Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En massespektrometribasert tilnærming for å identifisere fosfoproteinfosfater og deres interagere

Published: April 29, 2022 doi: 10.3791/63805
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 2Norris Cotton Cancer Center

Summary

Her presenterer vi en protokoll for berikelse av endogene fosfoproteinfosfater og deres interagerende proteiner fra celler og vev og deres identifisering og kvantifisering ved massespektrometribasert proteomikk.

Abstract

De fleste cellulære prosesser reguleres av dynamisk proteinfosforylering. Mer enn tre fjerdedeler av proteiner er fosforylert, og fosfoproteinfosfater (PPPer) koordinerer over 90% av all cellulær serin / treonin defosforylering. Deregulering av proteinfosforylering har vært involvert i patofysiologien til ulike sykdommer, inkludert kreft og nevrodegenerasjon. Til tross for deres utbredte aktivitet er de molekylære mekanismene som kontrollerer PPPer og de som kontrolleres av PPPer dårlig preget. Her beskrives en proteomisk tilnærming kalt fosfatasehemmerperler og massespektrometri (PIB-MS) for å identifisere og kvantifisere PPPer, deres posttranslasjonelle modifikasjoner og deres interaktivitet i så lite som 12 timer ved hjelp av en hvilken som helst cellelinje eller vev. PIB-MS bruker en ikke-selektiv PPP-hemmer, mikrocystin-LR (MCLR), immobilisert på sepharoseperler for å fange og berike endogene PPPer og deres tilknyttede proteiner (kalt PPPome). Denne metoden krever ikke det eksogene uttrykket av taggede versjoner av PPPer eller bruk av spesifikke antistoffer. PIB-MS tilbyr en innovativ måte å studere de evolusjonært bevarte PPP-ene og utvide vår nåværende forståelse av defosforyleringssignalering.

Introduction

Proteinfosforylering kontrollerer de fleste cellulære prosesser, inkludert, men ikke begrenset til, responsen på DNA-skade, vekstfaktorsignalering og passasjen gjennom mitose 1,2,3. I pattedyrceller er flertallet av proteiner fosforylert ved en eller flere serin-, treon- eller tyrosinrester på et tidspunkt, med fosforeriner og fosforetoniner som består av omtrent 98% av alle fosforyleringssteder 2,3. Mens kinases har blitt grundig studert i cellulær signalering, vises fortsatt PPPs rolle i reguleringen av dynamiske cellulære prosesser.

Fosforyleringsdynamikken styres av det dynamiske samspillet mellom kinaser og fosfater. I pattedyrceller er det mer enn 400 proteinkinaser som katalyserer serin / treoninfosforylering. Over 90% av disse nettstedene er defosforylatert av fosfoproteinfosfater (PPPer), en liten familie av enzymer som består av PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT og PPZ 2,3. PP1 og PP2A er ansvarlige for de fleste fosfor og fosforondefosforylering i en celle 2,3,4. Den bemerkelsesverdige forskjellen i antall mellom kinases og fosfater og mangelen på spesifisitet av PPP katalytiske subenheter in vitro førte til troen på at kinases er den viktigste determinanten for fosforylering 2,3. Imidlertid har flere studier vist fosfater for å etablere substratspesifikkitet gjennom dannelsen av multimeriske holoenzymer 5,6,7,8,9. For eksempel er PP1 en heterodimer som består av en katalytisk underenhet og på et gitt tidspunkt en av de mer enn 150 regulatoriske underenhetene 6,7,8. På den annen side er PP2A en heterotrimer som er dannet av et stillas (A), en regulatorisk (B) og en katalytisk (C) underenhet 2,3,9. Det er fire forskjellige familier av PP2A regulatoriske underenheter (B55, B56, PR72 og striatin), hver med flere gener, skjøtevarianter og lokaliseringsmønstre 2,3,9. Den multimeriske naturen til PPPer fyller gapet i antall kinases og PPP katalytiske underenheter. Det skaper imidlertid analytiske utfordringer for å studere PPP-signalering. For å analysere PPP-signalering grundig, er det viktig å undersøke de forskjellige holoenzymene i en celle eller et vev. Store fremskritt har blitt gjort i å studere den menneskelige kinome gjennom bruk av kinase inhibitor perler, betegnet multiplex inhibitor perler eller kinobeads, en kjemisk proteomisk strategi der kinase inhibitors er immobilisert på perler og masse spektrometri brukes til å identifisere beriket kinases og deres interagere 10,11,12,13.

