Summary
복잡한 해부학으로 인해 심장 샘플에 대한 일관되게 재현 가능한 해부 및 수확 프로토콜을 구현하기가 어려울 수 있습니다. 이 원고는 일부 표준 심장 해부 프로토콜의 핵심 요소를 제시하여 전체 검사 접근 방식과 조직 병리학 검사에 일반적으로 사용되는 샘플링 부위를 강조합니다.
Abstract
표준 총 검사 및 샘플링은 대형 동물에서 수행 된 심혈관 질환에 대한 실험적 연구의 재현성과 성공의 핵심 요소입니다. 심장의 복잡한 해부학, 종간 차이, 보상 및 병리학 적 반응의 유형을 고려할 때 일관된 프로토콜을 구현하기가 어렵습니다. 다중 해부 프로토콜의 활용은 일반적으로 프로 섹터의 경험에 맞게 조정되며 개인 선호도는 계속해서 실험 및 관찰자 간 변동성의 원천이됩니다. 여기에서 목표는 심혈관 질환의 모델로 일반적으로 사용되는 일부 종(개, 돼지, 반추동물 및 고양이 포함)에서 심장의 주요 해부학적 특징과 랜드마크, 해부 프로토콜 및 조직학적 샘플링 표준을 제시하는 것입니다.
여기에는 두 가지 표준 총 시험 프로토콜이 제시됩니다. 첫째, 심장과 큰 혈관을 통한 생리적 혈류 방향을 따르는 유입-유출 방법(개, 반추동물, 돼지에서 자주 사용됨), 둘째, 4챔버 해부 기술(고양이에서 예시됨)입니다. 두 기술 모두 특정 실험 상황에서 모든 종에 적용 할 수 있습니다. 샘플링 프로토콜에는 모든 관심 영역 (동방 결절, 심실, 심실 중격, 심방, 밸브 및 대동맥)이 포함되며 적절하게 수행되면 실험 연구의 재현성과 신뢰성을 모두 향상시킵니다.
Introduction
심장벽 두께 평가를 방해할 수 있는 복잡한 해부학과 초기 엄격함으로 인해 심장의 전체 검사는 까다롭고 여러 기술 관련 또는 해석 오류가 발생하기 쉽습니다. 이것은 종간 형태 학적 변이와 많은 임상 적 주요 심장 병리 (관상 동맥 심장 질환, 섬유증, 동맥염 및 아밀로이드증의 초기 사례 포함)가 본질적으로 조직 병리학 적 병리학 인 심한 변화와 관련이 없다는 사실에 의해 증폭됩니다. 표준화된 해부 및 조직학적 샘플 수집 프로토콜은 관찰자 간의 일관성을 가져오는 동시에 심혈관 질환에 대한 실험적 연구의 비교 가능성 및 재현성을 가져올 수 있습니다.
샘플은 두 마리의 개 (Canis lupus familiaris) (3 세, 수컷 프렌치 불독 및 8 세, 암컷 혼합 품종), 고양이 (Felis catus) (6 세, 수컷 유럽 쇼트 헤어), 국내 돼지 (Sus scrofa domesticus) (1 세, 수컷 큰 흰색) 및 소 (Bos taurus) (2 개월 된 암컷 홀스타인). 선택된 각 종은 다른 질병에 대한 심혈관 모델로 특히 사용됩니다. 예를 들어, 개는 부정맥 모델링에 선호되는 모델입니다. 고양이는 HCM의 유병률이 가장 높은 종이기 때문에 비대성 심근 병증 (HCM)에 선호됩니다. 돼지는 급성 심근 경색의 모델로 사용됩니다. 그리고 반추 동물은 초원11에서 쉽게 발견 할 수있는 독소에 노출되어 중독의 모델로 사용됩니다.
이 원고에서는 실험적 심혈관 질환에서 심장의 총 및 조직 학적 검사를 개선하기 위해 고안된 심장의 하나의 부검 프로토콜과 두 개의 해부 프로토콜이 제시됩니다. 설명 된 프로토콜은 수의학 교과서 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, 저널 문헌 3,13,14, 공식 문서 15 및 웨비나 16의 정보를 기반으로 개발되었습니다. ,17. 이 연구에 사용 된 샘플은 일상적인 부검 진단을 위해 USAMV Cluj-Napoca의 병리학 부서에 제출 된 시체에서 수확되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
실험 프로토콜은 생명 윤리 협약 (2022 년부터 311 호)을 받았으며 국가 (2014 년 법률 제 43 호) 및 유럽 (2010 년 EU 지침 제 63 호) 법률을 준수하여 농업 과학 및 수의학 대학 클루 지나포카 (Cluj-Napoca) 대학의 생명 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료 및 도구에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 부검 프로토콜
참고: 2,12를 수행할 때 더 쉽게 접근할 수 있으므로 제시된 모든 종에 대해 동일한 부검 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 다음 단계는 중형견에서 수행된 부검을 나타냅니다. 다른 주제에 대해 부검을 수행 할 때 단계를 조정하십시오.
