Summary
Esta publicação mostra a aplicação da difração de raios X e da calorimetria exploratória diferencial como padrão-ouro para investigar o estado sólido de excipientes à base de lipídios (LBEs). Compreender a alteração do estado sólido em LBEs e seu efeito sobre o desempenho de produtos farmacêuticos é o fator-chave para a fabricação de formas de dosagem robustas à base de lipídios.
Abstract
Os excipientes à base de lipídios (LBEs) são de baixa toxicidade, biocompatíveis e de base natural, e sua aplicação suporta a sustentabilidade da fabricação farmacêutica. No entanto, o grande desafio é o seu estado sólido instável, afetando a estabilidade do produto farmacêutico. As propriedades físicas críticas dos lipídios para seu processamento - como temperatura de fusão e viscosidade, reologia, etc. - estão relacionadas à sua estrutura molecular e sua cristalinidade. Os aditivos, bem como o estresse térmico e mecânico envolvido no processo de fabricação, afetam o estado sólido dos lipídios e, portanto, o desempenho dos produtos farmacêuticos dos mesmos. Portanto, compreender a alteração no estado sólido é crucial. Neste trabalho, a combinação de difração de raios X em pó e calorimetria exploratória diferencial (DSC) é introduzida como padrão-ouro para a caracterização do estado sólido dos lipídios. A difração de raios X é o método mais eficiente para rastrear o polimorfismo e o crescimento de cristais. O arranjo polimórfico e o comprimento da lamela são caracterizados nas regiões de grande e pequeno ângulo da difração de raios X, respectivamente. A região de espalhamento de raios X de pequeno ângulo (SAXS) pode ser usada para investigar o crescimento de cristais. A transição de fase e a separação podem ser indicadas. O DSC é usado para rastrear o comportamento térmico dos lipídios, estimar a miscibilidade de aditivos e/ou ingredientes farmacêuticos ativos (IFA) na matriz lipídica e fornecer diagramas de fase. Quatro estudos de caso são apresentados em que os LBEs são usados como material de revestimento ou como matriz de encapsulamento para fornecer sistemas multiparticulados revestidos de lipídios e nanosuspensões lipídicas, respectivamente. O estado sólido lipídico e sua potencial alteração durante o armazenamento são investigados e correlacionados com a alteração na liberação do IFA. Métodos microscópicos qualitativos, como microscopia de luz polarizada e microscopia eletrônica de varredura, são ferramentas complementares para investigar a cristalização em nível micro. Devem ser acrescentados outros métodos analíticos com base no processo de fabrico seleccionado. A relação estrutura-função-processabilidade deve ser entendida cuidadosamente para projetar produtos farmacêuticos robustos e estáveis à base de lipídios.
Introduction
Os lipídios são uma classe de materiais que contêm hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e seus derivados. Abrangem uma ampla gama de estruturas químicas, incluindo ácidos graxos, acilgliceróis, esteróis e ésteres de esteróis, ceras, fosfolipídios e esfingolípidos1. O uso de lipídios como excipientes farmacêuticos iniciou-se em 1960 para incorporação de fármacos em uma matriz de cera para fornecer formulações de liberação sustentada2. Desde então, os excipientes à base de lipídios (LBEs) ganharam ampla atenção para diversas aplicações, como liberação modificada de medicamentos, mascaramento de sabor, encapsulamento de medicamentos e aumento da biodisponibilidade de medicamentos. Os LBEs podem ser aplicados em uma ampla gama de formas de dosagem farmacêutica através de processos de fabricação versáteis, a saber, revestimento a quente, secagem por pulverização, extrusão de lipídios sólidos, impressão 3D, comprimidos e homogeneização de alta pressão, entre outros. Formas de dosagem como comprimidos, filmes de desintegração oral, sistemas multiparticulados, nano e micropartículas, pellets e formas impressas em 3D são o resultado 2,3,4.
Os LBEs possuem o status "Geral Reconhecido como Seguro", baixa toxicidade, boa biocompatibilidade e melhor tolerância do paciente. Sua origem natural e ampla disponibilidade permitem que eles capacitem a fabricação farmacêutica verde e sustentável. No entanto, o uso de LBEs tem sido associado a formas de dosagem instáveis. Alterações nas propriedades de produtos à base de lipídios após o armazenamento têm sido amplamente relatadas. O estado sólido dos LBEs e a existência de polimorfismo lipídico são considerados os principais motivos para a instabilidade das formas de dosagem à base de lipídios 5,6,7,8.
As propriedades mecânicas e físicas dos lipídios estão intimamente relacionadas às suas propriedades de cristalização e à estrutura de sua rede cristalina, o que mostra hierarquias distintas de organização estrutural. Quando os lipídios são utilizados na fabricação de produtos farmacêuticos, a estrutura cristalina é afetada pelos parâmetros de processo aplicados, como temperatura, solventes orgânicos, cisalhamento e forças mecânicas, o que, por sua vez, afeta o desempenho do produto farmacêutico 5,7,9,10,11,12 . Para entender essa relação estrutura-função, é importante conhecer os fundamentos da cristalização lipídica e da estrutura cristalina e métodos analíticos para rastreá-los.
