Summary
Questa pubblicazione mostra l'applicazione della diffrazione a raggi X e della calorimetria differenziale a scansione come gold standard per lo studio dello stato solido degli eccipienti a base lipidica (LBE). Comprendere l'alterazione allo stato solido negli LBE e il suo effetto sulle prestazioni dei prodotti farmaceutici è il fattore chiave per la produzione di forme di dosaggio robuste a base lipidica.
Abstract
Gli eccipienti a base lipidica (LBE) sono a bassa tossicità, biocompatibili e a base naturale e la loro applicazione supporta la sostenibilità della produzione farmaceutica. Tuttavia, la sfida principale è il loro stato solido instabile, che influisce sulla stabilità del prodotto farmaceutico. Le proprietà fisiche critiche dei lipidi per la loro lavorazione - come la temperatura e la viscosità della fusione, la reologia, ecc. - sono legate alla loro struttura molecolare e alla loro cristallinità. Gli additivi, così come le sollecitazioni termiche e meccaniche coinvolte nel processo di fabbricazione, influenzano lo stato solido dei lipidi e quindi le prestazioni dei loro prodotti farmaceutici. Pertanto, comprendere l'alterazione nello stato solido è cruciale. In questo lavoro, la combinazione di diffrazione a raggi X in polvere e calorimetria differenziale a scansione (DSC) viene introdotta come gold standard per la caratterizzazione dello stato solido dei lipidi. La diffrazione a raggi X è il metodo più efficiente per schermare il polimorfismo e la crescita dei cristalli. La disposizione polimorfica e la lunghezza della lamella sono caratterizzate rispettivamente nelle regioni grandangolari e piccole della diffrazione dei raggi X. La regione di diffusione dei raggi X ad angolo piccolo (SAXS) può essere ulteriormente utilizzata per studiare la crescita dei cristalli. La transizione di fase e la separazione possono essere indicate. Il DSC viene utilizzato per esaminare il comportamento termico dei lipidi, stimare la miscibilità degli additivi e/o dei principi attivi farmaceutici (API) nella matrice lipidica e fornire diagrammi di fase. Vengono presentati quattro casi di studio in cui gli LBE sono utilizzati come materiale di rivestimento o come matrice di incapsulamento per fornire rispettivamente sistemi multiparticolati rivestiti di lipidi e nanosospensioni lipidiche. Lo stato solido lipidico e la sua potenziale alterazione durante lo stoccaggio sono studiati e correlati all'alterazione nel rilascio di API. I metodi microscopici qualitativi come la microscopia a luce polarizzata e la microscopia elettronica a scansione sono strumenti complementari per studiare la cristallizzazione a microlivello. Ulteriori metodi analitici dovrebbero essere aggiunti in base al processo di produzione selezionato. La relazione struttura-funzione-processabilità dovrebbe essere compresa attentamente per progettare prodotti farmaceutici a base lipidica robusti e stabili.
Introduction
I lipidi sono una classe di materiali che contengono idrocarburi alifatici a catena lunga e loro derivati. Coprono una vasta gamma di strutture chimiche, tra cui acidi grassi, acilgliceroli, steroli ed esteri sterolici, cere, fosfolipidi e sfingolipidi1. L'uso dei lipidi come eccipienti farmaceutici è iniziato nel 1960 per incorporare farmaci in una matrice di cera per fornire formulazioni a rilascio prolungato2. Da allora, gli eccipienti a base lipidica (LBE) hanno guadagnato ampia attenzione per diverse applicazioni, come il rilascio modificato del farmaco, il mascheramento del gusto, l'incapsulamento dei farmaci e una maggiore biodisponibilità dei farmaci. Gli LBE possono essere applicati in una vasta gamma di forme farmaceutiche attraverso processi di produzione versatili, vale a dire, rivestimento hot-melt, spray-drying, estrusione di lipidi solidi, stampa 3D, compresse e omogeneizzazione ad alta pressione, tra gli altri. Forme di dosaggio come compresse, film disintegranti per via orale, sistemi multiparticolati, nano e microparticelle, pellet e forme stampate in 3D sono il risultato 2,3,4.
Gli LBE possiedono lo stato "General Recognized as Safe", bassa tossicità, buona biocompatibilità e una migliore tolleranza del paziente. La loro origine naturale e l'ampia disponibilità consentono loro di potenziare la produzione farmaceutica verde e sostenibile. Tuttavia, l'uso di LBE è stato associato a forme di dosaggio instabili. Le alterazioni delle proprietà dei prodotti a base lipidica dopo lo stoccaggio sono state ampiamente segnalate. Lo stato solido delle LBE e l'esistenza di polimorfismo lipidico sono considerati le ragioni principali dell'instabilità delle forme di dosaggio a base lipidica 5,6,7,8.
Le proprietà meccaniche e fisiche dei lipidi sono strettamente correlate alle loro proprietà di cristallizzazione e alla struttura della loro rete cristallina, che mostra distinte gerarchie di organizzazione strutturale. Quando i lipidi vengono utilizzati nella produzione di prodotti farmaceutici, la struttura cristallina è influenzata dai parametri di processo applicati, come temperatura, solventi organici, taglio e forze meccaniche, che a loro volta influenzano le prestazioni del prodotto farmaceutico 5,7,9,10,11,12 . Per comprendere questa relazione struttura-funzione, è importante conoscere i fondamenti della cristallizzazione lipidica e della struttura cristallina e i metodi analitici per esaminarli.