- 피사체의 무게를 측정하고 왼쪽의 괴사 테이블에 놓습니다(그림 1A). 피험자의 외부 검사를 진행하십시오 (큐티스와 점막을 검사하고 촉진하여 색상, 일관성 및 부피의 모든 변화를 기록함으로써).
- 칼 (또는 메스)을 사용하여 오른쪽 겨드랑이에 7cm의 절개를하십시오 (그림 1A).
- 대퇴 접합부를 찾습니다(그림 1A,B). 칼로 캡슐을여십시오. 대퇴골 머리의 인대를 자릅니다 (그림 1B).
- 칼을 사용하여 겨드랑이 두개골의 피부 절개를 하악 결합체로, 꼬리를 회음부까지 확장합니다(그림 1B).
- 메스로 피부를 제거하고 흉부와 복벽을 복부 정중선에서 척추 횡단 과정의 수준까지 노출시킵니다 (그림 1B).
- 메스와 집게로 복벽을 통해 플랩을 만들고 오른쪽 늑골 아치에 복실을 만듭니다. 가위로 복강을 열고 오른쪽 hypochondrium의 꼬리면을 따르십시오 (그림 1B).
- 외부 장골 볏까지 오른쪽 paralumbar 영역을 따라 절개 꼬리를 확장합니다. 그 후, 선형 알바의 음모 삽입까지 절개를 연장하십시오.
- 간단히 말해서, 복부 장기를 현장에서 검사하십시오 (장기의 색, 일관성, 부피 및 위치의 변화에 주목하여).
- 메스와 집게로 가장 높은 지점에서 다이어프램을 뚫습니다 (그림 1B).
- 뼈 절단 집게를 사용하여 두 개의 세로 섹션이있는 오른쪽 흉곽을 제거하여 흉강에 들어갑니다. 갈비뼈의 흉골 연골 부분을 절편화합니다. 다음으로, 늑골 관절에 근위에있는 갈비뼈의 등쪽 부분을 절편화합니다 (그림 1C).
- 제자리에서 심장을 검사하십시오 (그림 1C). 크기, 위치, 색상, 인접한 조직과의 연결 및 촉진에 의해 일관성의 변화를 확인하십시오9.
알림: 혈전증이나 선천성 심장 질환이있는 경우 심장을 현장에서 해부해야합니다 (이 방법을 사용하면 큰 혈관을 완전히 검사 할 수 있습니다). - 가위를 사용하여 심장의 기저부에서 정점까지 세로 부분으로 심낭을 검사하고 엽니 다. 심낭과 심 외막을 검사하십시오 (색, 일관성 및 부피의 변화에 유의하십시오)12.
- 가위로 심장을 풀어 대동맥, 폐동맥 및 대정맥의 횡단면을 생성합니다. 섹션 상부 대정맥 크리스타 터미널을 보존하기 위해 우심방 입구에서 최소 1cm 위에 11,13.
- 장기의 외부 윤곽, 심 외막의 모양, 심 외막의 투명성에 의한 심근의 모양 및 큰 혈관의 외관을 검사합니다 (그림 2A).
참고 : 일반적으로 심낭의 개방과 검사는 종간에 약간의 차이가 있습니다. 심낭 강의 검사는 전체 심낭 내용물 1,2의 심낭의 투명성을 통한 외부 검사 및 평가로 시작됩니다. 고양이 또는 개에서 심낭은 일반적으로 약 0.25mL/kg의 얇고 투명하며 반투명에서 담황색 액체9를 포함합니다. 병리학 적 삼출액이있는 경우 멸균 주사기 또는 vacutainer 튜브로 수집해야합니다.
2. 해부 프로토콜
알림: 심장에는 몇 가지 부검 기술이 사용되며 각각 몇 가지 장점이 있습니다. 이 프로토콜의 경우 가장 많이 사용되는 두 가지 기술이 선택되었습니다 : 1) 판막과 심내막을보다 잘 검사 할 수 있고 대부분의 종 2,11,12,16에 사용되는 프로토콜 인 "유입 유출 방법"및2) 고양이 또는 소형견에게 일반적으로 사용되는 "4 개의 챔버 해부"/ "심 초음파 평면"기술1, 17.
- 심장 해부를위한 "유입 유출 방법" 2,11,12,16
- 심방 면이 위를 향하도록 심장을 놓습니다(그림 2A).
- 가위와 이빨없는 집게를 사용하여 꼬리 대정맥에서 우심방으로 넓게 자릅니다 (그림 2B). 오른쪽 귀 부속기로 절단을 계속하여 크리스타 말단 / 동방 결절 (SA 노드)을 노출시킵니다. 등쪽에서 삼첨판 막을 검사하십시오.
- 우심방에서 우심실과 심실 중격 사이의 교차점까지 섹션을 자릅니다 (그림 2C). 오른쪽 방실 판막을 표시합니다.
- 심실 중격을 따라 우심실 자유 벽을 섹션화합니다. 폐동맥의 기원까지 섹션을 계속하십시오 (그림 2C, D).
- 척색건을 포함한 오른쪽 방실 판막과 유두근을 철저히 검사하십시오(그림 2D). 척색 건을 자르십시오.
