Summary
대뇌 오가노이드는 장기 발달 및 인간 질병 병리학을 연구하기위한 전례없는 기회를 제공합니다. 대뇌 오가노이드 배양 시스템으로 큰 성공을 거두었지만이 기술을 적용하는 데는 여전히 운영상의 어려움이 있습니다. 본 프로토콜은 중간 변화 및 오가노이드 전달을 용이하게 하는 대뇌 오가노이드 절차를 기술한다.
Abstract
현재 대뇌 오가노이드 배양 기술은 여전히 운영이 복잡하고 대규모로 적용하기가 어렵습니다. 간단하고 실용적인 해결책을 찾아야합니다. 따라서, 본 연구에서 보다 실현 가능한 대뇌 오가노이드 프로토콜이 제안된다. 초기 단계에서 중간 변화 및 오가노이드 전달의 피할 수없는 불편 함을 해결하기 위해 현재 연구는 엔지니어링 원칙을 적용하여 운영 기술을 최적화합니다. 배아체(EB) 샘플을 측면으로 비추기 위해 소프트 라이트 램프를 채택하여 EB를 향상된 확산 반사 효과를 통해 육안으로 볼 수 있도록 했습니다. 회전에 의해 생성 된 이차 흐름의 원리를 사용하여, 오가노이드는 우물의 중심을 향해 모여 중간 변화 또는 오가노이드 전달의 작동을 용이하게합니다. 분산 된 세포와 비교할 때, 배아체는 피펫에서 더 빨리 정착합니다. 이 현상을 사용하면 대부분의 자유 세포 및 죽은 세포 단편을 간단한 방법으로 효과적으로 제거 할 수있어 EB가 원심분리로 인한 손상을 입지 않도록합니다. 이 연구는 대뇌 오가노이드 문화의 작동을 용이하게하고 뇌 오가노이드의 적용을 촉진하는 데 도움이됩니다.
Introduction
2차원(2D) 배양 시스템과 비교하여, 3차원(3D) 배양 시스템은 특정 장기의 복잡한 구조의 진정한 복제 및 효율적인 재생을 포함하여 몇 가지 장점을 갖는다1. 따라서 대뇌 오가노이드는 인간 뇌 발달 및 질병2, 약물 스크리닝 및 세포 치료의 연구 분야에서 중요한 보조 방법 중 하나입니다.
회전 현탁액 방법에 의해 대뇌 오가노이드를 배양하는 것은 그들의 발달과 성숙에 도움이됩니다3. 대뇌 오가노이드 배양 시스템은 큰 성공을 거두었지만 여전히 적용을 제한하는 중대한 도전에 직면 해 있습니다. 예를 들어, 수동 재배는 복잡한 조작 단계를 포함하며 대규모 응용 프로그램을 달성하는 데 장애물을 초래합니다. 또한, 대뇌 오가노이드 배양의 각 발달 단계에서, 상이한 배지 및 사이토카인의 변화가 필요하다4. 그러나 초기 단계에서 오가노이드 또는 EB는 작은 크기 (약 200 μm ~ 300 μm)를 가지며 적절한 장치 없이는 거의 시각적으로 접근 할 수 없습니다. 필연적으로, 일정량의 귀중한 오가노이드 샘플은 배지가 변경될 때 플러시됩니다. 다른 종류의 오가노이드 배양에서 이것을 극복하기 위해 많은 기술이 탐구되었으며, 일부 예에는 개입없이 3 일 동안 전체 오가노이드 칩을 배양 배지에 침지하는 것이 포함됩니다5; 오래된 배지가 흡수성 종이를 사용하여 흡수된 후에 커버슬립을 통해 신선한 배지를 첨가하는단계(5); 또는 유체 교환을 위해 복잡한 미세 유체 파이프 라인을 적용 6,7,8. 오가노이드 재배의 초기 단계에서 직면 한 또 다른 장애물은 육안으로 직접 관찰을 달성하기가 어렵 기 때문에 오가노이드 전달 단계 중에 오가노이드 손상 및 손실을 초래하는 불량한 작동을 유발할 수 있습니다. 따라서, 오가노이드를 생성하기 위해 중간 변화 및 오가노이드 전달을 용이하게하는보다 실현 가능한 프로토콜을 수립 할 필요가있다.
