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Bioengineering

पार्श्व नरम प्रकाश रोशनी के माध्यम से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति की सुविधा

Published: June 6, 2022 doi: 10.3791/63989
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University

Summary

सेरेब्रल ऑर्गेनोइड अंग विकास और मानव रोग विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अभूतपूर्व अवसर प्रदान करते हैं। यद्यपि सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रणालियों के साथ बड़ी सफलता हासिल की गई है, फिर भी इस तकनीक को लागू करने में परिचालन कठिनाइयां हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल एक सेरेब्रल ऑर्गेनोइड प्रक्रिया का वर्णन करता है जो मध्यम परिवर्तन और ऑर्गेनोइड स्थानांतरण की सुविधा प्रदान करता है।

Abstract

वर्तमान में, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रौद्योगिकी अभी भी संचालित करने के लिए जटिल है और बड़े पैमाने पर लागू करना मुश्किल है। एक सरल और व्यावहारिक समाधान खोजना आवश्यक है। इसलिए, वर्तमान अध्ययन में एक अधिक व्यवहार्य सेरेब्रल ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल प्रस्तावित है। प्रारंभिक अवस्था में मध्यम परिवर्तन और ऑर्गेनोइड हस्तांतरण में अपरिहार्य असुविधा को हल करने के लिए, वर्तमान शोध इंजीनियरिंग सिद्धांत को लागू करके ऑपरेशन तकनीक का अनुकूलन करता है। भ्रूण शरीर (ईबी) नमूनों को पार्श्व रूप से रोशन करने के लिए एक नरम प्रकाश दीपक को अपनाया गया था, जिससे ईबी को बढ़ाया फैलाना प्रतिबिंब प्रभाव के माध्यम से नग्न आंखों से देखा जा सकता है। रोटेशन द्वारा उत्पन्न माध्यमिक प्रवाह के सिद्धांत का उपयोग करते हुए, ऑर्गेनोइड कुएं के केंद्र की ओर इकट्ठा होते हैं, जो मध्यम परिवर्तन या ऑर्गेनोइड हस्तांतरण के संचालन की सुविधा प्रदान करता है। छितरी हुई कोशिका की तुलना में, भ्रूण शरीर पिपेट में तेजी से बसता है। इस घटना का उपयोग करके, अधिकांश मुक्त कोशिकाओं और मृत कोशिका के टुकड़ों को प्रभावी ढंग से एक सरल तरीके से हटाया जा सकता है, जिससे ईबी को सेंट्रीफ्यूजेशन से नुकसान होने से रोका जा सकता है। यह अध्ययन सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति के संचालन की सुविधा प्रदान करता है और मस्तिष्क ऑर्गेनोइड के आवेदन को बढ़ावा देने में मदद करता है।

Introduction

द्वि-आयामी (2 डी) संस्कृति प्रणालियों की तुलना में, त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों के कई फायदे हैं, जिनमें वास्तविक प्रतिकृति और कुछ अंगों की जटिल संरचनाओं का कुशल प्रजननशामिल है 1. इसलिए, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड मानव मस्तिष्क के विकास और रोग 2, दवा स्क्रीनिंग और सेल थेरेपी के अनुसंधान क्षेत्रों के लिए महत्वपूर्ण सहायक तरीकों मेंसे एक हैं।

घूर्णन निलंबन विधि द्वारा सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संवर्धन उनके विकास और परिपक्वता के लिए अनुकूल है3. यद्यपि सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रणालियों ने बड़ी सफलता हासिल की है, फिर भी उन्हें महत्वपूर्ण चुनौतियों का सामना करना पड़ता है जो उनके आवेदन को सीमित करते हैं। उदाहरण के लिए, मैनुअल खेती में जटिल हेरफेर कदम शामिल हैं और बड़े पैमाने पर अनुप्रयोगों को प्राप्त करने के लिए बाधाओं का परिचय देता है। इसके अतिरिक्त, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड की संस्कृति में प्रत्येक विकास चरण में, विभिन्न मीडिया और साइटोकिन्स में परिवर्तन की आवश्यकता होतीहै 4. हालांकि, प्रारंभिक अवस्था में, ऑर्गेनोइड या ईबी के छोटे आकार (लगभग 200 μm से 300 μm) होते हैं और उपयुक्त उपकरण के बिना लगभग नेत्रहीन दुर्गम होते हैं। अनिवार्य रूप से, जब माध्यम बदल जाता है तो कीमती ऑर्गेनोइड नमूनों की एक निश्चित मात्रा को दूर कर दिया जाता है। अन्य प्रकार की ऑर्गेनोइड संस्कृतियों में इसे दूर करने के लिए कई तकनीकों का पता लगाया गया है, और कुछ उदाहरणों में हस्तक्षेप के बिना 3 दिनों के लिए संस्कृति माध्यम में पूरे ऑर्गेनोइड चिप्स को विसर्जित करना शामिलहै 5; शोषक पेपर5 का उपयोग करके पुराने माध्यम को अवशोषित करने के बाद कवरस्लिप के माध्यम से एक ताजा माध्यम जोड़ना; या द्रव विनिमय 6,7,8 के लिए जटिल माइक्रोफ्लुइडिक पाइपलाइनों को लागू करना। ऑर्गेनोइड खेती के शुरुआती चरण में सामना की जाने वाली एक और बाधा नग्न आंखों के साथ प्रत्यक्ष टिप्पणियों को प्राप्त करने में कठिनाई है, जो खराब संचालन का कारण बन सकती है जो ऑर्गेनोइड हस्तांतरण चरणों के दौरान ऑर्गेनोइड क्षति और हानि का कारण बनती है। इसलिए, एक अधिक व्यवहार्य प्रोटोकॉल स्थापित करना आवश्यक है जो ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए मध्यम परिवर्तन और ऑर्गेनोइड हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करता है।