No nível molecular, a menor unidade de um cristal lipídico é denominada "célula unitária". Uma repetição tridimensional regular de células unitárias constrói as redes cristalinas, com interações moleculares mais fortes ao lado de suas direções laterais do que as longitudinais, explicando a construção em camadas de cristais lipídicos. O empacotamento transversal repetido das cadeias de hidrocarbonetos é conhecido como subcélula 1,12,13 (Figura 1). As lamelas são o empacotamento lateral das moléculas lipídicas. No pacote de cristais, as interfaces entre diferentes lamelas são feitas de grupos finais de metila, enquanto os grupos glicerol polar são colocados nas partes internas da lamela14. Para diferenciar cada cadeia de ácidos graxos na lamela, o termo folheto é empregado, que representa uma subcamada composta de cadeias únicas de ácidos graxos. Os acilgliceróis podem ser dispostos em comprimentos de cadeia de folheto duplos (2L) ou triplos (3L)14. A energia superficial das lamelas os leva a empilhar epitaxialmente uns aos outros, para fornecer nanocristalitos. Diferentes fatores de processamento, como temperatura e taxa de resfriamento, afetam o número de lamelas empilhadas e, portanto, a espessura do cristalito (~ 10-100 nm). A agregação de cristalitos leva à formação de esferulitos em microescala, e a agregação de esferulitos fornece à rede cristalina de LBEs um comportamento macroscópico definido13.
As transições de estado sólido começam no nível molecular. A transição geométrica de uma subcélula para outra é chamada de polimorfismo. Três polimorfos principais de forma α, β e β são geralmente encontrados em acilgliceróis, ordenados de acordo com o aumento da estabilidade. A inclinação da lamela em relação aos grupos finais ocorre durante as transições polimórficas 1,13. Transições polimórficas mediadas por armazenamento e fusão são experimentadas por LBEs. As transições de armazenamento ocorrem quando a forma metaestável é armazenada abaixo de sua temperatura de fusão, enquanto as transições mediadas por fusão acontecem à medida que a temperatura sobe acima do ponto de fusão de uma forma metaestável, provocando fusão e cristalização sucessiva da forma mais estável.
Além disso, a separação de fases e o crescimento de cristais também podem ocorrer. A separação de fases é impulsionada pela cristalização multifásica inicial e pelo crescimento de uma fase ou mais. Interações partícula-partícula, incluindo sinterização, interações moleculares, características microestruturais e componentes estranhos, também podem desencadear o crescimento de cristais 1,5.
O monitoramento das transições de estado sólido dos LBEs e seu impacto no desempenho das formas de dosagem é de importância significativa. Entre outros, a calorimetria exploratória diferencial (DSC) e a difração de raios X, especificamente o espalhamento simultâneo de raios-X de pequeno e grande ângulo (SWAXS), são dois padrões ouro para avaliar o estado sólido lipídico.
O DSC é comumente usado para medir as mudanças de entalpia do material de interesse associado ao fluxo de calor em função do tempo e da temperatura. O método é amplamente utilizado para a triagem do comportamento térmico de lipídios, como possíveis vias de fusão e cristalização, temperatura e entalpia correspondentes de diferentes formas polimórficas, bem como frações menores e principais de composições lipídicas. Esses dados podem ser utilizados para descrever a heterogeneidade, as múltiplas fases e o polimorfismo lipídico 5,7,13.
As técnicas de difração de raios X são os métodos mais poderosos para a determinação de estruturas no estado sólido. Possuindo nanoestrutura ordenada com lamelas repetidas, a reflexão do feixe de raios-X de cristais lipídicos pode ser investigada usando a lei de Bragg:
d = λ/2sinθ (Equação 1)
onde λ é o comprimento de onda de raios-X de 1,542 Å, θ é o ângulo de difração do feixe disperso e d é o espaçamento interplanar de camadas repetidas, definido como comprimento de lamela em lipídios. A região de pequeno ângulo do raio-x pode ser perfeitamente usada para detectar o padrão de espaçamento longo e calcular o comprimento da lamela (d). Quanto maior a distância repetida d, menor o ângulo de dispersão (1-15°, região de ângulo pequeno), uma vez que d é inversamente proporcional ao pecado θ. O arranjo subcelular dos lipídios pode ser caracterizado como o padrão de espaçamento curto na região grande angular da difração de raios X. Ambos os padrões de espaçamento longo e curto dos lipídios (comprimento da lamela e arranjo subcelular) podem ser usados para indicar a transformação polimórfica monotrópica. Por exemplo, a forma α (hexagonal) pode ser alterada para β (triclínica) devido a uma mudança no ângulo de inclinação das correntes, com alterações no comprimento da lamela (padrão de espaçamento longo, na região de pequeno angular, 1-15°) e no modo de empacotamento transversal (padrão de espaçamento curto, na região grande angular, 16-25°) (Figura 2).