A livello molecolare, la più piccola unità di un cristallo lipidico è definita "cellula unitaria". Una regolare ripetizione tridimensionale di cellule unitarie costruisce i reticoli cristallini, con interazioni molecolari più forti lungo le loro direzioni laterali rispetto a quelle longitudinali, spiegando la costruzione stratificata dei cristalli lipidici. L'impacchettamento ripetuto della sezione trasversale delle catene idrocarburiche è noto come sottocella 1,12,13 (Figura 1). Le lamelle sono l'impacchettamento laterale delle molecole lipidiche. Nel pacchetto cristallino, le interfacce tra le diverse lamelle sono costituite da gruppi terminali metilici, mentre i gruppi glicerolo polare sono posizionati nelle parti interne della lamella14. Per differenziare ogni catena di acidi grassi nella lamella, viene impiegato il termine foglietto, che rappresenta un sottostrato composto da singole catene di acidi grassi. Gli acilgliceroli possono essere disposti in doppie (2L) o triple (3L) lunghezze di catena di foglietti14. L'energia superficiale delle lamelle le spinge a impilarsi epitassialmente l'una con l'altra, per fornire nanocristalliti. Diversi fattori di lavorazione come la temperatura e la velocità di raffreddamento influenzano il numero di lamelle impilate e, quindi, lo spessore della cristallite (~ 10-100 nm). L'aggregazione dei cristalliti porta alla formazione di sferuliti su micro-scala, e l'aggregazione delle sferuliti fornisce alla rete cristallina di LBE un comportamento macroscopico definito13.
Le transizioni allo stato solido iniziano a livello molecolare. La transizione geometrica da una sottocella all'altra è chiamata polimorfismo. Tre polimorfi principali della forma α, β' e β si trovano solitamente negli acilgliceroli, ordinati in base alla maggiore stabilità. L'inclinazione della lamella rispetto ai gruppi terminali avviene durante le transizioni polimorfiche 1,13. Le transizioni polimorfiche mediate da stoccaggio e fusione sono sperimentate dagli LBE. Le transizioni di immagazzinamento si verificano quando la forma metastabile è immagazzinata al di sotto della sua temperatura di fusione, mentre le transizioni mediate dalla fusione si verificano quando la temperatura sale al di sopra del punto di fusione di una forma metastabile provocando fusione e successiva cristallizzazione della forma più stabile.
Inoltre, possono verificarsi anche la separazione di fase e la crescita dei cristalli. La separazione di fase è guidata dalla cristallizzazione multifasica iniziale e dalla crescita di una fase o più. Le interazioni particella-particella, tra cui la sinterizzazione, le interazioni molecolari, le caratteristiche microstrutturali e i componenti estranei, possono anche innescare la crescita dei cristalli 1,5.
Il monitoraggio delle transizioni allo stato solido degli LBE e del loro impatto sulle prestazioni delle forme di dosaggio è di notevole importanza. Tra gli altri, la calorimetria differenziale a scansione (DSC) e la diffrazione dei raggi X, in particolare lo scattering simultaneo di raggi X a piccolo e grandangolo (SWAXS), sono due standard di riferimento per la valutazione dello stato solido lipidico.
Il DSC è comunemente usato per misurare le variazioni entalpiche del materiale di interesse associate al flusso di calore in funzione del tempo e della temperatura. Il metodo è ampiamente utilizzato per lo screening del comportamento termico dei lipidi, come le possibili vie di fusione e cristallizzazione, la corrispondente temperatura ed entalpia di diverse forme polimorfiche, nonché frazioni minori e principali di composizioni lipidiche. Questi dati possono essere utilizzati per rappresentare l'eterogeneità, le fasi multiple e il polimorfismo lipidico 5,7,13.
Le tecniche di diffrazione dei raggi X sono i metodi più potenti per la determinazione della struttura allo stato solido. Possedendo una nanostruttura ordinata con lamelle ripetute, la riflessione del fascio di raggi X dai cristalli lipidici può essere studiata usando la legge di Bragg:
d = λ/2sinθ (equazione 1)
dove λ è la lunghezza d'onda dei raggi X di 1,542 Å, θ è l'angolo di diffrazione del fascio diffuso e d è la spaziatura interplanare degli strati ripetuti, definita come lunghezza della lamella nei lipidi. La regione a piccolo angolo della radiografia può essere perfettamente utilizzata per rilevare il modello di spaziatura lunga e calcolare la lunghezza della lamella (d). Maggiore è la distanza ripetuta d, minore è l'angolo di scattering (1-15°, regione ad angolo piccolo) poiché d è inversamente proporzionale al peccato θ. La disposizione subcellulare dei lipidi può essere caratterizzata come il modello di spaziatura corta nella regione grandangolare della diffrazione dei raggi X. Entrambi i modelli di spaziatura lunga e corta dei lipidi (lunghezza della lamella e disposizione delle sottocellule) possono essere utilizzati per indicare la trasformazione polimorfica monotropica. Ad esempio, la forma a α (esagonale) può essere modificata in β (triclino) a causa di un cambiamento nell'angolo di inclinazione delle catene, con alterazioni nella lunghezza della lamella (schema di spaziatura lunga, nella regione ad angolo piccolo, 1-15°) e nella modalità di impacchettamento della sezione trasversale (modello di spaziatura corta, nella regione grandangolare, 16-25°) (Figura 2).
Le informazioni ottenute dalla regione SAXS possono essere ulteriormente utilizzate per studiare la crescita dei cristalli misurando il suo spessore (D) tramite l'equazione di Scherrer15:
D = Kλ/FWHMcosθ (equazione 2)
Dove, FWHM è la larghezza in radianti del massimo di diffrazione misurata a metà strada tra lo sfondo e il picco, generalmente noto come larghezza intera a metà massimo (FWHM); θ è l'angolo di diffrazione; λ è la lunghezza d'onda dei raggi X (1,542 Å) e K (costante di Scherrer) è un numero adimensionale che fornisce informazioni sulla forma del cristallo (in caso di assenza di informazioni dettagliate sulla forma K = 0,9 è una buona approssimazione). Si noti che l'equazione di Scherrer può essere utilizzata per stimare le dimensioni medie dei cristalli fino a circa 100 nm poiché l'allargamento del picco è inversamente proporzionale alla dimensione del cristallite. Pertanto, la sua applicazione è utile per determinare lo spessore delle nanopiastrine e, indirettamente, il numero di lamelle aggregate. Esempi di utilizzo di questo approccio ben noto per lo screening delle proprietà cristalline dei lipidi nello sviluppo della formulazione farmaceutica e la corrispondente instabilità nelle prestazioni del prodotto possono essere trovati in 5,12,16,17,18.
