Summary
Karmaşık anatomi nedeniyle, kardiyak örnekler için sürekli tekrarlanabilir bir diseksiyon ve hasat protokolünün uygulanması zor olabilir. Bu yazıda bazı standart kardiyak diseksiyon protokollerinin temel unsurları sunulmakta ve hem brüt inceleme yaklaşımları hem de histopatolojik inceleme için yaygın olarak kullanılan örnekleme alanları vurgulanmaktadır.
Abstract
Standart brüt muayene ve örnekleme, büyük hayvanlarda yürütülen kardiyovasküler hastalıkların deneysel çalışmalarının tekrarlanabilirliği ve başarısında kilit unsurlardır. Kalbin karmaşık anatomisi, türler arası farklılıklar ve telafi edici ve patolojik reaksiyon türleri göz önüne alındığında, tutarlı protokollerin uygulanması zordur. Çoklu diseksiyon protokollerinin kullanımı genellikle sektörün deneyimine uyacak şekilde uyarlanır ve kişisel tercihler deneysel ve gözlemciler arası değişkenlik kaynağı olmaya devam eder. Burada amaç, kardiyovasküler hastalıkların modelleri olarak yaygın olarak kullanılan bazı türlerde (köpekler, domuzlar, ruminantlar ve kediler dahil) kalbin ana anatomik özelliklerini ve yer işaretlerini, diseksiyon protokollerini ve histolojik örnekleme standartlarını sunmaktır.
Burada iki standart brüt muayene protokolü sunulmaktadır. Birincisi, kalpten ve büyük damarlardan (köpeklerde, ruminantlarda ve domuzlarda sıklıkla kullanılan) fizyolojik kan akış yönünü takip eden giriş-çıkış yöntemi ve ikincisi, dört odacıklı diseksiyon tekniği (kedilerde örneklenmiştir). Her iki teknik de belirli deneysel koşullarda herhangi bir türe uyarlanabilir. Örnekleme protokolleri tüm ilgi alanlarını (sinoatriyal düğüm, ventriküller, interventriküler septum, atriyum, kapakçıklar ve aort) içerir ve uygun şekilde gerçekleştirilirse, deneysel çalışmaların hem tekrarlanabilirliğini hem de güvenilirliğini arttırır.
Introduction
Kardiyak duvar kalınlığının değerlendirilmesine müdahale edebilen karmaşık anatomi ve erken titizlik nedeniyle, kalbin brüt muayenesi zordur ve teknikle ilgili çeşitli veya yorumlama hatalarına eğilimlidir. Bu, interspesifik morfolojik varyasyonlar ve birçok klinik, majör kardiyak patolojinin (erken koroner kalp hastalıkları, fibroz, arterit ve amiloidoz vakaları dahil) özünde histolojik patolojiler olan herhangi bir büyük değişiklikle ilişkili olmadığı gerçeğiyle güçlendirilmiştir. Standartlaştırılmış bir diseksiyon ve histolojik numune toplama protokolü, gözlemciler arasında tutarlılık ve aynı zamanda kardiyovasküler hastalıkların deneysel çalışmalarının karşılaştırılabilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlayabilir.
Örnekler iki köpekten (Canis lupus familiaris) (3 yaşında, erkek bir Fransız Bulldog ve 8 yaşında, dişi karışık cins), bir kediden (Felis catus) (6 yaşında, erkek bir Avrupa stenografisi), bir evcil domuzdan (Sus scrofa domesticus) (1 yaşında, erkek Büyük Beyaz) ve bir (Bos taurus) (2 aylık, dişi Holstein) toplandı. Seçilen türlerin her biri, farklı bir hastalık için kardiyovasküler bir model olarak özel bir kullanıma sahiptir; örneğin, köpekler aritmi modellemesi için tercih edilen bir modeldir; HCM prevalansının en yüksek olduğu türler olduğu için hipertrofik kardiyomiyopati (HCM) için kediler tercih edilir; domuzlar akut miyokard enfarktüsü için bir model olarak kullanılır; ruminantlar, çayırlarda kolayca bulunabilen toksinlere maruz kalmaları nedeniyle zehirlenme için bir model olarak kullanılır11.
Bu yazıda, deneysel kardiyovasküler hastalıklarda kalbin brüt ve histolojik incelemesini iyileştirmek için tasarlanmış bir nekropsi protokolü ve kalbin iki diseksiyon protokolü sunulmuştur. Açıklanan protokoller, veterinerlik ders kitapları 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, dergi literatürü 3,13,14, resmi belgeler 15 ve web seminerlerinden alınan bilgilere dayanarak geliştirilmiştir 16 ,17. Bu çalışmada kullanılan örnekler, rutin otopsi teşhisi için USAMV Cluj-Napoca Patoloji Bölümü'ne sunulan kadavralardan toplanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneysel protokol biyoetik anlaşma (2022'den itibaren No. 311) aldı ve hem ulusal (2014 tarihli 43 sayılı Kanun) hem de Avrupa (2010'dan itibaren 63 sayılı AB Direktifi) mevzuatına uygun olarak Tarım Bilimleri ve Veterinerlik Üniversitesi Cluj-Napoca Biyoetik Kurulu tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve araçlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız.
1. Nekropsi protokolü
NOT: Sunulan tüm türler için aynı nekropsi protokolünün kullanılması tavsiye edilir, çünkü daha kolay erişim 2,12. Aşağıdaki adımlar, orta büyüklükte bir köpekte gerçekleştirilen nekropsi'yi temsil eder. Farklı konularda nekropsiler yaparken adımları uyarlayın.