As informações obtidas da região SAXS podem ainda ser utilizadas para investigar o crescimento do cristal medindo sua espessura (D) através da equação de Scherrer15:
D = Kλ/FWHMcosθ (Equação 2)
Onde, FWHM é a largura em radianos do máximo de difração medido a uma altura intermediária entre o fundo e o pico, geralmente conhecido como largura total a meio máximo (FWHM); θ é o ângulo de difração; λ é o comprimento de onda de raios-X (1,542 Å) e K (constante de Scherrer) é um número adimensional que fornece informações sobre a forma do cristal (no caso da ausência de informações detalhadas sobre a forma K = 0,9 é uma boa aproximação). Por favor, note que a equação de Scherrer pode ser usada para estimar tamanhos médios de cristais de até cerca de 100 nm, uma vez que o pico de alargamento é inversamente proporcional ao tamanho do cristalito. Portanto, sua aplicação é útil para determinar a espessura das nanoplaquetas e, indiretamente, o número de lamelas agregadas. Exemplos de utilização dessa conhecida abordagem para triagem das propriedades cristalinas dos lipídios no desenvolvimento da formulação farmacêutica e da correspondente instabilidade no desempenho do produto podem ser encontrados em 5,12,16,17,18.
O monitoramento do estado sólido dos LBEs dentro de cada estágio de desenvolvimento por meio de técnicas analíticas bem estabelecidas fornece uma estratégia eficaz para projetar processos de fabricação de alto desempenho e produtos farmacêuticos estáveis à base de lipídios.
Esta publicação apresenta a aplicação crítica de uma análise abrangente do estado sólido dos LBEs para monitorar as mudanças no estado sólido e sua correlação com a alteração no perfil de liberação do ingrediente farmacêutico ativo (IFA) da forma farmacêutica farmacêutica. Sistemas multiparticulados baseados em cristais API revestidos de lipídios via revestimento a quente e suspensões nanolipídicas produzidas via homogeneização de alta pressão são tomados como estudos de caso. O foco desta publicação é a aplicação da difração de raios X em pó e do DSC como ferramentas analíticas. Os dois primeiros exemplos mostram o efeito da transformação polimórfica e do crescimento de cristais, respectivamente, sobre a alteração na liberação de API de amostras revestidas. O último exemplo revela a correlação entre o estado sólido estável dos lipídios e o desempenho estável do produto farmacêutico em sistemas multiparticulados revestidos de lipídios e em suspensões nanolipídicas.
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Protocol
1. Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
- Preparação do instrumento
- Use um calorímetro de varredura diferencial equipado com um intracooler, um amostrador automático e o software para controle de instrumentos e análise de dados.
- Ligue a fonte de gás nitrogênio e ajuste a pressão entre 0,2 e 0,5 bar e ligue o instrumento DSC e o trocador automático de amostras.
- Abra o software e ative o modo de espera clicando no botão Sim . Permitir o equilíbrio do dispositivo por pelo menos uma hora
- Limpe o forno com nitrogênio, clique no ícone Novo Método e vá para Definição do Método. Ative a opção Modulação de temperatura na janela de visão geral. Vá para a guia de cabeçalho e selecione o método clicando em "amostra".
- Vá para a guia Programa de temperatura, selecione Purgar 2 MFC e em MFC protetor, ambos a 50 mL/min.
- Inserir o seguinte método de medição: Modo de espera a 20 °C, ciclo de aquecimento a 5 K/min de 20 °C até acima da temperatura de fusão dos lípidos, retenção isotérmica a esta temperatura durante 5 minutos, ciclo de arrefecimento a 0 °C a 5 K/min a -20 °C, temperatura final de reposição de emergência a uma temperatura de 10 graus °C acima da temperatura mais elevada do programa, e temperatura final de espera a 20 °C.
- Vá para a guia calibração e selecione o arquivo de temperatura e sensibilidade apropriado. Salvar o método
- Preparação e medição de amostras
- Pesar 3-4 mg de cada amostra em cadinhos de alumínio. Registre o peso exato carregado em cada cadinho e sele o cadinho de alumínio com uma tampa perfurada.
- Coloque os cadinhos na bandeja do amostrador automático e ative o modo de amostrador automático no software e no método relacionado à carga para cada amostra.
- Preencha a posição da amostra, o nome da amostra e o peso de cada amostra, bem como a posição do cadinho de referência na janela Visualização da bandeja da amostra e inicie as medições.
- Análise de dados
- Abra os dados brutos usando o software para análise de dados e plote a temperatura versus fluxo de calor, clicando no botão "X-time / X-temperature"
- Na janela estourada, clique em "Ocultar segmentos isotérmicos". No lado esquerdo da tela, selecione apenas as curvas a serem analisadas (por exemplo, desclique nos dados "Adicionais").