- 폐동맥을 통해 집게를 놓고 몸통을 세로로 자릅니다 (그림 2E). 폐 유출관, 폐동맥 기원 및 반월 판막을 검사하십시오.
- 폐정맥에서 좌심방을 왼쪽 귀의 끝까지 자릅니다 (그림 2F). 등쪽에서 이첨판 (승모판)을 검사하십시오.
- 심실 중격이 아래를 향하도록 심장을 놓습니다(그림 2F). 심실 기저부에서 심장 정점까지 심실 자유 벽에 큰 절개를하십시오. 왼쪽 방실 판막을 완전히 표시하십시오.
- 왼쪽 방실 판막의 교두의 척막 건 을 자릅니다.
- 좌심실 유출로를 통해 집게를 놓고 대동맥을 여는 지침으로 사용하십시오 (그림 2G).
- 식염수를 사용하여 모든 혈전을 제거하십시오. 모든 혈전이 제거되면 심박수를 평가하고 체질량 또는 표준 심박수 표와 비교합니다(표 1)11,13.
- 마음의 무게를 잰다.
- SA 노드 만 관심 지점 인 경우 좌심실 검사 후 심장 전체를 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF)에 24 시간 동안 놓고 우심방을 다듬어 크리스타 터미널을 샘플링합니다.
참고: 이 기술을 사용하면 좌심실과 우심실을 쉽게 감상할 수 있습니다. 왼쪽과 오른쪽 심실 벽 두께의 비율은 3 : 1이며 종과 품종에 따라 약간의 차이가 있습니다. 동물 태아 심장의 경우 비율은 1:112입니다.
3. 조직학을 위한 샘플링 프로토콜16
- 메스를 사용하여 우심방, 삼첨판 막 및 우심실 자유 벽을 포함하는 두 개의 세로 평행 절단 (약 5mm 간격)을 만듭니다 (그림 2I).
- 좌심방, 승모판막, 등쪽 유두근 및 좌심실을 포함하는 두 개의 세로 평행 절단(약 5mm 간격)을 만듭니다(그림 2H).
- 심장의 등쪽 상부 1/3 내에서 심실 중격, 우심방, 대동맥, 대동맥 판막 및 삼첨판 막을 포함하여 선을 따라 심장의 기저부를 횡 방향으로 절단합니다 (그림 2J).
- 대동맥의 기저부와 심실 중격을 포함하는 두 개의 세로 평행 절단을하십시오 (그림 2J).
- 크리스타 터미널 주변의 우심방을 다듬고 크리스타의 세로 축 (약 3-4mm 간격)에서 가로 방향으로 향하는 여러 평행 섹션을 제공하여 SA 노드의 6 개 조각을 얻습니다 (그림 3, 그림 4I 및 그림 5H).
- 조직 학적 카세트에서 얻은 조직을 다듬습니다.
참고: 권장 차단 프로토콜: 단계 3.1.-조직학적 블록 1(그림 6은 이 블록의 결과 슬라이드를 보여줍니다.), 단계 3.2.-조직학적 블록 2(그림 7은 이 블록의 결과 슬라이드를 보여줍니다), 단계 3.4.-조직학적 블록 3(그림 8은 이 블록의 결과 슬라이드를 보여줍니다), 단계 3.5.-조직학적 블록 4(그림 9는 이 블록의 결과 슬라이드를 보여줍니다). - 조직을 10 % NBF에 적어도 48 시간 동안 담그십시오.
4. 관상 동맥 샘플링 3,10,14
- 집게와 메스를 사용하여 심장 원추 홈에서 관상 동맥을 해부합니다 (그림 4K). 관상 동맥을 10 % NBF로 밤새 고정하십시오.
- 필요한 경우 8% 포름산과 염산의 1:1 혼합물로 적절하게 석회질을 제거합니다.
- 3mm 간격으로 여러 번 가로 절단하십시오. 섹션을 카세트에 넣은 다음 카세트가 포함될 때까지 10% NBF에 넣습니다.
참고 : 돼지는 특히 관상 동맥 심장 질환의 경우 인간의 심장 모델로 사용할 수 있습니다. 따라서 관상 동맥의 보충 샘플 및 조직 학적 섹션이 권장됩니다 3,10,14.
5. 심장의 "4 개의 방"/ "심 초음파 평면"해부 기술 1,17
참고 : 4 개의 챔버 해부 기술은 표준보기1을 얻기 위해 심장의 기저부에서 정점까지 절단하는 것으로 구성됩니다. "4 챔버"기술은 고정 된 조직에 가장 잘 적용됩니다.
- 심장 전체를 최소 10시간 동안 48% NBF에 넣습니다.
- 심장을 최소 48 시간 동안 10 % NBF에 고정 한 후 (그림 10A), 두 개의 이가없는 직선 해부 집게를 두개골 카바-우심방-삼첨판 막-우심실을 통과하고 두 번째는 폐정맥-좌심방-승모판-좌심실을 통해 놓습니다 (그림 10B).
