대뇌 오가노이드는 장기 발달 및 인간 질병 병리학을 연구하기위한 전례없는 기회를 제공합니다. 대뇌 오가노이드 배양 시스템으로 큰 성공을 거두었지만이 기술을 적용하는 데는 여전히 운영상의 어려움이 있습니다. 본 프로토콜은 중간 변화 및 오가노이드 전달을 용이하게 하는 대뇌 오가노이드 절차를 기술한다.
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이 논문에서
요약
초록
현재 대뇌 오가노이드 배양 기술은 여전히 운영이 복잡하고 대규모로 적용하기가 어렵습니다. 간단하고 실용적인 해결책을 찾아야합니다. 따라서, 본 연구에서 보다 실현 가능한 대뇌 오가노이드 프로토콜이 제안된다. 초기 단계에서 중간 변화 및 오가노이드 전달의 피할 수없는 불편 함을 해결하기 위해 현재 연구는 엔지니어링 원칙을 적용하여 운영 기술을 최적화합니다. 배아체(EB) 샘플을 측면으로 비추기 위해 소프트 라이트 램프를 채택하여 EB를 향상된 확산 반사 효과를 통해 육안으로 볼 수 있도록 했습니다. 회전에 의해 생성 된 이차 흐름의 원리를 사용하여, 오가노이드는 우물의 중심을 향해 모여 중간 변화 또는 오가노이드 전달의 작동을 용이하게합니다. 분산 된 세포와 비교할 때, 배아체는 피펫에서 더 빨리 정착합니다. 이 현상을 사용하면 대부분의 자유 세포 및 죽은 세포 단편을 간단한 방법으로 효과적으로 제거 할 수있어 EB가 원심분리로 인한 손상을 입지 않도록합니다. 이 연구는 대뇌 오가노이드 문화의 작동을 용이하게하고 뇌 오가노이드의 적용을 촉진하는 데 도움이됩니다.
서론
2차원(2D) 배양 시스템과 비교하여, 3차원(3D) 배양 시스템은 특정 장기의 복잡한 구조의 진정한 복제 및 효율적인 재생을 포함하여 몇 가지 장점을 갖는다1. 따라서 대뇌 오가노이드는 인간 뇌 발달 및 질병2, 약물 스크리닝 및 세포 치료의 연구 분야에서 중요한 보조 방법 중 하나입니다.
회전 현탁액 방법에 의해 대뇌 오가노이드를 배양하는 것은 그들의 발달과 성숙에 도움이됩니다3. 대뇌 오가노이드 배양 시스템은 큰 성공을 거두었지만 여전히 적용을 제한하는 중대한 도전에 직면 해 있습니다. 예를 들어, 수동 재배는 복잡한 조작 단계를 포함하며 대규모 응용 프로그램을 달성하는 데 장애물을 초래합니다. 또한, 대뇌 오가노이드 배양의 각 발달 단계에서, 상이한 배지 및 사이토카인의 변화가 필요하다4. 그러나 초기 단계에서 오가노이드 또는 EB는 작은 크기 (약 200 μm ~ 300 μm)를 가지며 적절한 장치 없이는 거의 시각적으로 접근 할 수 없습니다. 필연적으로, 일정량의 귀중한 오가노이드 샘플은 배지가 변경될 때 플러시됩니다. 다른 종류의 오가노이드 배양에서 이것을 극복....
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프로토콜
이 프로토콜은 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 광저우 의과 대학 세 번째 부속 병원 윤리위원회 (의료 및 윤리 검토 [2021] No. 022)의 승인이 부여되었습니다. 실험 전에, 각 배지는 Juergen A. Knoblich사의 화학식12 (보충 표 1-4)에 따라 제조되거나, 시판되는 대뇌 오가노이드 키트를 사용하였다 ( 표 참조). 이 연구에 사용 된 iPSC는 이전에 우리 실험실에서 설립되었으며 정보에 입각 한 면제를 받았습니다. SCA3-iPSCs는 ATXN3 유전자 13에 26/78 CAG 반복을 보유하는 것으로 유전자형화된31 세 여성 척수 소뇌 운동 실조증 유형 3 (SCA3) 환자로부터 생성되었다 (보충 도 1A). 이전 기사에서 언급된 정상 인간 iPSCs는 NC-iPSCs 14로 선택되었고, ATXN3 유전자는14/14 CAG 반복을 갖는 것으로 확인되었다(보충 도 1B).
1. 유도만능줄기세포(iPSCs)의 제조
- 자원 봉사....
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결과
본 연구는 iPSCs(도 2B)를 대뇌 오가노이드로 유도하였다(도 2C). 초기 단계에서 재배된 EB는 OCT4 마커(그림 2A)를 나타내었으며, 이는 양호한 다능성을 나타냈다. 후기 단계에서 EB는 성숙한 대뇌 오가노이드로 발전했습니다 (그림 2D). 이 연구는 정상적인 건강한 개인과 SCA3 환자의 iPSC를 대뇌 오가노이드로 배양했습니다 (그림 3A). 마차도요세프 병(MJD)으로도 알려진 SCA3는 ATXN3 유전자25의 폴리글루타민 확장으로 인한 퇴행성 신경퇴행성 질환이다. RNA-seq 데이터 (공개 저장소에 업로드, 자료 표 참조)는 신경 전달 물질 수송, 시냅스 형성 및 조절과 .......