Il monitoraggio dello stato solido degli LBE all'interno di ogni fase di sviluppo attraverso tecniche analitiche consolidate fornisce una strategia efficace per la progettazione di processi di produzione ad alte prestazioni e prodotti farmaceutici stabili a base lipidica.
Questa pubblicazione presenta l'applicazione critica di un'analisi completa dello stato solido degli LBE per il monitoraggio dei cambiamenti nello stato solido e la sua correlazione con l'alterazione del profilo di rilascio del principio attivo farmaceutico (API) dalla forma di dosaggio farmaceutica. I sistemi multiparticolati basati su cristalli API rivestiti di lipidi tramite rivestimento hot-melt e le sospensioni nanolipidiche prodotte tramite omogeneizzazione ad alta pressione sono presi come casi di studio. Il focus di questa pubblicazione è l'applicazione della diffrazione dei raggi X delle polveri e della DSC come strumenti analitici. I primi due esempi mostrano l'effetto della trasformazione polimorfica e della crescita dei cristalli, rispettivamente, sull'alterazione del rilascio di API da campioni rivestiti. L'ultimo esempio rivela la correlazione tra lo stato solido stabile dei lipidi e le prestazioni stabili del prodotto farmaceutico nei sistemi multiparticolati rivestiti di lipidi e nelle sospensioni nanolipidiche.
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Protocol
1. Calorimetria differenziale a scansione (DSC)
- Preparazione dello strumento
- Utilizzare un calorimetro differenziale a scansione dotato di un intracooler, un autocampionatore e il software per il controllo dello strumento e l'analisi dei dati.
- Accendere l'alimentazione del gas azoto e impostare la pressione tra 0,2 e 0,5 bar e accendere lo strumento DSC e lo scambiatore automatico di campioni.
- Aprire il software e attivare la modalità standby facendo clic sul pulsante Sì . Consentire l'equilibrio del dispositivo per almeno un'ora
- Spurgare il forno con azoto, fare clic sull'icona Nuovo metodo e andare su Definizione metodo. Attivare l'opzione Modulazione temperatura nella finestra panoramica. Vai alla scheda dell'intestazione e seleziona il metodo facendo clic su "campione".
- Andare alla scheda Programma di temperatura, selezionare Spurgo 2 MFC e su MFC protettivo, entrambi a 50 mL/min.
- Inserire il seguente metodo di misurazione: standby a 20 °C, ciclo di riscaldamento a 5 K/min da 20 °C a oltre la temperatura di fusione dei lipidi, mantenimento isotermico a questa temperatura per 5 minuti, ciclo di raffreddamento a 0 °C a 5 K/min a -20 °C, temperatura finale di ripristino di emergenza a una temperatura superiore di 10 gradi °C alla temperatura più alta del programma, e temperatura finale in standby a 20 °C.
- Vai alla scheda di calibrazione e seleziona il file di temperatura e sensibilità appropriato. Salvare il metodo
- Preparazione e misurazione dei campioni
- Pesare 3-4 mg di ciascun campione in crogioli di alluminio. Registrare il peso esatto caricato in ciascun crogiolo e sigillare il crogiolo di alluminio con un coperchio forato.
- Posizionare i crogioli nel vassoio dell'autocampionatore e attivare la modalità autocampionatore nel software e caricare il metodo correlato per ciascun campione.
- Compilare la posizione del campione, il nome e il peso di ciascun campione e la posizione del crogiolo di riferimento nella finestra Vista vassoio campioni e avviare le misurazioni.
- Analisi dei dati
- Aprire i dati grezzi utilizzando il software per l'analisi dei dati e tracciare la temperatura rispetto al flusso di calore, facendo clic sul pulsante "X-time / X-temperature"
- Nella finestra visualizzata, fai clic su "Nascondi segmenti isotermici". Sul lato sinistro dello schermo, selezionare solo le curve che devono essere analizzate (ad es. deselezionare i dati "Aggiuntivi").
- Verificare il comportamento termico dei lipidi come eventi endotermici ed esotermici di energia assorbita o rilasciata sotto forma di calore, rispettivamente, in funzione della temperatura.
- Clicca sulla curva, seguita da Valutazione e Area, per calcolare l'entalpia di fusione come l'area sotto la curva degli endotermi.
- Selezionare i limiti di integrazione spostando le linee verticali di circa 2-3 gradi Celsius prima e dopo l'inizio e il punto finale del picco.
- Selezionare una linea di base lineare per l'integrazione dei picchi. L'area tra la curva e la linea di base è proporzionale alla variazione di entalpia. Clicca su Applica per completare il calcolo. Allo stesso modo, calcolare l'entalpia di cristallizzazione come l'area sotto la curva degli esotermi
- Determinare l'inizio della temperatura di fusione (A) cliccando sulla curva da analizzare e poi su Valutazione e Inizio.
- Selezionare i limiti di quantificazione spostando le linee verticali nella sezione più diritta della curva. Questo di solito è intorno ai 5-10 ° C prima e dopo il picco. Quindi, determinare la temperatura di fusione facendo clic sulla curva da analizzare, seguita da Valutazione e Picco. Il valore ottenuto è il picco massimo.
2. Diffusione dei raggi X di piccole e grandi dimensioni (SWAXS)
- Preparazione dello strumento
- Utilizzare un sistema di diffusione a raggi X, componendo una telecamera a fuoco puntuale fissata a un generatore di raggi X a tubo sigillato e dotata di un'unità di controllo e del relativo software.
- Utilizzare cooper (λ = 1,54 Å) a 50 kV e 1 mA come sorgente di raggi X e due rivelatori sensibili posizionati linearmente per coprire regioni di diffusione dei raggi X sia piccole che grandangolari.