इंजीनियरिंग सिद्धांतों के आधार पर एक संबंधित अनुकूलित ऑपरेशन इन समस्याओं को दूर करने के लिए प्रस्तावित है, जो कई ऑर्गेनोइड प्रक्रियाओं को काफी और आसानी से सुविधाजनक बनाता है। प्रकृति में, जब सूरज खिड़की के अंतराल के माध्यम से एक घर में चमकता है, तो नग्न आंखें प्रकाश किरण में नृत्य करने वाली धूल को देख सकती हैं। धूल पर सूरज की रोशनी के फैलाने वाले प्रतिबिंब के कारण, एक दृश्य छवि का उत्पादन करने के लिए नेत्रगोलक में कुछ प्रकाश अपवर्तित होता है। इस घटना 9,10 के सिद्धांत से प्रेरित होकर, इस अध्ययन ने एक नरम प्रकाश दीपक बनाया और ईबी को पार्श्व रूप से रोशन किया। यह पाया गया कि ईबी देखने के दायरे को प्रभावित किए बिना नेत्रहीन रूप से स्पष्ट हो सकते हैं। केंद्र की ओर इशारा करते हुए एक माध्यमिक प्रवाह भंवर धाराओं के कारण संस्कृति प्लेट को घूर्णन करके तरल में उत्पन्न होता है11. मूल रूप से बिखरे हुए ईबी प्लेट के केंद्र में जमा होते हैं। इस आधार पर, और घटना है कि ऑर्गेनोइड का अवसादन वेग कोशिकाओं की तुलना में तेज है, सेंट्रीफ्यूजेशन के बिना मध्यम परिवर्तन और ऑर्गेनोइड हस्तांतरण की एक आसान संचालन विधि प्रस्तावित है। संस्कृति माध्यम में ऑर्गेनोइड को इस हस्तांतरण ऑपरेशन के माध्यम से मुक्त कोशिकाओं और मृत कोशिका टुकड़ों से प्रभावी ढंग से अलग किया जा सकता है।

यहां, एक प्रोटोकॉल जो संचालित करना आसान है, मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए प्रस्तावित है। ऑपरेशन तकनीक को इंजीनियरिंग सिद्धांत को लागू करके अनुकूलित किया गया था, जिससे 3 डी संस्कृति में संचालन 2 डी संस्कृति के रूप में सरल और व्यवहार्य हो गया था। बेहतर तरल विनिमय विधि और ऑर्गेनॉइड ट्रांसफर ऑपरेशन अन्य प्रकार के ऑर्गेनोइड संस्कृति और स्वचालित संस्कृति मशीनों के डिजाइन के लिए भी सहायक हैं।

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Protocol

प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा के बाद आयोजित किया गया था। अनुमोदन गुआंगज़ौ मेडिकल यूनिवर्सिटी के तीसरे संबद्ध अस्पताल की आचार समिति द्वारा प्रदान किया गया था (चिकित्सा और नैतिक समीक्षा [2021] नंबर 022)। प्रयोग से पहले, प्रत्येक माध्यम को जुएर्गेन ए नोबलिच के सूत्र12 (पूरक तालिका 1-4) के अनुसार तैयार किया गया था, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेरेब्रल ऑर्गेनोइड किट का उपयोग किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। इस अध्ययन में उपयोग किए गए आईपीएससी पहले हमारी प्रयोगशाला द्वारा स्थापित किए गए थे और एक सूचित छूट प्राप्त की है। एससीए 3-आईपीएससी एक 31 वर्षीय महिला स्पिनोसेरेबेलर गतिभंग टाइप 3 (एससीए 3) रोगी से उत्पन्न हुए थे, जो एटीएक्सएन 3 जीन13 (पूरक चित्रा 1 ए) में 26/78 सीएजी दोहराव को आश्रय देने के रूप में जीनोटाइप किया गया था। पिछले लेख में उल्लिखित सामान्य मानव आईपीएससी को एनसी-आईपीएससी14 के रूप में चुना गया था, और एटीएक्सएन 3 जीन को 14/14 सीएजी दोहराव (पूरक चित्रा 1 बी) के रूप में पहचाना गया था।

1. प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) की तैयारी

  1. स्वयंसेवकों और रोगियों की सूचित सहमति के साथ वेनिपंक्चर द्वारा परिधीय रक्त के 3 एमएल एकत्र करें।
  2. फिकोल-पाक विधि15 के अनुसार परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करें।
  3. सेंडाई रिप्रोग्रामिंग किट के प्रोटोकॉल के अनुसार आईपीएससी स्थापित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. मैट्रिगेल (एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, सामग्री की तालिका देखें) के साथ कवर किए गए 35 मिमी पेट्री व्यंजनों में एमटीईएसआर 1 माध्यम के साथ आईपीएससी संस्कृति। हर दिन माध्यम बदलें। आईपीएससी वृद्धि घनत्व 75% से अधिक नहीं होना चाहिए।
    2. पीएससी पृथक्करण समाधान के साथ कोशिकाओं को पचाएं ( सामग्री की तालिका देखें) और उन्हें हर 3-5 दिनों में 1: 5 के अनुपात में उपसंस्कृति करें।
      सावधानी: सेंडाई वायरस का उपयोग यहां किया जाता है। इसे जैव सुरक्षा कैबिनेट में संचालित किया जाना चाहिए, और आत्म-सुरक्षा उपाय किए जाने चाहिए। यह स्पष्ट होना चाहिए कि क्या इसका उपयोग स्थानीय देश में कानूनी रूप से किया जा सकता है। उपयोग करते समय स्थानीय जैव सुरक्षा कानूनों और नियमों का सख्ती से पालन किया जाना चाहिए।

2. ईबी तैयारी (दिन 0-1)