- 집게 암 사이의 공간을 심장의 바닥에서 정점까지 절단 날의 지침으로 사용하십시오 (그림 10C). 5.2단계에서 설명한 섹션에서 약 5mm 떨어진 추가 세로 섹션을 제공합니다. 대동맥을 포함하는 심장 부분에.
- 횡단 절개로 심장 기저부를 정점에서 완전히 분리하십시오. 각 조직 세그먼트를 조직 학적 카세트에 넣습니다.
참고: 권장 차단 프로토콜: 심장 정점-조직학적 블록 5 (도 11A는 이 블록으로부터의 결과 슬라이드를 도시함), 심장 기저-조직학적 블록 6 (도 11B는 이 블록으로부터의 결과적인 슬라이드를 도시함). - 카세트를 임베딩될 때까지 10% NBF에 넣습니다. 모든 심장 샘플을 10 % NBF (조직 부피의 10 배 이상)로 고정하고, 파라핀 왁스로 일상적으로 처리하고, 4 μm 두께로 절단하고, 이전에 설명한 프로토콜10에 따라 헤마톡실린 및 에오신 염색 (H & E 염색)으로 염색합니다.
참고: 심근염이 의심되는 경우 "미생물 및 바이러스 연구를 위해 멸균 수술 재료와 멸균 샘플 용기와 함께 멸균 조건에서 신선한 심장 조직 조각을 보관해야 합니다"13.
6. 사진 문서
참고: 사진 문서화는 부검 검사의 선택적 단계입니다. 그러나 사진 및 비디오 녹화는 "정상 및 비정상 해부학에 대한 정확한 문서화"3를 유지하는 데 필수적입니다.
- 적절한 사진 문서화를 위해 "심장 조직의 점진적 해부"13를 수행하는 동안 디지털 이미지를 촬영하십시오. 사진 문서화 및 사진15 일반 보기-전방 및 후방에 대한 지침을 참조하십시오. 심장의 한 조각; 및 의심되는 병변.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜은 해부학 적 특징을 시각화하고 4 가지 종 (개, 고양이, 돼지 및 소)에서 심장의 조직 학적 검사를위한 샘플을 수집하는 데 사용되었습니다. 부검 프로토콜은 위에서 언급 한 각 종에서 반복되었지만 개에서만 설명되었습니다. 부검 프로토콜은 신체(그림 1A)(피부, 탐색 가능한 림프절 및 외부 점막 포함)에 대한 광범위한 외부 검사, 전체 체중 측정 및 동물의 일반적인 상태 점수로 시작됩니다. 외부 검사 후, 부검은 신체의 부분 스킨 (피하 및 표면 근육을 철저히 검사하도록 지시 됨)과 본체 공동의 개방으로 계속됩니다 (그림 1B-D).
복강은 일반적으로 가장 먼저 검사하고(그림 1C), 복강과 복부 장기에 대한 광범위한 현장 검사, 횡격막 절개, 마지막으로 오른쪽 hemithorax 제거(그림 1D)가 이어집니다. 이 기술을 통해 흉복부 장기 (심낭 및 심장 포함)의 우수한 현장 검사를 달성 할 수 있으며 동시에 이러한 기관과 국소 혈관, 림프관, 인대 및 신경의 연결을 적절하게 평가할 수 있습니다. 심낭의 검사는 심장의 세로 축을 따라 정수리 심낭의 넓은 절편에 의해 이루어지며, 폐 실질에 가까운 심장 큰 혈관을 절편하여 심장을 제거합니다. 심장의 외부 검사 후 심장 충치의 절편이 이루어지며, 이는 광범위한 검사를 허용하고 마지막으로 조직 병리학을위한 조직 샘플의 적절한 수확을 허용합니다. 간략하게, 두 개의 심장 해부 기술, "혈류"(그림 2, 그림 3, 그림 4 및 그림 5) 및 "네 개의 챔버"(그림 10)의 절차 및 결과가 제시됩니다.
"혈류"기술은 개, 돼지 및 반추 동물의 심장에서 사용되었습니다 (그림 2, 그림 4 및 그림 5). 심장을 신체로부터 제거한 후, 외부 구성을 관찰하였다(도 2A, 도 4A, 및 도 5A). 해부를 수행하는 동안 심방 구성, 크리스타 터미널, 이는 동방 결절에 대한 식별의 거시적 요소 (그림 2B, 그림 4B 및 그림 5B). 프로토콜의 단계를 진행한 후(그림 2B-G, 그림 4B-G 및 그림 5B-G), 해부가 완료되고 조직학에 대한 수확 프로토콜이 시작될 수 있습니다(그림 2H-J, 그림 4G-J 및 그림 5H-K). 또는 크리스타 터미널은 심장이 10 % NBF에 고정 된 후 (그림 3) 수확 할 수도 있습니다. 개와 비교할 때, 돼지의 심장부에서 수행되어야 할 추가 단계, 즉 관상 동맥 적출이 있습니다 (그림 4K).