이러한 문제를 극복하기 위해 엔지니어링 원칙에 기반한 해당 최적화 된 작업이 제안되어 많은 오가노이드 절차가 상당히 편리하게 용이합니다. 자연에서 태양이 창문 틈을 통해 집에 비추면 육안으로는 광선에서 춤추는 먼지를 볼 수 있습니다. 먼지에 햇빛이 확산되어 반사되기 때문에 일부 빛은 안구로 굴절되어 시각적 이미지를 생성합니다. 이 현상 9,10의 원리에서 영감을 얻은 이 연구는 부드러운 조명 램프를 만들고 EB를 옆으로 비췄습니다. EB는 시야 범위에 영향을 미치지 않고 시각적으로 명확 할 수 있음을 발견했습니다. 중심을 가리키는 이차 흐름은 와류(11)로 인해 배양 플레이트를 회전시킴으로써 액체에서 생성된다. 원래 분산된 EB는 플레이트의 중앙에 축적됩니다. 이를 바탕으로, 오가노이드의 침강 속도가 세포의 침강 속도보다 빠르다는 현상이 있으며, 원심분리 없이 배지 변경 및 오가노이드 이송이 용이한 조작방법이 제안된다. 배양 배지 내의 오가노이드는 이러한 전달 조작을 통해 자유 세포 및 죽은 세포 단편으로부터 효과적으로 분리될 수 있다.
여기서, 조작하기 쉬운 프로토콜이 인간 다능성 줄기 세포로부터 대뇌 오가노이드를 생성하도록 제안된다. 운영 기술은 엔지니어링 원리를 적용하여 최적화되었으며, 3D 문화에서의 작업을 2D 문화에서처럼 간단하고 실현 가능하게 만들었습니다. 향상된 액체 교환 방법 및 오가노이드 전달 작동은 다른 유형의 오가노이드 배양 및 자동 배양 기계 설계에도 도움이됩니다.
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Protocol
이 프로토콜은 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 광저우 의과 대학 세 번째 부속 병원 윤리위원회 (의료 및 윤리 검토 [2021] No. 022)의 승인이 부여되었습니다. 실험 전에, 각 배지는 Juergen A. Knoblich사의 화학식12 (보충 표 1-4)에 따라 제조되거나, 시판되는 대뇌 오가노이드 키트를 사용하였다 ( 표 참조). 이 연구에 사용 된 iPSC는 이전에 우리 실험실에서 설립되었으며 정보에 입각 한 면제를 받았습니다. SCA3-iPSCs는 ATXN3 유전자 13에 26/78 CAG 반복을 보유하는 것으로 유전자형화된31 세 여성 척수 소뇌 운동 실조증 유형 3 (SCA3) 환자로부터 생성되었다 (보충 도 1A). 이전 기사에서 언급된 정상 인간 iPSCs는 NC-iPSCs 14로 선택되었고, ATXN3 유전자는14/14 CAG 반복을 갖는 것으로 확인되었다(보충 도 1B).
1. 유도만능줄기세포(iPSCs)의 제조
- 자원 봉사자와 환자의 정보에 입각 한 동의하에 정맥 천자에 의해 말초 혈액 3 mL를 수집하십시오.
- Ficoll-Paque 방법15에 따라 말초 혈액 단핵구를 분리한다.
- 센다이 리프로그래밍 키트의 프로토콜에 따라 iPSC를 설정합니다( 자료 표 참조).
- iPSCs를 mTeSR1 배지로 배양하여 마트리겔로 덮은 35mm 페트리 접시에 넣는다(기저막 매트릭스, 자료표 참조). 매일 매체를 바꿉니다. iPSC 성장 밀도는 75%를 초과하지 않아야 합니다.
- 세포를 PSC 해리 용액 ( 물질 표 참조)으로 소화하고 3-5 일마다 1:5의 비율로 계대 배양하십시오.
주의: 센다이 바이러스는 여기에 사용됩니다. 그것은 생물 안전 캐비닛에서 작동해야하며 자기 보호 조치를 취해야합니다. 현지 국가에서 합법적으로 사용할 수 있는지 여부는 분명해야합니다. 지역 생물 안전 법률 및 규정은 사용 시 엄격하게 준수되어야 합니다.