  1. एक पिपेट के साथ आईपीएससी से एमटीईएसआर 1 माध्यम निकालें और इसे 1 एक्स पीबीएस के 1 एमएल के साथ 2 एक्स धो लें।
  2. एक पिपेट के साथ पीबीएस निकालें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 मिनट के लिए एकल कोशिकाओं में आईपीएससी को पचाने के लिए सेल टुकड़ी समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के 300 μL जोड़ें।
  3. ईबी-गठन माध्यम (पूरक तालिका 1) के 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और फिर 300 एक्स जी (कमरे के तापमान) पर 5 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र करें।
  4. 5 मिनट के लिए विरोधी पालन कुल्ला समाधान (500 μL/ अच्छी तरह से) के साथ विशेष 24-अच्छी तरह से प्लेट प्रीट्रीट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: इष्टतम ईबी और गोलाकार गठन के लिए एंटी-पालन रिंसिंग समाधान आवश्यक है।
  5. एमएल के सेल घनत्व के साथ वाई -27632 (अंतिम एकाग्रता, 10 μM, सामग्री की तालिका देखें) युक्त ईबी-गठन माध्यममें कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  6. विरोधी पालन कुल्ला समाधान निकालें, और ईबी गठन माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला।
  7. अच्छी तरह से (चित्रा 1 ए, बाएं) के घनत्व पर विशेष 24-अच्छी तरह सेप्लेटों में कोशिकाओं को जोड़ें।
    नोट: आम तौर पर, प्रत्येक कुएं में 300 ईबी तैयार किए जा सकते हैं। यह विधि एक ही आकार के ईबी की बड़ी मात्रा तैयार कर सकती है।
  8. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 100 x g पर प्लेट अपकेंद्रित्र। प्लेट के तल पर प्रत्येक कक्ष में कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करें (चित्रा 1 ए, दाएं)।
    नोट: यदि कोई उपयुक्त अपकेंद्रित्र नहीं है, तो प्लेट को सीधे स्थिर संस्कृति के लिए इनक्यूबेटर में भी रखा जा सकता है, लेकिन ईबी गेंद का गठन समय सामान्य सेंट्रीफ्यूजेशन के तहत कई घंटे बाद होगा।
  9. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर नमूने सेते हैं। यदि पिछले चरण में सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग नहीं किया गया था, तो 36 घंटे के लिए सेते हैं। नमूना स्थिर रखें, और इस अवधि के दौरान इनक्यूबेटर से बाहर न निकालें।

3. नरम प्रकाश दीपक की तैयारी (दिन 1)

  1. ए 5 पेपर के आकार में 0.3-0.5 सेमी की मोटाई के साथ एक पारदर्शी ऐक्रेलिक बोर्ड का उपयोग करें। ऐक्रेलिक प्लेट के आगे और पीछे सफेद पैड पेस्ट करें।
    1. प्लेट के किनारे पर एलईडी सफेद रोशनी की एक पंक्ति स्थापित करें ताकि रोशनी ऐक्रेलिक प्लेट के किनारे से प्रवेश कर सके और फिर समानांतर (पूरक चित्रा 2 ए-एफ, चित्रा 1 बी) में शूट कर सके।
      नोट: चूंकि प्रारंभिक चरण में ईबी का व्यास लगभग 200 μm से 300 μm है, इसलिए उन्हें साफ बेंच के फ्लोरोसेंट लैंप के नीचे नग्न आंखों के साथ स्पष्ट रूप से देखना मुश्किल है। इसके विपरीत, फैलाना प्रतिबिंब की वृद्धि के कारण, हम पार्श्व प्रबुद्ध नरम प्रकाश (चित्रा 1 बी, सी) का उपयोग करके स्पष्ट रूप से ईबी का पता लगा सकते हैं। बाद के प्रयोगों में ईबी संस्कृतियों के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट की सिफारिश की जाती है। हालांकि, नरम प्रकाश के दृश्य प्रभाव को बेहतर ढंग से दिखाने के लिए, व्यंजनों का उपयोग कभी-कभी प्लेटों के बजाय इस अध्ययन में तस्वीरें और वीडियो लेने के लिए किया जाता है, इसलिए कृपया गलत न समझें। पार्श्व रूप से प्रबुद्ध नरम प्रकाश दीपक का उपयोग 6-अच्छी तरह से प्लेट के लिए भी किया जा सकता है।

4. ईबी हस्तांतरण और मध्यम प्रतिस्थापन (दिन 2-5)

  1. एक नई 6-अच्छी तरह से कम आसंजन प्लेट तैयार करें, और प्रत्येक कुएं में ईबी-गठन माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. एक 1000 μL चौड़े बोर विंदुक टिप ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ माध्यम के साथ ईबी निकालें और उन्हें 6 अच्छी तरह से कम आसंजन प्लेट (~ 100 ईबी /
    नोट: ऑपरेशन प्रक्रिया ईबी को निरीक्षण करने में आसान बनाने के लिए एक नरम प्रकाश दीपक (चरण 3 में उल्लिखित) को गोद लेती है। नरम प्रकाश के दृश्य प्रभाव को बेहतर बनाने के लिए अन्य इनडोर प्रकाश स्रोतों को बंद कर दें।
  3. हर दिन ताजा ईबी-गठन माध्यम की एक ही मात्रा के साथ बदलें। केंद्र में ईबी इकट्ठा करने और माध्यम को बदलने के लिए माध्यमिक प्रवाह का उपयोग करें।
    1. धीरे-धीरे कुएं के किनारे पाइप करके पुराने माध्यम की आकांक्षा करें। बहुत कठिन चूसना मत करो; अन्यथा, ईबी को एक साथ हटा दिया जाएगा। फिर, ईबी को फिर से निलंबित करने के लिए ताजा माध्यम जोड़ें।
      नोट: सिद्धांत माध्यमिक प्रवाह (चित्रा 1 डी)। एक गोलाकार कक्षा के साथ पकवान को घुमाकर एक भंवर प्रवाह को प्रेरित करें। भंवर प्रवाह के कारण, एक माध्यमिक प्रवाह केंद्र की ओर निर्देशित होता है। रोटेशन के माध्यम से उत्पन्न माध्यमिक प्रवाह के कारण ईबी या ऑर्गेनोइड कुएं के केंद्र में परिवर्तित होते हैं, जिसके बाद मध्यम परिवर्तन या भ्रूण हस्तांतरण को आसानी से निष्पादित किया जा सकता है।