Vi har etablert en lignende tilnærming for å studere PPP-biologi. Denne teknikken innebærer affinitetsfangst av PPP-katalytiske underenheter ved hjelp av perler med en immobilisert, ikke-selektiv PPP-hemmer kalt microcystin-LR (MCLR) kalt fosfatasehemmerperler (PIB)14,15. I motsetning til andre metoder som krever endogen merking eller uttrykk for eksogene PPP-underenheter som kan endre proteinaktivitet eller lokalisering, tillater PIB-MS berikelse av endogene PPP-katalytiske underenheter, deres tilhørende regulatoriske og stillasunderenheter, og interagerende proteiner (kalt PPPome) fra celler og vev på et gitt tidspunkt eller under spesifikke behandlingsforhold. MCLR hemmer PP1, PP2A, PP4-6, PPT og PPZ ved nanomolarkonsentrasjoner, noe som gjør PIBer svært effektive til å berike for PPPome16. Denne metoden kan skaleres for bruk på ethvert startmateriale fra celler til kliniske prøver. Her beskriver vi i detalj bruken av PIBer og massespektrometri (PIB-MS) for effektivt å fange, identifisere og kvantifisere den endogene PPPome og dens modifikasjonstilstander.

Figure 1
Figur 1: Visuelt sammendrag av PIB-MS-protokollen. I et PIB-MS-eksperiment kan prøver fås i forskjellige former, fra celler til svulster. Prøven samles inn, lyser og homogeniseres før PPP-berikelse. For å berike for PPPer inkuberes lysatet med PIBer med eller uten PPP-hemmer, for eksempel MCLR. PIB-ene vaskes deretter, og PPPer elutes under denatureringsforhold. Prøvene er utarbeidet for massespektrometrianalyse ved fjerning av vaskemidler gjennom SP3 proteinberikelse, tryptisk fordøyelse og avsalting. Prøver kan deretter eventuelt TMT-merket før massespektrometrianalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

PIB-MS innebærer lysis og avklaring av celler eller vev, inkubasjon av lysatet med PIBer, elution og analyse av eluate via vestlig blotting eller massespektrometribaserte tilnærminger (figur 1). Tillegg av gratis MCLR kan brukes som en kontroll for å skille spesifikke PIB-permer fra ikke-spesifikke interagere. For de fleste applikasjoner kan en etikettfri tilnærming brukes til å identifisere proteiner direkte i eluates. I tilfeller der større presisjon i kvantifisering eller identifisering av lav-overflod arter er nødvendig, kan videre behandling med tandem masse-tag (TMT) merking brukes til å øke dekningen og redusere inngang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Genereringen av PIBer gjøres som beskrevet av Moorhead et al., hvor 1 mg mikrocystin og ca. 6 ml sepharose kombineres for å generere PIB-er med en bindingskapasitet på opptil 5 mg/ml17.

1. Prøvepreparering

MERK: Et typisk startbeløp for PIB-MS er 1 mg totalt protein per tilstand. For dette eksperimentet ble ca. 2,5 x 106 HeLa-celler brukt til å trekke ut 1 mg protein. Denne beregningen bør utføres for hver cellelinje eller vev som brukes i et eksperiment18. Hvis prøven er begrenset og 1 mg ikke kan oppnås, kan mengden inndata reduseres med et mindre tap av PPP-underenhetsdeteksjon. Alternativt kan TMT-merking brukes til å tillate blanding av alle forhold i en prøve, noe som øker følsomheten for deteksjon som vist i trinn 9.

  1. Samle vevsprøver eller cellepellets. For cellepellets, samle celler ved sentrifugering ved 277 x g i 2 min ved romtemperatur (RT), fjern medier og vask cellene med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Cellepellets kan lagres ved -80 °C i flere måneder.
  2. Forbered lysisbuffer (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5% Triton X-100 (vol/vol), 5 mM beta-glyserofosforsyredisodium salt pentahydrat, 1:500 (vol/vol) proteasehemmercocktail III) og hold på is. Gjør nok til å lyse og vaske alle prøvene. Hvis du starter med 1 mg protein per tilstand, gjør du ca. 3 ml buffer per prøve for lysis og vasker.
    MERK: Lysisbufferen som er notert i dette trinnet er en mild vaskemiddelløsning, som kanskje ikke er tilstrekkelig til å løse opp uoppløselig membran eller cytoskeletal-assosierte proteiner. Andre vaskemidler kan utforskes for å forbedre solubilisering. En rekke NaCl- og Triton-X-100-konsentrasjoner ble testet, og konsentrasjonene ovenfor ble funnet å være optimale for lav bakgrunn og høy fosfataseunderenhetsbinding.
  3. Tilsett kjølt lysisbuffer i prøvene. For lysis av 1 mg protein, bruk 1 ml buffer. Hvis prøven er frosset, tilsett lysisbufferen og la prøven tine på is i bufferen.
    1. For celler, homogeniser prøvene via sonifisering, og hold cellene på is mellom pulser. Soniker prøvene ved 15 % amplitude med tre pulser på 15 s. Dette kan variere avhengig av sonikeren som brukes (se Materialfortegner).
    2. For vev, homogeniser prøvene først ved hjelp av en Dounce vevskvern for å male vevet til det er flytende før sonikering som beskrevet i trinn 1.3.1.
  4. Klargjør den homogeniserte prøven av uoppløselig rusk ved sentrifugering ved 21.130 x g i 15 min ved 4 °C. Deretter, uten å forstyrre de dannede pellets eller lipider som har samlet på siden av rørene, overfør lysates til nye rør. Fjern 100 μL av forberikelsesprøven av det klargjorte lysatet om ønskelig og oppbevar ved -20 °C. Pass på å holde lysatene på is.
  5. Bestem det totale proteininnholdet i hver prøve ved å utføre en protein kvantifiseringsanalyse, for eksempel en bicinchoninic acid assay (BCA), på en liten aliquot av hver prøve, i henhold til produsentens instruksjoner. Sørg for at lysatene holdes på is under BCA-analysen.
  6. Etter å ha utført BCA-analysen, overfør en tilsvarende mengde protein til nye rør og fortynn med lysisbuffer for å sikre at hvert rør har samme konsentrasjon av protein (f.eks. 1 mg / ml). Hvis eksperimentet krever en PPP-hemmerkontroll, lag to aliquots av hver prøve som har samme proteininnhold og fortsett til trinn 1.7. Hvis PPP-hemmerkontroller ikke er nødvendig, går du til trinn 2. Sørg for at prøver holdes på is.
    MERK: Det er kritisk at like proteinkonsentrasjoner brukes per tilstand i en PIB-MS-analyse. PPP-hemmerkontroller brukes til å skille spesifikke bindemidler til PIBer fra den ikke-spesifikke bakgrunnen.
  7. For PPP-hemmerkontrollen behandler du den ene prøven med gratis MCLR (1 μM) og den andre med et likt volum DMSO som en kontroll. Virvel prøvene forsiktig og inkuber dem på is i 15 min.
    MERK: MCLR-behandling av lysatene blokkerer bindingen av PPP-katalytiske underenheter, men ikke proteiner som binder seg ikke spesifikt til PIBer i prøvene. Vær forsiktig når du håndterer MCLR da det er giftig. Se håndtere forholdsregler i materialfortegnelsen.

