यह प्रोटोकॉल स्पंदित SILAC, untargeted मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण, और प्रोटीन आधे जीवन की एक सुव्यवस्थित गणना के साथ senescent और गैर-विभाजित कोशिकाओं के चयापचय लेबलिंग के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है।
बढ़ते सबूतों से पता चला है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सेनेसेंट कोशिकाओं का संचय अल्जाइमर और पार्किंसंस रोगों जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में योगदान देता है। सेलुलर सेनेसेंस स्थायी सेल चक्र गिरफ्तारी की एक स्थिति है जो आमतौर पर उप-घातक तनावों के संपर्क में आने के जवाब में होती है। हालांकि, अन्य गैर-विभाजित कोशिकाओं की तरह, सेनेसेंट कोशिकाएं चयापचय रूप से सक्रिय रहती हैं और कई कार्यों को पूरा करती हैं जिनके लिए अद्वितीय ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसलेशनल मांगों और इंट्रासेल्युलर और स्रावित प्रोटिओम में व्यापक परिवर्तन की आवश्यकता होती है। यह समझना कि सेनेसेंस के दौरान प्रोटीन संश्लेषण और क्षय दर कैसे बदलती है, सेलुलर सेनेसेंस के अंतर्निहित तंत्र को रोशन कर सकती है और सेनेसेंट कोशिकाओं द्वारा बढ़ी हुई बीमारियों के लिए संभावित चिकित्सीय रास्ते पा सकती है। यह पेपर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में सेल संस्कृति (पीएसएलसी) में अमीनो एसिड द्वारा स्पंदित स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग करके गैर-विभाजित कोशिकाओं में प्रोटीन आधे जीवन के प्रोटीन के आधे जीवन के प्रोटिओम-स्केल मूल्यांकन के लिए एक विधि का वर्णन करता है। pSILAC में अमीनो एसिड के स्थिर भारी आइसोटोप युक्त संस्करणों के साथ कोशिकाओं का चयापचय लेबलिंग शामिल है। आधुनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण के साथ युग्मित, pSILAC जटिल मिश्रण में सैकड़ों या हजारों प्रोटीन के प्रोटीन टर्नओवर के माप को सक्षम बनाता है। चयापचय लेबलिंग के बाद, प्रोटीन की टर्नओवर गतिशीलता को मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाए गए पेप्टाइड्स में भारी आइसोटोप के सापेक्ष संवर्धन के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, एक वर्कफ़्लो को सेनेसेंट फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए वर्णित किया गया है और इसी तरह गिरफ्तार quiescent fibroblasts, साथ ही साथ एक सरलीकृत, एकल-समय बिंदु pSILAC लेबलिंग समय-पाठ्यक्रम जो प्रत्याशित प्रोटीन टर्नओवर दरों के कवरेज को अधिकतम करता है। इसके अलावा, एक पाइपलाइन pSILAC मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा के विश्लेषण और स्प्रेडशीट का उपयोग करके प्रोटीन गिरावट दरों की उपयोगकर्ता के अनुकूल गणना के लिए प्रस्तुत की जाती है। इस प्रोटोकॉल के आवेदन को सेनेसेंट कोशिकाओं से परे किसी भी गैर-विभाजित सुसंस्कृत कोशिकाओं जैसे न्यूरॉन्स तक बढ़ाया जा सकता है।
सेनेसेंस को पहली बार रेप्लिकेटिव थकावट1 तक पहुंचने के बाद सुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शित अनिश्चितकालीन विकास गिरफ्तारी की स्थिति के रूप में पहचाना गया था। तब से यह दिखाया गया है कि सेनेसेंस कई सेलुलर अपमानों के जवाब में उत्पन्न हो सकता है, जिसमें जीनोटॉक्सिक, माइटोकॉन्ड्रियल और ऑन्कोजेनिक तनाव शामिल हैं, दूसरोंके बीच 2। जबकि सीनेसेंस में कई शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण भूमिकाएं हैं, जैसे कि ट्यूमर दमन और घाव भरने, उम्र बढ़ने के दौरान सेनेसेंट कोशिकाओं का संचय स्वास्थ्य3 पर हानिकारक प्रभावों के एक मेजबान के साथ जुड़ा हुआ है, जिसमें कई न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियां 4,5,6 शामिल हैं। सेलुलर सेनेसेंस कई मस्तिष्क कोशिका