- Garantire i requisiti di sicurezza per la protezione dall'esposizione ai raggi X.
- Accendere il sistema dell'acqua di raffreddamento sull'unità di controllo, la pompa del vuoto, le valvole del gas e il sistema di controllo dell'alimentazione e della sicurezza.
- Accendere il controllo della tensione e le valvole di spurgo per i rivelatori con un flusso di gas compreso tra 10 e 20 ml/min.
- Accendere il tubo radiogeno e l'opzione standby e attendere circa 10 minuti. Spegnere la modalità standby e accendere il tubo radiogeno alla massima potenza (>50 kV) e attendere almeno 30 minuti.
- Avviare il software di controllo e cliccare su RESET TPF. Scegliere il filtro Tugsten e impostare la posizione. Vai a Posizione per correggere la posizione del filtro Tungsten
- Preparazione e misurazione dei campioni
- Assicurarsi che i campioni siano disponibili come polvere fine. Se necessario, macinare delicatamente i campioni a basse temperature per ottenere una polvere fine.
- Riempire i campioni in speciali capillari di vetro con un diametro esterno di circa 2 mm, evitando qualsiasi intrappolamento d'aria nei capillari. Sigillare il capillare di vetro con cera e posizionarlo con cura nel supporto capillare.
- Accendere il motore per la rotazione del campione e chiudere la valvola del vuoto fino a quando la pressione è inferiore a 5 mbar.
- Nel software, correggere l'impostazione delle misure selezionando una risoluzione di posizione di 1024. Fissare il tempo di esposizione a 1200 s.
- Imposta i limiti energetici facendo clic sul rubinetto Strumenti, quindi fai clic su energia e risoluzione e fai clic su Riavvia. Impostare i limiti di energia in un intervallo adeguato tra 400-900.
- Aprire la serranda di sicurezza e avviare le misurazioni. Assicurarsi che la finestra di misurazione mostri un massimo di 80 conteggi al secondo. Se questo non viene fornito, adattare la posizione del filtro.
- Analisi dei dati
- Esportare i dati come file p00. I dati sono costituiti dall'intensità di trasmissione e assorbimento rispetto al numero di canale e all'angolo di diffrazione.
- Trasferire i dati per la valutazione a un software statistico e correggere i dati normalizzando le intensità utilizzando la massa di dispersione misurata con il filtro Tungsteno.
- Create un grafico di intensità normalizzata rispetto a due volte l'angolo di diffrazione [(2Θ) 2xtheta].
- Utilizzare la funzione di "screen reader" per trovare picchi di diffrazione nelle regioni SAXS e WAXS.
- Applicare l'equazione di Bragg per calcolare i picchi di diffrazione con la massima intensità in spaziatura d breve e lunga rispettivamente per le regioni WAXS e SAXS.
- Calcola i rapporti della posizione di picco della regione SAXS per scoprire la simmetria cristallina dei lipidi (ad esempio, lamellare, esagonale, cubico).
- Utilizzare il picco di diffrazione principale della regione SAXS per quantificare lo spessore della cristallite (D). Inserire il picco in una funzione gaussiana tramite i minimi quadrati classici e ottenere il FWHM facendo clic su Analisi, Picchi e linee di base, Analizzatore di picchi, finestra di dialogo Apri.
- Nella finestra visualizzata, seleziona l'opzione "Fit Peaks Pro". Selezionare una linea di base costante con y = 0, selezionare il picco di diffrazione principale della regione SAXS e fare clic su "Fit control" per selezionare i parametri di peak fit.
- Scegliere la funzione GaussAmp. Impostare i parametri y_0, xc_1 e A_1 come fissi e ottenere il FWHM dall'adattamento. Utilizzare l'equazione di Scherrer per calcolare lo spessore della cristallite.
3. Test di dissoluzione
- Rilascio API da sistemi multiparticolato rivestiti
- Utilizzare l'apparecchio USP 2 (paddle) per gli studi di dissoluzione.
- Riempire i recipienti di prova di dissoluzione con tampone fosfato pH 6,8 e portare a 37 °C.
- Pesare triplicazioni di campioni di particelle rivestite equivalenti a una singola dose di API e collocare i campioni in recipienti di prova di dissoluzione.
- Avviare la pagaia ad una velocità di 100 giri / min.
- Impostare l'autocampionatore per prelevare campioni di 1 mL nei seguenti punti di campionamento: 30 min, 60 min, 90 min, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 18 h e 24 h.
- Analizzare i campioni tramite un metodo HPLC adatto 5,7,17.
- Analizzare i dati tracciando il rilascio cumulativo dell'API rispetto al tempo.
- Effettuare gli esperimenti per campioni conservati a lungo termine (25 °C, 60% di umidità relativa) e accelerati (40 °C e 70% di umidità relativa).
- Rilascio di API da nanoparticelle lipidiche solide (SLN)
- Preparare il fluido polmonare simulato (SLF) miscelando lo 0,02% (p/p) di dipalmitoilfosfatidilcolina nella soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (D-PBS), con la seguente composizione: KCl (2,683 mM), KH 2PO 4 (1,47 mM), NaCl (136,893 mM), Na2HPO4· 2H2 O (8,058 mM), CaCl2· 2H2 O (0,884 mM) e MgCl2· 6H2O (0,492 mM). Preriscaldarlo a 37 °C.
- Utilizzare cassette di dialisi con una sacca di membrana di cellulosa di un cut-off controllato di 7.000 Da in triplice copia per ogni campione.
- Assegnare una cassetta di dialisi per ogni tempo di campionamento: 0,5 h, 1,5 h, 3 h, 5 h, 7 h e 24 h. Idratare le cassette di dialisi per 2 minuti immergendole in SLF. Quindi, asciugare accuratamente la superficie con morbidi asciugamani di carta.
- Iniettare 3 mL del campione (lipid-nanosospensione), equivalenti a 600 μg di desametasone, in ciascuna cassetta.