- Verificar o comportamento térmico dos lipídios como eventos endotérmicos e exotérmicos de energia absorvida ou liberada na forma de calor, respectivamente, em função da temperatura.
- Clique na curva, seguida de Avaliação e Área, para calcular a entalpia de fusão como a área sob a curva de endotermas.
- Selecione os limites de integração movendo as linhas verticais em torno de 2 a 3 graus Celsius antes e depois do início e do ponto final do pico.
- Selecione uma linha de base linear para a integração de pico. A área entre a curva e a linha de base é proporcional à mudança na entalpia. Clique em Aplicar para concluir o cálculo. Da mesma forma, calcule a entalpia de cristalização como a área sob a curva de exotermas
- Determine o início da temperatura de fusão (Para) clicando na curva a ser analisada e, em seguida, em Avaliação e Início.
- Selecione os limites de quantificação movendo as linhas verticais para a seção mais reta da curva. Isso geralmente ocorre em torno de 5-10 ° C antes e depois do pico. Em seguida, determine a temperatura de fusão clicando na curva a ser analisada, seguida de Avaliação e Pico. O valor obtido é o pico máximo.
2. Espalhamento de raios-X de pequeno e grande angular (SWAXS)
- Preparação do instrumento
- Use um sistema de espalhamento de raios-x, compondo uma câmera de foco pontual fixada a um gerador de raios-X de tubo selado e equipada com uma unidade de controle e software relacionado.
- Use cooper (λ = 1,54 Å) a 50 kV e 1 mA como fonte de raios-X e dois detectores sensíveis posicionados linearmente para cobrir regiões de espalhamento de raios-X pequenas e grandes angulares.
- Garantir os requisitos de segurança para proteger da exposição a raios-x.
- Ligue o sistema de água de arrefecimento na unidade de controlo, na bomba de vácuo, nas válvulas de gás e no sistema de controlo de potência e segurança.
- Ligue as válvulas de controle de tensão e purga para os detectores em um fluxo de gás entre 10 e 20 mL/min.
- Ligue o tubo de raios X e a opção de espera e aguarde aproximadamente 10 min. Desligue o modo de espera e ligue o tubo de raios X para a potência máxima (>50kV) e aguarde pelo menos 30 minutos.
- Inicie o software de controle e clique em RESET TPF. Escolha Filtro de rebocador e defina a posição. Vá para Posição para fixar a posição do filtro de tungstênio
- Preparação e medição de amostras
- Certifique-se de que as amostras estão disponíveis como pó fino. Se necessário, moer as amostras suavemente a baixas temperaturas para fornecer um pó fino.
- Encher as amostras em capilares de vidro especiais com um diâmetro externo de aproximadamente 2 mm, evitando qualquer aprisionamento de ar nos capilares. Sele o capilar de vidro com cera e coloque-o cuidadosamente no suporte capilar.
- Ligue o motor para a rotação da amostra e feche a válvula de vácuo até que a pressão esteja abaixo de 5 mbar.
- No software, corrija a configuração de medições selecionando uma resolução de posição de 1024. Fixe o tempo de exposição para 1200 s.
- Configure os limites de energia clicando no toque em Ferramentas, clique em energia e resolução e clique em reiniciar. Configure os limites de energia para uma faixa adequada entre 400-900.
- Abra o obturador de segurança e inicie as medições. Certifique-se de que a janela de medição mostre um máximo de 80 contagens por segundo. Se isso não for dado, adapte a posição do filtro.
- Análise de dados
- Exporte os dados como arquivos p00. Os dados consistem na intensidade de transmissão e absorção versus o número de canais e o ângulo de difração.
- Transfira os dados para avaliação para um software estatístico e corrija os dados normalizando as intensidades usando a massa de dispersão medida com o filtro de tungstênio.
- Crie um gráfico de intensidade normalizada versus duas vezes o ângulo de difração [(2Θ) 2xtheta].
- Use a função de "leitor de tela" para encontrar picos de difração nas regiões SAXS e WAXS.
- Aplique a equação de Bragg para calcular os picos de difração com intensidade máxima em espaçamento d curto e longo para as regiões WAXS e SAXS, respectivamente.
- Calcule as razões da posição de pico da região SAXS para descobrir a simetria cristalina dos lipídios (por exemplo, lamelar, hexagonal, cúbico).
- Use o pico de difração principal da região SAXS para quantificar a espessura do cristalito (D). Ajuste o pico em uma função gaussiana através de mínimos quadrados clássicos e obtenha o FWHM clicando em Análise, Picos e linhas de base, Analisador de pico, Caixa de diálogo Abrir.
- Na janela de saída, selecione a opção "Fit Peaks Pro". Selecione uma linha de base constante com y = 0 e selecione o pico de difração principal da região SAXS e clique em "Controle de ajuste" para selecionar os parâmetros de ajuste de pico.