- Konuyu tartın ve sol tarafındaki nekropsi tablasının üzerine yerleştirin (Şekil 1A). Konunun dış incelemesine devam edin (cutis ve mukozaların incelenmesi ve palpasyonuyla, renk, tutarlılık ve hacimdeki tüm değişiklikleri not ederek).
- Bir bıçak (veya neşter) kullanın ve sağ aksillada 7 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 1A).
- Koxofemoral kavşağı bulun (Şekil 1A,B). Kapsülü bir bıçakla açın. Femur başının bağını kesin (Şekil 1B).
- Aksilla kraniyalindeki deri insizyonunu mandibuler simfize ve kaudal olarak perineye uzatmak için bıçağı kullanın (Şekil 1B).
- Cildi neşterle çıkarın ve torasik ve abdominal duvarı ventral orta hattan vertebral enine süreçlerin seviyesine kadar maruz bırakın (Şekil 1B).
- Neşter ve forseps ile, karın duvarından bir flep oluşturun, ventrocaudal sağ kostal kemere. Karın boşluğunu makasla açın - sağ hipokondriyumun kaudal yönünü takip edin (Şekil 1B).
- Kesiyonu sağ paralomber bölge boyunca kaudal olarak eksternal iliak tepeye kadar uzatın. Daha sonra, insizyonu linea alba'nın kasık yerleştirilmesine kadar uzatın.
- Kısaca, karın organlarını in situ olarak inceleyin (organların renk, kıvam, hacim ve pozisyonundaki değişiklikleri not ederek).
- Neşter ve forseps ile diyaframı en yüksek noktada delin (Şekil 1B).
- Kemik kesici forseps kullanarak sağ göğüs kafesini iki uzunlamasına kesitle çıkararak göğüs boşluğuna girin. Kaburgaların parasternal kıkırdaklı segmentini kesitleyin. Daha sonra, kaburgaların dorsal segmentini, kostovertebral eklemlere proksimal olarak kesitleyin (Şekil 1C).
- Kalbi yerinde inceleyin (Şekil 1C). Boyuta, konuma, renge, bitişik dokularla bağlantılara ve palpasyonla, tutarlılıktaki herhangi bir değişikliğe dikkat edin9.
NOT: Bir tromboz veya konjenital kalp hastalığı varsa, kalp in situ olarak diseke edilmelidir (bu yaklaşım büyük damarların tam olarak incelenmesine izin verir). - Perikardiyal boşluğu, tabandan kalbin tepesine kadar uzunlamasına bir kesitle incelemek ve açmak için makas kullanın. Perikard boşluğunu ve epikardı inceleyin (renk, tutarlılık ve hacimdeki değişiklikleri fark ederek)12.
- Kalbi makasla serbest bırakın, aort, pulmoner gövde ve her iki vena kavanın enine bölümlerini verin. Sağ atriyuma girişten en az 1 cm yukarıda superior vena kava kesitini korumak için crista terminalis11,13'tür.
- Organın dış konturunu, epikardın görünümünü, epikardın şeffaflığı ile miyokardın görünümünü ve büyük damarların dış görünümünü inceleyin (Şekil 2A).
NOT: Genel olarak, perikardın açılması ve incelenmesi, türler arasında bazı farklılıklar göstermektedir. Perikard boşluğunun incelenmesi, genel perikardiyal içeriğin perikardının şeffaflığı yoluyla harici bir muayene ve değerlendirme ile başlar 1,2. Bir kedi veya köpekte, perikard tipik olarak yaklaşık 0.25 mL / kg ince, berrak, yarı saydam ila açık sarı sıvıiçerir 9. Herhangi bir patolojik efüzyon varsa, steril bir şırınga veya vakumlayıcı tüp ile toplanmalıdır.
2. Diseksiyon protokolü
NOT: Kalp için her biri çeşitli avantajlara sahip çeşitli nekropsi teknikleri kullanılır. Bu protokol için en çok kullanılan tekniklerden ikisi seçildi: 1) valflerin ve endokardın daha iyi incelenmesini sağlayan vetürlerin çoğu için kullanılan bir protokol olan "giriş-çıkış yöntemi" 2,11,12,16 ve 2) tipik olarak kediler veya küçük boyutlu köpekler için kullanılan "dört odacıklı diseksiyon" / "ekokardiyografik düzlem" tekniği1, 17.
- Kardiyak diseksiyon için "giriş-çıkış yöntemi" 2,11,12,16
- Kalbi atriyal yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 2A).
- Kaudal vena kavadan sağ atriyuma doğru geniş bir şekilde kesmek için makas ve dişsiz forseps kullanın (Şekil 2B). Crista terminals/sinoatriyal düğümü (SA nodu) ortaya çıkarmak için sağ auriküler uzantıya doğru kesime devam edin. Triküspid kapağı dorsal görünümden kontrol edin.
- Sağ atriyumdan sağ ventrikül ve interventriküler septum arasındaki kavşağa kadar bir kesit kesin (Şekil 2C). Sağ atriyoventriküler kapağı görüntüleyin.
- İnterventriküler septum boyunca sağ ventrikülsüz duvarı kesitleyin. Pulmoner gövdenin orijinine kadar bölüme devam edin (Şekil 2C,D).
- Kordae tendineae ve papiller kaslar dahil olmak üzere sağ atriyoventriküler kapakları iyice inceleyin (Şekil 2D). chordae tendineae kesin.