प्रकारों में होता है, जिसमें न्यूरॉन्स 7,8,9,10, एस्ट्रोसाइट्स11, माइक्रोग्लिया12, और ओलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत13 शामिल हैं, और न्यूरोडीजेनेरेशन और संज्ञानात्मक शिथिलता में योगदान देता है। एमिलॉइड बीटा ओलिगोमर्स, अल्जाइमर रोग 14 के हॉलमार्क में से एक, न्यूरोनल सेनेसेंस13,15,16 में तेजी लाने के लिए दिखाया गया है। सेनेसेंट कोशिकाओं की एक बढ़ी हुई व्यापकता को पार्किंसंस रोग17 के साथ भी जोड़ा गया है, विशेष रूप से पर्यावरणीय तनाव11,18 से उत्पन्न होता है। महत्वपूर्ण रूप से, पूर्व-नैदानिक मॉडल में सेनेसेंट कोशिकाओं का चयनात्मक उन्मूलन जीवनकाल का विस्तार करता है और उम्र से संबंधित बीमारियों की एक भीड़ को कम करता है 3,5,12 और संज्ञानात्मक घाटे में सुधार करताहै 8,11,12,13। सेनेसेंट कोशिकाएं इस प्रकार कई उम्र से संबंधित स्थितियों के उपचार के लिए आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में उभरी हैं।
सेनेसेंट कोशिकाओं का अधिकांश हानिकारक प्रभाव सेनेसेंस-संबद्ध स्रावी फेनोटाइप (एसएएसपी) के कारण होता है, जो सेनेसेंट कोशिकाओं द्वारा स्रावित बायोएक्टिव अणुओं का एक जटिल मिश्रण है जो स्थानीय सूजन, एंजियोजेनेसिस, एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स के विनाश और आसपास के ऊतकों में सेनेसेंस का प्रसार कर सकता है 19,20,21 . एसएएसपी सेनेसेंस की एक दिलचस्प जैविक घटना का भी प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि इसे सेल चक्र गिरफ्तारी की स्थिति के दौरान काफी ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसलेशनल प्रयास की आवश्यकता होती है। वास्तव में, सेनेसेंट कोशिकाओं को राइबोसोम बायोजेनेसिस22,23,24 में कमी का प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है जो प्रोटीन संश्लेषण को कम करना चाहिए। इसके बजाय, सेनेसेंट कोशिकाएं कुछ प्रोटीनों, विशेष रूप से एसएएसपी कारकों का दृढ़ता से अनुवाद करती हैं, और आसपास के ऊतक25 के चयापचय को प्रभावित करती हैं। इस प्रकार, यह समझने में काफी रुचि है कि कैसे एक स्थायी सेल चक्र गिरफ्तारी से गुजरने वाली सेनेसेंट कोशिकाएं प्रोटीन होमोस्टैसिस को बनाए रखना जारी रखती हैं, जबकि एक ही समय में एसएएसपी कारकों और अन्य चुनिंदा प्रोटीनों को मजबूती से व्यक्त करती हैं।
यह विधि वर्णन करती है कि सेल कल्चर (पीएसआईएलएसी) में अमीनो एसिड द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री और स्पंदित-स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग कैसे किया जाए ताकि विश्व स्तर पर प्रोटिओम-वाइड स्केल पर सेनेसेंट कोशिकाओं में प्रोटीन के आधे जीवन को मापा जा सके। पारंपरिक SILAC में, सुसंस्कृत कोशिकाओं को प्रोटीन बहुतायत के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए अमीनो एसिड के भारी और हल्के गैर-रेडियोधर्मी आइसोटोप के साथ पूरी तरह से चयापचय रूप से लेबल किया जाता है। इस विधि को पहले सुसंस्कृतफाइब्रोब्लास्ट्स 26 के एसएएसपी में व्यापक और मात्रात्मक रूप से बहुतायत परिवर्तनों का आकलन करने के लिए लागू किया गया है। पीएसआईएलएसी में, कोशिकाओं को इसी तरह भारी आइसोटोप की नाड़ी के साथ चयापचय रूप से लेबल किया जाता है जो प्रकाश आइसोटोप के साथ पूर्व-लेबलिंग का अनुसरण करता है, और फिर एक या एक से अधिक समय अंतराल पर काटा जाता है। पहले से मौजूद प्रकाश आइसोटोप के संदर्भ में भारी आइसोटोप को शामिल करने की दरों का उपयोग तब सापेक्ष प्रोटीन टर्नओवर दरों की गणना करने के लिए किया जाता है। आम तौर पर, आर्जिनिन और लाइसिन के आइसोटोप का उपयोग किया जाता है क्योंकि ट्रिप्सिन उन अवशेषों पर क्लीव्स करता है; इस प्रकार, मानक पाचन से सभी पेप्टाइड्स में संभावित रूप से भारी लेबल