5. प्लुरिपोटेंसी मार्कर ओसीटी 4 (दिन 4) के साथ लेबलिंग करके प्लुरिपोटेंसी की जांच करना

नोट: जब ईबी का व्यास 300 μm से अधिक होता है, तो उनके प्लुरिपोटेंसी का पता लगाने के लिए OCT4 मार्कर इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए कई ईबी लें।

  1. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ईबी को ठीक करें, इसके बाद हर बार 10 मिनट के लिए 1 एक्स पीबीएस 3 एक्स में धोएं।
  2. 0.3% ट्राइटन एक्स -100 और 2 घंटे के लिए 3% बीएसए युक्त कमरे के तापमान पीबीएस में ईबी को स्थानांतरित करें, इसके बाद हर बार 10 मिनट के लिए पीबीएस 3 एक्स में धोना।
    नोट: ट्राइटन एक्स -100 के साथ इलाज किए जाने के बाद, ईबी तरल सतह पर तैरते हैं और सफाई के दौरान तरल के साथ आसानी से चूसा जा सकता है। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत ऑपरेशन की सिफारिश की जाती है।
  3. 1: 200 के अनुपात में 1% बीएसए युक्त 1 एक्स पीबीएस के 1 एमएल के साथ ओसीटी 4 प्राथमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के लिए ईबीएस में जोड़ें, फिर हर बार 10 मिनट के लिए पीबीएस 3 एक्स में धो लें।
  4. 1:500 पर 1x पीबीएस के साथ संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें और ईबी में 1 एमएल जोड़ें।
  5. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेटिंग के बाद, हर बार 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस 3x में कोशिकाओं को धो लें।
  6. एमएल डीएपीआई युक्त 1 एक्स पीबीएस समाधान के 2 एमएल जोड़ें, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, और फिर हर बार 10 मिनट के लिए पीबीएस 3 एक्स में धोलें।
  7. स्लाइड पर तरल की एक छोटी मात्रा वाले ईबी को स्थानांतरित करें, किनारे पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेट्रोलियम जेली ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ लेपित कवर ग्लास के साथ स्लाइड को सील करें, और फिर प्रतिदीप्ति कंफोकल माइक्रोस्कोप के तहत छवि का निरीक्षण और संग्रह करें।
    नोट: OCT4 अभिव्यक्ति ईबी प्लुरिपोटेंसी12 का प्रतिनिधित्व करती है। जब OCT4 की अभिव्यक्ति 90% से कम होती है, तो ईबी को त्याग दिया जाना चाहिए, और ईबी को फिर से तैयार किया जाना चाहिए।

6. तंत्रिका प्रेरण (दिन 5-7)

  1. कम आसंजन के साथ एक नई 6-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें, और प्रत्येक कुएं में तंत्रिका प्रेरण माध्यम (पूरक तालिका 2) के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. पार्श्व नरम प्रकाश (चरण 3 में उल्लिखित) चालू करें और अन्य इनडोर प्रकाश स्रोतों को बंद कर दें।
  3. अतिरिक्त तंत्रिका प्रेरण माध्यम (~ 100 ईबी / अच्छी तरह से) के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेट में ईबी स्थानांतरित करें। नए कुएं में मूल माध्यम के जितना संभव हो उतना कम जोड़ें।
    नोट: कार्बनिक हस्तांतरण के सरल कौशल का परिचय दें। स्वाभाविक रूप से, गुरुत्वाकर्षण के तहत और माध्यम की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक घनत्व के साथ, पुन: निलंबित ईबी धीरे-धीरे चित्रा 1 ई में दिखाए गए ऑपरेशन को लागू करके डूब जाएगा। इसलिए, ईबी को आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता है। चूंकि, ईबी की तुलना में, मुक्त कोशिकाएं और मृत कोशिका के टुकड़े अधिक धीरे-धीरे डूबते हैं, इस प्रकार अधिकांश मुक्त कोशिकाओं और मृत कोशिका के टुकड़ों को इस अवसादन विधि (चित्रा 1 एफ) के माध्यम से हटाया जा सकता है।
  4. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर नमूने सेते हैं।
    नोट: माइक्रोस्कोप के तहत, ईबी का व्यास लगभग 500 μm था, और किनारे पारदर्शी था, यह दर्शाता है कि एक न्यूरोएपिथेलियल परत का गठन हुआ।
  5. अगले चरण पर आगे बढ़ें।

7. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेडिंग (दिन 7-10)