2. Forberedelse av PIBer

  1. Bestem hvor mange PIBer som trengs for eksperimentet. For 1 mg protein kan 1-3 μg PPPer og interagerende proteiner oppnås; bruk minst 10 μL fast PIBs harpiks per prøve for å minimere perletap. Bindingskapasiteten til PIBer er 3-5 mg/ml14,17.
  2. Overfør riktig mengde PIBer til et 1,5 ml rør og vask dem 3x med 0,5 ml lysisbuffer ved forsiktig virveling og sentrifugering ved 376 x g i 30 s ved RT mellom vasker. Unngå pipettering av perlene når du fjerner lysisbuffer mellom vaskene.
  3. Lag en 50% PIB / bufferløsning (vol / vol) ved å legge til en passende mengde lysisbuffer til de vaskede PIB-ene. Rør forsiktig opp og ned og virvle pipetspissen i slammet for å gjenopplive PIB-ene.
  4. Overfør 20 μL av slammet til et nytt 1,5 ml rør som allerede inneholder 0,5 ml lysisbuffer. Lysisbufferen i røret hjelper til med å utvise perlene fra pipetspissen. Gjør dette til det er nok rør som inneholder like mange PIBer for hver prøve.
  5. Snurr rørene på 376 x g i 30 s ved RT. Pass på at alle rør inneholder like mye perleharpiks. Kast eventuelle supernatanter, bare la solid harpiks og maksimalt 50 μL lysisbuffer i hvert rør.

3. Inkubasjon av PIBer med lysater

  1. Overfør lystene fra trinn 1.6. eller trinn 1.7. til det passende merkede røret som inneholder PIBer fra trinn 2. Roter lysatet ved 8 o/min med PIB-ene i 1 time ved 4 °C.

4. Vasking av PIBer

  1. Sentrifuger PIB-ene ved 376 x g i 30 s ved 4 °C for å samle perlene. Fjern og kast supernatanten, og lagre en 100 μL aliquot for post-berikelsesanalyse, om ønskelig.
  2. Vask PIBs 3x ved å legge 0,5 ml lysisbuffer til perlene, invertere rørene (vortexing anbefales ikke), samle perlene ved sentrifugering ved 376 x g i 30 s ved 4 °C, og fjern lysisbufferen fra de avgjorte perlene, vær forsiktig så du ikke forstyrrer perlepellets.

5. Elution av PPPer fra PIB-ene

  1. Etter den endelige vasken, fjern så mye av lysisbufferen som mulig uten å pipettere opp noen av PIB-ene. Lag elutionbuffer som inneholder 2 % SDS (vol/vol) og elute PPPene fra PIB-ene ved å legge til nok volum elutionbuffer til å være 4x-5x volumet av PIBer. Hvis for eksempel 10 μL PIBer brukes, bruker du 50 μL elutionbuffer. Inkuber PIB-ene med elutionbufferen ved 65 °C i 1 time for å unngå PPP-ene fra PIB-ene.
  2. Etter elution, samle eluate ved sentrifugering rørene på 376 x g i 30 s ved RT og pipetter eluate inn i et eget rør, vær forsiktig så du ikke overfører noen PIBs. Bruk eluate for vestlig blot analyse eller for massespektrometri analyser. Eluates kan lagres ved -20 °C i opptil flere måneder.
  3. For å regenerere PIB-ene for videre bruk, inkuber perlene i 2% SDS (vol / vol), rotere ved 8 rpm ved RT i 1 time. Vask dem 3x-5x i 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) med rotasjon i 30 min per vask. Når alle vasker, oppbevar PIB-er i 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) lagringsbuffer med natriumazid (0,05 % wt/vol).
  4. Analyser eluates ved vestlig blotting eller massespektrometri. Massespektrometrianalysen av PIB eluates er beskrevet nedenfor.