- Immergere ogni cassetta in 200 mL di SLF a 37 °C (condizioni di lavello) e agitare il sistema a 125 giri/min.
- Prelevare campioni da 200 mg dall'interno della cassetta utilizzando una siringa ad ogni tempo di campionamento determinato.
- Determinare il contenuto dell'API utilizzando il metodo HPLC-MS sviluppato18.
- Calcolare l'API rilasciata da SLN per bilancio di massa, secondo18, brevemente come differenza tra la quantità totale di API in SLN e la quantità rimanente di API dopo il campionamento.
- Ripetere il processo per i campioni memorizzati.
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Representative Results
Correlazione tra transizione polimorfica dei lipidi e rilascio di API in cristalli di API rivestiti di lipidi:
I cristalli di API rivestiti con glicerolo monostearato vengono misurati tramite DSC e raggi X direttamente dopo il rivestimento e dopo 3 mesi di conservazione in condizioni accelerate (40 °C, 75% di umidità relativa)7. Il gliceril monostearato è un sistema multifasico contenente il 40% -55% di monogliceridi, il 30% -45% di digliceridi e il 5% -15% di gliceridi, principalmente tristearina19. Le forme polimorfiche di sub-α, α, β-primi e β sono riportate per la monostearina20. Tristearin e 1, 2-distearina mostrano α, β-primi e β forme polimorfiche14.
I dati DSC dei campioni T0 e dei campioni conservati in condizioni accelerate sono mostrati nella Figura 3A. Il ciclo di riscaldamento sul campione T0 ha mostrato un ampio evento endotermico fino a 10 °C, che può essere correlato alla transizione reversibile sub-α / α descritta per 1-monostearina e 1-monopalmitina21. Due eventi endotermici a To = 54,0 °C e 46,7 sono correlati alla forma β e ad una fase coesistente di punto di fusione inferiore. Una fase coesistente può essere vista nei dati radiografici come la breve spaziatura d di 4,16 Å corrispondente alla forma polimorfa α, organizzata in una fase lamellare di 57,3 Å e corrispondente a diversi componenti della miscela. La disposizione lamellare del rivestimento lipidico del campione T0 è data a causa del picco armonico disponibile a 18,7 Å corrispondente alla riflessione del terzo ordine nel diffrattogramma SAXS7 (Figura 3B).
I dati DSC dei campioni dopo 3 mesi di conservazione in condizioni accelerate mostrano un endoterma a To = 55,7 °C, con due eventi sovrapposti a Tm = 60,2 °C per la restante forma α e a Tm = 63,8 °C come evento principale per la fusione della β-forma. La transizione polimorfica è confermata con i dati dei raggi X rilevando brevi distanze d di 4,66 Å, 4,58 Å, 4,37 Å, 3,92 Å e 3,83 Å, tipiche della forma β, combinate con la riduzione dello spessore della lamella da 57,3 Å a 50,4 Å, a causa dell'inclinazione molecolare7.
Il confronto del profilo di rilascio dell'API dal rivestimento a T0 e dopo 3 mesi di stoccaggio in condizioni accelerate (Figura 3C) mostra una significativa alterazione nei profili di rilascio, che può essere spiegata dall'evidente trasformazione polimorfica della forma α in forma β con una disposizione sub-cella più densa, risultando in una superficie idrorepellente 7,21.
Correlazione tra crescita cristallina del rivestimento lipidico, potenziale separazione di fase e alterazione del rilascio nei cristalli API rivestiti di lipidi: i cristalli API sono rivestiti con una miscela di tripalmitina e polisorbato 65 in rapporto 90:10 %p/p. La tripalmitina è un trigliceride con una purezza del 99%5. I trigliceridi mostrano comunemente le forme polimorfiche α, β-prime e β, ordinate dalla maggiore densità del pacchetto cristallino e dalla maggiore stabilità.
Il polisorbato 65 è un emulsionante con un valore di equilibrio idrofilo-lipofilo (HLB) di 10,5 e una temperatura di fusione di 32 °C. I trigliceridi sono comunemente cristallizzati nel loro α-polimorfo dalla fusione. Alcuni additivi inducono la trasformazione di α in β di TAG, tra cui il polisorbato 65. Inoltre, il polisorbato 65 agisce come un'impurità nel sistema, causando una cristallizzazione eterogenea della tripalmitina a forze motrici inferiori e innescando la crescita dei cristalli.
I dati DSC e a raggi X dei campioni T0 e dei campioni conservati in condizioni accelerate sono mostrati nella Figura 4A,B. Il ciclo di riscaldamento delle misure DSC sul campione T0 mostra un forte evento endotermico con un picco a 64,8 °C, corrispondente alla forma β polimofica della tripalmitina5. Questo è rilevabile anche nella regione WAXS, che mostra la spaziatura corta a 4,6 Å, caratteristica della sottocella della forma β (Figura 4A,B). I dati mostrano, chiaramente, la β polimorfica indotta della tripalmitina in presenza di polisorbato 65 nei campioni T0 e, naturalmente, nei campioni conservati. Lo spessore lamellare corrispondente è calcolato usando l'equazione di Bragg come d = 2π/q001 = 42 Å5.
Lo spessore del cristallo (D) dei campioni T0 e dei campioni conservati può essere misurato utilizzando l'equazione di Scherrer descritta sopra. I calcoli mostrano uno spessore del cristallo di 24 nm nei campioni T0 e uno spessore aumentato di 37 nm nei campioni conservati, corrispondenti rispettivamente a 5,7 e 8,8 lamelle.
Il confronto del profilo di rilascio dell'API dal rivestimento a T0 e dopo 3 mesi di stoccaggio in condizioni accelerate mostra nuovamente un'alterazione significativa nei profili di rilascio dopo lo stoccaggio (Figura 4C).