होगा। पेप्टाइड्स के जोड़े जो केवल भारी लाइसिन या आर्जिनिन की उपस्थिति या अनुपस्थिति से भिन्न होते हैं, रासायनिक रूप से समान होते हैं और एक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा विभेदित और परिमाणित किए जा सकते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के बाद, पेप्टाइड्स को परिणामी पेप्टाइड पहचान में आइसोटोपिक लेबल की उपस्थिति या अनुपस्थिति के आधार पर नए संश्लेषित या पूर्व-मौजूदा के रूप में पहचाना जा सकता है। प्रोटीन टर्नओवर दरों को तब प्रकाश (12सी –14एन) पेप्टाइड्स पर भारी (13सी –15एन) के अनुपात को घातीय विकास या क्षय27,28 के लिए गतिज मॉडल के लिए दिए गए प्रोटीन के लिए फिट करके निर्धारित किया जा सकता है। pSILAC का उपयोग प्रोटीन टर्नओवर दरों29,30,31,32 की कई तुलनाओं में किया गया है और वर्तमान में प्रोटीन आधे जीवन के माप के लिए सबसे व्यापक और उच्च-थ्रूपुट विधि है।
यह प्रोटोकॉल संस्कृति में इसी तरह के विकास-गिरफ्तार क्विसेंट कोशिकाओं के साथ समानांतर में सेनेसेंट कोशिकाओं की तैयारी का विवरण देता है, जिसके बाद पीएसएलसी के साथ चयापचय लेबलिंग होती है। कोशिकाओं को तब काटा जाता है, लिसेट में homogenized, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए संसाधित किया जाता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री से प्राप्त डेटा का उपयोग तब एक सरलीकृत मात्रात्मक विधि का उपयोग करके प्रोटीन के आधे जीवन को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, जिसमें एक एकल समय बिंदु और एक स्प्रेडशीट में किए गए आधे जीवन की गणना को नियोजित किया जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, प्रोटीन आधे जीवन के अनुमानों को एक व्यापक और मात्रात्मक तरीके से मापा जा सकता है जो प्रोटीन संश्लेषण या टर्नओवर के अवरोधकों का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल की तुलना में अनियंत्रित सेलुलर स्थितियों के लिए अधिक प्रामाणिक है।
pSILAC एक शक्तिशाली तकनीक है जो कई सेलुलर स्थितियों में प्रोटीन टर्नओवर दरों के वैश्विक परिमाणीकरण को सक्षम बनाती है। यह पेपर psILAC के उपयोग का विवरण देता है ताकि सेनेसेंट और क्विसेंट कोशिकाओं के बीच वैश्विक प्रोटीन आधे जीवन की तुलना की जा सके, जिसमें सेनेसेंट और क्विसेंट कोशिकाओं की तैयारी के लिए निर्देश, SILAC लेबलिंग और कटाई, और अंततः डीडीए मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण शामिल है। इसके अतिरिक्त, एक दो-चरणीय परीक्षण को सेनेसेंस फेनोटाइप के सत्यापन के लिए वर्णित किया गया है, जिसमें SA-πGal और RT-qPCR विश्लेषण का उपयोग किया गया है, जो mRNA एन्कोडिंग सेनेसेंस-संबद्ध प्रोटीन का उपयोग करता है। वर्णित दो दृष्टिकोणों के साथ सेनेसेंस के सत्यापन के अलावा, प्रोटिओमिक स्तर पर सेनेसेंट और क्विसेंट कोशिकाओं के बीच ज्ञात सेनेसेंस मार्करों में परिवर्तन की तलाश में मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के बाद सेनेसेंस का एक तीसरा सत्यापन किया जा सकता है। सेनेसेंस से जुड़े प्रोटीन जिन्हें ऊंचा किए जाने की उम्मीद है, उनमें पी 16, पी 21 और बीसीएल 2 शामिल हैं, दूसरों के बीच, कहीं और44,45 का वर्णन किया गया है। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में, आयनीकरण विकिरण का उपयोग सेनेसेंस और सीरम भुखमरी के प्रेरण के लिए किया गया था। सेनेसेंस के प्रेरण के लिए, कई विकल्प उपलब्ध हैं और उनमेंसे 41,42,46 में पर्याप्त विषमता है। वर्तमान में, कोई संवेदनशील विधि नहीं है जिसे “सबसे अधिक शारीरिक” माना जाता है, इसलिए सेनेसेंट प्रेरक का विकल्प काफी हद तक प्रयोग के संदर्भ पर आधारित है। हालांकि, सेनेसेंस के बारे में एक सामान्य घटना बताने के लक्ष्य के साथ प्रयोगों को कम से कम दो अलग-अलग सेनेसेंट प्रेरकों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। सेनेसेंस प्रतिमानों की सीमा पर चर्चा करना इस पेपर के दायरे से परे है, लेकिन सेनेसेंस को प्रेरित करने के लिए कुछ सामान्य तरीकों में डीएनए क्षति (आईआर, डोक्सोरुबिसिन, रेप्लिकेटिव थकावट) को ट्रिगर करना, ऑन्कोजेनिक प्रोटीन (एचआरएएस, बीआरएएफ) को व्यक्त करना और माइटोकॉन्ड्रिया फ़ंक्शन2 को बाधित करना शामिल है।