2. EB 준비 (0-1 일)
- iPSCs로부터 mTeSR1 배지를 피펫으로 제거하고, 1 mL의 1x PBS로 2x 세척하였다.
- PBS를 피펫으로 제거하고, 300 μL의 세포 분리 용액 ( 표 문헌 참조)을 첨가하여 iPSCs를 37°C에서 3-4분 동안 단일 세포로 소화시켰다.
- 세포를 2 mL의 EB 형성 배지 (보충 표 1)에 재현탁시킨 다음, 샘플을 300 x g (실온)에서 5분 동안 원심분리한다.
- 특수 24웰 플레이트를 부착 방지 헹굼 용액(500μL/웰)으로 5분 동안 전처리 하십시오(재료 표 참조).
참고 : 부착 방지 헹굼 솔루션은 최적의 EB 및 스페로이드 형성에 필수적입니다. - 세포를 Y-27632 (최종 농도, 10 μM, 물질 표 참조)를 함유하는 EB 형성 배지에 재현탁시키고, 세포 밀도는 1.5 x 106 세포/mL이다.
- 부착 방지 헹굼 용액을 제거하고, 2 mL의 EB 형성 배지로 각 웰을 헹구었다.
- 세포를 3 x 10 6 셀/웰의 밀도로 특수 24웰 플레이트에 추가합니다(그림 1A, 왼쪽).
참고: 일반적으로 각 웰에 300개의 EB를 준비할 수 있습니다. 이 방법은 동일한 크기의 대량의 EB를 준비 할 수 있습니다. - 플레이트를 실온에서 2분 동안 100 x g 에서 원심분리한다. 플레이트의 바닥에 있는 각 챔버에 세포를 균일하게 분배한다(도 1A, 오른쪽).
참고 : 적절한 원심 분리기가없는 경우 플레이트를 정적 배양을 위해 인큐베이터에 직접 배치 할 수도 있지만 EB 볼의 형성 시간은 정상적인 원심 분리보다 몇 시간 늦습니다. - 샘플을 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 원심분리가 이전 단계에서 사용되지 않은 경우, 36시간 동안 인큐베이션한다. 샘플을 안정적으로 유지하고이 기간 동안 인큐베이터에서 꺼내지 마십시오.
3. 소프트 라이트 램프의 제조 (1 일째)
- A5 용지 크기의 두께가 0.3-0.5cm 인 투명 아크릴 보드를 사용하십시오. 아크릴 판의 앞면과 뒷면에 흰색 패드를 붙여 넣습니다.
- 아크릴 플레이트의 측면에서 조명이 들어올 수 있도록 플레이트 가장자리에 LED 백색 조명 행을 설치한 다음 병렬로 쏘아 올립니다(보충 그림 2A-F, 그림 1B).
참고 : 초기 단계의 EB의 직경은 약 200 μm ~ 300 μm이므로 깨끗한 벤치의 형광등 아래에서 육안으로 명확하게 관찰하기가 어렵습니다. 반대로 확산 반사가 향상됨에 따라 측면 조명이 있는 부드러운 빛을 사용하여 EB를 명확하게 감지할 수 있습니다(그림 1B, C). 6웰 플레이트는 후속 실험에서 EB 배양에 권장됩니다. 그러나 부드러운 빛의 시각 효과를보다 잘 보여주기 위해이 연구에서 접시 대신 그림과 비디오를 찍는 데 요리가 사용되므로 오해하지 마십시오. 측면 조명 소프트 라이트 램프는 6 웰 플레이트에도 사용할 수 있습니다.
- 아크릴 플레이트의 측면에서 조명이 들어올 수 있도록 플레이트 가장자리에 LED 백색 조명 행을 설치한 다음 병렬로 쏘아 올립니다(보충 그림 2A-F, 그림 1B).
4. EB 전송 및 중간 교체 (2-5 일)
- 새로운 6-웰 저접착성 플레이트를 준비하고, 각 웰에 EB 형성 배지 2 mL를 첨가한다.
- 1000μL 와이드 보어 피펫 팁( 재료 표 참조)으로 배지와 함께 EB를 제거하고 6웰 저접착 플레이트(~100EB/웰)로 옮깁니다.