- Escolha a função GaussAmp. Defina os parâmetros y_0, xc_1 e A_1 como fixos e obtenha o FWHM a partir do ajuste. Use a equação de Scherrer para calcular a espessura do cristalito.
3. Ensaios de dissolução
- Liberação de API de sistemas multiparticulados revestidos
- Use o aparelho USP 2 (pá) para estudos de dissolução.
- Encher os recipientes de ensaio de dissolução com tampão fosfato pH 6,8 e aquecer a 37 °C.
- Pesar triplicados de amostras de partículas revestidas equivalentes a uma dose única de IFA e colocar as amostras em recipientes de ensaio de dissolução.
- Inicie a raquete a uma velocidade de 100 rpm.
- Ajuste o amostrador automático para coletar amostras de 1 mL nos seguintes pontos de amostragem: 30 min, 60 min, 90 min, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 18 h e 24 h.
- Analisar as amostras através de um método de HPLC adequado 5,7,17.
- Analise os dados plotando a versão cumulativa da API versus o tempo.
- Realizar os experimentos para amostras armazenadas em longo prazo (25 °C, 60% de umidade relativa) e acelerada (40 °C e 70% de umidade relativa).
- Liberação de API a partir de nanopartículas lipídicas sólidas (SLN)
- Preparar fluido pulmonar simulado (SLF) misturando 0,02% (p/p) de dipalmitoilfosfatidilcolina na solução salina tampão fosfato de Dulbecco (D-PBS), com a seguinte composição: KCl (2,683 mM), KH 2 PO 4(1,47 mM), NaCl (136,893 mM), Na2HPO4· 2H 2O (8.058 mM), CaCl2· 2H 2O (0,884 mM) e MgCl2· 6H2O (0,492 mM). Pré-aqueça-o a 37 °C.
- Use de diálise com um saco de membrana de celulose de um ponto de corte controlado de 7.000 Da em triplicado para cada amostra.
- Atribua um de diálise para cada tempo de amostragem: 0,5 h, 1,5 h, 3 h, 5 h, 7 h e 24 h. Hidrate as de diálise durante 2 minutos, imergindo-as em SLF. Em seguida, seque cuidadosamente sua superfície com toalhas de papel macias.
- Injetar 3 mL da amostra (nanosuspensão lipídica), equivalente a 600 μg de dexametasona, em cada.
- Mergulhe cada em 200 mL de SLF a 37 °C (condições de dissipação) e agite o sistema a 125 rpm.
- Colher 200 mg de amostras no interior do utilizando uma seringa em cada hora de amostragem determinada.
- Determine o conteúdo da API usando o método HPLC-MS desenvolvido18.
- Calcule a API liberada da SLN pelo balanço de massa, de acordo com18, brevemente como a diferença entre a quantidade total de API na SLN e a quantidade restante de API após a amostragem.
- Repita o processo para amostras armazenadas.
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Representative Results
Correlação entre a transição polimórfica de lipídios e a liberação de API em cristais de API revestidos de lipídios:
Os cristais API revestidos com monoestearato de glicerol são medidos via DSC e raio-x diretamente após o revestimento e após 3 meses de armazenamento em condições aceleradas (40 °C, 75% de umidade relativa)7. O monoestearato de glicerila é um sistema multifásico contendo 40%-55% de monoglicerídeos, 30%-45% de diglicerídeos e 5%-15% de glicerídeos, principalmente tristearina19. As formas polimórficas de sub-α, α, β-prime e β são relatadas para monoestearina20. Tristearina e 1, 2-dislaverina apresentam formas polimórficas α, β-primo e β14.
Os dados do DSC das amostras T0 e das amostras armazenadas em condições aceleradas são mostrados na Figura 3A. O ciclo de aquecimento da amostra T0 mostrou um amplo evento endotérmico de até 10 °C, que pode ser correlacionado com a transição reversível sub-α/α descrita para 1-monoestearina e 1-monopalmitina21. Dois eventos endotérmicos em To = 54,0 °C e 46,7 estão correlacionados com a forma β e uma fase coexistente de menor ponto de fusão. Uma fase coexistente pode ser vista nos dados radiográficos como o espaçamento d curto de 4,16 Å correspondente à forma α polimórfica, organizada em uma fase lamelar de 57,3 Å e correspondendo a diferentes componentes da mistura. O arranjo lamelar do revestimento lipídico da amostra T0 é dado devido ao pico harmônico disponível em 18,7 Å correspondente à reflexão de terceira ordem no difractogramaSAXS 7 (Figura 3B).
Os dados de DSC das amostras após 3 meses de armazenamento em condições aceleradas mostram uma endoterma a To = 55,7 °C, com dois eventos sobrepostos a Tm = 60,2 °C para o restante α-forma e a Tm = 63,8 °C como o principal evento para a fusão de β-forma. A transição polimórfica é confirmada com os dados radiográficos pela detecção de espaçamentos d curtos de 4,66 Å, 4,58 Å, 4,37 Å, 3,92 Å e 3,83 Å, típicos da forma β, combinados com a redução da espessura da lamela de 57,3 Å para 50,4 Å, devido à inclinação molecular7.