- Forsepsleri pulmoner gövdeden geçirin ve gövdeyi uzunlamasına kesin (Şekil 2E). Pulmoner çıkış yolunu, pulmoner gövde orijinini ve semilunar kapakları inceleyin.
- Sol atriyumu pulmoner damarlardan sol kulak kepçesinin ucuna kadar kesin (Şekil 2F). Biküspid (mitral) kapağı dorsal görünümden kontrol edin.
- Kalbi interventriküler septum aşağı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 2F). Ventrikül serbest duvarında ventrikül tabanından kardiyak tepeye kadar büyük bir kesi yapın. Sol atriyoventriküler kapağı tamamen görüntüleyin.
- Sol atriyoventriküler kapağın tepesinin kordae tendineasını kesin.
- Forsepsleri sol ventrikül çıkış yolundan geçirin ve aortu açmak için kılavuz olarak kullanın (Şekil 2G).
- Tüm kan pıhtılarını çıkarmak için tuzlu su çözeltisi kullanın. Tüm kan pıhtıları çıkarıldıktan sonra, kalp ağırlığını vücut kütlesi veya standart kalp ağırlığı tabloları ile değerlendirin ve karşılaştırın (Tablo 1)11,13.
- Kalbi tartın.
- Sadece SA düğümü ilgi çekici ise, sol ventrikül muayenesinden sonra, tüm kalbi 24 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) içine yerleştirin ve crista terminallerini örneklemek için sağ atriyumu kesin.
NOT: Bu teknikle, sol ve sağ ventriküller kolayca takdir edilebilir. Sol ve sağ ventrikül duvar kalınlığı arasındaki oran, türlere ve cinslere göre küçük farklılıklarla 3: 1'dir; hayvan fetüs kalbi için oran 1: 112'dir.
3. Histoloji için örnekleme protokolü16
- Bir neşterle, sağ atriyumu, triküspid kapağı ve sağ ventrikül serbest duvarını içeren iki uzunlamasına paralel kesim (yaklaşık 5 mm arayla) yapın (Şekil 2I)
- Sol atriyum, mitral kapak, dorsal papiller kas ve sol ventrikülü içeren iki uzunlamasına paralel kesim (yaklaşık 5 mm arayla) yapın (Şekil 2H).
- Kalbin dorsal üst-üçte birinde, interventriküler septum, sağ atriyum, aort, aort kapağı ve triküspid kapak dahil olmak üzere bir çizgiyi takip ederek kalbin tabanını enine kesitleyin (Şekil 2J).
- Aort tabanını ve interventriküler septumu içeren iki uzunlamasına paralel kesi yapın (Şekil 2J).
- Crista terminallerinin etrafındaki sağ atriyumu kesin ve SA düğümünün altı parçasını elde etmek için kristanın uzunlamasına ekseni üzerinde (yaklaşık 3-4 mm aralıklı) enine yönlendirilmiş birkaç paralel kesit sağlayın (Şekil 3, Şekil 4I ve Şekil 5H).
- Elde edilen dokuları histolojik kasetlerde kesin.
NOT: Önerilen engelleme protokolü: adım 3.1.-histolojik blok 1 (Şekil 6 bu bloktan elde edilen slaytı gösterir.), adım 3.2.-histolojik blok 2 (Şekil 7 bu bloktan elde edilen slaytı gösterir), adım 3.4.-histolojik blok 3 (Şekil 8 bu bloktan elde edilen slaytı gösterir), adım 3.5.-histolojik blok 4 (Şekil 9 bu bloktan elde edilen slaytı gösterir). - Dokuları en az 48 saat boyunca% 10 NBF'ye batırın.
4. Koroner arterlerin örneklenmesi 3,10,14
- Koroner arterleri kardiyak parakonal oluktan diseke etmek için forseps ve neşter kullanın (Şekil 4K). Koroner arteri gece boyunca% 10 NBF'de sabitleyin.
- Gerekirse,% 8 formik asit ve hidroklorik asidin 1: 1'lik bir karışımında yeterince kireçlenin.
- 3 mm aralıklarla birden fazla enine kesim yapın. Bölümleri bir kasete yerleştirin ve ardından kaseti gömene kadar% 10 NBF'ye yerleştirin.
NOT: Domuzlar, özellikle koroner kalp hastalığı söz konusu olduğunda, insanlar için kardiyak bir model olarak kullanılabilir. Bu nedenle koroner arterlerin ek örnekleri ve histolojik kesitleri önerilmektedir 3,10,14.
5. Kalbin "dört odacıklı"/"ekokardiyografik düzlem" diseksiyon tekniği 1,17
NOT: Dört odacıklı diseksiyon tekniği, standart görünüm1'i elde etmek için tabandan kalbin tepesine kadar bir kesimden oluşur. "Dört odacıklı" teknik en iyi sabit dokulara uygulanır.
- Tüm kalbi en az 48 saat boyunca% 10 NBF'ye yerleştirin.
- Kalp en az 48 saat boyunca %10 NBF'de sabitlendikten sonra (Şekil 10A), biri kraniyal kava-sağ atriyum-triküspid kapak-sağ ventrikülden, ikincisi pulmoner ven-sol atriyum-mitral kapak-sol ventrikülden olmak üzere iki dişsiz düz diseksiyon forsepsi yerleştirin (Şekil 10B).