6. Fjerning av vaskemidler

MERK: Ulike tilnærminger kan brukes til å fjerne vaskemiddel fra eluate prøver for MS-analyse. Vi fant ut at enkeltpottet, solidfaseforbedret prøvepreparering (SP3), beskrevet av Hughes et al., fungerer godt19.

  1. Tilsett 0,5 μL SP3 perler til 50 μL eluate fra trinn 5.2 ovenfor. Bruk SP3 perler i et forhold på 10: 1 (μg: μg) eller minst 0,5 μg / μL (lageroppløsning er 50 μg / μL). Virvel forsiktig perlene og eluate.
  2. Tilsett ett elutionvolum på 100% etanol til perle-eluateblandingen (f.eks. hvis 50 μL av eluatet ble brukt, bruk 50 μL 100% etanol). Inkuber prøvene i 5 min i en thermomixer satt til å riste ved 1000 rpm ved 24 °C.
  3. For å samle alle perlene, plasser dem i et magnetisk rørstativ. Når perlene samler seg, kast supernatanten og vask perlene med 0,5 ml 80% etanol (vol / vol) 3x. For vasking, resuspend perlene ved vortexing, samle perlene ved å plassere dem i det magnetiske rørstativet, og kast supernatanten mellom vasker.
  4. Vask perlene en gang til med 0,5 ml 100% acetonitril (ACN) for å fjerne alle spor av etanol, og fjern så mye ACN som mulig.

7. Fordøyelse av proteiner

  1. Lag en 1:100 fortynning av trypsin (endelig konsentrasjon på 0,004 μg/μL) i 166 mM HEPES (pH 8,5) og tilsett 30 μL av denne trypsinløsningen til hvert rør med perlene, resuspending ved vortexing.
  2. Inkuber SP3-trypsinperleblandingen i thermomixer ved 1000 o/min ved 37 °C i 5 timer eller over natten ved 30 °C. Plasser rørene i magnetstativet for å samle perlene og fjerne fordøyelsene til nye rør.
  3. For etikettfri analyse, slukk reaksjonen ved å tilsette 20% trifluoroacetisk syre (TFA) (vol / vol) til en endelig konsentrasjon på 0,2% TFA (vol / vol). Kontroller at pH for hver prøve er mellom 2-3 med et pH-papir. Hvis ikke, legg til små ekstra aliquots på 20% TFA til dette er oppnådd. Prøvene må være tilstrekkelig surgjort før avsalting. Fortsett til trinn 8.
  4. For TMT-merking av prøvene må du ikke surgjøre og fortsette til trinn 9.

8. Avsalting av fordøyelsen

  1. Forbered et trinntips for hver prøve ved å pakke en 200 μL MS-løsningsmiddelkompatibel spiss med C18-harpiks som beskrevet av Rappsilber et al.20. Bruk en stump nål til å trykke på to C18-materialskiver, og sørg for at diskene forblir i nålen. Overfør diskene til den MS-løsningsmiddelkompatible spissen ved hjelp av et tynt trådstempelet for å fjerne platene fra kanylen.
    MERK: Det er viktig å bruke MS-løsningsmiddelkompatible spisser fra dette punktet i protokollen, siden andre pipetspisser kan lekke kjemikalier inn i prøvene som kan oppdages via massespektrometri.
  2. Likevekt hvert trinn tips med 30 μL av 100% MeOH, deretter med 30 μL av 60% MeOH (vol / vol), etterfulgt av 30 μL av 0,1% TFA (vol / vol). Skyv hver løsning gjennom trinnspissen med en sprøyte. Fest en pipetspiss til enden av en sprøyte med en gjennomsiktig film for å øke kontakten mellom sprøyten og scenespissen om nødvendig. Pass på at du aldri lar C18-materialet inne i scenespissen tørke.
  3. Tilsett surgjort peptidfordøyd fra trinn 7.3 til den merkede trinnspissen og skyv gjennom trinnspissen med en sprøyte, og vær igjen forsiktig så du ikke lar trinnspissen gå helt tørr.
  4. Vask hver prøve 2x med 30 μL 0,1% TFA (vol/vol). Elute peptidene fra hvert trinn tips ved å legge 30 μL av 60% MeOH (vol / vol) til hvert trinn tips og utvise alt fra spissen med sprøytetrykk inn i et nytt, merket rør. Dette er det eneste trinnet der C18-materialet er helt tørket.
  5. Tørk hver prøve ved vakuumsentrifugering. Tørkede peptider kan lagres ved -20 °C i flere måneder. Prøvene er nå klare for etikettfri massespektrometrianalyse. Bruk bare halvparten av prøven til analyse på massespektrometeret og den andre halvparten for reinjeksjon om nødvendig. Sikre bruk av en passende massespektrometermetode for analyse.