A causa del fatto che la miscela di tripalmitina e polisorbato 65 è un sistema bifasico, la crescita cristallitica della tripalmitina è innescata dall'esistenza della fase polisorbato, specialmente nella condizione accelerata (40 ° C, 75% di umidità relativa) dove il polisorbato 65 è nella sua forma liquida fusa. La transizione di fase e la crescita della fase di polisorbato in condizioni accelerate sono molto probabilmente dovute al movimento del materiale liquido dovuto alle forze di capillarità e gravità 5,22. La conseguenza è l'alterazione del rilascio di API dal rivestimento5.
Correlazione tra stato solido stabile dei lipidi e prestazioni stabili dei prodotti farmaceutici a base lipidica: vengono valutati due diversi prodotti farmaceutici a base lipidica: (a) una forma di dosaggio solida composta da cristalli di API rivestiti con eccipienti a base lipidica17 e (b) una forma di dosaggio liquida composta da nanoparticelle solido-lipidiche sospese caricate con un API18 . Gli LBE impiegati per entrambi i prodotti sono esteri poliglicerici degli acidi grassi (PGFA), un gruppo di molecole lipidiche costituite da idrossieteri oligomerici di glicerolo completamente o parzialmente esterificati con acidi grassi. I PGFA sono caratterizzati dalla cristallizzazione monofasica in forma α, dall'assenza di transizioni polimorfiche e dalla stabilità complessiva della loro struttura molecolare, nano e microstruttura23.
Nel primo prodotto, i cristalli di API sono stati rivestiti con PG3-C16/C18p, un PGFA composto da 3 unità di glicerolo parzialmente esterificate con acido palmitico e stearico. I dati DSC e a raggi X dei campioni T0 e 3 mesi conservati in condizioni accelerate sono mostrati nella Figura 5. L'analisi DSC (Figura 5A) mostra un singolo picco di fusione nel primo ciclo di riscaldamento corrispondente all'esistenza di una sola forma polimorfica di PG3-C16/C18p con To = 54,2 °C. Il ciclo di raffreddamento rivela la cristallizzazione monofasica del lipide attraverso l'esistenza di un unico picco con Tc = 45,4°C. I campioni conservati rivelano anche termogrammi invariati, che non presentano polimorfismo e nessuna separazione di fase. Lo stato solido stabile di PG3-C16/C18p è confermato dai pattern SWAXS (Figura 5B). La regione WAXS mostra un picco corrispondente a una breve spaziatura di d = 4,15 Å in T0 e campioni conservati17. Tale breve spaziatura d è associata alla forma α dei TAG 1,13. Il segnale WAXS inalterato dopo la memorizzazione conferma l'assenza di polimorfismo di PG3-C16/C18p. La regione SAXS rivela un picco principale ad una lunga spaziatura d di d = 63,7 Å, corrispondente a una struttura lamellare con configurazione 2L. La dimensione dei cristalliti (D) dei campioni T0 ottenuti tramite analisi Scherrer indica 23 nm, corrispondenti a quattro lamelle impilate. Dopo la conservazione non sono mostrate alterazioni dello spessore delle lamelle (63,5 Å) o della crescita dei cristalli (quattro lamelle). Un confronto tra il profilo di rilascio dei campioni T0 e dopo lo stoccaggio (Figura 5C) mostra l'eccezionale stabilità del prodotto sviluppato. Lo stato solido stabile della matrice lipidica fornita da PG3-C16/C18p determina prestazioni stabili del profilo di rilascio del prodotto17.
Per il secondo prodotto, sono state preparate nanoparticelle lipidiche solide caricate con API (SLN) sotto forma di nanosospensione acquosa utilizzando PG2-C18f come matrice lipidica e Polossamero 188 come emulsionante18. PG2-C18f è una molecola di PGFA composta da 2 unità di glicerolo completamente esterificate con acido stearico. Poloxamer 188 è un polimero a blocchi non ionici con un alto HLB di 29. La struttura chimica è composta da parti in poliossipropilene e poliossietilene. L'API è incapsulata nella matrice lipidica. All'interno di questo prodotto, lo stato solido del lipide può essere influenzato non solo dalle condizioni di lavorazione, ma anche dalle interazioni acqua-nanoparticelle e dalle interazioni emulsionante-lipidico. I dati DSC e a raggi X delle nanosospensioni a T0 e dopo 3 mesi di conservazione in condizioni accelerate sono mostrati nella Figura 6. L'analisi DSC mostra un evento endotermico a To = 55,3 °C seguito da un ampio endoterma esteso fino a 100 °C. Il primo evento attribuito alla fusione di SLN di PG2-C18f e dell'ampio endoterma è dovuto all'evaporazione dell'acqua. Poiché il Poloxamer 188 viene sciolto nella fase acquosa, nessun endoterma è raffigurato nel primo ciclo. Il comportamento termico stabile è rappresentato nell'analisi DSC dei campioni memorizzati, che non mostrano alterazioni. Sebbene il polimorfismo lipidico sia solitamente accelerato nei sistemi di dimensioni nanometriche, l'analisi SWAXS conferma il comportamento stabile della matrice lipidica. La breve spaziatura d misurata di 4,15 Å per PG2-C18f dopo la sua cristallizzazione nel SLN appena prodotto e dopo 6 mesi di conservazione dei campioni in condizioni accelerate (6 m / AC) indica la presenza della forma stabileα. Lo spessore della lamella di PG2-C18f all'interno di SLN a T0 (56,5 Å) e dopo lo stoccaggio (56,3 Å) non mostra alterazioni. La struttura lamellare del lipide è evidenziata da un segnale armonico a 18,7 Å. La dimensione dei cristalliti (D) di PG2-C18f mediante analisi Scherrer è risultata essere di 10,8 nm (due lamelle), che non mostra alcuna crescita cristallina dopo lo stoccaggio delle nanosospensioni (11,7 nm, due lamelle)18. L'uso di SLN nell'industria farmaceutica è stato ostacolato a causa di problemi di stabilità ben segnalati dopo lo stoccaggio, come agglomerazione e gelificazione di particelle, perdita di incapsulamento (espulsione API) e profilo di rilascio instabile. Invece, l'applicazione di una matrice lipidica stabile, PG2-C18f, come mostrato qui, si traduce nelle prestazioni del prodotto presentate nella Figura 7. Non sono rappresentati agglomerati di particelle, profili di rilascio stabili ed efficienza di incapsulamento stabile. L'instabilità generale della SLN è stata attribuita al polimorfismo lipidico e ad altre transizioni allo stato solido24. I lipidi polimorfici subiscono transizioni durante lo stoccaggio da forme cristalline meno dense (forma α) a forme più dense (β-prime e β). Questa transizione polimorfica può influenzare l'area superficiale delle nanoparticelle prodotte, specialmente se l'area superficiale non è sufficientemente stabilizzata dall'emulsionante. I conseguenti possono essere instabili come agglomerazione o gelificazione. Inoltre, l'alterazione della densità cristallina da α a β causa la perdita di spazio sufficiente per l'API all'interno della matrice lipidica, che porta all'espulsione dell'API, alterazioni nell'efficienza di incapsulamento e nel profilo di rilascio. Considerando le piccole dimensioni di SLN (in questo studio x50 = 234,3 nm), anche gli effetti della crescita dei cristalli sulle prestazioni del prodotto diventano critici. L'uso di una matrice lipidica allo stato solido stabile ha portato a prestazioni stabili del prodotto18.