- Forseps kolları arasındaki boşluğu, tabandan kalbin tepesine kadar kesme bıçağı için kılavuz olarak kullanın (Şekil 10C). Adım 5.2'de açıklanan bölümden yaklaşık 5 mm ayrı olarak ilave bir uzunlamasına kesit sağlayın. aortu içeren kardiyak segmentte.
- Transversal bir insizyon ile, kalp tabanını tepeden tamamen ayırın. Her doku segmentini histolojik bir kasete yerleştirin.
NOT: Önerilen blokaj protokolü: kardiyak apeks-histolojik blok 5 (Şekil 11A bu bloktan elde edilen slaytı gösterir), kardiyak baz-histolojik blok 6 (Şekil 11B bu bloktan elde edilen slaytı gösterir). - Kasetleri gömene kadar %10 NBF içine yerleştirin. Tüm kardiyak örnekleri% 10 NBF'de (doku hacminin 10 katından fazla) sabitleyin, rutin olarak parafin balmumu, 4 μm kalınlığında kesit ve daha önce tarif edilen bir protokol10'u izleyerek hematoksilin ve eozin boyası (H & E boyası) ile boyanın.
NOT: Miyokarditten şüpheleniliyorsa, "mikrobiyolojik ve viral çalışmalar için steril cerrahi malzeme ve steril numune kabı ile steril koşullar altında bir parça taze kalp dokusu tutulmalıdır"13.
6. Fotoğraflı belgeler
NOT: Fotografik dokümantasyon, nekropsi incelemesinde isteğe bağlı bir adımdır. Bununla birlikte, fotoğraf ve video kayıtlarının "normal ve anormal anatominin doğru bir şekilde belgelendirilmesi"3 için gereklidir.
- Doğru fotoğrafik dokümantasyon için, "kalp dokularının ilerleyici diseksiyonu"13 yaparken dijital görüntüler alın. Fotoğrafik dokümantasyon ve fotoğraf15 genel görünüm-ön ve arka kılavuzlarına bakınız; kalbin bir dilimi; ve şüpheli lezyonlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, anatomik özellikleri görselleştirmek ve dört farklı türde (köpek, kedi, domuz ve) kalbin histolojik incelemesi için örnekler toplamak için kullanıldı. Nekropsi protokolü, yukarıda belirtilen türlerin her birinde tekrarlandı, ancak sadece köpeklerde gösterildi. Nekropsi protokolü, vücudun (Şekil 1A) (deri, keşfedilebilir lenf düğümleri ve dış mukoza dahil) kapsamlı bir dış muayenesiyle, toplam ağırlığın ölçülmesiyle ve hayvanın genel durumunun puanlanmasıyla başlar. Dış muayeneden sonra, nekropsi vücudun kısmi bir derisi (subkutis ve yüzeysel kasları iyice incelemeye yönelik) ve ana vücut boşluklarının açılmasıyla devam eder (Şekil 1B-D).
Karın boşluğu tipik olarak incelenecek ilk kişidir (Şekil 1C), ardından periton boşluğunun ve karın organlarının kapsamlı bir in situ muayenesi, ardından diyaframın bölümlenmesi ve son olarak sağ hemitoraksın çıkarılması (Şekil 1D). Bu teknikle, torakoabdominal organların (perikardiyal boşluk ve kalp dahil) iyi bir in situ muayenesi sağlanabilir ve aynı zamanda bu organların lokal kan damarları, lenfatikler, bağlar ve sinirler ile bağlantılarının uygun bir şekilde değerlendirilmesine izin verilir. Perikard boşluğunun incelenmesi, kalbin uzunlamasına eksenini takiben parietal perikardın geniş bir şekilde bölümlenmesi ve ardından akciğer parankimine yakın kardiyak büyük damarların bölümlendirilmesiyle kalbin çıkarılmasıyla sağlanır. Kalbin dış muayenesini, kapsamlı bir incelemeye ve son olarak histopatoloji için doku örneklerinin uygun şekilde toplanmasına izin veren kalp boşluklarının bölümlenmesi izler. Kısaca iki kardiyak diseksiyon tekniği olan "kan akışı" (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5) ve "dört odacık" (Şekil 10) prosedürü ve sonuçları sunulmuştur.
"Kan akışı" tekniği köpeklerin, domuzların ve ruminantların kalbinde kullanılmıştır (Şekil 2, Şekil 4 ve Şekil 5). Kalp vücuttan çıkarıldıktan sonra, dış konfigürasyon gözlendi (Şekil 2A, Şekil 4A ve Şekil 5A). Diseksiyon yapılırken, atriyal konfigürasyona, sinoatriyal düğüm için tanımlamanın makroskopik elemanı olan crista terminallerine dikkat edilmelidir (Şekil 2B, Şekil 4B ve Şekil 5B). Protokolün adımlarına devam ettikten sonra (Şekil 2B-G, Şekil 4B-G ve Şekil 5B-G), diseksiyon tamamlanır ve histoloji için hasat protokolü başlatılabilir (Şekil 2H-J, Şekil 4G-J ve Şekil 5H-K). Alternatif olarak, crista terminalis, kalp sabitlendikten sonra% 10 NBF'de (Şekil 3) de hasat edilebilir. Köpeklerle karşılaştırıldığında, domuzun kalbinde gerçekleştirilecek ekstra bir adım vardır - koroner arterin toplanması (Şekil 4K).