सेनेसेंट इनड्यूसर की पसंद के अलावा, नियंत्रण कोशिकाओं की पसंद एक समान रूप से महत्वपूर्ण विचार है। सेनेसेंट कोशिकाएं, परिभाषा के अनुसार, अनिश्चित विकास गिरफ्तारी के तहत हैं, इसलिए अन्य विकास-गिरफ्तार कोशिकाओं की तुलना अक्सर चुनी जाती है। PSILAC के लिए, सेल चक्र गिरफ्तार कोशिकाएं आम तौर पर बेहतर होती हैं क्योंकि वे दोहराते नहीं हैं और इस प्रकार प्रोटीन अर्ध-जीवन गणना47 के लिए उपयोग करना आसान होता है। हालांकि, चूंकि सुसंस्कृत कोशिकाएं अक्सर कुछ विभाजित कोशिकाओं को बनाए रखती हैं, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि सेल चक्र गिरफ्तारी को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीके कोशिकाओं से त्रुटि को कम करने के लिए यथासंभव समरूप प्रतिक्रिया उत्पन्न करते हैं जो अभी भी फैल रहे हैं। पीएसएलसी का उपयोग करके साइकिल चलाने वाली कोशिकाओं के लिए प्रोटीन गिरावट दर की गणना करने के लिए उस दर की क्षतिपूर्ति करने के लिए अतिरिक्त गणना की आवश्यकता होती है जिस पर प्रोटीन को बेटी कोशिकाओं में पतला किया जाता है27। हालांकि, quiescent विकास की गिरफ्तारी ही जटिलताओं के बिना नहीं है। सेल चक्र गिरफ्तारी के लिए दो सामान्य तरीके हैं: सीरम अभाव और संपर्क निषेध48। संपर्क निषेध के माध्यम से सभी कोशिकाओं को क्विसेंट नहीं बनाया जा सकता है, हालांकि कुछ फाइब्रोब्लास्ट्स को कई दिनों के बाद क्विसेंस का प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गयाहै। इस विधि ने सीरम अभाव का उपयोग किया क्योंकि यह आमतौर पर सेनेसेंट कोशिकाओं की तुलना के लिए उपयोग किया जाता है, हालांकि इसे सटीक तुलना के लिए समान रूप से सीरम-वंचित होने की आवश्यकता होती है। सीरम एमटीओआर कॉम्प्लेक्स को सक्रिय करता है, और इस प्रकार सीरम अभाव में सेल चक्र गिरफ्तारी50 के अलावा सेल पर कई डाउनस्ट्रीम प्रभाव होते हैं। विशेष रूप से, सेनेसेंट कोशिकाओं को सीरम अभाव या एमटीओआर निषेध51,52 पर कम एसएएसपी प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है।
पीएसआईएलएसी में विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि परीक्षण करने के लिए कितने समय अंक हैं। इस प्रोटोकॉल ने एक ही समय बिंदु (हल्के या भारी लेबलिंग के 3 दिनों) पर कोशिकाओं को एकत्र किया, जो परिणामी विश्लेषण को काफी हद तक सरल बनाता है। समय बिंदु का चयन प्रयोग के उद्देश्य पर आधारित होना चाहिए। वैश्विक विश्लेषण के लिए, 3 दिनों से अधिकांश प्रोटीन पर कब्जा करने की उम्मीद है, हालांकि अल्पकालिक प्रोटीन के लिए आधे जीवन जो 3 दिनों के भीतर पूरी तरह से कारोबार करते हैं (सभी प्रकाश संकेत खो जाते हैं) को इस समय बिंदु पर मापा नहीं जा सकता है। इसके विपरीत, 3 दिनों में बहुत कम टर्नओवर वाले लंबे समय तक रहने वाले प्रोटीन को भी मापना मुश्किल होता है और अक्सर बेहद बड़े आधे जीवन (हफ्तों के क्रम में) होने के रूप में दिखाई देते हैं जो आमतौर पर बहुत कम भारी सिग्नल संचय का परिणाम होते हैं। भारी और हल्के पेप्टाइड संकेतों के अनुपात में गैर-रैखिक संबंध के कारण कम और लंबे समय तक नए संश्लेषित प्रोटीन के प्रतिशत बनाम, अतिरिक्त लेबलिंग समय बिंदुओं को जोड़कर आधे जीवन की मात्रा में सुधार किया जा सकता है। दो सेल राज्यों के बीच सापेक्ष तुलना के