Figura 1: Le configurazioni di tune fork e chair di una molecola TAG, della sottocellula, della lamella e della piastrina cristallina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Modelli di spaziatura corta (mano sinistra) e spaziatura lunga (mano destra) della tripalmitina nelle regioni grandangolari e ad angolo piccolo dei diffrattogrammi a raggi X, rispettivamente . (A) La forma alfa e (B) la forma beta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Cristalli di API rivestiti con glicerolo monostearato: analisi allo stato solido dei lipidi come materiale di rivestimento e profilo di rilascio di API di campioni appena preparati (T0) e dopo 3 mesi di conservazione in condizioni accelerate (AC). (A) DSC, (B) SWAXS e (C) profilo di rilascio. Questa cifra è stata modificata da7. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Cristalli di API rivestiti con tripalmitina e polisorbato 65 (90:10 %p/p): analisi allo stato solido del materiale di rivestimento e rilascio di API di campioni appena preparati (T0) e dopo 3 mesi di conservazione in condizioni accelerate (AC). (A) DSC, (B) SWAXS, (C) profilo di rilascio API. Questa cifra è stata modificata da5. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Cristalli API rivestiti con PG3-C16/C18p: Analisi allo stato solido di PG3-C16/C18p come materiale di rivestimento e profilo di rilascio API di campioni appena preparati (T0) e dopo 3 mesi di conservazione in condizioni accelerate (AC). (A) DSC, (B) SWAXS, (C) profilo di rilascio API. Questa cifra è stata modificata da17. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Analisi allo stato solido di campioni SLN appena preparati (T0), dopo 3 mesi di conservazione in condizioni accelerate (AC) ed eccipiente lipidico grezzo . (A) DSC e (B) SWAXS. Questa cifra è stata modificata da18. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Prestazioni del prodotto di SLN appena preparati (T0) e dopo 3 e 6 mesi di conservazione in condizioni accelerate (3m/AC, 6m/AC). (A) Distribuzione granulometrica, (B) profilo di rilascio, (C) efficienza di incapsulamento. Questa cifra è stata modificata da18. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La diffrazione dei raggi X in polvere e il DSC sono stati descritti in questo manoscritto come gold standard per l'analisi allo stato solido degli LBE. La diffrazione a raggi X in polvere ha l'eccezionale vantaggio di elaborare le misure in situ, con una minima manipolazione allo stato solido dei campioni durante le misurazioni. Inoltre, i capillari riempiti possono essere conservati in condizioni diverse dopo le misurazioni iniziali per studiare l'alterazione dello stato solido durante lo stoccaggio. In questo lavoro, ci siamo concentrati sulle regioni grandangolari e piccole dei raggi X, consentendoci di fornire dati strutturali di dimensioni fino a circa 100 nm.
Ultra SAXS (USAXS) può essere utilizzato per tracciare l'aggregazione delle nanopiastrine cristallite (CNP) e la crescita cristallina in dimensioni maggiori. Il metodo è stato applicato con successo in particolari sistemi per analizzare le dimensioni CNP nella regione di circa 100 a 1.000 nm 15,26,27. La caratterizzazione dei cristalli lipidici in sistemi liquidi richiede una risoluzione più elevata. La radiazione di sincrotrone e la fornitura di flussi di raggi X con intensità più elevata sono normalmente utilizzate per tale caratterizzazione28. La diffrazione dei raggi X di sincrotrone e lo scattering di neutroni a piccolo angolo (SANS) sono potenti strumenti per la caratterizzazione di cristalli liquidi e sistemi autoemulsionanti multistrato come i liposomi, che non rientrano nell'ambito di questo articolo25,28,29. I sistemi liquidi possono anche essere caratterizzati utilizzando la configurazione a raggi X descritta nel protocollo regolando il tempo di radiazione per un periodo più lungo.
I seguenti punti devono essere notati per l'implementazione della radiografia per lo screening dello stato solido dei lipidi e delle loro composizioni: (i) Generalmente, il tempo di radiazione deve essere selezionato individualmente, in base alla natura dei campioni e alle impostazioni delle apparecchiature. ii) L'intensità dei segnali è direttamente proporzionale alla concentrazione del materiale in una miscela. Pertanto, è importante schermare, in un primo momento, la miscela fisica di una composizione multifasica. Ciò eviterà l'errata interpretazione dei dati nelle dispersioni solide amorfe (ASD), se viene studiata la ricristallizzazione dell'API amorfo nella sua composizione elaborata con un LBE. Per rilevare piccole frazioni di cristalli in tali composizioni, è importante ingrandire le regioni in cui sono attesi i segnali. (iii) La macinazione dei campioni per fornire polvere fine per il riempimento dei capillari deve essere eseguita a bassa temperatura per evitare calore e stress esterni. Ciò può causare alterazioni allo stato solido del lipide nel campione. Il denso riempimento dei capillari è importante per evitare l'intrappolamento dell'aria tra le particelle e per garantire l'immacolata dispersione dei raggi X da parte delle particelle.