참고: 작동 프로세스는 EB를 더 쉽게 관찰할 수 있도록 소프트 라이트 램프(3단계에서 언급)를 채택합니다. 다른 실내 광원을 끄면 부드러운 빛의 시각 효과를 높일 수 있습니다. - 매일 같은 양의 신선한 EB 형성 배지로 교체하십시오. 보조 흐름을 사용하여 EB를 중앙에 모으고 매체를 변경합니다.
- 우물의 가장자리로 천천히 피펫팅하여 오래된 매체를 흡인하십시오. 너무 열심히 빨지 마십시오. 그렇지 않으면 EB가 함께 제거됩니다. 그런 다음 새 매체를 추가하여 EB를 다시 일시 중단합니다.
참고: 원리 보조 흐름(그림 1D). 접시를 원형 궤도를 따라 회전시켜 소용돌이 흐름을 유도하십시오. 소용돌이 흐름으로 인해 이차 흐름이 중심을 향하도록 유도됩니다. EB 또는 오가노이드는 회전을 통해 생성된 이차 흐름으로 인해 웰의 중심으로 수렴되며, 그 후에 배지 변화 또는 배아 전달이 쉽게 실행될 수 있다.
- 우물의 가장자리로 천천히 피펫팅하여 오래된 매체를 흡인하십시오. 너무 열심히 빨지 마십시오. 그렇지 않으면 EB가 함께 제거됩니다. 그런 다음 새 매체를 추가하여 EB를 다시 일시 중단합니다.
5. 다능성 마커 OCT4로 라벨링하여 다능성 확인 (4일째)
참고: EB의 직경이 300μm보다 크면 OCT4 마커 면역형광 염색을 위해 여러 EB를 취하여 다능성을 검출하십시오.
- EBs를 4°C에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, 1x PBS에서 3x로 세척하여 매번 10분 동안 3배로 세척하였다.
- EBs를 2시간 동안 0.3% 트리톤 X-100 및 3% BSA를 함유하는 실온 PBS로 옮기고, 매번 10분 동안 PBS 3x로 세척하였다.
참고: Triton X-100으로 처리한 후 EB는 액체 표면에 떠 다니며 청소하는 동안 액체로 쉽게 빨아들일 수 있습니다. 입체 현미경으로 조작하는 것이 좋습니다. - OCT4 일차 항체 ( 표 참조)를 1:200의 비율로 1% BSA를 함유하는 1x PBS 1 mL로 희석하고, 4°C에서 밤새 인큐베이션하기 위해 EBs를 첨가한 다음, 매번 10분 동안 PBS 3x로 세척한다.
- 각각의 이차 항체 ( 물질 표 참조)를 1:500에서 1x PBS로 희석하고 EBs에 1 mL를 첨가한다.
- 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 1x PBS 3x로 10분 동안 각각 세척하였다.
- PBS를 제거하고, 1 μg/mL DAPI를 함유하는 1x PBS 용액 2 mL를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, 매번 10분 동안 PBS 3x로 세척한다.
- 소량의 액체를 함유하는 EB를 슬라이드 상으로 옮기고, 가장자리에 시판되는 석유 젤리로 코팅된 커버 글라스(표 표 참조)로 슬라이드를 밀봉한 다음, 형광 공초점 현미경으로 이미지를 관찰하고 수집한다.
참고: OCT4 발현은 EB 다능성12를 나타낸다. OCT4의 발현이 90 % 미만이면 EB를 폐기하고 EB를 다시 준비해야합니다.
6. 신경 유도 (5-7 일)
- 낮은 접착력을 가진 새로운 6-웰 플레이트를 준비하고, 각 웰에 3 mL의 신경 유도 배지 (보충 표 2)를 첨가한다.
- 측면 소프트 라이트(3단계에서 언급)를 켜고 다른 실내 광원을 끕니다.
- EB를 신경망 유도 매체(~100EB/웰)가 추가된 6웰 플레이트로 옮깁니다. 원래 매체를 가능한 한 적게 새 우물에 추가하십시오.
참고 : 오가노이드 전송의 간단한 기술을 소개합니다. 당연히, 중력 하에서, 그리고 매질보다 상대적으로 더 높은 밀도로, 재현탁된 EB는 그림 1E에 도시된 조작을 적용함으로써 점차적으로 가라앉을 것이다. 따라서 EB를 편리하게 전송할 수 있습니다. EBs에 비해, 자유 세포 및 죽은 세포 단편은 더 느리게 가라앉기 때문에, 대부분의 자유 세포 및 죽은 세포 단편은 따라서 이러한 침전 방법을 통해 제거될 수 있다(도 1F). - 샘플을 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
참고 : 현미경 하에서, EBs의 직경은 약 500 μm이었고, 가장자리는 반투명하여 신경 상피층이 형성되었음을 나타냅니다. - 다음 단계로 진행합니다.