लिए, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में, एक अनुमानित आधा जीवन पर्याप्त हो सकता है, लेकिन मात्रात्मक सटीकता में सुधार के लिए अतिरिक्त टाइमपॉइंट का उपयोग किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि प्रोटीन टर्नओवर का एक अनलक्षित डीडीए-आधारित विश्लेषण कैसे किया जाए। हालांकि, प्रोटीन टर्नओवर गणना को आम तौर पर किसी भी अधिग्रहण योजना पर लागू किया जा सकता है जो भारी और हल्के पेप्टाइड जोड़े की सापेक्ष बहुतायत प्राप्त करने में सक्षम है। उदाहरण के लिए, MS2-आधारित विधियों जैसे डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण (DIA/SWATH) को टर्नओवर दरों की गणना के लिए सफलतापूर्वक53 भी लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में वर्णित उपकरणों के अलावा अन्य इंस्ट्रूमेंटेशन और सॉफ़्टवेयर पाइपलाइनों का उपयोग डीडीए विश्लेषण, प्रोटीन पहचान और प्रोटीन परिमाणीकरण करने के लिए किया जा सकता है। पेप्टाइड पीक क्षेत्रों को निकालने के लिए स्काईलाइन जैसे प्रोटीन परिमाणीकरण सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करते समय, दस्तावेज़ कार्यक्षेत्र में निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम का मैन्युअल रूप से निरीक्षण करने, उन चोटियों की पहचान करने की सलाह दी जाती है जो गलती से एकीकृत और गैर-मात्रात्मक चोटियों की पहचान करते थे, और तदनुसार दस्तावेज़ को क्यूरेट करते हैं। ट्यूटोरियल का एक व्यापक संग्रह स्काईलाइन (skyline.ms) के लिए ऑनलाइन उपलब्ध है।
pSILAC बेहतर मल्टीप्लेक्सिंग (proteome कवरेज) और थ्रूपुट के कारण सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रोटीन आधे जीवन के वैश्विक परिमाणीकरण के लिए सबसे आदर्श तरीकों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। जबकि pSILAC संश्लेषण या गिरावट की प्रत्यक्ष दर प्रदान नहीं करता है, क्योंकि हल्के और भारी संकेत में परिवर्तन कारकों के संगम के कारण होता है, pSILAC स्थितियों और विभिन्न सेल प्रकारों के बीच तुलना के लिए अत्यधिक उपयोगी है। कम-थ्रूपुट विधियां अक्सर दो प्रकारों में आती हैं: 1) प्रोटीन संश्लेषण को अवरुद्ध करने के लिए साइक्लोहेक्सिमाइड के साथ कोशिकाओं का उपचार और क्षय की निगरानी के अलावा समय अंतराल पर फसल, या 2) प्रोटीन क्षय के अवरोधक के साथ कोशिकाओं का उपचार और प्रोटीन के संचय की निगरानी करने के लिए समय अंतराल पर फसल, इस प्रकार प्रोटीन क्षय दर का अनुमान लगाया जाता है। दोनों विधियों की सीमा यह है कि इस तरह के उपचार अनिवार्य रूप से सेलुलर फिजियोलॉजी में पर्याप्त परिवर्तन का कारण बनेंगे। इसके विपरीत, pSILAC को कोई पर्याप्त हस्तक्षेप की आवश्यकता नहीं होती है और सैद्धांतिक रूप से सेलुलर फिजियोलॉजी पर कोई पता लगाने योग्य प्रभाव नहीं पड़ता है क्योंकि आइसोटोपिक अमीनो एसिड अपने गैर-आइसोटोपिक समकक्षों से केवल एक न्यूट्रॉन से भिन्न होते हैं। इस प्रकार, पीएसएलसी के लिए यहां वर्णित विधि गैर-विभाजित कोशिकाओं में सबसे अधिक शारीरिक प्रोटीन आधे जीवन के वैश्विक माप के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करती है।
प्रोटीन टर्नओवर में परिवर्तन उम्र बढ़ने, उम्र से संबंधित बीमारियों, न्यूरोडीजेनेरेशन और दीर्घायु54,55 के लिए घनिष्ठ संबंध है। यह प्रोटोकॉल सेनेसेंस कोशिकाओं में प्रोटीन टर्नओवर दरों को मापने के लिए सेल संस्कृति में अमीनो एसिड के स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग करके इन संबंधों से पूछताछ करने की एक विधि का वर्णन करता है। हालांकि, चूहों जैसे पूरे जीवों में विवो में उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेशन के संदर्भ में अध्ययन करने के लिए कई अनुरूप तरीके मौजूद हैं। दरअसल, इन अध्ययनों ने उम्र से संबंधित बीमारियों 56,57,58,59 के संदर्भ में प्रोटीन टर्नओवर दर को मापने के महत्व पर जोर दिया है।