Hasattan sonra, numuneler% 10 NBF'de sabitlendi, rutin olarak işlendi ve parafin mumuna gömüldü ve son olarak 4 μm'de kesitlendi ve H & E ile boyandı. Bu teknikle elde edilen histolojik slaytlar tipik olarak aşağıdakileri içerir: 1) sağ atriyum ve ventrikülün epikardı, miyokard ve endokardiyumu, triküspid kapak ve histolojik blok 1 için koroner arterler (Şekil 6); 2) sol atriyum ve ventrikülün epikardı, miyokard ve endokardiyumu, mitral kapak, koroner arterler ve histolojik blok 2 için kalp sinirleri (Şekil 7); 3) miyokard, interventriküler septumun endokardu ve sağ atriyumun epikardı ve histolojik blok 3 için triküspid kapak (Şekil 8); 4) Histolojik blok 4 için SA düğümünden çoklu kesitler (Şekil 9); 5) histolojik blok 5 için kalbin tepesinin epikardı, miyokard ve endokardı (sol ve sağ ventriküller ve interventriküler septum) (Şekil 11A); ve 6) histolojik blok 6 için kalp tabanının epikardı, miyokard ve endokardı (sol ve sağ atriyum, ventriküller, interventriküler septum, atriyoventriküler kapakçıklar ve koroner arterler) (Şekil 11B).
Resim 1: Bir köpekte nekropsi tekniği. (A) Konunun sol tarafa yerleştirilmesi; (B) karın boşluğunun açılması; (C) göğüs boşluğunun açılması; (D) göğüs boşluğunun incelenmesi. 1-7, önerilen insizyonların yerlerini ve sırasını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Köpeğin kalbinde diseksiyon ve örnekleme protokolü. (A) Kalbin dış konfigürasyonu; (B) Kaudal kavadan başlayın ve sağ atriyumu kesin, sağ atriyumu açın ve crista terminallerini gözlemleyin; (C) sağ ventrikülü interventriküler septum ile kavşak boyunca kesmek; triküspid valfi göstermek; (D) chordae tendineae kesildikten sonra, sağ ventrikülü inceleyin ve parakonal oluk boyunca kesime devam edin; (E) forsepsleri pulmoner gövdeden geçirin ve kesiği yönlendirmek için kullanın; pulmoner çıkışı incelemek; (F) 1-sol atriyumu açın, 2-tabandan, tepeye kadar kesilmiş; mitral kapağı ve sol ventrikülü inceleyin; (G) forsepsleri aorttan geçirin ve kesiği yönlendirmek için kullanın; aortu incelemek; (H) sol kalp boyunca iki kesim yapın ve orta parçayı %10 NBF'ye yerleştirin; (I) sağ kalp boyunca iki kesim yapmak, orta parçayı %10 NBF'ye yerleştirmek ve crista terminallerini kesmek; (J) kalbin tabanını kesin, parça boyunca iki kesim yapın ve orta parçayı% 10 NBF'ye yerleştirin. Kısaltmalar: SAN = sinoatriyal düğüm; NBF = nötr tamponlu formalin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Formalin sabit kalpten crista terminalis örneklemesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Domuz kalbindeki diseksiyon ve örnekleme protokolü. (A) Kalbin dış konfigürasyonu; (B) Kaudal kavadan başlayın ve sağ atriyumu kesitleyin, sağ atriyumu inceleyin, crista terminallerini bulun ve sağ ventrikülü açmaya başlayın; (C) interventriküler septum ile bağlantı noktası boyunca sağ ventrikülü kesin ve triküspid kapağı inceleyin; (D) chordae tendineae kesildikten sonra, sağ ventrikülü inceleyin, forsepsleri pulmoner gövdeden yerleştirin ve kesimi yönlendirmek için kullanın; (E) pulmoner çıkışı incelemek; sol atriyumu kestikten sonra, sol ventrikülü tabandan tepeye doğru kesin; (F) mitral kapağı ve sol ventrikülü incelemek ve chordae tendineae'yi kesmek; forsepsleri aorttan geçirin ve kesiği yönlendirmek için kullanın; (G) aortu incelemek, sol kalp boyunca iki kesik yapmak, orta parçayı %10 NBF'ye yerleştirmek; (H) sağ kalp boyunca iki kesik yapmak; orta parçayı% 10 NBF'ye yerleştirin; (I) crista terminallerini kırpın, parçayı %10 NBF'ye yerleştirin; (J) kalbin tabanını kesin, parça boyunca iki kesim yapın ve orta parçayı% 10 NBF'ye yerleştirin; (K) koroner arteri kesin, gece boyunca sabitleyin ve ardından 3 mm aralıklarla çoklu enine kesikler yapın. Kısaltma: NBF = nötr tamponlu formalin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: kalbindeki diseksiyon ve örnekleme protokolü. (A) Kalbin dış konfigürasyonu; (B) Kaudal kavadan başlayın ve sağ atriyumu kesitleyin, sağ atriyumu inceleyin, crista terminallerini bulun ve sağ ventrikülü açmaya başlayın; (C) interventriküler septum ile bağlantı noktası boyunca sağ ventrikülü kesin ve triküspid kapağı inceleyin; (D) kesiği parakonal oluğa paralel olarak devam ettirin, forsepsleri pulmoner gövdeden geçirin ve kesimi yönlendirmek için kullanın; (E) pulmoner çıkışı incelemek, pulmoner damarları ve sol atriyumu kesmeye başlamak ve daha sonra sol ventrikülü tabandan tepeye kesmeye devam etmek; (F) mitral kapağı ve sol ventrikülü incelemek ve chordae tendineae'yi kesmek; (G) forsepsleri aorttan geçirmek, kesiği yönlendirmek için kullanmak ve aortu incelemek; (H) crista terminallerini kesin ve parçayı %10 NBF'ye yerleştirin; (I) sol kalp boyunca iki kesim yapın