9. TMT-merking

MERK: Tandemmassemerkemerking brukes til multipleksprøver for kvantitativ analyse. Et 0,8 mg hetteglass med TMT-reagens er tilstrekkelig til å merke opptil 0,8 mg protein21. I et PIB-nedtrekkseksperiment som starter med 1 mg protein, oppnås 1-3 μg fosfoproteinunderenheter. Protokollen nedenfor er optimal for opptil 10 μg protein.

  1. Rekonstituer ett 0,8 mg hetteglass med TMT-reagens i 80 μL vannfri ACN.
  2. Merk hvert eksempel fra trinn 7.4 med en annen TMT-etikett for opptil 18 kanaler. Pass på at du noterer deg hvilken TMT-etikett som legges til i hvert utvalg. Tilsett 2 μL av TMT-reagenset og 2 μL ACN i peptidfordøyd, virvel forsiktig å blande, sentrifuge ved 376 x g i 30 s ved RT for å samle prøven, og inkubere ved RT i 1 time for å merke prøven.
  3. For å teste TMT-merkingseffektiviteten, lag en etikettkontrollprøve ved å kombinere 1 μL av hver merkingsreaksjon i et 0,5 ml rør som inneholder 9 μL LC-MS-klasse vann og 1 μL 10% hydroksylamin (vol / vol) for å slukke reaksjonen. Plasser de resterende umerkede merkede prøvene i en -80 °C fryser. Prøver kan lagres i flere dager mens merkingseffektiviteten evalueres.
  4. Forsure TMT-etikettkontrollprøven ved å legge til 30 μL 0,1 % TFA (vol/vol). Kontroller at pH er mellom 2 og 3. Hvis ikke, tilsett 20% TFA (vol /vol) til denne pH er oppnådd. Avsalt etikettkontrollprøven via trinntipping, som beskrevet i trinn 8.1.-8.5.
  5. Analyser TMT-etikettkontrollprøven på massespektrometeret for å evaluere merkingseffektiviteten. Filtrer søkeresultatene til en 1 % falsk oppdagelsesrate (FDR) på peptidnivået og bestem etiketteffektiviteten21,22.
  6. Helt TMT-merkede peptider har TMT-reagens ved N-terminus og i det hele tatt lysiner. Kvantifisere TMT-reporterens ionintensiteter og sammenligne deres totale sum på tvers av alle kanaler. Utvalget er tilstrekkelig merket når >95% av alle peptider er merket og TMT-reporterens ionsumintensiteter er sammenlignbare
    MERK: I tillegg til ufullstendig merking, kan forskjeller i oppsummerte TMT-reporterionintensiteter være et resultat av unøyaktig pipettering av 1 μL-testprøven. Det kan også gjenspeile en ekte biologisk observasjon, i så fall bør alle replikeringer vise samme oppførsel.
  7. Fjern de umerkede prøvene fra -80 °C lagring og tine dem. Hvis de ikke er fullstendig merket, tilsett 1 μL av riktig TMT-reagens i prøven som nevnt ovenfor, inkuber i 1 time og gjenta TMT-etikettkontrollen. Hvis eksemplene er fullstendig merket, går du videre til trinn 9.8.
  8. Når det er fullstendig merket, tilsett 2 μL 10% hydroksylamin (vol/vol) til TMT-reaksjonene for å slukke merkingen. Inkuber prøvene på RT i 15 min. Når prøvene er slokket, kan de oppbevares ved -80 °C i flere måneder.
  9. Kombiner alle slokkede TMT-kanaler og tilsett 2 μL 20 % TFA (vol/vol) for å forsure reaksjonen. Kontroller pH-en til den kombinerte reaksjonen, og sørg for at den er mellom pH 2-3. Hvis ikke, tilsett små aliquots på 20% TFA til ønsket pH er nådd. Dette er avgjørende for riktig desalting.
  10. Fjern ACN ved vakuumsentrifugering i 30 min og avsalt prøven som beskrevet nedenfor.

10. Avsalting av den TMT-merkede kombinerte prøven

  1. Bruk en SPE C18 avsaltingsplate med riktig proteinkapasitet (2 mg sorbent er vanligvis tilstrekkelig for dette bruksområdet) for å avsalte det kombinerte TMT-reagenset. Likevekt brønnen med 200 μL 60% MeOH (vol/vol) og 200 μL på 10% MeOH/0,1% TFA (vol/vol).
  2. Last de sure TMT-merkede peptidene fra trinn 9.10. på avsaltingsplaten. Vask prøvebrønnene 2x med 200 μL 10% MeOH/0,1% TFA (vol/vol).
  3. Elute peptidene med 100 μL av 60% MeOH (vol / vol). Tørk prøvene ved vakuumsentrifugering. Den tørkede, TMT-merkede prøven kan lagres ved -80 °C i flere måneder.
  4. For massespektrometrianalyse av den TMT-merkede prøven, injiser halvparten av prøven og spar den andre halvparten hvis det er nødvendig med reinjeksjon.
    MERK: Injeksjonsmengdene på massespektrometrien vil variere avhengig av den spesifikke kolonnen, instrumentoppsettet og prøvetypen.