इस अध्ययन में, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में रहने वाले राइबोसोमल प्रोटीन और प्रोटीन क्रमशः सेनेसेंट कोशिकाओं में कम और बढ़े हुए आधे जीवन के साथ प्रोटीन की दो श्रेणियों के रूप में खड़े थे। जबकि निश्चित निष्कर्षों के लिए स्थिर-राज्य स्तरों के आगे के विश्लेषण की आवश्यकता होती है, इन परिणामों से आगे पता चलता है कि सेनेसेंट कोशिकाएं राइबोसोमल प्रोटीन के आधे जीवन में कमी के माध्यम से विशिष्ट रूप से अनुवाद को विनियमित कर सकती हैं। आगे बढ़ते हुए, माउस मॉडल में विवो में सेलुलर सेनेसेंस और न्यूरोडीजेनेरेशन के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए स्थिर आइसोटोप लेबलिंग दृष्टिकोण को लागू करना इस प्रोटोकॉल द्वारा वर्णित आइसोटोप लेबलिंग दृष्टिकोण का एक आशाजनक विस्तार होगा।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) और इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम (आईआरपी), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग (एनआईए) द्वारा समर्थित किया गया था। एन.बी. दीर्घायु प्रोत्साहन अनुदान, और आहार की खुराक (ओडीएस) विद्वानों के कार्यक्रम के कार्यालय द्वारा समर्थित था। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।
Acetonitrile (LC-MS grade) | Grainger | AH015 | |
Ammonium Bicarbonate | Millipore-Sigma | 9830 | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23227 | |
Dithiothreotol (DTT) | Sigma | D9779 | |
DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher | 12430112 | |
dNTP Mix | ThermoFisher | R0191 | |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated | ThermoFisher | 10082147 | |
Formic Acid | Sigma | 27001 | |
Gammacel 40 Exactor | Best Theratronics | Cesium Irradiator for cells | |
GlycoBlue | ThermoFisher | AM2238 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I1149 | Light sensitive |
IMR-90 primary lung fibroblasts | ATCC | CCL-186 | |
iRT Kit (indexed retention time) | Biognosys | Ki-3002-2 | Indexed Retention Time Peptide Standards |
Isopropanol | ThermoFisher | 423835000 | |
Mascot | Matrix Science | Mascot Daemon 2.8 | Proteomic database searching software |
Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) | ThermoFisher | EP0742 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
Nano LC System | ThermoFisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges | Waters | 186000383 | |
Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | Q Exactive HF Orbitrap | |
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 327110025 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM | ThermoFisher | A33972 | |
QuantStudio 6 Real-Time PCR System | ThermoFisher | ||
Random Hexamer Primer | ThermoFisher | SO142 | |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
Skyline | University of Washington | Skyline-Daily v21.2.1.424 | Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms |
Sonicator waterbath | Branson | CPX-952-516R | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | Referred to as phenol in text; hazardous |
TRYPle Express | ThermoFisher | 12605010 | |
Trypsin (sequencing grade) | Promega | V5113 | |
TURBO Dnase (2U/ uL) | ThermoFisher | AM2238 | |
Urea | ThermoFisher | 29700 | |
Water (LC-MS grade) | Grainger | AH365 |