  1. झिल्ली मैट्रिक्स को भंग करने के लिए अग्रिम में 60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रखें। अग्रिम में आवश्यक मैट्रिक्स की राशि की गणना करें। झिल्ली मैट्रिक्स के 1.5 एमएल में लगभग 100 ईबी एम्बेडेड थे।
  2. पार्श्व नरम प्रकाश को चालू करें और कंसोल के शीर्ष पर प्रकाश स्रोत को बंद कर दें।
  3. जमने से रोकने के लिए झिल्ली मैट्रिक्स को बर्फ पर रखें।
  4. हर बार ताजा विस्तार माध्यम (पूरक तालिका 3) युक्त 60 मिमी डिश में ईबी की एक छोटी राशि स्थानांतरित करें। एक ईबी को हटाना आसान बनाने के लिए ईबी की संख्या को कम करें।
  5. फिर, एक नई 6-अच्छी तरह से कम आसंजन प्लेट का उपयोग करें। हर बार 200 μL चौड़े बोर पिपेट टिप ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक एकल ईबी (लगभग 10 μL माध्यम युक्त) चूसना, और फिर इसे बूंदों को बनाने के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट के नीचे जोड़ें। प्रति अच्छी तरह से पांच बूंदों का उपयोग करें।
    नोट: कुंजी 50 μL करने के लिए विंदुक बंदूक की सीमा को समायोजित करने और एक ईबी चूसना है, और फिर चित्रा 1 ई के संचालन को संदर्भित करें। जब ईबी पिपेट टिप के बोर में बस जाता है, तो टिप जल्दी से प्लेट के अच्छी तरह से नीचे छूती है और एक छोटी बूंद बनाने के लिए तरल के लगभग 10 μL को धक्का देती है।
  6. ईबी युक्त प्रत्येक बूंद के लिए झिल्ली मैट्रिक्स के 15 μL जोड़ें और इसे जल्दी से मिलाएं। छोटी बूंद के केंद्र में ईबी गेंद एम्बेड करें।
    नोट: ईबी को एक मानक पिपेट टिप के साथ आकांक्षा नहीं की जानी चाहिए, जो ईबी को नुकसान पहुंचाती है। इसके बजाय 200 μL चौड़े बोर विंदुक टिप का उपयोग करने की आवश्यकता है।
  7. 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से प्लेट रखें, और ईबी युक्त झिल्ली मैट्रिक्स बूंदों को जमना।
  8. प्रत्येक कुएं में विस्तार माध्यम के 3 एमएल जोड़ें और उन्हें निलंबित करने के लिए मैट्रिक्स-एम्बेडेड ईबी को धीरे-धीरे उड़ा दें।
  9. 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेते हैं।
    नोट: यदि ईबी की सतह पर नवोदित देखा जाता है, तो इसका मतलब है कि एक विस्तारित न्यूरोएपिथेलियम का गठन किया गया है16.

8. ऑर्गेनोइड परिपक्वता (दिन 10-40)

  1. धीरे मूल माध्यम को हटा दें, और प्रत्येक कुएं में परिपक्वता माध्यम (पूरक तालिका 4) के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक क्षैतिज प्रकार के बरतन पर ऑर्गेनोइड प्लेट रखें।
  3. संस्कृति को क्षैतिज रूप से घुमाना जारी रखें। शेकर को उचित गति पर सेट करें।
    नोट: 6-अच्छी तरह से प्लेट पर सेरेब्रल ऑर्गेनोइड की खेती करते समय, क्षैतिज शेकर के निर्माता के अनुसार, 0.11808 एक्स जी का एक सापेक्ष केन्द्रापसारक बल (आरसीएफ) अधिक उपयुक्त है (सामग्री की तालिका देखें)। सापेक्ष केन्द्रापसारक बल और घूर्णन गति17,18 के बीच रूपांतरण के अनुसार, आरसीएफ = 1.118 x 10−5 × आर × आरपीएम2, जहां आरसीएफ = सापेक्ष केन्द्रापसारक बल (जी), आरपीएम = प्रति मिनट क्रांति (आर / विभिन्न शेकर्स के शेकिंग थ्रो पैरामीटर अलग-अलग हो सकते हैं। इसलिए, यह अनुमान लगाया जा सकता है कि घूर्णन गति आरपीएम = 299 एक्स (आरसीएफ /
  4. हर 2-3 दिनों में ताजा परिपक्वता माध्यम बदलें।
  5. 20-30 दिनों के बाद, धीरे-धीरे सेरेब्रल ऑर्गेनोइड को परिपक्वता के लिए संस्कृति दें।
    नोट: इस अवधि के दौरान, ऑर्गेनोइड का उपयोग प्रयोगों और पता लगाने के लिए किया जा सकता है, जैसे तंत्रिका मार्कर का पता लगाने और ट्रांसक्रिप्टोम अनुक्रमण 19,20,21।

9. सेरेब्रल ऑर्गेनोइड के जमे हुए वर्गों और इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ऑर्गेनोइड को ठीक करें और फिर हर बार 10 मिनट के लिए 1 एक्स पीबीएस के साथ उन्हें 3x धो लें।
  2. पीबीएस निकालें, और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% सुक्रोज में ऑर्गेनोइड विसर्जित करें।
  3. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% / 7.5% जिलेटिन / सुक्रोज में ऑर्गेनोइड ्स एम्बेड करें और फिर उन्हें एम्बेडिंग मोल्ड में जल्दी से स्थानांतरित करें।
  4. इथेनॉल घोल तैयार करने के लिए 100% इथेनॉल में सूखी बर्फ जोड़ें, और त्वरित ठंड के लिए इसमें ऑर्गेनोइड नमूने रखें।
  5. एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जमे हुए नमूने स्टोर। जब आवश्यक हो, तो 20 μm की मोटाई के साथ जमे हुए वर्गों बनाओ।
  6. चरण 5.3.-5.5 देखें। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए। परमाणु डीएनए धुंधला के लिए न्यूरोनल कोशिकाओं22,23,24, और डीएपीआई को लेबल करने के लिए एपिकल पूर्वज कोशिकाओं, टीयूजे 1 एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका देखें) को लेबल करने के लिए पैक्स 6 एंटीबॉडी का उपयोग करें।