11. Dataanalyse

MERK: Metoder for datafiltrering og analyse varierer og er utenfor omfanget av denne protokollen, men følgende merknader om analyse er inkludert for å gi veiledning som er spesifikk for typen data som følge av denne protokollen.

  1. Søk i rå massespektrometridata mot en artsspesifikk proteomdatabase basert på opprinnelsen til prøvecellene eller vevet som brukes. Her ble Comet brukt som søkealgoritme23.
  2. Filtrer søkeresultatene med en FDR på 1 % ved å justere søkealgoritmespesifikke parametere22. For etikettfri kvantifisering, bruk MS1-toppområdemålinger for å kvantifisere dataene. For TMT-merkede prøver, bruk MSn-avledede reporter-ionintensiteter for kvantifisering. For statistisk signifikans, analyser prøvene i biologiske triplikater.
  3. For å de novo identifisere PPP-underenheter og deres interagere, må du sørge for at triplikatbiologiske prøver av MCLR-hemmet og DMSO-behandlede prøver sammenlignes. For å sammenligne PPPome under ulike forhold eller ved legemiddelbehandling, må du sørge for at biologiske triplikater av hver tilstand eller narkotikabehandling ble generert.
  4. Filtrer dataene slik at bare proteiner med totalt peptidtall >1 i minst to av tre DMSO kontrollbehandlede prøver er til stede. MCLR-konkurransen konkurrerer ikke alltid om all katalytisk underenhetsbinding. Noen PPP-katalytiske underenheter kan også ikke spesifikt holde seg til sepharoseharpiksen. For å ta hensyn til begge mulighetene mens du filtrerer ut proteiner som ikke spesifikt binder seg til harpiksen, fjern proteiner med et totalt peptidtall i MCLR-behandlet tilstand høyere enn for noen PPP-katalytisk underenhet.
  5. Utelukke vanlige forurensninger, som keratin, kollagen, 40S og 60S ribosomale proteiner, og heterogene nukleære ribonukleoproteiner som ikke er PPP-underenheter, fra analysen14.
  6. Importer filtrerte data til Perseus ved å klikke Generisk matriseopplasting i Last inn-delen24,25. Logg2 transformer dataene ved å gå til Grunnleggende > Transformer, merke dataene og angi transformasjonsfunksjonen i dette tilfellet log2(x).
  7. Imputer manglende verdier fra en normalfordeling ved å gå til Imputering > Erstatt manglende verdier fra normalfordeling, merke dataene og angi bredden (standard 0,3) og nedforskyvningen (standard 1,8) for beregningen. Utfør kvantil normalisering ved å gå til Normalize > Quantile Normalization.
  8. Beregn log2-forhold og Student T-test p-verdier for de respektive forholdene. Først kommenterer du dataene ved å gå til Annot. Rader > kategoriske merknadsrader. Utfør T-testen ved å gå til Tester > To utvalgstester, og velg gruppene som skal sammenlignes, testen som skal utføres, og metoden for flerhypotesetestingskorrigering som brukes til avkorting.
    MERK: For de novo-identifisering betraktes et protein som et PPP-interagerende protein hvis overfloden er statistisk signifikant i MCLR-behandlet versus DMSO-tilstand, med en logg2-fold endring større enn den minste foldeendringen av en spesifikt bundet kjent PPP-underenhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 2
Figur 2: Identifisering av spesifikke PIBs bindemidler. (A) En rekke vevstyper eller celler kan analyseres via PIB-MS. HeLa-celler i biologisk triplikat ble enten behandlet med DMSO eller PPP-hemmeren MCLR, inkubert med PIBer, og analysert via LC-MS/MS. (B) Vulkanplott av PIB-MS-analyse i DMSO- og MCLR-behandlede HeLa-cellelyder, med spesifikke PIB-bindemidler vist i rødt. PPP katalytiske underenheter er merket og vist i blått. Ny kandidat PPP-underenheter eller interagerende proteiner vises i svart. Ikke-spesifikke dokumentordnere vises i grått. (C) Spred plott av logg2-området av to biologiske repliker fra HeLa celle lysater behandlet med DMSO for å demonstrere reproduserbarheten av berikelsen. Spesifikke dokumentordnere til PIBer vises i rødt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Nettverksanalyse av alle PPP-underenheter og PPP-interagerende proteiner identifisert i HeLa-celler. Disse proteinene ble funnet å være spesifikke PIB-interagere i HeLa PIB-nedtrekket med og uten MCLR. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å demonstrere ytelsen til PIB-ene utførte vi et PIB-pulldown-eksperiment i HeLa-celler for å identifisere PPPer og deres interaktivitet (figur 2A). HeLa celler ble dyrket i biologisk triplikat og lysed. Hver triplikatlysat ble delt i to, hvor halvparten ble behandlet med MCLR i 15 minutter for å forhindre binding av PPP katalytiske underenheter eller DMSO før PIB-berikelse ble utført. Etter PIB-berikelse ble det utført en etikettfri sammenligning av overflod av proteiner kvantifisert i de DMSO-behandlede og MCLR-behandlede prøvene for å skille spesifikt fra ikke-spesifikke interagere (figur 2B). I analysen oppdaget vi alle MCLR-sensitive PPP-katalytiske underenheter PP1ca, PP1cb, PP1cc, PP2Aca, PP2Acb, PP4c, PP5c og PP6c. I DMSO-behandlede prøver var overflod (logg2 områder av protein kvantifisering) svært korrelert, noe som indikerer reproduserbarhet (figur 2C), men ved behandling med MCLR ble PPP katalytisk subenhet eller PPP interagerende proteinoverflod i PIB-pulldowns sterkt redusert (figur 2B). I denne analysen identifiserte vi 92 PPP-underenheter og spesifikke PPP-interaktorer (se Supplerende tabell 1), som kan sammenlignes med en tidligere PIB-MS-analyse i HeLa-cellene14 (figur 3).