Comparando-se o perfil de liberação de IFA do revestimento em T0 e após 3 meses de armazenamento em condições aceleradas (Figura 3C) mostram-se alteração significativa nos perfis de liberação, o que pode ser explicado pela evidente transformação polimórfica da forma α para a forma β com um arranjo subcelular mais denso, resultando em uma superfície repelente à água 7,21.
Correlação entre o crescimento cristalino do revestimento lipídico, a separação potencial de fase e a alteração da liberação em cristais API revestidos de lipídios: os cristais API são revestidos com uma mistura de tripalmitina e polissorbato 65 na proporção 90:10 %p/p. A tripalmitina é um triglicerídeo com pureza de 99%5. Os triglicerídeos comumente mostram as formas polimórficas α, β-prime e β, ordenadas pelo aumento da densidade do pacote de cristais e aumento da estabilidade.
O polissorbato 65 é um emulsionante com um valor de balanço hidrofílico-lipofílico (HLB) de 10,5 e uma temperatura de fusão de 32 °C. Os triglicerídeos são comumente cristalizados em seu polimorfo α do derretimento. Certos aditivos induzem a transformação de α em β de TAGs, entre eles o polissorbato 65. Além disso, o polissorbato 65 atua como uma impureza no sistema, causando cristalização heterogênea da tripalmitina em forças motrizes mais baixas e desencadeando o crescimento de cristais.
Os dados de DSC e raios-X de amostras T0 e amostras armazenadas em condições aceleradas são mostrados na Figura 4A,B. O ciclo de aquecimento das medidas de DSC na amostra T0 mostra um evento endotérmico acentuado com pico a 64,8 °C, correspondendo à forma β polimófica da tripalmitina5. Isso também é detectável na região WAXS, mostrando o espaçamento curto a 4,6 Å, característico da subcélula da β forma (Figura 4A,B). Os dados mostram, claramente, a forma polimórfica induzida β da tripalmitina na presença de polissorbato 65 em amostras T0 e, naturalmente, em amostras armazenadas. A espessura lamelar correspondente é calculada usando a equação de Bragg como d = 2π/q001 = 42 Å5.
A espessura do cristal (D) das amostras T0 e das amostras armazenadas pode ser medida usando a equação de Scherrer descrita acima. Os cálculos mostram uma espessura cristalina de 24 nm em amostras de T0 e uma espessura aumentada de 37 nm em amostras armazenadas, correspondendo a 5,7 e 8,8 lamelas, respectivamente.
A comparação do perfil de liberação do IFA do revestimento em T0 e após 3 meses de armazenamento em condições aceleradas novamente mostra alteração significativa nos perfis de liberação após o armazenamento (Figura 4C).
Devido ao fato de que a mistura de tripalmitina e polissorbato 65 é um sistema bifásico, o crescimento cristalito da tripalmitina é desencadeado pela existência de fase polissorbato, especialmente sob a condição acelerada (40 °C, 75% de umidade relativa) onde o polissorbato 65 está em sua forma líquida derretida. A transição de fase e o crescimento da fase polissorbato sob condição acelerada devem-se muito provavelmente ao movimento do material líquido devido à capilaridade e às forças gravitacionais 5,22. A consequência é a alteração na liberação do API do revestimento5.
Correlação entre o estado sólido estável dos lipídios e o desempenho estável dos produtos farmacêuticos à base de lipídios: Dois produtos farmacêuticos à base de lipídios diferentes são avaliados: (a) uma forma de dosagem sólida composta de cristais API revestidos com excipientes à base de lipídios17 e (b) uma forma de dosagem líquida composta de nanopartículas sólido-lipídicas em suspensão carregadas com um API18 . Os LBEs empregados para ambos os produtos são ésteres de poliglicerol de ácidos graxos (PGFAs), um grupo de moléculas lipídicas consistindo de hidroxiéteres oligoméricos de glicerol total ou parcialmente esterificados com ácidos graxos. Os PGFAs são caracterizados pela cristalização monofásica em forma α, ausência de transições polimórficas e estabilidade geral de sua molecular, nano e microestrutura23.