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Representative Results

वर्तमान अध्ययन ने सेरेब्रल ऑर्गेनोइड (चित्रा 2 सी) में आईपीएससी (चित्रा 2 बी) को प्रेरित किया। प्रारंभिक अवस्था में खेती की गई ईबी ने ओसीटी 4 मार्कर (चित्रा 2 ए) व्यक्त किया, जिसने अच्छी प्लुरिपोटेंसी का संकेत दिया। बाद के चरण में, ईबी परिपक्व सेरेब्रल ऑर्गेनोइड (चित्रा 2 डी) में विकसित हुए। अनुसंधान ने सामान्य स्वस्थ व्यक्तियों और एससीए 3 रोगियों से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड (चित्रा 3 ए) में आईपीएससी की खेती की। एससीए 3, जिसे मचाडो-जोसेफ रोग (एमजेडी) के रूप में भी जाना जाता है, एक न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है जो एटीएक्सएन 3 जीन25 में पॉलीग्लूटामाइन विस्तार के कारण होता है। आरएनए-सेक डेटा (एक सार्वजनिक भंडार में अपलोड किया गया, सामग्री की तालिका देखें) ने न्यूरोट्रांसमीटर परिवहन, सिनैप्स गठन और विनियमन (चित्रा 3 बी) जैसे मार्गों में सामान्य सेरेब्रल ऑर्गेनोइड समूह और एससीए 3-सेरेब्रल ऑर्गेनोइड समूह के बीच जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल में महत्वपूर्ण अंतर का खुलासा किया। कफलिंक सॉफ्टवेयर का उपयोग जीन अभिव्यक्ति स्तर और अंतर26 की गणना करने के लिए किया गया था। डेटा27 का विश्लेषण करने के लिए डीएसईक्यू 2 का उपयोग किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: ईबी के अनुकूलित मध्यम परिवर्तन और हस्तांतरण संचालन। आईपीएससी को पचाया गया और विशेष 24-अच्छी तरह से प्लेटों (बाएं) में जोड़ा गया। कोशिकाओं ने ईबी (दाएं) का गठन किया। स्केल बार 400 μm है(B) ऑर्गेनोइड्स को देखने में सहायता करने के लिए पार्श्व रूप से प्रबुद्ध नरम प्रकाश का योजनाबद्ध आरेख। (सी) ईबी को विभिन्न प्रकाश स्रोतों के साथ देखा गया था। पीला तीर: पार्श्व रूप से प्रबुद्ध प्रकाश; लाल तीर: अंधेरे पृष्ठभूमि; हरे तीर: ईबी। (डी) एक गोलाकार कक्षा के साथ डिश को घुमाकर एक भंवर प्रवाह प्रेरित होता है। भंवर प्रवाह के कारण, केंद्र की ओर निर्देशित एक माध्यमिक प्रवाह प्रेरित होता है। ईबी रोटेशन के माध्यम से उत्पन्न माध्यमिक प्रवाह द्वारा संचालित डिश के केंद्र में अभिसरण करते हैं। सफेद तीर: ईबी। (ई) ऑर्गेनोइड स्थानांतरण। (मैं) सबसे पहले, एक विस्तृत मुंह विंदुक टिप का उपयोग मिश्रण समाधान को चूसने के लिए किया जाता है, जिसमें ईबी और संस्कृति माध्यम दोनों शामिल हैं। (द्वितीय) फिर, पिपेट को सीधा रखते हुए, ईबी धीरे-धीरे गुरुत्वाकर्षण प्रभाव के तहत डूब जाते हैं और पिपेट टिप के मुंह की ओर अभिसरण करते हैं। (III) पिपेट टिप का मुंह तरल (आमतौर पर ताजा माध्यम) सतह को फिर से छूता है, और तरल सतह तनाव के कारण, (चतुर्थ) ईबी जल्दी से माध्यम में डूब जाते हैं (मैन्युअल रूप से पाइपिंग द्वारा अतिरिक्त उड़ाने की कोई आवश्यकता नहीं है)। लाल रेखा: तरल स्तर; पीले तीर: ईबी। (एफ) चूंकि मुक्त कोशिकाएं और मृत कोशिका के टुकड़े ईबी की तुलना में अधिक धीरे-धीरे डूबते हैं, इसलिए अधिकांश मुक्त कोशिकाओं और मृत कोशिका के टुकड़ों को भ्रूण हस्तांतरण की सुविधा के लिए उपरोक्त अवसादन विधि के माध्यम से हटाया जा सकता है। ऊपरी दाएं कोने में लाल बॉक्स एक बढ़ी हुई छवि है। स्केल बार 400 μm है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सेरेब्रल ऑर्गेनोइड में आईपीएससी का प्रेरण ( ए) ईबी का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना। ओसीटी 4: ऑक्टामर-बाइंडिंग ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर -4; डीएपीआई: डीएपीआई डाइहाइड्रोक्लोराइड। स्केल बार 100 μm है। (B) आईपीएससी। स्केल बार 400 μm है( C) सेरेब्रल ऑर्गेनोइड। स्केल बार 200 μm है (डी) सेरेब्रल ऑर्गेनोइड के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना। पैक्स 6: युग्मित बॉक्स 6 एपिकल पूर्वज कोशिकाओं का मार्कर है; टीयूजे 1: न्यूरॉन-विशिष्ट वर्ग III β-ट्यूबुलिन एक न्यूरॉन-विशिष्ट मार्कर है। स्केल बार 50 μm है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सेरेब्रल ऑर्गेनोइड में स्वस्थ व्यक्तियों और एससीए 3 रोगियों से आईपीएससी की खेती। (ए) ईबी से शुरू होने वाले सेरेब्रल ऑर्गेनोइड की परिपक्वता को कवर करने वाले विभिन्न चरण। एनसी: सामान्य समूह; एससीए 3: एससीए 3 / कम और उच्च आवर्धन छवियों के स्केल बार क्रमशः 400 μm और 200 μm हैं। (बी) सामान्य ऑर्गेनोइड और एससीए 3 ऑर्गेनोइड के बीच डाउन-विनियमित, अलग-अलग व्यक्त जीन के गो संवर्धन विश्लेषण