Supplerende tabell 1: MS-data for representativ PIB-MS-analyse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PIB-MS er en kjemisk proteomisk tilnærming som brukes til kvantitativ profilering av PPPome fra ulike prøvekilder i en enkelt analyse. Det er gjort mye arbeid med kinasehemmerperler for å studere kinome og hvordan det endrer seg i kreft og annen sykdom sier 10,11,12,13. Likevel henger studiet av PPPome etter. Vi forventer at denne tilnærmingen er i stand til å fylle dette gapet og belyse reguleringen av cellulær defosforylering. Her viser vi at vi ved hjelp av PIBer kan berike katalytiske og ikke-katalytiske komponenter i PP1, PP2A, PP4, PP5 og PP6. Vi er også i stand til å identifisere nye kandidat PPP-interagere i en rekke cellelinjer, vevstyper og organismer.

Det er flere kritiske trinn i PIB-MS-protokollen som ikke bør overses. Disse inkluderer inkorporering av passende kontroller og replikeringer, tilførsel av like mengder protein på tvers av alle prøver, vedlikehold av ikke-denatureringsforhold under prøvepreparering, inkubasjon av prøven med PIBer og vasking av PIB-ene. Når det gjelder kontroller og replikeringer, er det viktig at halvparten av hver prøve behandles med en PPP-hemmer hvis målet er å identifisere nye PPP-underenheter og interagere. Dette er nødvendig for å skille mellom spesifikke og ikke-spesifikke PIB-interagere. Hvis du søker å identifisere hvordan kjent PPP-underenhet eller PPP-interaktivitetsuttrykk endres på tvers av celle- eller vevstyper og cellesyklusfaser, eller ved ulike legemiddelbehandlinger, er det viktig å kuratere en liste over kjente PPP-underenheter og interagere for sammenligning. Videre gjøres disse eksperimentene vanligvis i biologisk triplikat for å sikre statistisk tillit. Lik proteininngang per prøve er avgjørende for datareduserbarhet på tvers av prøver; Det sikrer også at forskjeller i PPP-underenhet eller interageroverflod ikke bare skyldes forskjeller i proteininngang. En proteinanalyse som en BCA må brukes til å bestemme proteinkonsentrasjonen i hver prøve. Til slutt er ikke-denaturerende forhold i prøvepreparering, PIB-berikelse og PIB-vask avgjørende for å sikre at proteinene forblir i sin opprinnelige tilstand. Dette bevarer PPP-underenhetssamhandlinger.

PIB-MS er et kraftig verktøy for å forhøre PPPome, men det kommer med flere begrensninger. PIBer kan berike for katalytiske og ikke-katalytiske komponenter i PP1, PP2A, PP4, PP5 og PP6, men ikke PP2B eller PP7, siden MCLR ikke hemmer disse fosfatene ved nanomolarkonsentrasjoner. Det er viktig å merke seg at dette verktøyet er egnet for enkel identifisering og kvantifisering av endogene, MCLR-sensitive PPP-holoenzymer, som de som er nevnt. PIB-MS kan ikke oppdage PPP holoenzymer som hemmes av endogene PPP-hemmere som blokkerer PPP-aktive området, for eksempel α4 og SET14. Denne teknikken krever ikke det eksogene uttrykket av taggede PPP-underenheter eller bruk av PPP-spesifikke antistoffer. Som andre affinitetsberikelsesstrategier ved hjelp av sepharose-baserte matriser, er PIB-MS utsatt for binding av ikke-spesifikke proteiner. Imidlertid gjør tilsetningen av gratis MCLR som en negativ kontroll det mulig å skille spesifikt fra ikke-spesifikke interagere, noe som muliggjør identifisering av nye PPP-underenheter og interagerende proteiner. Videre kan ikke-spesifikke interagere reduseres via ekstra vasker og forsiktig bruk av riktig mengde PIBer.

