포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

Summary

여기에서, 우리는 세포 및 조직으로부터 내인성 포스포단백질 포스파타제와 이들의 상호작용하는 단백질의 농축과 질량 분광법 기반 프로테오믹스에 의한 이들의 확인 및 정량화를 위한 프로토콜을 제시한다.

Abstract

대부분의 세포 과정은 동적 단백질 인산화에 의해 조절된다. 단백질의 삼분의 일 이상이 인산화되고, 포스포단백질 포스파타제(PPPs)는 모든 세포 세린/트레오닌 탈인산화의 90% 이상을 배위한다. 단백질 인산화의 탈조절은 암 및 신경변성을 비롯한 다양한 질병의 병태생리학에 연루되어 왔다. 그들의 광범위한 활동에도 불구하고, PPP를 통제하는 분자 메커니즘과 PPP에 의해 제어되는 메커니즘은 저조한 특성화되어 있습니다. 여기에서, 포스파타제 억제제 비드 및 질량 분광분석법 (PIB-MS)이라고 불리는 프로테오믹 접근법은 임의의 세포주 또는 조직을 사용하여 12 시간만큼 적은 시간에 PPPs, 이의 번역 후 변형, 및 이들의 상호작용자를 확인하고 정량화하기 위해 기술된다. PIB-MS는 내인성 PPP 및 이들의 관련 단백질(PPPome이라고 함)을 포획하고 풍부하게하기 위해 세파로스 비드에 고정화된 비선택적 PPP 억제제인 마이크로시스틴-LR(MCLR)을 이용한다. 이 방법은 PPPs의 태그된 버전의 외인성 발현 또는 특정 항체의 사용을 필요로 하지 않는다. PIB-MS는 진화적으로 보존된 PPP를 연구하고 탈인산화 신호전달에 대한 현재의 이해를 넓힐 수 있는 혁신적인 방법을 제공합니다.

Introduction

단백질 인산화는 DNA 손상에 대한 반응, 성장 인자 신호전달, 및 유사분열 ^1,2,3을 통한 통과를 포함하나 이에 한정되지 않는 대부분의 세포 과정을 조절한다. 포유동물 세포에서, 단백질의 대부분은 특정 시점에서 하나 이상의 세린, 트레오닌 또는 티로신 잔기에서 인산화되며, 포스포세린 및 포스포트레오닌은 모든 인산화 부위 ^2,3의 약 98%를 포함한다. 키나아제는 세포 신호전달에서 광범위하게 연구되어 왔지만, 동적 세포 과정의 조절에서 PPP의 역할은 여전히 대두되고 있다.

인산화 역학은 키나아제와 포스파타제 사이의 동적 상호 작용에 의해 제어됩니다. 포유류 세포에는 세린 / 트레오닌 인산화를 촉매하는 400 개 이상의 단백질 키나아제가 있습니다. 이 부위의 90 % 이상이 포스포 단백질 포스파타제 (PPPs)에 의해 탈인산화되며, PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT 및 PPZ ^2,3

Protocol

참고 : PIB의 생성은 Moorhead et al.에 의해 설명 된대로 수행되며, 여기서 1mg의 마이크로 시스틴과 약 6mL의 세파로스가 결합되어 최대 5mg / mL의 결합 능력을 가진 PIB를 생성합니다¹⁷.

1. 시료 준비

참고: PIB-MS의 전형적인 출발량은 조건당 총 단백질 1mg이다. 이 실험을 위해, 대략 2.5 x 10⁶ HeLa 세포를 사용하여 단백질 1 mg을 추출하였다. 이러한 계산은 실험¹⁸에서 사용되는 각 세포주 또는 조직에 대해 수행되어야 한다. 샘플이 제한되고 1mg을 얻을 수 없는 경우, PPP 서브유닛 검출의 경미한 손실로 투입량을 줄일 수 있습니다. 대안적으로, TMT 표지는 하나의 샘플에서 모든 조건의 혼합을 허용하고, 단계 9에 나타낸 바와 같이 검출의 민감도를 증가시키기 위해 채용될 수 있다.

1. 조직 샘플 또는 세포 펠릿을 수집합니다. 세포 펠릿의 경우, 실온(RT)에서 2분 동안 277 x g 에서 원심분리하여 세포를 수집하고, 배지를 제거하고, 세포를 5 mL의 인산완충 식염수(PB....

Results

도 2: 특정 PIBs 결합제의 확인 . (A) PIB-MS를 통해 다양한 조직 유형 또는 세포를 분석할 수 있다. 생물학적 삼중항 내의 HeLa 세포를 DMSO 또는 PPP 억제제 MCLR로 처리하고, PIB와 함께 인큐베이션하고, LC-MS/MS. (B) DMSO 및 MCLR 처리된 HeLa 세포 용해물에서 PIB-MS 분석의 화산 플롯을 통해 분석하였으며, 특정 PIB 결합제는 적색으로 표시되었다. PPP 촉매 서브유닛은 표지되고 파란색으로 표시된다. 새로운 후보 PPP 서브유닛 또는 상호작용 단백질은 검정으로 표시된.......