수확 후, 샘플을 10 % NBF로 고정하고, 일상적으로 가공하여 파라핀 왁스에 매립하고, 최종적으로 4 μm에서 절편화하고, H & E로 염색했다. 이 기술에 의해 수득된 조직학적 슬라이드는 전형적으로 다음을 포함한다: 1) 조직학적 블록 1에 대한 우심방 및 심실의 심외막, 심근 및 심내막, 삼첨판 및 관상동맥; 2) 좌심방 및 심실의 심외막, 심근 및 심내막, 승모판막, 관상동맥 및 심장신경의 조직학적 차단 2(도 7); 3) 심근, 심실 중격의 심내막, 우심방의 심 외막, 및 조직 학적 블록 3을위한 삼첨판 막 (그림 8); 4) 조직학적 블록 4에 대한 SA 노드로부터의 다중 절편(도 9); 5) 조직학적 차단 5에 대한 심장의 정점(좌심실 및 우심실 및 심실 중격)의 심외막, 심근, 및 심내막; 및 6) 조직학적 차단 6(그림 11B)에 대한 심장 기저부의 심외막, 심근 및 심내막(왼쪽 및 오른쪽 심방, 심실, 심실 중격, 방실 판막 및 관상 동맥).
그림 1 : 개의 부검 기술. (A) 피사체를 왼쪽에 배치; (b) 복강의 개방; (c) 흉강의 개방; (D) 흉강 검사. 1-7은 권장 절개의 위치와 순서를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 개 심장의 해부 및 샘플링 프로토콜. (A) 심장의 외부 구성; (B) 꼬리 카바에서 시작하여 우심방을 다듬고 우심방을 열고 크리스타 터미널을 관찰하십시오. (c) 심실 중격과의 접합부를 따라 우심실을 다듬는 단계; 삼첨판 막을 표시하십시오. (d) 척색대 건을 절개한 후, 우심실을 검사하고 파라코날 홈을 따라 절단을 계속하고; (E) 집게를 폐동맥을 통과시키고 절단을 안내하는 데 사용합니다. 폐 유출을 검사하십시오. (F) 1-좌심방을 열고, 2-베이스에서 정점까지 절단; 승모판과 좌심실을 검사하십시오. (G) 집게를 대동맥에 통과시키고 절단을 안내하는 데 사용합니다. 대동맥을 검사하십시오. (H) 왼쪽 심장을 따라 두 번 자르고 중간 조각을 10 % NBF에 넣습니다. (I) 오른쪽 심장을 따라 두 번 자르고 중간 조각을 10 % NBF에 넣고 크리스타 터미널을 잘라냅니다. (J) 심장의 바닥을 잘라내고 조각을 따라 두 번 자르고 중간 조각을 10 % NBF에 넣습니다. 약어 : SAN = 동방 결절; NBF = 중성 완충 포르말린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 크리스타 터미널의 샘플링포르 말린 고정 심장에서입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 돼지 심장의 해부 및 샘플링 프로토콜. (A) 심장의 외부 구성; (B) 꼬리 구멍에서 시작하여 우심방을 절개하고 우심방을 검사하고 크리스타 터미널을 찾은 다음 우심실을 열기 시작합니다. (c) 심실 중격과의 접합부를 따라 우심실을 다듬고 삼첨판 막을 검사합니다. (d) 척색건을 절단한 후 우심실을 검사하고 집게를 폐동맥에 삽입한 후 절단을 안내하는 데 사용합니다. (e) 폐 유출을 검사하는 단계; 좌심방을 절편 한 후 좌심실을 기저부에서 정점으로 자릅니다. (f) 승모판과 좌심실을 검사하고, 척대건을 절단하는 단계; 대동맥을 통해 집게를 놓고 절단을 안내하는 데 사용하십시오. (G) 대동맥을 검사하고 왼쪽 심장을 따라 두 번 절개하고 중간 조각을 10 % NBF에 넣습니다. (H) 오른쪽 심장을 따라 두 번 자릅니다. 중간 조각을 10 % NBF에 넣습니다. (I) 크리스타 터미널을 잘라내고 조각을 10% NBF에 놓습니다. (J) 심장의 기저부를 잘라내고 조각을 따라 두 번 자르고 중간 조각을 10% NBF에 넣습니다. (K) 관상 동맥을 다듬고 밤새 고정 한 다음 3mm 간격으로 여러 번 가로 절단합니다. 약어 : NBF = 중성 완충 포르말린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 소의 심장에서 해부 및 샘플링 프로토콜. (A) 심장의 외부 구성; (B) 꼬리 구멍에서 시작하여 우심방을 절개하고 우심방을 검사하고 크리스타 터미널을 찾은 다음 우심실을 열기 시작합니다. (c) 심실 중격과의 접합부를 따라 우심실을 다듬고 삼첨판 막을 검사합니다. (D) 파라코날 홈과 평행하게 절단을 계속하고 집게를 폐동맥을 통과시켜 절단을 안내하는 데 사용합니다. (E) 폐 유출을 검사하고 폐정맥과 좌심방을 절단하기 시작한 다음 좌심실을 기저부에서 정점까지 계속 절단합니다. (f) 승모판과 좌심실을 검사하고, 척대건을 절단하는 단계; (G) 집게를 대동맥에 통과시키고, 절단을 안내하고, 대동맥을 검사하는 데 사용합니다. (H) 크리스타 터미널을 잘라내고 조각을 10% NBF에 놓습니다. (I) 왼쪽 심장을 따라 두 번 자르고 중간 조각을 10 % NBF에 놓습니다. (J) 오른쪽 심장을 따라 두 번 자르고 중간 조각을 10 % NBF에 놓습니다. (K) 심장의 바닥을 잘라내고 조각을 따라 두 번 자르고 중간 조각을 10 % NBF에 놓습니다. 