ve orta parçayı %10 NBF'ye yerleştirin; (J) sağ kalp boyunca iki kesim yapın ve orta parçayı %10 NBF'ye yerleştirin; (K) kalbin tabanını kesin, parça boyunca iki kesim yapın ve orta parçayı% 10 NBF'ye yerleştirin. Kısaltma: NBF = nötr tamponlu formalin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Bir köpeğin kalbindeki sağ ventrikül, sağ atriyum ve triküspid kapağın histolojik incelemesi. H&E boyama. (A) Sağ ventrikül, sağ atriyum ve triküspid kapağın histolojik örneği; (B) sağ ventrikül, sağ atriyum ve triküspid kapak. Ölçek çubukları = 500 μm; (C) sağ ventrikül, sağ atriyum ve koroner arterler. Ölçek çubukları = 100 μm; (D) sağ atriyum. Ölçek çubukları = 500 μm. Kısaltmalar: H&E = hematoksilin ve eozin; RV = sağ ventrikül; RA = sağ atriyum; Ts-V = triküspid valf; CA = koroner arter; EnC = endokard; MC = miyokard; EpC = epikard. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Bir köpeğin kalbindeki sol ventrikül, sol atriyum ve mitral kapağın histolojik incelemesi. H&E boyama. (A) Sol ventrikül, sol atriyum ve mitral kapağın histolojik örneği; (B) sol atriyum. Ölçek çubukları = 500 μm; (C) sol atriyum, sol ventrikül, koroner arter ve sinir. Ölçek çubukları = 100 μm; (D) koroner arter, sinir. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: H & E = hematoksilin ve eozin; LA = sol atriyum; LV = sol ventrikül; Mt-V = mitral kapak; CA = koroner arter; EnC = endokard; MC = miyokard; EpC = epikard; NV = sinir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Bir köpeğin kalbindeki interventriküler septumun, sağ atriyumun ve triküspid kapağın histolojik muayenesi. H&E boyama (A) İnterventriküler septum, sağ atriyum ve triküspid kapak-histolojik örnek; (B) interventriküler septum, sağ atriyum ve triküspid kapak. Ölçek çubukları = 500 μm. Kısaltmalar: H&E = hematoksilin ve eozin; IVS = interventriküler septum; RA = sağ atriyum; Ts-V triküspid valf. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Bir köpeğin kalbindeki sinoatriyal düğümün histolojik incelemesi. H&E boyama. (A) Crista terminallerinin histolojik örneği; (B) sinoatriyal düğüm 4x büyütme. Ölçek çubukları = 500 μm; (C) sinoatriyal düğüm 20x büyütme. Ölçek çubukları = 100 μm; (D) sinoatriyal düğüm 40x büyütme. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: H & E = hematoksilin ve eozin; SA düğümü = sinoatriyal düğüm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Bir kedinin formalin sabit kalbi üzerinde diseksiyon protokolü. (A) Kalbin dış konfigürasyonu; (B) forsepsleri kranial kava ve pulmoner venlerden geçirmek; forsepsler uzunlamasına bölümü tabandan tepeye doğru yönlendirir; (C) Kesimden sonraki dört odacıklı görünüm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Bir kedinin kalbinin histolojik örnekleri. H&E boyama. (A) Kalp-histolojik numunenin tepesi; (B) kalp-histolojik numunenin tabanı. Kısaltmalar: H & E = hematoksilin ve eozin; LV = sol ventrikül; IVS = interventriküler septum; RV = sağ ventrikül; LA = sol atriyum; MV = mitral kapak; TS-V = triküspid valf; RA = sağ atriyum. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tür | Yaş | Ortalama %BW | (AG + S)/RV | Atıf numaraları |
| Kedi | Yenidoğan | 0.77% | - | 7 |
| Kedi | Yetişkin | 0.33%-0.46% | 2.94-4.17 | 8, 5, 11 |
| Köpek | Yenidoğan | 0.47%-0.76% | - | 8, 7 |
| Köpek | Yetişkin | 0.70%-0.85% | 2.39-5.12 | 8, 6, 11 |
| Domuz | Yetişkin | 0.32%-0.48% | 2.38-3.84 | 11 |
| Koyun | Yetişkin | 0.17%-0.65% | 2.63-4.54 | 11 |
| Yetişkin | 0.30%-0.66% | 2.43-4.00 | 11 |
Tablo 1: Hayvanlarda normal kalp ağırlığı/vücut ağırlığı oranı ve ventriküler oran için referans değerler. Kedi, köpek, domuz, koyun ve için kardiyak ölçümler. Kısaltmalar: BW = vücut ağırlığı; LV = sol ventrikül; S = interventriküler septum; RV = sağ ventrikül.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokolü gerçekleştirirken, tutarlı sonuçlar için birkaç kritik adım dikkatlice düşünülmelidir. Genç hayvanlarda, kardiyak ölçümler yetişkinlerdekilerden farklıdır (ventriküler duvar kalınlığı dahil) ve genellikle kalp, vücut ağırlığının daha büyük bir bölümünü temsil eder11,12. Ventriküler hipertrofinin derecesi, genel bir ağırlık formülü uygulanarak, sol ventrikül ile septum arasındaki oran, normal koşullar altında olgun hayvanlarda 2.8-4.0 olması gereken serbest sağ ventrikül ağırlığına bölünerek ölçülebilir (Tablo 1). Bu oran 4.0'ı aşarsa sol ventrikül hipertrofisini, 2.8'den az ise sağ ventrikül hipertrofisinigösterir 4,11,12. Odanın değerini elde etmek için sağ ventrikül serbest duvarı interventriküler duvar boyunca diseke edilmeli ve koroner oluk sağ atriyumdan ayrılmalıdır. Sol ventrikülün sol atriyumdan diseksiyonu atriyoventriküler halka4'te yapılır.