Discussion

PIB-MS는 단일 분석에서 다양한 샘플 소스로부터 PPPome을 정량적으로 프로파일링하는 데 사용되는 화학적 프로테오믹스 접근법입니다. 키나제 억제제 비드를 사용하여 키노메를 연구하고 암 및 기타 질병 상태^10,11,12,13에서 어떻게 변화하는지 연구하기 위해 많은 연구가 수행되었습니다. 그러나 PPPome에 대한 연구는 뒤쳐져 있습니다. 우리는이 접근법이이 격차를 메우고 세포 탈인산화의 조절에 빛을 비출 수있을 것으로 기대합니다. 여기서 우리는 PIB를 사용하여 PP1, PP2A, PP4, PP5 및 PP6의 촉매 및 비촉매 성분을 풍부하게 할 수 있음을 보여줍니다. 우리는 또한 다양한 세포주, 조직 유형 및 유기체에서 새로운 후보 PPP 인터랙터를 확인할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아세토니트릴(ACN)	Honeywell	AH015-4	주의: ACN은 가연성이며 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고 화학 흄 후드에서 작업하십시오.
무수 아세토니트릴	시그마-알드리치	271004-100ML	주의: ACN은 가연성이며 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.
실험대용 원심분리기	Eppendorf	모델 번호 5424
베타-글리세로인산, 다이소듐 염, 5수화물	Acros Organics	410991000
Centrifuge	, Eppendorf	모델 번호 5810 R, 15 amp version
증류수
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
Dounce tissue 그라인더	Fisherbrand Pellet Pestles	12-141-363
Empore 고체상 추출 디스크, C18	CDS Analytical	76333-132
Eppendorf tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22363204	CRITICAL: 다른 tube는 폴리머를 시료로 침출시켜 분석을 오염시킬 수 있습니다.
Eppendorf tubes, 2 mL	Eppendorf	22363352	CRITICAL: 다른 튜브가 폴리머를 시료에 침출시켜 분석을 오염시킬 수 있습니다.
추출 플레이트 매니폴드	Waters	WAT097944
Falcon 튜브, 50 mL	VWR	21008
일반 무딘 끝 바늘 및 플런저
일반 자기 분리 랙
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
염화수소(HCl)	VWR 화학 물질 BDH	BDH3028	주의 : HCl은 부식성입니다. 장갑을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.
하이드록실아민 용액 50% (wt/vol)	Sigma-Aldrich	467804
인큐베이터, 65 ° C	VWR	모델 번호 1380FM
Koptec 순수 에탄올, 200 Proof	Decon Labs	V1001
HPLC (MeOH) 용 메탄올	Sigma-Aldrich	34860-4L-R	주의: MeOH는 가연성 및 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.
Microcystin LR (MCLR)	Cayman Chemical	10007188	주의: MCLR은 독성이 있습니다. 취급 시 장갑을 착용하고 피부 접촉을 피하십시오.
PBS, 1× 칼슘과 마그네슘 없음, pH 7.4 > 0.1	코닝	21-040-CV
pH 테스트 스트립(예: MilliporeSigma MColorpHast pH 테스트 스트립 및 지표 종이	Fisher Scientific	M1095310001
PIB PIB			생성을 위한 프로토콜은 Moorhead et al., 2007을 참조하십시오.
Pierce BCA 단백질 분석 키트	Thermo Scientific	23225
피펫 팁, 10 μ L	Eppendorf	22491504	CRITICAL: 다른 팁으로 인해 폴리머가 샘플에 침출되어 분석이 오염될 수 있습니다.
피펫 팁, 1000 μ L	Eppendorf	22491555	위험: 다른 팁으로 인해 폴리머가 샘플에 침출되어 분석이 오염될 수 있습니다.
피펫 팁, 200 μ L	Eppendorf	22491539	위험: 다른 팁으로 인해 폴리머가 샘플에 침출되어 분석이 오염될 수 있습니다.
플라스틱 주사기, 10 mL	BD	309604
프로테아제 억제제 칵테일 III	Research Products International	P50700-1
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap 질량분석기, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, 또는 Orbitrap Eclipse Tribrid 질량분석기	Thermo Scientific
냉장 벤치탑 원심분리기	Eppendorf	모델 번호 5424 R
Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)	Thermo Scientific	13-687-12Q	8 rpm 회전
시료 채취 플레이트, 96- 웰, 1 mL	Waters	WAT058957
SDS	Fisher Scientific	BP1311-1
염기서열분석 등급 수정된 트립신	Promega	V511C
아지드화나트륨	EMD 화학물질	SX0299-1	주의: 아지드화나트륨은 폭발성과 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고, 화학 흄 후드에서 작업하며, 금속과의 접촉을 피하십시오.
염화나트륨 (NaCl)	Fisher Chemical	S27110
Sonicator (Branson digital sonifier)		모델 번호. SFX 250
SPE C18 탈염 플레이트	Waters	186001828BA
SpeedBeads 자기 카르복실레이트 수정 입자 (SP3 비드)	Cytiva	6.51521E+13
Thermomixer	Eppendorf	모델 번호. 5350
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag	ThermoFisher	A37725
트리플루오로아세트산(TFA)	Honeywell	T6508-25ML	주의: TFA는 부식성이 있으며 접촉 시 피부를 자극합니다. 장갑과 보안경을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.
Tris Base	Research Products International	T60040
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
진공 원심 분리기 및 증기 트랩	Thermo Scientific	모델 번호 SpeedVac SPD120 및 RVT5105
Vortexer(Vortex-Genie 2)	과학 산업
물 LC-MS	Honeywell	LC365-4