चार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: एटीएक्सएन 3 सीएजी की पहचान केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा दोहराती है। (क) एससीए3 रोगी आईपीएससी (एससीए3-आईपीएससी) की पहचान एटीएक्सएन3 जीन में 26/78 सीएजी रिपीट के रूप में की गई थी। (ख) सामान्य मानव आईपीएससी (एनसी-आईपीएससी) की पहचान एटीएक्सएन3 जीन में 14/14 सीएजी रिपीट के रूप में की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: नरम प्रकाश दीपक की तैयारी। (ए) बिजली की आपूर्ति और एलईडी रोशनी ऐक्रेलिक बोर्ड के एक तरफ स्थापित की गई थी (जैसा कि लाल बिंदीदार बॉक्स में दिखाया गया है)। एलईडी सॉफ्ट लाइट लैंप की बिखरने वाली तरंग दैर्ध्य 450-470 एनएम है, चमकदार प्रवाह 1300-1800 एलएम है, और रंग प्रतिपादन सूचकांक 75-85 आरए है( बी) यह जांच की गई थी कि एलईडी बल्ब सामान्य रूप से प्रकाश कर सकते हैं (जैसा कि लाल बिंदीदार बॉक्स में दिखाया गया है)। (सी) ऐक्रेलिक प्लेट के सामने और पीछे एक सफेद पैड चिपकाया गया था (जैसा कि लाल तीर द्वारा इंगित किया गया है)। (डी) नरम प्रकाश दीपक की समग्र उपस्थिति। (ई) नरम प्रकाश दीपक को फ्रेम के बिना एक वाणिज्यिक एलईडी पेंटिंग लाइट पैड द्वारा भी प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जिसका उपयोग आमतौर पर रेखाचित्रों की प्रतिलिपि बनाते समय ट्रैकिंग के लिए किया जाता है। सफेद फिल्म की एक परत को सीधे एलईडी पेंटिंग लाइट पैड के ऊपर चिपकाया जाना चाहिए। (एफ) काम पर नरम प्रकाश दीपक। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: ईबी-गठन माध्यम की संरचना। ईबी गठन के प्रारंभिक चरण में (आमतौर पर पहले 2 दिन), वाई -27632 (50 μM) और बीएफजीएफ (4 एनजी / एमएल) को ईबी-गठन माध्यम में जोड़ा जाना चाहिए। माध्यम को 0.2 μm फ़िल्टर इकाई के साथ फ़िल्टर किया जाना चाहिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 2: तंत्रिका प्रेरण माध्यम की संरचना। माध्यम को 0.2 μm फ़िल्टर इकाई के साथ फ़िल्टर किया जाना चाहिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 3: विस्तार माध्यम की संरचना। डीएमईएम-एफ 12 में 2-मर्काप्टोएथेनॉल का 1: 100 कमजोर पड़ना तैयार किया गया था, और इसमें से 87.5 μL को विस्तार माध्यम में जोड़ा गया था। बी 27 में विटामिन ए नहीं होना चाहिए। माध्यम को 0.2 μm फ़िल्टर इकाई के साथ फ़िल्टर किया जाना चाहिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 4: परिपक्वता माध्यम की संरचना। डीएमईएम-एफ 12 में 2-मर्काप्टोएथेनॉल का 1: 100 कमजोर पड़ना तैयार किया गया था और इसमें से 87.5 μL परिपक्वता माध्यम में जोड़ा गया था। बी 27 में विटामिन ए नहीं होना चाहिए। माध्यम को 0.2 μm फ़िल्टर इकाई के साथ फ़िल्टर किया जाना चाहिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सेरेब्रल ऑर्गेनोइड चिकित्सा अनुसंधान के लिए नए रास्ते खोलते हैं। इस तकनीक के कई उपयोगी अनुप्रयोगों का पता लगाया जाना शुरू हो गयाहै 28. इस शोध में पाया गया कि आनुवंशिक रूप से रोगग्रस्त सेरेब्रल ऑर्गेनोइड और सामान्य सेरेब्रल ऑर्गेनोइड के ट्रांसक्रिप्टोम अनुक्रमण परिणाम रोग और स्वास्थ्य के बीच अंतर को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, आरएनए-सेक डेटा विश्लेषण परिणाम (चित्रा 3 बी) एससीए 3 रोगों 29,30,31,32 पर कई रिपोर्ट किए गए अध्ययनों के अनुरूप हैं। प्रायोगिक संचालन, जैसे कि मध्यम परिवर्तन, ईबी स्थानांतरण, और रैपिंग, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड की खेती करने और यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि क्या अच्छी एकरूपता वाले ऑर्गेनोइड33,34 तैयार किए जा सकते हैं। इस अध्ययन में, एक सेरेब्रल ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल जो मध्यम परिवर्तन और ऑर्गेनोइड ट्रांसफर की सुविधा प्रदान करता है। एक पार्श्व नरम प्रकाश दीपक ऑर्गेनोइड संस्कृति के संचालन में बहुत सहायता कर सकता है। हालांकि, इसे बनाना मुश्किल नहीं है, एलईडी पेंटिंग लाइट पैड और सरल प्रसंस्करण भी इसे बदल सकते हैं। सरल तरल विनिमय विधि और ऑर्गेनोइड ट्रांसफर ऑपरेशन पूरी संस्कृति प्रक्रिया को आसान बनाते हैं। सेरेब्रल ऑर्गेनोइड का अनुप्रयोग अक्सर खराब एकरूपता35 की समस्या से प्रभावित होता है। इस अध्ययन और अन्य सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति दिशानिर्देशों के बीच सबसे बड़ा अंतर यह है कि प्रयोग को अधिक दोहराने योग्य बनाने के लिए ऑपरेशन को अनुकूलित करने पर ध्यान केंद्रित किया जाता है।