Kalp, büyük damarları keserek vücuttan ayrılır. Büyük damarların bölümleri kalp tabanına çok yakınsa, başta atriyum ve kulak kepçeleri olmak üzere çeşitli yapılar tehlikeye girebilir. İşlemi kolaylaştırmak için, büyük damarları kalbin tabanının üzerinde düzgün bir şekilde bölmek için kalbi ventralal olarak yavaşça çekmek gerekir. İkinci kritik adım, kalbin ayrıntılı yapısal bilgisini gerektiren ayrı bir anatomik yapı olan crista terminalis'in morfolojisini tanımaktır. SA düğümü, histolojik işlem sırasında bloklar içindeki doku örneklerinin düzenlenmesi için özel bir dikkatle dikkatlice toplanmalı ve gömülmelidir.
"Dört odacıklı" tekniğin modifikasyonu, histolojik blokaj şemasını bir bloktan ikiye değiştirmekti. Yaygın olarak kullanılan histolojik kasetlerin standart boyutları ve uyarlanmış histolojik prosedür (döner mikrotom boyama istasyonu dahil), doku distorsiyonu olmadan kalbin tüm bölümünü tek bir bloğa sığdırmak için uygun değildir. "Dört odacıklı" teknik, kalp odacıklarının yapısının incelenmesini kolaylaştırsa da, iletken sistemin incelenmesini sınırlar. Bu özellikle kardiyak aritmi belgelendiğinde önemlidir. Ayrıca, "dört odacıklı" tekniğin NBF'de sabit doku gerektirdiği göz önüne alındığında, bakteriyoloji ve moleküler biyoloji gibi birkaç ek inceleme belirli bir dereceye kadar tehlikeye girebilir.
Bir kedinin veya küçük boyutlu bir köpeğin kalbi söz konusu olduğunda, sabit doku üzerinde doğru bir standart ekokardiyografik plan elde edilir. Dört odacıklı görünüm, özellikle ventriküler veya atriyal boyutlarda farklılıklar varsa, oda boyutları için yararlıdır1. Ekokardiyografi ile klinik muayene sırasında elde edilenlerle planlanmış brüt kırpmanın mükemmel süperpozisyonu ile ilgili avantajlara ek olarak, bu teknik, kalbin anahtar bileşenlerinin çoğunu sadece iki histolojik bloğa dahil etme avantajını sunar.
Domuzlarda tanımlanan "giriş-çıkış" yöntemi, koroner arter örnekleme adımı eklenerek insanların kalplerinde kullanılan protokollerden uyarlanmıştır. Şu anda tarif edilen kalp diseksiyon protokolleri, örnekleme için standart noktaları göstermektedir. Ek olarak, dissektör protokolde kapsananlar dışında başka lezyonları gözlemlediğinde veya şüphelendiğinde, ilgi alanlarından ek örnekler toplanmalıdır.
Mevcut protokoller geliştirilirken, majör kardiyak eğrilerin ilk uzunlamasına kesilmesini içeren yöntem 12 ve "ekmek somunu" / kısa eksen tekniği 9,11 gibi diğer yöntemler incelenmiştir. Majör kardiyak eğrilerin uzunlamasına kesilmesini içeren teknik, biyomedikal eğitiminde sıklıkla kullanılan daha basit bir protokoldür12. Kısa eksenli kesitleme tekniği ("ekmek somunu tekniği"), bir kısa eksenli bölüm11 veya tepeden tabana doğru 1-2 cm kalınlığında bir dizi kesit ile gerçekleştirilebilir ve atriyoventriküler aparatbozulmadan bırakılır 9. Bu teknik, disperyonun miyokard patolojilerinden (inflamatuar patolojiler ve kardiyomiyopatiler dahil) şüphelenmesi, ancak kapak bileşenlerinin yüzeysel olarak incelenmesinin dezavantajı varsa en uygun olanıdır9.
Her iki teknik de kalp anatomisi hakkında nispeten temel bilgiye sahip bireyler tarafından kolayca öğrenilir, ancak her bir kardiyak bileşenin histolojik örneklemesi ve ağırlıklandırılması için sağlam noktalardan yoksundur. Bu yöntemlere devam ettikten sonra, sonraki hasat prosedürü, ilgi alanlarını belirlemek ve sürekli örnekler elde etmek için zahmetli bir çalışma içerir. Bu yöntemler kullanılarak diseke edilen kalplerde, iki yarının ayrı ayrı tartılması, aralarındaki oranı hesaplayabilmek için çaba gerektirir. Kısa eksenli yöntem, endokardın ve kalbin tabanında bulunan tüm bileşenlerin incelenmesi için ek adımlara ihtiyaç duyar. Ayrıca, bu yöntemleri takip eden hasat prosedürü, ilgi alanlarını belirlemek ve sürekli numuneler elde etmek için zahmetli çalışmalardan oluşur.