7. 기저막 매트릭스에 임베딩 (7-10 일)
- 멤브레인 매트릭스를 4°C 냉장고에 미리 60분 동안 놓고 용해시킨다. 필요한 행렬의 양을 미리 계산하십시오. 약 100개의 EB가 1.5mL의 멤브레인 매트릭스에 포매되었다.
- 측면 소프트 라이트를 켜고 본체 상단의 광원을 끕니다.
- 응고를 방지하기 위해 멤브레인 매트릭스를 얼음 위에 보관하십시오.
- 매번 소량의 EB를 신선한 팽창 배지가 들어있는 60mm 접시에 옮기십시오 (보충 표 3). 단일 EB를 더 쉽게 제거할 수 있도록 EB 수를 줄입니다.
- 그런 다음 새로운 6-웰 저접착 플레이트를 사용하십시오. 매번 단일 EB (약 10 μL 배지 포함)를 200 μL 와이드 보어 피펫 팁 ( 재료 표 참조)으로 흡입 한 다음 6-웰 플레이트의 바닥에 첨가하여 액적을 만듭니다. 우물 당 다섯 방울을 사용하십시오.
참고: 핵심은 피펫 건(pipette gun)의 범위를 50μL로 조정하고 EB를 빨아들인 다음 그림 1E의 작동을 참조하는 것입니다. EB가 피펫 팁의 보어에 정착하면 팁이 플레이트의 웰 바닥에 빠르게 닿아 약 10μL의 액체를 밀어 액적을 형성합니다. - 15 μL의 멤브레인 매트릭스를 EB를 함유하는 각 방울에 첨가하고 신속하게 혼합한다. EB 볼을 물방울 중앙에 끼워 넣습니다.
참고: EB는 EB를 손상시키는 표준 피펫 팁으로 흡입되어서는 안 됩니다. 대신 200μL 와이드 보어 피펫 팁을 사용해야 합니다. - 6-웰 플레이트를 30분 동안 37°C 인큐베이터에 넣고, EBs를 함유하는 막 매트릭스 액적을 응고시킨다.
- 확장 배지 3mL를 각 웰에 넣고 매트릭스 내장 EB를 부드럽게 날려 현탁시킵니다.
- 3일 동안 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이션한다.
참고 : EB의 표면에서 싹이 트면 확장 된 신경 상피가 형성되었음을 의미합니다16.
8. 오가노이드 성숙 (10-40 일)
- 원래 배지를 부드럽게 제거하고, 3 mL의 성숙 배지 (보충 표 4)를 각 웰에 첨가한다.
- 오가노이드 플레이트를 37°C 인큐베이터의 수평 진탕기 상에 놓는다.
- 문화권을 수평으로 계속 회전시킵니다. 셰이커를 적절한 속도로 설정하십시오.
참고 : 6 웰 플레이트에서 대뇌 오가노이드를 배양 할 때 수평 쉐이커 제조업체에 따르면 0.11808 x g의 상대 원심력 (RCF)이 더 적합합니다 (재료 표 참조). 상대 원심력과 회전 속도17,18 사이의 변환에 따르면, RCF = 1.118 x 10-5 × R × rpm 2, 여기서 RCF = 상대 원심력 (g), rpm = 분당 회전 (r / min) 및 R = 회전 반경 (cm), 흔들림 던지기라고도합니다. 다른 쉐이커의 흔들림 던지기 매개 변수는 다를 수 있습니다. 따라서, 회전 속도는 rpm = 299 x (RCF/R)1/2인 것으로 추정될 수 있다. - 2-3 일마다 신선한 성숙 배지를 교체하십시오.
- 20-30 일 후, 점차적으로 성숙하기 위해 대뇌 오가노이드를 배양하십시오.
참고: 이 기간 동안 오가노이드는 신경 마커 검출 및 전사체 시퀀싱19,20,21과 같은 실험 및 검출에 사용될 수 있습니다.