약어 : NBF = 중성 완충 포르말린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 개의 심장에 있는 우심실, 우심방 및 삼첨판 막의 조직학적 검사. H&E 염색. (a) 우심실, 우심방 및 삼첨판막의 조직학적 샘플; (B) 우심실, 우심방 및 삼첨판 판막. 스케일 바 = 500 μm; (C) 우심실, 우심방 및 관상 동맥. 스케일 바 = 100 μm; (D) 우심방. 스케일 바 = 500 μm. 약어 : H & E = 헤 마톡 실린 및 에오신; RV = 우심실; RA = 우심방; Ts-V = 삼첨판 막; CA = 관상 동맥; EnC = 심내막; MC = 심근; EpC = 심 외막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 개의 심장에있는 좌심실, 좌심방 및 승모판의 조직 학적 검사. H&E 염색. (a) 좌심실, 좌심방 및 승모판막의 조직학적 샘플; (B) 좌심방. 스케일 바 = 500 μm; (C) 좌심방, 좌심실, 관상 동맥 및 신경. 스케일 바 = 100 μm; (D) 관상 동맥, 신경. 스케일 바 = 50 μm. 약어 : H & E = 헤 마톡 실린 및 에오신; LA = 좌심방; LV = 좌심실; Mt-V = 승모판; CA = 관상 동맥; EnC = 심내막; MC = 심근; EpC = 심 외막; NV = 신경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 개 심장의 심실 중격, 우심방 및 삼첨판 막의 조직 학적 검사. H & E 염색 (A) 심실 중격, 우심방 및 삼첨판 판막 조직 학적 샘플; (B) 심실 중격, 우심방 및 삼첨판 판막. 스케일 바 = 500 μm. 약어 : H & E = 헤 마톡 실린 및 에오신; IVS = 심실 중격; RA = 우심방; TS-V 삼첨판 막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 : 개 심장에있는 동방 결절의 조직 검사. H&E 염색. (a) 크리스타 말단의 조직학적 샘플; (B) 동방 노드 4배 배율. 스케일 바 = 500 μm; (C) 동방 결절 20배 확대. 스케일 바 = 100 μm; (D) 동방 결절 40배 확대. 스케일 바 = 50 μm. 약어 : H & E = 헤 마톡 실린 및 에오신; SA 노드 = 동방 노드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 고양이의 포르말린 고정 심장에 대한 해부 프로토콜. (A) 심장의 외부 구성; (B) 집게를 두개골 및 폐정맥을 통과시킵니다. 집게는 밑면에서 꼭대기까지 세로 부분을 안내합니다. (c) 절단 후 4 챔버도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11 : 고양이 심장의 조직 학적 샘플. H&E 염색. (a) 심장-조직학적 샘플의 정점; (b) 심장-조직학적 샘플의 기저. 약어 : H & E = 헤 마톡 실린 및 에오신; LV = 좌심실; IVS = 심실 중격; RV = 우심실; LA = 좌심방; MV = 승모판; TS-V = 삼첨판 막; RA = 우심방. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 종 | 연령 | 평균 %BW | (LV + S)/RV | 인용 번호 |
| 고양이 | 신생아 | 0.77% | - | 7 |
| 고양이 | 성인 | 0.33%-0.46% | 2.94-4.17 | 8, 5, 11 |
| 개 | 신생아 | 0.47%-0.76% | - | 8, 7 |
| 개 | 성인 | 0.70%-0.85% | 2.39-5.12 | 8, 6, 11 |
| 돼지 | 성인 | 0.32%-0.48% | 2.38-3.84 | 11 |
| 양 | 성인 | 0.17%-0.65% | 2.63-4.54 | 11 |
| 암소 | 성인 | 0.30%-0.66% | 2.43-4.00 | 11 |
표 1: 동물의 정상 심박수/체중 비율 및 심실 비율에 대한 기준값. 고양이, 개, 돼지, 양 및 소에 대한 심장 측정. 약어 : BW = 체중; LV = 좌심실; S = 심실 중격; RV = 우심실.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
현재 프로토콜을 수행할 때 일관된 결과를 위해 몇 가지 중요한 단계를 신중하게 고려해야 합니다. 어린 동물에서 심장 측정은 성인의 심장 측정 (심실 벽 두께 포함)과 다르며 일반적으로 심장은 체중11,12의 더 큰 비율을 나타냅니다. 심실 비대의 정도는 일반적인 체중 공식, 좌심실과 중격 사이의 비율을 자유 우심실 무게로 나눈 값, 정상적인 조건에서 성숙한 동물에서 2.8-4.0이어야합니다 (표 1)를 적용하여 정량화 할 수 있습니다. 이 비율이 4.0을 초과하면 좌심실 비대를 나타내고 2.8보다 작 으면 우심실 비대 4,11,12를 나타냅니다. 챔버의 값을 얻으려면 우심실 자유 벽과 우심방 분리 될 관상 동맥 홈을 따라 해부되어야합니다. 좌심방에서 좌심실의 해부는 방실 링4에서 이루어집니다.