No primeiro produto, os cristais API foram revestidos com PG3-C16/C18p, um PGFA composto por 3 unidades de glicerol parcialmente esterificadas com ácido palmítico e esteárico. Os dados de DSC e raios-x de amostras armazenadas em T0 e 3 meses em condições aceleradas são mostrados na Figura 5. A análise do DSC (Figura 5A) mostra um único pico de fusão no primeiro ciclo de aquecimento correspondente à existência de apenas uma forma polimórfica de PG3-C16/C18p com To = 54,2 °C. O ciclo de resfriamento revela a cristalização monofásica do lipídio através da existência de um único pico com Tc = 45,4°C. As amostras armazenadas também revelam termogramas inalterados, que não apresentam polimorfismo e separação de fases. O estado sólido estável do PG3-C16/C18p é confirmado pelos padrões SWAXS (Figura 5B). A região WAXS apresenta um pico correspondente a um espaçamento curto de d = 4,15 Å em T0 e amostras armazenadas17. Esse espaçamento d curto está associado à forma α das TAGs 1,13. O sinal WAXS inalterado após o armazenamento confirma a ausência de polimorfismo de PG3-C16/C18p. A região SAXS revela um pico principal em um longo espaçamento d de d = 63,7 Å, correspondendo a uma estrutura lamelar com configuração 2L. O tamanho cristalito (D) das amostras T0 obtidas através da análise de Scherrer representa 23 nm, correspondendo a quatro lamelas empilhadas. Não são mostradas alterações da espessura da lamela (63,5 Å) ou do crescimento cristalino (quatro lamelas) após o armazenamento. Uma comparação do perfil de liberação de amostras T0 e após o armazenamento (Figura 5C) mostra a excelente estabilidade do produto desenvolvido. O estado sólido estável da matriz lipídica proporcionado pelo PG3-C16/C18p resulta no desempenho estável do perfil de liberação do produto17.
Para o segundo produto, nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) carregadas de API na forma de nanossuspensão aquosa foram preparadas usando PG2-C18f como matriz lipídica e Poloxâmero 188 como emulsificante18. PG2-C18f é uma molécula de PGFA composta por 2 unidades de glicerol totalmente esterificadas com ácido esteárico. O poloxâmero 188 é um polímero de bloco não iônico com um alto HLB de 29. A estrutura química é composta de peças de polioxipropileno e polioxietileno. O API é encapsulado na matriz lipídica. Dentro deste produto, o estado sólido do lipídio pode ser impactado não apenas pelas condições de processamento, mas também pelas interações água-nanopartículas e interações emulsificante-lipídio. Os dados de DSC e raios-X das nanosuspensões em T0 e após 3 meses de armazenamento em condições aceleradas são mostrados na Figura 6. A análise do DSC mostra um evento endotérmico a To = 55,3 °C seguido por uma endoterma ampla estendida até 100 °C. O primeiro evento atribuído ao derretimento do SLN de PG2-C18f e à ampla endotermia é devido à evaporação da água. Como o Poloxâmero 188 é dissolvido na fase da água, nenhuma endoterma é representada no primeiro ciclo. O comportamento térmico estável é representado na análise do CEO das amostras armazenadas, que não apresentam alterações. Embora o polimorfismo lipídico seja geralmente acelerado em sistemas nanométricos, a análise SWAXS confirma o comportamento estável da matriz lipídica. O espaçamento d curto medido de 4,15 Å para PG2-C18f após sua cristalização no SLN recém-fabricado e após 6 meses de armazenamento de amostras em condição acelerada (6m/AC) indica a presença da forma estávelα. A espessura da lamela de PG2-C18f dentro do SLN em T0 (56,5 Å) e após o armazenamento (56,3 Å) não apresenta alterações. A estrutura lamelar do lipídio é evidenciada por um sinal harmônico a 18,7 Å. O tamanho cristalito (D) da PG2-C18f pela análise de Scherrer é de 10,8 nm (duas lamelas), não apresentando crescimento cristalino após o armazenamento das nanosuspensões (11,7 nm, duas lamelas)18. O uso de SLN na indústria farmacêutica tem sido dificultado devido a problemas de estabilidade bem relatados após o armazenamento, como aglomeração e gelificação de partículas, perda de encapsulamento (expulsão de API) e perfil de liberação instável. Em vez disso, a aplicação de uma matriz lipídica estável, PG2-C18f, como aqui mostrado, resulta no desempenho do produto apresentado na Figura 7. Nenhuma aglomeração de partículas, perfil de liberação estável e eficiência de encapsulamento estável são representados. A instabilidade geral do LS tem sido atribuída ao polimorfismo lipídico e a outras transições de estado sólido24. Os lipídios polimórficos sofrem transições durante o armazenamento de formas cristalinas menos densas (forma α) para formas mais densas (β-prime e β). Essa transição polimórfica pode afetar a área de superfície das nanopartículas fabricadas, especialmente, se a área de superfície não for suficientemente estabilizada pelo emulsificante. As consequentes podem ser instabilidades como aglomeração ou gelificação. Além disso, a alteração da densidade cristalina de α para β causa a perda de espaço suficiente para o IFA dentro da matriz lipídica, o que leva à expulsão do IFA, alterações na eficiência do encapsulamento e no perfil de liberação. Considerando o pequeno tamanho do LS (neste estudo x50 = 234,3 nm), os efeitos do crescimento de cristais no desempenho do produto também se tornam críticos. A utilização de uma matriz lipídica com estado sólido estável resultou em desempenho estável do produto18.