9. 냉동 절편과 대뇌 오가노이드의 면역형광
- 오가노이드를 4°C에서 16시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 다음, 이를 10분 동안 1x PBS로 3배 세척하였다.
- PBS를 제거하고, 오가노이드를 4°C에서 하룻밤 동안 30% 수크로오스에 침지시켰다.
- 오가노이드를 37°C에서 1시간 동안 10%/7.5% 젤라틴/수크로오스에 내장한 다음, 이를 임베딩 몰드로 신속하게 옮깁니다.
- 드라이 아이스를 100 % 에탄올에 첨가하여 드라이 아이스 / 에탄올 슬러리를 준비하고 오가노이드 샘플을 넣어 빠르게 동결시킵니다.
- 냉동된 샘플을 -80°C 냉동고에 보관한다. 필요한 경우 두께가 20μm인 냉동 단면을 만듭니다.
- 단계 5.3.-5.5를 참조하십시오. 면역 형광을 위해. PAX6 항체를 사용하여 정점 전구 세포를 표지하고, TUJ1 항체 (물질 표 참조)를 사용하여 신경 세포22,23,24를 표지하고, DAPI를 핵 DNA 염색에 표지한다.
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Representative Results
본 연구는 iPSCs(도 2B)를 대뇌 오가노이드로 유도하였다(도 2C). 초기 단계에서 재배된 EB는 OCT4 마커(그림 2A)를 나타내었으며, 이는 양호한 다능성을 나타냈다. 후기 단계에서 EB는 성숙한 대뇌 오가노이드로 발전했습니다 (그림 2D). 이 연구는 정상적인 건강한 개인과 SCA3 환자의 iPSC를 대뇌 오가노이드로 배양했습니다 (그림 3A). 마차도요세프 병(MJD)으로도 알려진 SCA3는 ATXN3 유전자25의 폴리글루타민 확장으로 인한 퇴행성 신경퇴행성 질환이다. RNA-seq 데이터 (공개 저장소에 업로드, 자료 표 참조)는 신경 전달 물질 수송, 시냅스 형성 및 조절과 같은 경로에서 정상 뇌 오가노이드 그룹과 SCA3-대뇌 오가노이드 그룹 간의 유전자 발현 프로필에서 유의한 차이를 나타냈다 (도 3B). 커프링크 소프트웨어는 유전자 발현 수준 및 차이26을 계산하기 위해 사용되었다. DEseq2는 데이터27을 분석하는데 추가로 사용되었다.
그림 1: EB의 매체 변경 및 전송 작업을 최적화했습니다 . (A) EB 준비. iPSC를 소화하여 특수 24웰 플레이트에 첨가하였다(왼쪽). 세포가 EB를 형성했습니다 (오른쪽). 스케일 바는 400 μm입니다. (B) 오가노이드 관찰을 돕기 위해 측방으로 조명 된 부드러운 빛의 개략도. (C) EBs는 상이한 광원으로 관찰되었다. 노란색 화살표 : 측면 조명 조명; 빨간색 화살표 : 어두운 배경; 녹색 화살표 : EBs. (D) 소용돌이 흐름은 접시를 원형 궤도를 따라 회전시킴으로써 유도된다. 소용돌이 흐름으로 인해 중심을 향한 이차 흐름이 유도됩니다. EB는 회전을 통해 생성 된 보조 흐름에 의해 구동되는 접시의 중심으로 수렴합니다. 흰색 화살표 : EBs. (E) 오가노이드 전달. (i) 먼저, 넓은 입 피펫 팁이 EBs 및 배양 배지 모두를 포함하는 혼합 용액을 빨아들이기 위해 사용된다. (II) 그런 다음 피펫을 똑바로 유지하면서 EB는 중력 효과에 따라 점차 가라 앉고 피펫 팁의 입쪽으로 수렴합니다. (III) 피펫 팁의 입이 액체 (일반적으로 신선한 매체) 표면에 다시 닿으면 액체 표면 장력으로 인해 EB가 신속하게 매체에 가라 앉습니다 (수동으로 피펫팅하여 추가로 불어 낼 필요가 없음). 빨간 선: 액체 수준; 노란색 화살표 : EBs. (f) 자유 세포 및 죽은 세포 단편은 EBs보다 더 느리게 가라앉기 때문에, 대부분의 자유 세포 및 죽은 세포 단편은 배아 전달을 용이하게 하기 위해 상기 침전 방법을 통해 제거될 수 있다. 오른쪽 위 모서리에 있는 빨간색 상자는 확대된 이미지입니다. 스케일 바는 400μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 대뇌 오가노이드로의 iPSCs의 유도 . (A) EBs의 면역형광 염색. OCT4: 옥타머-결합 전사 인자-4; DAPI: DAPI 디하이드로클로라이드. 