심장은 큰 혈관을 절단하여 신체에서 분리됩니다. 큰 혈관의 섹션이 심장 기저부에 너무 가까우면 주로 심방과 귓바퀴와 같은 여러 구조가 손상 될 수 있습니다. 이 과정을 용이하게하려면 심장 복부를 부드럽게 당겨 심장 기저부 위의 큰 혈관을 적절하게 절단해야합니다. 두 번째 중요한 단계는 심장에 대한 상세한 구조적 지식이 필요한 개별 해부학 적 구조 인 crista terminalis의 형태를 인식하는 것입니다. SA 노드는 조직학적 과정 동안 블록 내의 조직 샘플 배열을 특별히 고려하여 조심스럽게 수확하고 매립해야 합니다.
"4 챔버"기술의 수정은 조직 학적 차단 체계를 1 블록에서 2 블록으로 변경하는 것이 었습니다. 광범위하게 사용되는 조직학적 카세트의 표준 치수와 적응된 조직학적 절차(회전식 마이크로톰 염색 스테이션 포함)는 조직 왜곡 없이 심장의 전체 섹션을 하나의 블록에 맞추기에 적합하지 않습니다. "4 챔버"기술은 심장 챔버의 구조 검사를 용이하게하지만 전도성 시스템의 검사를 제한합니다. 이것은 심장 부정맥이 문서화 된 경우에 특히 중요합니다. 또한 "4 챔버"기술이 NBF에 고정 된 조직을 필요로한다는 점을 고려할 때 세균학 및 분자 생물학과 같은 몇 가지 추가 검사가 어느 정도 손상 될 수 있습니다.
고양이 또는 작은 강아지의 심장에 관해서는 고정 된 조직에서 정확한 표준 심 초음파 계획을 얻습니다. 4 챔버보기는 특히 심실 또는 심방 크기1에 변화가있는 경우 챔버 치수에 유용합니다. 심 초음파에 의한 임상 검사 중에 얻은 것과 계획된 총 트리밍의 완벽한 중첩과 관련된 이점 외에도이 기술은 심장의 주요 구성 요소 대부분을 단 두 개의 조직 학적 블록에 포함하는 이점을 제공합니다.
돼지에 기술된 "유입-유출" 방법은 관상동맥 샘플링 단계를 추가하여 인간의 심장에서 사용되는 프로토콜로부터 채택되었다. 현재 설명된 심장 해부 프로토콜은 샘플링을 위한 표준 지점을 보여줍니다. 또한, 해부가 프로토콜에서 다루는 것 이외의 다른 병변을 관찰하거나 의심하는 경우 관심 영역에서 보충 샘플을 수집해야합니다.
현재의 프로토콜을 개발하는 동안, 주요 심장 곡선(12)의 초기 종방향 절단을 포함하는 방법 및 "빵 덩어리"/단축 기술(9,11)과 같은 다른 방법이 연구되었다. 주요 심장 곡선의 세로 절단을 포함하는 기술은 생물 의학 교육12에서 자주 사용되는 더 간단한 프로토콜입니다. 단축 절편 기술("빵 덩어리 기술")은 하나의 단축 섹션(11) 또는 정점으로부터 기저부를 향한 1-2cm 두께의 일련의 섹션으로 수행될 수 있으며, 방실 장치(9)는 그대로 유지된다. 이 기술은 해부가 심근 병리 (염증성 병리 및 심근 병증 포함)를 의심하지만 판막 구성 요소의 표면 검사의 단점이있는 경우에 가장 적합합니다9.
이 두 기술 모두 심장 해부학에 대한 비교적 기본적인 지식을 가진 개인이 쉽게 마스터할 수 있지만 각 심장 구성 요소의 조직학적 샘플링 및 가중치에 대한 강력한 포인트가 부족합니다. 이러한 방법을 진행한 후, 후속 수확 절차에는 관심 영역을 식별하고 일정한 샘플을 얻기위한 힘든 작업이 필요합니다. 이 방법을 사용하여 해부 된 심장에서 두 반쪽의 개별 계량은 그들 사이의 비율을 계산할 수있는 노력이 필요합니다. 단축 방법은 심내막 및 심장 기저부에 위치한 모든 구성 요소의 검사를위한 추가 단계가 필요합니다. 또한 이러한 방법에 따른 수확 절차는 관심 영역을 식별하고 일정한 샘플을 얻기 위한 힘든 작업으로 구성됩니다.