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토론
대뇌 오가노이드는 의학 연구를위한 새로운 길을 열어줍니다. 이 기술의 많은 유용한 응용은 단지 탐구되기 시작했다28. 이 연구는 유전적으로 병든 대뇌 오가노이드와 정상 뇌 오가노이드의 전사체 시퀀싱 결과가 질병과 건강의 차이를 반영할 수 있음을 발견했다. 예를 들어, RNA-seq 데이터 분석 결과(도 3B)는 SCA3 질환 29,30,31,32에 대한 많은 보고된 연구와 일치한다. 중간 변화, EB 전달 및 포장과 같은 실험 작업은 대뇌 오가노이드를 배양하고 균일 성이 좋은 오가노이드를 준비 할 수 있는지 여부를 결정하는 데 중요합니다33,34
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 광동성 자연 과학 재단 (보조금 번호 2020A0505100062), 광저우시 과학 기술 핵심 주제 프로젝트 (보조금 번호 201904020025), 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 31872800, 32070582, 82101937), 광저우시 박사후 연구 보조금 프로젝트 (Bangzhu Chen)의 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 &무; m 필터 | NEST 생명 공학, 중국 | 331001 | |
| 1000 μ L 광구경 피펫 팁 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 9405163 | |
| 200 μ L 광폭 피펫 팁 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 9405020 | |
| 2-메르캅토에탄올 | Merck, 독일 | 8057400005 | |
| 4% 파라포름알데히드 | Servicebio, 중국 | G1101 | |
| 6-well 저접착 플레이트 | NEST Biotechnology, 중국 | 703011 | EB 현탁액 배양에 사용됩니다. |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | iPSC를 단일 세포로 소화하는 데 사용됩니다. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | EB 준비를 위한 미세 다공성 배양 플레이트. |
| Anti-Adherence 헹굼 솔루션 | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | 세포 부착을 방지하기 위한 배양기류용 헹굼 솔루션 |
| B27-vit. 보충제 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, 미국 | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, 중국 | ST025 | |
| 원심분리기 | Eppendorf, 독일 | 5810 R | 다양한 유형의 원심분리기 튜브, 시약 병 및 작업 플레이트의 원심분리에 사용할 수 있습니다. |
| 커버 유리 | Shitai 실험실 장비, 중국 | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, 중국 | C1002 | 핵 염색에 사용됩니다. DAPI를 이중 가닥 DNA와 결합한 후 최대 여기 파장은 364nm, 최대 방출 파장은 454nm였습니다. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, 미국 | 17-5442-02 | Ficoll-Paque 방법에 따라 말초 혈액 단핵 세포를 분리합니다. |
| 젤라틴 | 상곤 비오티치, 중국 | A609764 | |
| 글루타맥스 보충제 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 35050061 | |
| 글루타맥스 보충제 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 17504044 | |
| 염소 항닭 IgY 2차 항체 | Abcam, 영국 | ab150171 | 염소 항닭 IgG. 활용: Alexa Fluor 647. 예: 652nm, Em: 668nm. 1:500 희석에서 사용하십시오. |
| 염소 항 마우스 IgG 2 차 항체 | Abcam, 영국 | ab150120 | 염소 항 마우스 IgG. 활용: Alexa Fluor 594. 예: 590nm, Em: 617nm. 1:500 희석에서 사용하십시오. |
| 염소 항토끼 IgG 2차 항체 | Abcam, 영국 | ab150077 | 염소 항토끼 IgG. 활용: Alexa Fluor 488. 예: 495nm, Em: 519nm. 1:500 희석에서 사용하십시오. |
| Heparin | Merck, 독일 | H3149 | |
| 수평 셰이커 | Servicebio, 중국 | DS-H200 | 제조업체 INFORS HT(스위스)에 따르면 0.11808 x g의 상대 원심력(RCF)이 더 적합합니다. |
| 인슐린 | Merck, 독일 | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, 미국 | 354277 | Matrigel은 4도 이상의 환경에서 응고됩니다. C, 그래서 그것은 저온에 이하 포장되어야 합니다. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, 캐나다 | 85850 | iPSC 배양 배지 |
| N2 보충제 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 21103049 | |
| OCT4 일차 항체 | Abcam, 영국 | ab19857 | 호스트: 토끼. 500으로 디졸브 μ 엘 PBS. 1:200 희석에서 사용합니다. |
| 병리학 냉동 슬라이서 | Leica, 독일 | Leica CM1860 | |
| PAX6 1 차 항체 | Abcam, 영국 | ab78545 | 호스트 : 마우스. 1:100 희석에서 사용하십시오. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 15140122 | |
| PSC 해리 솔루션 | Beijing Saibei Biotechnology, 중국 | CA3001500 | 효소가 없는 해리 솔루션은 iPSC 분해 및 통과에 사용할 수 있습니다. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Sendai Reprogramming Kit의 프로토콜에 따라 iPSC를 설정합니다. |
| 슬라이드 유리 | Shitai 실험실 장비, 중국 | 188105W | |
| 소프트 라이트 램프 | 너트 | 너트 간단한 자체 제작 장치는 준비를 위해 보충 그림 2를 참조하십시오. | |
| STEMdiff 대뇌 오가노이드 키트 | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | 포함: 1. EB 형성 배지; 2. 감응작용 매체; 3. 확장 매체; 4. 성숙 매체. |
| STEMdiff 대뇌 오가노이드 성숙 키트 | STEMCELL Technologies, 캐나다 | 8571 | 성숙 배지 |
| 자당 | Sangon Bioteach, 중국 | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, 독일 | X100 | |
| TUJ1 1차 항체 | Abcam, 영국 | ab41489 | 숙주: 닭. 1:1000 희석에서 사용하십시오. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, 중국 | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | PBS에서 5mM 원액을 준비하고 624µ에서 1mg을 재현탁합니다. PBS의 L. |
| Weblink | |||
| Raw 염기서열 분석 데이터 | 게놈 염기서열 아카이브(유전체학, 단백질체학 및 기타) Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of | Sciences GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
참고문헌
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature.
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재인쇄 및 허가