스케일 바는 100 μm입니다. (B) iPSCs. 스케일 바는 400 μm이다. (C) 대뇌 오가노이드. 스케일 바는 200 μm이다. (D) 대뇌 오가노이드의 면역형광 염색. PAX6: 짝을 이룬 박스 6은 정점 전구 세포의 마커이고; TUJ1: 뉴런-특이적 클래스 III β-튜불린은 뉴런-특이적 마커이다. 스케일 바는 50μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 건강한 개인과 SCA3 환자로부터 대뇌 오가노이드로의 iPSCs 배양. (A) EBs에서 시작하는 대뇌 오가노이드의 성숙을 다루는 다른 단계. NC: 정상군; SCA3: SCA3/MJD 그룹. 저배율 및 고배율 이미지의 스케일 바는 각각 400μm 및 200μm입니다. (b) 정상 오가노이드와 SCA3 오가노이드 사이의 하향조절된, 차등적으로 발현된 유전자의 GO 농축 분석 차트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 모세관 전기영동에 의한 ATXN3 CAG 반복의 확인. (a) SCA3 환자 iPSC (SCA3-iPSC)가 ATXN3 유전자에서 26/78 CAG 반복을 갖는 것으로 확인되었다. (b) 정상 인간 iPSC (NC-iPSC)는 ATXN3 유전자에서 14/14 CAG 반복을 갖는 것으로 확인되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2 : 소프트 라이트 램프의 준비. (A) 전원 공급 장치 및 LED 조명은 아크릴 보드의 한쪽면에 설치되었습니다 (빨간색 점선 상자에 표시됨). LED 소프트 라이트 램프의 산란 파장은 450-470 nm, 광속은 1300-1800 lm, 연색 지수는 75-85 Ra. (B) LED 전구가 정상적으로 점등될 수 있는지 여부를 확인했다(빨간색 점선 상자 표시). (C) 흰색 패드를 아크릴판의 앞면과 뒷면에 붙여 넣었습니다 (빨간색 화살표로 표시됨). (D) 부드러운 조명 램프의 전반적인 외관. (E) 소프트 라이트 램프는 프레임이없는 상업용 LED 페인팅 라이트 패드로 대체 될 수 있으며, 이는 일반적으로 스케치를 복사 할 때 추적에 사용됩니다. 흰색 필름 층을 LED 페인팅 라이트 패드 바로 위에 붙여 넣어야합니다. (F) 직장에서 부드러운 조명 램프. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: EB 형성 매질의 조성. EB 형성의 초기 단계 (일반적으로 처음 2 일)에서 Y-27632 (50 μM) 및 bFGF (4 ng / mL)를 EB 형성 배지에 첨가해야합니다. 배지는 0.2 μm 필터 유닛으로 여과하고 -20°C에 보관해야 합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 신경 유도 배지의 조성. 배지는 0.2 μm 필터 유닛으로 여과하고 -20°C에 보관해야 합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 3: 팽창 배지의 조성. 1:100으로 희석된 2-메르캅토에탄올을 DMEM-F12에서 제조하고, 이 중 87.5 μL를 팽창 배지에 첨가하였다. B27에는 비타민 A가 포함되어서는 안 됩니다. 배지는 0.2 μm 필터 유닛으로 여과하고 -20°C에 보관해야 합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 4: 성숙 배지의 조성. DMEM-F12 중의 2-메르캅토에탄올을 1:100 희석하여 제조하고, 이 중 87.5 μL를 성숙 배지에 첨가하였다. B27에는 비타민 A가 포함되어서는 안 됩니다. 배지는 0.2 μm 필터 유닛으로 여과하고 -20°C에 보관해야 합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