Bu yazıda bazı standart kardiyak diseksiyon protokollerinin temel unsurları sunulmakta ve hem brüt inceleme yaklaşımları hem de histopatolojik inceleme için yaygın olarak kullanılan örnekleme alanları vurgulanmaktadır. Tekniğin gelecekteki uygulamaları ile ilgili olarak, sunulan protokolün temel amacı, ayrıntılı bir kardiyak değerlendirme gerektiren tüm deneysel çalışmalarda kolayca kullanılabilecek kardiyak diseksiyon için sağlam bir kılavuz sunmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Hiç kimse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline solution | B. BRAUN MELSUNGEN AG | W04479004 | For washing all the blood, and blood clots from the heart. |
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Q Path | 11699404 | Materials for collecting histopathology samples. |
| Bone cutting forceps | HELEN SRL | LS109HV | Sturdy instrument for cutting bone. |
| Cutting board | Ambition | 86304 | For an easier manipulation, and cutting the organs. |
| Decalcifying solution | Thermo Scientific TBD-2 | 6764004 | 1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid. |
| Digital camera | Canon Inc. | PowerShot SX540 HS | For photographic, and videographic documentation. |
| Forceps | MKD-Medicale | 15-430 | Dissection instruments. |
| Histological cassettes | Q Path | 720-2215 | Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm |
| Knife | TEHNO FOOD COM SERV SRL | D2006/15 | Sharp blade for cutting soft tissue. |
| Latex gloves | MKD-Medicale | SANTEX-S | Protection equipment. |
| Mask | MKD-Medicale | 21221 | Protection equipment. |
| Petri dishes | MKD-Medicale | 0598-1V | Materials for collecting ancillary testing samples. |
| Plastic recipients | Corning Gosselin | TP200-02 | Materials for collecting histopathology samples. |
| Scale | ESPERANZA | MEEKS008 | For weighing the organs. |
| Scale | White Deals | 72 | For weighing the subjects. |
| Scalpel | MKD-Medicale | 10322E | Sharp blade for cutting soft tissue. |
| Scissors | MKD-Medicale | 13-260 | Dissection instruments. |
| Scrub | MKD-Medicale | 410100-52 | Protection equipment. |
| Syringes | MKD-Medicale | 10573EU | Materials for collecting ancillary testing samples. |
References
- Ashworth, M. Pathology of Heart Disease in the Fetus, Infant and Child: Autopsy, Surgical and Molecular Pathology. , Cambridge University Press. Cambridge. (2019).
- Barone, R. Anatomie Comparée des Mammifères Domestiques: Angiologie. Vigot, , Lyon. (2011).
- Basso, C., et al. Guidelines for autopsy investigation of sudden cardiac death: 2017 update from the Association for European Cardiovascular Pathology. Virchows Archiv. 471 (6), 691-705 (2017).
- Bishop, S. P. Chapter 37 - Necropsy Techniques for the Heart and Great Vessels. Textbook of Canine and Feline Cardiology: Principles and Clinical Practice,.2nd ed. Fox, P. R., Sisson, D., Moïse, N. S. , W. B. Saunders. Philadelphia, PA. 846-848 (1999).
- Joseph, D. R. The ratio between the heart-weight and body weight in various animals. Journal of Experimental Medicine. 10 (4), 521-522 (1908).
- Keenan, C. M., Vidal, J. D. Standard morphologic evaluation of the heart in the laboratory dog and monkey. Toxicologic Pathology. 34 (1), 67-74 (2006).
- Latimer, H. B. Variability in body and organ weights in the newborn dog and cat compared with that in the adult. The Anatomical Record. 157 (3), 449-456 (1967).
- Lee, J. C., Taylor, F. N., Downing, S. E. A comparison of ventricular weights and geometry in newborn, young, and adult mammals. Journal of Applied Physiology. 38 (1), 147-150 (1975).
- McDonough, S. P., Southard, T. Necropsy Guide for Dogs, Cats, and Small Mammals. , John Wiley & Sons. 9 (2016).
- Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. Laboratory Methods in Histotechnology. , Armed Forces Institute of Pathology-American Registry of Pathology. Washington, DC. 29-58 (1992).
- Robinson, W. F., Robinson, N. A. Chapter 1 - Cardiovascular System. Jubb, Kennedy & Palmer's Pathology of Domestic Animals, 6th ed. Grant Maxie, M., Saunders, W. B. 3, 12-49 (2016).
- Tabaran, A. F. Autopsie et Medecine Legale: Guide de Travaux Pratiques. , Academic Press. 21-86 (2020).
- Autopsypathology.net. , Available from: http://autopsypathology.net/wpcontent/uploads/2016/02/rcpath_cardiacdeath_jul2015.pdf (2021).
- Pathology.ucla.edu. , Available from: http://pathology.ucla.edu/workfiles/Education/Residency%20Program/Gross%20Manual/Endomyocardial%20Biopsy%20(EMB).pdf (2021).
- Arbeitsgruppen Sudden Cardiac Death. , Available from: http://www.sgrm.ch/medizin/arbeitsgruppen/sudden-cardiac-death.html (2021).
- Toxpath.org. , Available from: https://www.toxpath.org/Trimming-N-Collection-Training.asp (2021).
- YouTube.com. , Available from: httpswwwyoutubecomwatchvxkJ2WGqi2Qw&t2494s (2021).