Vi har brukt PIB-MS til å sammenligne PPP-uttrykksmønstrene til ulike kreftcellelinjer, inkludert brystkreft og glioblastom14. Vi fant ut at disse krefttypene har unike PPP-uttrykksmønstre som indikerer opprinnelsen14. PPPer er blant de mest bevarte enzymene 2,3. Vi var i stand til å demonstrere at PIB-MS er effektiv i å analysere PPPome i gjær og musevev14. PIB-MS kan også brukes til å identifisere forskjeller i PPP-uttrykksmønstre under ulike forhold, for eksempel interfase versus mititotiske prøver15. Dermed gir PIB-MS innsikt i fosfoproteinfosfatasenettverk og utvider vår forståelse av PPP-regulering på tvers av flere cellelinjer og sykdomstilstander, samt ved narkotikabehandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre og ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

A.N.K. anerkjenner støtte fra NIH R33 CA225458 og R35 GM119455. Vi takker Kettenbach og Gerber labs for deres hjelpsomme diskusjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN) Honeywell AH015-4 CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Anhydrous Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-100ML CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Benchtop centrifuge Eppendorf model no. 5424
Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate Acros Organics 410991000
Centrifuge Eppendorf model no. 5810 R 15 amp version
Distilled water
DMSO Fisher Scientific BP231-100
Dounce tissue grinder Fisherbrand Pellet Pestles 12-141-363
Empore solid phase extraction disk, C18 CDS Analytical 76333-132
Eppendorf tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204 CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.
Eppendorf tubes, 2 mL Eppendorf 22363352 CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.
Extraction plate manifold Waters WAT097944
Falcon tubes, 50 mL VWR 21008
Generic blunt end needle and plunger
Generic magnetic separation rack
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen chloride (HCl) VWR Chemicals BDH BDH3028 CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.
Hydroxylamine solution 50% (wt/vol) Sigma-Aldrich 467804
Incubator, 65 °C VWR model no. 1380FM
Koptec Pure Ethanol, 200 Proof Decon Labs V1001
Methanol for HPLC (MeOH) Sigma-Aldrich 34860-4L-R CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Microcystin LR (MCLR) Cayman Chemical 10007188 CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.
PBS, 1× without calcium and magnesium, pH 7.4 ± 0.1 Corning  21-040-CV
pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers Fisher Scientific M1095310001
PIBs For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pipette tips, 10 μL Eppendorf 22491504 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
Pipette tips, 1000 μL Eppendorf 22491555 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
Pipette tips, 200 μL Eppendorf 22491539 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
plastic syringe, 10 mL BD 309604
Protease inhibitor cocktail III Research Products International P50700-1
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer  Thermo Scientific
Refrigerated benchtop centrifuge Eppendorf model no. 5424 R
Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) Thermo Scientific 13-687-12Q 8 rpm rotation
Sample collection plate, 96- well, 1 mL Waters WAT058957
SDS Fisher Scientific BP1311-1
Sequencing grade modified trypsin Promega V511C
Sodium azide EMD Chemicals SX0299-1 CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.
Sodium chloride (NaCl) Fisher Chemical S27110
Sonicator (Branson digital sonifier) model no. SFX 250
SPE C18 desalting plate Waters 186001828BA
SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads) Cytiva 6.51521E+13
Thermomixer Eppendorf model no. 5350
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag ThermoFisher A37725
Trifluoroacetic acid (TFA) Honeywell T6508-25ML CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.
Tris Base Research Products International T60040
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Vacuum centrifuge and vapor trap Thermo Scientific model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105
Vortexer (Vortex-Genie 2) Scientific Industries
Water LC-MS Honeywell LC365-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nilsson, J. Protein phosphatases in the regulation of mitosis. Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).
  2. Brautigan, D. L. Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling. The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).
  3. Brautigan, D. L., Shenolikar, S. Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates. Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).
  4. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).
  5. Virshup, D. M., Shenolikar, S. From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover. Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).
  6. Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. The extended PP1 toolkit: designed to create specificity. Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).
  7. Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. 4D-networking by mitotic phosphatases. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).
  8. Heroes, E., et al. The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity. The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).
  9. Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer. Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).
  10. Bantscheff, M., et al. Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors. Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).
  11. Klaeger, S., et al. Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).
  12. Duncan, J. S., et al. Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer. Cell. 149 (2), 307-321 (2012).
  13. Cooper, M. J., et al. Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia. PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).
  14. Lyons, S. P., et al. A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).
  15. Nasa, I., et al. Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry. Science Signaling. 13 (648), (2020).
  16. Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse. Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).
  17. Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose. Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).
  18. Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).
  19. Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  20. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  21. Zecha, J., et al. TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach. Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).
  22. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  23. Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool. Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).
  24. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  25. Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins. Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).

Tags

Biokjemi utgave 182
En massespektrometribasert tilnærming for å identifisere fosfoproteinfosfater og deres interagere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smolen, K. A., Kettenbach, A. N. A… More

Smolen, K. A., Kettenbach, A. N. A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors. J. Vis. Exp. (182), e63805, doi:10.3791/63805 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter