PPPome nei tessuti di lievito e topo14. PIB-MS può anche essere usato per identificare le differenze nei modelli di espressione PPP in varie condizioni, come l'interfase rispetto ai campioni mitotici15. Pertanto, PIB-MS fornisce approfondimenti sulle reti di fosfoproteine fosfatasi ed espande la nostra comprensione della regolazione ppp su più linee cellulari e stati patologici, nonché sui trattamenti farmacologici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare e nessun conflitto di interessi.
Acknowledgments
A.N.K. riconosce il supporto di NIH R33 CA225458 e R35 GM119455. Ringraziamo i laboratori Kettenbach e Gerber per la loro utile discussione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Honeywell | AH015-4 | CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Anhydrous Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | model no. 5424 | |
| Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate | Acros Organics | 410991000 | |
| Centrifuge | Eppendorf | model no. 5810 R 15 amp version | |
| Distilled water | |||
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Dounce tissue grinder | Fisherbrand Pellet Pestles | 12-141-363 | |
| Empore solid phase extraction disk, C18 | CDS Analytical | 76333-132 | |
| Eppendorf tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis. |
| Eppendorf tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363352 | CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis. |
| Extraction plate manifold | Waters | WAT097944 | |
| Falcon tubes, 50 mL | VWR | 21008 | |
| Generic blunt end needle and plunger | |||
| Generic magnetic separation rack | |||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen chloride (HCl) | VWR Chemicals BDH | BDH3028 | CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood. |
| Hydroxylamine solution 50% (wt/vol) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Incubator, 65 °C | VWR | model no. 1380FM | |
| Koptec Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | V1001 | |
| Methanol for HPLC (MeOH) | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Microcystin LR (MCLR) | Cayman Chemical | 10007188 | CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact. |
| PBS, 1× without calcium and magnesium, pH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | |
| pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers | Fisher Scientific | M1095310001 | |
| PIBs | For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007. | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pipette tips, 10 μL | Eppendorf | 22491504 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| Pipette tips, 1000 μL | Eppendorf | 22491555 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| Pipette tips, 200 μL | Eppendorf | 22491539 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| plastic syringe, 10 mL | BD | 309604 | |
| Protease inhibitor cocktail III | Research Products International | P50700-1 | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Refrigerated benchtop centrifuge | Eppendorf | model no. 5424 R | |
| Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) | Thermo Scientific | 13-687-12Q | 8 rpm rotation |
| Sample collection plate, 96- well, 1 mL | Waters | WAT058957 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP1311-1 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511C | |
| Sodium azide | EMD Chemicals | SX0299-1 | CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals. |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S27110 | |
| Sonicator (Branson digital sonifier) | model no. SFX 250 | ||
| SPE C18 desalting plate | Waters | 186001828BA | |
| SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads) | Cytiva | 6.51521E+13 | |
| Thermomixer | Eppendorf | model no. 5350 | |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag | ThermoFisher | A37725 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Honeywell | T6508-25ML | CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood. |
| Tris Base | Research Products International | T60040 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Vacuum centrifuge and vapor trap | Thermo Scientific | model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105 | |
| Vortexer (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries | ||
| Water LC-MS | Honeywell | LC365-4 |
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