संस्कृति व्यवस्था की स्थिरता बनाए रखना बहुत जरूरी है। यदि स्थितियां अनुमति देती हैं, तो वाणिज्यिक सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड माध्यम को प्राथमिकता देने का सुझाव दिया जाता है, जो माध्यम की अस्थिरता के कारण विभिन्न बैचों में प्रयोगात्मक परिणामों में महान अंतर को प्रभावी ढंग से कम कर सकता है। इसके अलावा, 4 डिग्री सेल्सियस पर सेरेब्रल ऑर्गेनोइड मध्यम भंडारण 2 सप्ताह से अधिक नहीं रहना चाहिए; अन्यथा, यह संस्कृति प्रणाली की स्थिरता को प्रभावित करेगा। बेशक, यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि उपयोग किए जाने वाले आईपीएससी विभेदित के बजाय प्लुरिपोटेंट हैं। ओसीटी 4 इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने का उपयोग किया जा सकता है। यदि ओसीटी 4-पॉजिटिव कोशिकाएं 90% से कम हैं, तो उन्हें फिर से उच्च गुणवत्ता वाले आईपीएससी और संस्कृति सेरेब्रल ऑर्गेनोइड के साथ बदलने की सिफारिश की जाती है।

इस अध्ययन में पेश की गई सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रौद्योगिकी में कुछ सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड को विकास के बाद के चरण में गहन रूप से सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है, जो संस्कृति स्थान की बर्बादी है। सेरेब्रल ऑर्गेनोइड लगाने में हल होने वाली यह एक तत्काल समस्या भी है। यदि कई सेरेब्रल ऑर्गेनोइड खोखले विस्तार का प्रदर्शन करते हैं, तो प्रत्येक कुएं में ऑर्गेनोइड की संख्या कम हो जाती है, मध्यम विनिमय आवृत्ति बढ़ जाती है, और ऑर्गेनोइड पर्याप्त पोषक तत्वों के साथ एक गैर-उच्चपद अवस्था में होते हैं।

यह अध्ययन कई मौजूदा सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति विधियों 12,36,37 और यहां तक कि अन्य प्रकार के अंग संस्कृति विधियों 38,39 के लिए एक परिचालन पूरक है। यह भविष्य में स्वचालित ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रणालियों को विकसित करने और ऑर्गेनोइड के अनुसंधान और अनुप्रयोग को बढ़ावा देने में मदद करेगा। यदि स्वचालित बुद्धिमान खेती प्रणाली में ऑर्गेनोइड के प्रकाश फैलाना प्रतिबिंब प्रभाव को बढ़ाने की तकनीक का उपयोग किया जाता है, तो यह सैद्धांतिक रूप से उच्च परिशुद्धता छवि प्रवर्धन कैमरे को प्रतिस्थापित कर सकता है, और केवल एक साधारण छवि मान्यता डिवाइस स्थापित करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, चूषण सिर पर रोटेशन और प्राकृतिक अवसादन द्वारा उत्पन्न माध्यमिक प्रवाह के माध्यम से मध्यम विनिमय और ऑर्गेनोइड हस्तांतरण सैद्धांतिक रूप से भविष्य के स्वचालित संस्कृति उपकरणों में सेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में अधिक व्यवहार्य हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2020 ए0505100062), गुआंगज़ौ सिटी साइंस एंड टेक्नोलॉजी की टॉपिक्स प्रोजेक्ट (ग्रांट नंबर 201904020025), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रांट नंबर 31872800, 32070582, 82101937), और गुआंगज़ौ सिटी पोस्टडॉक्टरल रिसर्च ग्रांट प्रोजेक्ट (बंगझू चेन के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm Filter NEST Biotechnology, China 331001
1000 μL wide-bore pipette tip Thermo Fisher Scientific, USA 9405163
200 μL wide-bore pipette tip Thermo Fisher Scientific, USA 9405020
2-Mercaptoethanol Merck, Germany 8057400005
4% Paraformaldehyde Servicebio, China G1101
6-well low adhesion plate NEST Biotechnology, China 703011 It is used for EBs suspension cultures
Aaccute cell detachment solution STEMCELL Technologies, Canada 07920 It is used to digest iPSC into single cells.
AggreWell800 24-well STEMCELL Technologies, Canada 34811 Microporous culture plate for EBs preparation.
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies, Canada 07010 Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion
B27-vit. A supplement Thermo Fisher Scientific, USA 12587010
bFGF Peprotech, USA GMP100-18B
BSA Beyotime Biotechnology, China ST025
Centrifuge Eppendorf, Germany 5810 R It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.
Cover glass Shitai Laboratory Equipment, China 10212020C
DAPI Beyotime Biotechnology, China C1002 Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific, USA 11330032
ES-quality FBS Thermo Fisher Scientific, USA 10270106
Ficoll Paque General Electric Company, USA 17-5442-02 Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.
Gelatin Sangon Bioteach, China A609764
Glutamax supplement Thermo Fisher Scientific, USA 35050061
Glutamax supplement Thermo Fisher Scientific, USA 17504044
Goat anti-Chicken IgY  secondary antibody Abcam, UK ab150171 Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody Abcam, UK ab150120 Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody Abcam, UK ab150077 Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.
Heparin Merck, Germany H3149
Horizontal shaker Servicebio, China DS-H200 Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).
Insulin Merck, Germany I9278-5ML
KOSR Thermo Fisher Scientific, USA 10828028
Matrigel Corning, USA 354277 Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature.
MEM-NEAA Thermo Fisher Scientific, USA 11140050
mTeSR1 STEMCELL Technologies, Canada 85850 iPSC culture medium
N2 supplement Thermo Fisher Scientific, USA 17502048
Neurobasal Thermo Fisher Scientific, USA 21103049
OCT4 primary antibody Abcam, UK ab19857 Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution.
Pathological frozen slicer Leica, Germany Leica CM1860
PAX6 primary antibody Abcam, UK ab78545 Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.
PBS STEMCELL Technologies, Canada 37350
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific, USA 15140122
PSC dissociation solution Beijing Saibei Biotechnology, China CA3001500 Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.
Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific, USA A16518 Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.
Slide Glass Shitai Laboratory Equipment, China 188105W
Soft light lamp NUT NUT A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.
STEMdiff Cerebral Organoid Kit STEMCELL Technologies, Canada 8570 Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit STEMCELL Technologies, Canada 8571 Maturation Medium
Sucrose Sangon Bioteach, China A502792
Triton X-100 Merck, Germany X100
TUJ1 primary antibody Abcam, UK ab41489 Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.
Vaseline Sangon Bioteach, China A510146
Y-27632 STEMCELL Technologies, Canada 72302 Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS.
Weblink
Raw sequencing data Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences GSA-Human: HRA002430 https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/

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बायोइंजीनियरिंग अंक 184
पार्श्व नरम प्रकाश रोशनी के <em>माध्यम से</em> सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति की सुविधा
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Chen, B., Lin, Q., Liu, N., Chen, D., Zhang, Y., Sun, X. Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination. J. Vis. Exp. (184), e63989, doi:10.3791/63989 (2022).

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