이 원고는 일부 표준 심장 해부 프로토콜의 핵심 요소를 제시하여 전체 검사 접근 방식과 조직 병리학 검사에 일반적으로 사용되는 샘플링 부위를 강조합니다. 기술의 향후 적용과 관련하여 제시된 프로토콜의 주요 목적은 상세한 심장 평가가 필요한 모든 실험 연구에서 쉽게 사용할 수있는 심장 해부에 대한 강력한 지침을 제공하는 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline solution | B. BRAUN MELSUNGEN AG | W04479004 | For washing all the blood, and blood clots from the heart. |
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Q Path | 11699404 | Materials for collecting histopathology samples. |
| Bone cutting forceps | HELEN SRL | LS109HV | Sturdy instrument for cutting bone. |
| Cutting board | Ambition | 86304 | For an easier manipulation, and cutting the organs. |
| Decalcifying solution | Thermo Scientific TBD-2 | 6764004 | 1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid. |
| Digital camera | Canon Inc. | PowerShot SX540 HS | For photographic, and videographic documentation. |
| Forceps | MKD-Medicale | 15-430 | Dissection instruments. |
| Histological cassettes | Q Path | 720-2215 | Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm |
| Knife | TEHNO FOOD COM SERV SRL | D2006/15 | Sharp blade for cutting soft tissue. |
| Latex gloves | MKD-Medicale | SANTEX-S | Protection equipment. |
| Mask | MKD-Medicale | 21221 | Protection equipment. |
| Petri dishes | MKD-Medicale | 0598-1V | Materials for collecting ancillary testing samples. |
| Plastic recipients | Corning Gosselin | TP200-02 | Materials for collecting histopathology samples. |
| Scale | ESPERANZA | MEEKS008 | For weighing the organs. |
| Scale | White Deals | 72 | For weighing the subjects. |
| Scalpel | MKD-Medicale | 10322E | Sharp blade for cutting soft tissue. |
| Scissors | MKD-Medicale | 13-260 | Dissection instruments. |
| Scrub | MKD-Medicale | 410100-52 | Protection equipment. |
| Syringes | MKD-Medicale | 10573EU | Materials for collecting ancillary testing samples. |
References
- Ashworth, M. Pathology of Heart Disease in the Fetus, Infant and Child: Autopsy, Surgical and Molecular Pathology. , Cambridge University Press. Cambridge. (2019).
- Barone, R. Anatomie Comparée des Mammifères Domestiques: Angiologie. Vigot, , Lyon. (2011).
- Basso, C., et al. Guidelines for autopsy investigation of sudden cardiac death: 2017 update from the Association for European Cardiovascular Pathology. Virchows Archiv. 471 (6), 691-705 (2017).
- Bishop, S. P. Chapter 37 - Necropsy Techniques for the Heart and Great Vessels. Textbook of Canine and Feline Cardiology: Principles and Clinical Practice,.2nd ed. Fox, P. R., Sisson, D., Moïse, N. S. , W. B. Saunders. Philadelphia, PA. 846-848 (1999).
- Joseph, D. R. The ratio between the heart-weight and body weight in various animals. Journal of Experimental Medicine. 10 (4), 521-522 (1908).
- Keenan, C. M., Vidal, J. D. Standard morphologic evaluation of the heart in the laboratory dog and monkey. Toxicologic Pathology. 34 (1), 67-74 (2006).
- Latimer, H. B. Variability in body and organ weights in the newborn dog and cat compared with that in the adult. The Anatomical Record. 157 (3), 449-456 (1967).
- Lee, J. C., Taylor, F. N., Downing, S. E. A comparison of ventricular weights and geometry in newborn, young, and adult mammals. Journal of Applied Physiology. 38 (1), 147-150 (1975).
- McDonough, S. P., Southard, T. Necropsy Guide for Dogs, Cats, and Small Mammals. , John Wiley & Sons. 9 (2016).
- Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. Laboratory Methods in Histotechnology. , Armed Forces Institute of Pathology-American Registry of Pathology. Washington, DC. 29-58 (1992).
- Robinson, W. F., Robinson, N. A. Chapter 1 - Cardiovascular System. Jubb, Kennedy & Palmer's Pathology of Domestic Animals, 6th ed. Grant Maxie, M., Saunders, W. B. 3, 12-49 (2016).
- Tabaran, A. F. Autopsie et Medecine Legale: Guide de Travaux Pratiques. , Academic Press. 21-86 (2020).
- Autopsypathology.net. , Available from: http://autopsypathology.net/wpcontent/uploads/2016/02/rcpath_cardiacdeath_jul2015.pdf (2021).
- Pathology.ucla.edu. , Available from: http://pathology.ucla.edu/workfiles/Education/Residency%20Program/Gross%20Manual/Endomyocardial%20Biopsy%20(EMB).pdf (2021).
- Arbeitsgruppen Sudden Cardiac Death. , Available from: http://www.sgrm.ch/medizin/arbeitsgruppen/sudden-cardiac-death.html (2021).
- Toxpath.org. , Available from: https://www.toxpath.org/Trimming-N-Collection-Training.asp (2021).
- YouTube.com. , Available from: httpswwwyoutubecomwatchvxkJ2WGqi2Qw&t2494s (2021).