대뇌 오가노이드는 의학 연구를위한 새로운 길을 열어줍니다. 이 기술의 많은 유용한 응용은 단지 탐구되기 시작했다28. 이 연구는 유전적으로 병든 대뇌 오가노이드와 정상 뇌 오가노이드의 전사체 시퀀싱 결과가 질병과 건강의 차이를 반영할 수 있음을 발견했다. 예를 들어, RNA-seq 데이터 분석 결과(도 3B)는 SCA3 질환 29,30,31,32에 대한 많은 보고된 연구와 일치한다. 중간 변화, EB 전달 및 포장과 같은 실험 작업은 대뇌 오가노이드를 배양하고 균일 성이 좋은 오가노이드를 준비 할 수 있는지 여부를 결정하는 데 중요합니다33,34. 이 연구에서는 배지 변화와 오가노이드 전달을 촉진하는 뇌 오가노이드 프로토콜이 도입되었습니다. 측면 부드러운 조명 램프는 오가노이드 문화의 작동을 크게 도울 수 있습니다. 그러나, 만드는 것은 어렵지 않다, LED 페인팅 라이트 패드와 간단한 가공은 또한 그것을 대체 할 수있다. 간단한 액체 교환 방법과 오가노이드 전달 조작은 전체 배양 과정을 더 쉽게 만듭니다. 대뇌 오가노이드의 적용은 종종 빈약한 균일성의 문제에 의해 영향을 받는다35. 이 연구와 다른 대뇌 오가노이드 배양 지침의 가장 큰 차이점은 실험을보다 반복 가능하게 만들기 위해 수술을 최적화하는 데 중점을두고 있다는 것입니다.
배양 시스템의 안정성을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 조건이 허용하는 경우, 상업적 대뇌 오가노이드 배지의 우선 순위를 정하는 것이 제안되며, 이는 배지의 불안정성으로 인해 다른 배치에서 실험 결과의 큰 차이를 효과적으로 줄일 수 있습니다. 또한, 4°C에서 대뇌 오가노이드 배지 저장은 2주 이상 지속되어서는 안 된다; 그렇지 않으면, 그것은 배양 시스템의 안정성에 영향을 미칠 것이다. 물론, 사용되는 iPSC가 차별화되기보다는 다능성인지 확인하는 것도 중요합니다. OCT4 면역형광 검출이 사용될 수 있다. OCT4 양성 세포가 90 % 미만이면 고품질의 iPSC로 대체하고 대뇌 오가노이드를 다시 배양하는 것이 좋습니다.
이 연구에서 도입 된 대뇌 오가노이드 배양 기술에는 몇 가지 한계가 있습니다. 예를 들어, 대뇌 오가노이드는 발달 후반 단계에서 집중적으로 배양 될 수 없으며, 이는 문화 공간의 낭비입니다. 이것은 또한 대뇌 오가노이드를 적용 할 때 해결해야 할 긴급한 문제입니다. 많은 대뇌 오가노이드가 중공 확장을 나타내면 각 웰의 오가노이드 수가 줄어들고 중간 교환 빈도가 증가하며 오가노이드는 충분한 영양소를 가진 비 저산소 상태에 있습니다.
이 연구는 기존의 많은 대뇌 오가노이드 배양 방법12,36,37 및 심지어 다른 유형의 장기 배양 방법 38,39에 대한 운영 보완책입니다. 이것은 미래에 자동화 된 오가노이드 배양 시스템을 개발하고 오가노이드의 연구 및 적용을 촉진하는 데 도움이 될 것입니다. 오가노이드의 광 확산 반사 효과를 향상시키는 기술이 자동 지능형 재배 시스템에 사용되면 이론적으로 고정밀 이미지 증폭 카메라를 대체 할 수 있으며 일반 이미지 인식 장치 만 설치하면됩니다. 또한, 흡입 헤드에서의 회전 및 자연 침강에 의해 생성된 이차 유동을 통한 배지 교환 및 오가노이드 전달은 이론적으로 미래의 자동 배양 장비에서 원심분리보다 더 실현 가능하다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 광동성 자연 과학 재단 (보조금 번호 2020A0505100062), 광저우시 과학 기술 핵심 주제 프로젝트 (보조금 번호 201904020025), 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 31872800, 32070582, 82101937), 광저우시 박사후 연구 보조금 프로젝트 (Bangzhu Chen)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
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