DSC è un potente strumento per lo screening del comportamento termico dei lipidi, stimando la miscibilità di additivi e / o API nella matrice lipidica e fornendo diagrammi di fase. L'evento termodinamico, inclusi gli esordi e i picchi di fusione e cristallizzazione, nonché l'entalpia di ciascun evento, fornisce informazioni utili sulle forme polimorfiche disponibili, sulle possibili transizioni polimorfiche e sulle diverse transizioni di fase. Tuttavia, contrariamente alla diffrazione a raggi X, il calore applicato nelle misurazioni DSC può manipolare il comportamento allo stato solido dei lipidi e causare una transizione polimorfica e di fase durante le misurazioni. Pertanto, si raccomanda vivamente di evitare il solo utilizzo di questa tecnica per l'analisi dello stato solido lipidico. Questo metodo deve essere utilizzato come tecnica complementare alla diffrazione dei raggi X. La diffrazione accoppiata di DSC e raggi X è stata ampiamente utilizzata nell'industria alimentare per l'analisi allo stato solido lipidico 30,31,32,33,34. La sua applicazione nell'industria farmaceutica è piuttosto limitata alla rilevazione di cambiamenti polimorfici nelle API35,36,37. L'altro svantaggio dell'uso esclusivo di DSC è la caratterizzazione dei sistemi lipidici multifasici, perché l'intensità degli eventi termici è dipendente dalla concentrazione. Inoltre, possono verificarsi eventi termici sovrapposti. Il DSC modulato in temperatura può essere utilizzato per la caratterizzazione di sistemi multifasici, che consente la separazione di eventi cinetici e transizioni sovrapposte38,39.
Per l'attuazione delle prove DSC descritte nel protocollo, vanno annotati i seguenti punti: (i) Sulla base degli esperimenti, è possibile applicare un secondo ciclo di riscaldamento, se necessario. (ii) A causa del comportamento costante della capacità termica specifica (Cp) dei lipidi durante l'analisi, viene appropriata la selezione di una linea di base lineare. (iii) Per ottenere l'inizio della fusione (To), devono essere definiti i limiti di calcolo. I limiti minimo e massimo dovrebbero includere il punto estremo della curva delle derivate e l'intervallo più lineare della linea di base. Il punto di intersezione tra la tangente flessiva e la linea di base è determinato come A.
Nel caso di termogrammi con picchi ben separati, si raccomanda di considerare l'entalpia di ciascun evento calcolando l'area sotto la curva. I dati sono utili per spiegare il grado di transizione polimorfica o di fase nel sistema, in combinazione con i dati di diffrazione dei raggi X.
Questo manoscritto tratta dei gold standard per l'analisi degli LBE e dei loro prodotti farmaceutici. Altri metodi analitici possono essere utilizzati come metodi complementari. Esempi sono metodi microscopici qualitativi come la microscopia a luce polarizzata e la microscopia elettronica a scansione, per studiare l'effetto dello stress di processo sulla velocità di cristallizzazione e, di conseguenza, sulla forma e morfologia dei cristalli. L'approccio allo sviluppo di prodotti farmaceutici a base lipidica dovrebbe essere basato sulla caratterizzazione degli LBE fisico-chimici, per definire i loro attributi critici rilevanti per i processi di produzione selezionati e per prevederne la processabilità. Anche le interazioni eccipiente-API devono essere attentamente esaminate per ogni singola API40. Ulteriori metodi analitici dovrebbero essere aggiunti in base al processo di produzione selezionato. La relazione struttura-funzione-processabilità dovrebbe essere compresa attentamente per progettare prodotti farmaceutici a base lipidica robusti e stabili.
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Disclosures
Gli autori rivelano tutti i conflitti di interesse.
Acknowledgments
Il Centro di Ricerca Ingegneria Farmaceutica (RCPE) è finanziato nell'ambito dei COMET - Competence Centers for Excellent Technologies di BMK, BMDW, Land Steiermark e SFG. Il programma COMET è gestito dalla FFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Cassettes with a cellulose membrane bag with a cut-off of 7000 Da, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer 7K | Fisher Scientific Inco, USA | ||
| Control software of x-ray system | HECUS dedicated house equipment | ||
| Control unit of x-ray system | HECUS dedicated house equipment | ||
| Differential scanning calorimeter (DSC) aluminum crucibles and lids | Netzsch, Germany | ||
| Differential scanning calorimeter DSC 204 F1 Phoenix (NETZSCH, Germany). | Netzsch, Germany | ||
| Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) | Sigma-Aldrich | 850355P | |
| Dissolution paddle apparatus II, Erweka DT 828 LH | Erweka GmbH, Langen, Germany | ||
| Dynasan 116 | IOI OLEO | Tripalmitin | |
| Geleol | Gattefosse | Glyceryl monosterarate | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Kolliphor P 188 | BASF Chem Trade | Poloxamer 188 | |
| MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Netzsch DSC 204F1 Software Version 8.0.1 | Netzsch, Germany | 6.239.2-64.51.00 | |
| Origin Pro (OriginLab, Northampton, MA) (statistical software | OriginLab, Northampton, MA | ||
| Proteous Analysis Software | Netzsch, Germany | ||
| Tween 65 | Polysorbate 65 | ||
| Witepsol PMF 1683 | IOI OLEO | Triglycerol ester of stearatic/palmitic acid (partially esterified) | |
| Witepsol PMF 282 | IOI OLEO | Diglycerol ester of stearic acid | |
| X-ray HECUS system composed of a point-focusing camera and two linearly positioned sensitive detectors | HECUS dedicated house equipment |
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