Figura 1: As configurações do garfo e da cadeira de uma molécula TAG, da subcélula, da lamela e da plaqueta cristalina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Espaçamento curto (mão esquerda) e espaçamento longo (mão direita) padrões de tripalmitina em regiões grande angular e pequeno ângulo de difratogramas de raios-x, respectivamente . (A) A forma alfa e (B) a forma beta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cristais de API revestidos com monoestearato de glicerol: análise do estado sólido de lipídios como material de revestimento e perfil de liberação de API de amostras recém-preparadas (T0) e após 3 meses de armazenamento sob condições aceleradas (AC). (A) DSC, (B) SWAXS e (C) perfil de liberação. Este valor foi modificado de7. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Cristais API revestidos com tripalmitina e polissorbato 65 (90:10 %p/p): Análise do estado sólido do material de revestimento e liberação de API de amostras recém-preparadas (T0) e após 3 meses de armazenamento em condições aceleradas (AC). (A) DSC, (B) SWAXS, (C) Perfil de liberação API. Este valor foi modificado de5. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Cristais API revestidos com PG3-C16/C18p: Análise do estado sólido de PG3-C16/C18p como material de revestimento e perfil de liberação de API de amostras recém-preparadas (T0) e após 3 meses de armazenamento sob condições aceleradas (AC). (A) DSC, (B) SWAXS, (C) perfil de liberação API. Este número foi modificado de17. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise do estado sólido de amostras de LS recém-preparadas (T0), após 3 meses de armazenamento em condições aceleradas (CA), e excipiente lipídico bruto . (A) DSC e (B) SWAXS. Este número foi modificado de18. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Desempenho do produto de SLNs recém-preparados (T0) e após 3 e 6 meses de armazenamento em condições aceleradas (3m/AC, 6m/AC). (A) Distribuição granulométrica, (B) Perfil de liberação, (C) eficiência de encapsulamento. Este número foi modificado de18. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Difração de raios X em pó e DSC foram descritos neste manuscrito como padrão-ouro para a análise do estado sólido de LBEs. A difração de raios X em pó tem a excelente vantagem de processar as medições in situ, com o mínimo de manipulação de estado sólido das amostras durante as medições. Além disso, os capilares cheios de mesmo tipo podem ser armazenados em diferentes condições após as medições iniciais para investigar a alteração do estado sólido durante o armazenamento. Neste trabalho, nos concentramos nas regiões de grande e pequeno ângulo de raios-x, permitindo-nos fornecer dados estruturais de dimensões de até aproximadamente 100 nm.
Ultra SAXS (USAXS) pode ser usado para rastrear a agregação e o crescimento cristalino das nanoplaquetas cristalinas (CNP) em dimensões maiores. O método tem sido aplicado com sucesso em sistemas específicos para analisar tamanhos de CNP na região de aproximadamente 100 a 1.000 nm 15,26,27. A caracterização de cristais lipídicos em sistemas líquidos requer maior resolução. A radiação síncrotron e o fornecimento de fluxo de raios-X com maior intensidade são normalmente utilizados para tal caracterização28. A difração de raios X síncrotron e o espalhamento de nêutrons de pequeno ângulo (SANS) são ferramentas poderosas para a caracterização de cristais líquidos e sistemas autoemulsificantes multicamadas, como os lipossomas, que não são o escopo deste artigo25,28,29. Os sistemas líquidos também podem ser caracterizados usando a configuração de raios-X descrita no protocolo, ajustando o tempo de radiação por um período mais longo.
Os seguintes pontos devem ser observados para a implementação do raio-x para triagem do estado sólido dos lipídios e suas composições: (i) Geralmente, o tempo de radiação deve ser selecionado individualmente, com base na natureza das amostras e configurações do equipamento. ii) A intensidade dos sinais é directamente proporcional à concentração de material numa mistura. Portanto, é importante triar, em um primeiro momento, a mistura física de uma composição multifásica. Isso evitará a interpretação errada dos dados em dispersões sólidas amorfas (ASDs), se a recristalização do API amorfo em sua composição processada com um LBE for investigada. Para detectar pequenas frações de cristais em tais composições, é importante ampliar as regiões em que os sinais são esperados. (iii) Moer as amostras para fornecer pó fino para enchimento de capilares deve ser realizado a uma baixa temperatura para evitar calor e estresse externos. Isso pode causar alteração no estado sólido do lipídio na amostra. O enchimento denso dos capilares é importante para evitar o aprisionamento do ar entre as partículas e para garantir o espalhamento imaculado do raio-x pelas partículas.
O DSC é uma ferramenta poderosa para rastrear o comportamento térmico de lipídios, estimar a miscibilidade de aditivos e/ou API na matriz lipídica e fornecer diagramas de fase. O evento termodinâmico, incluindo os inícios e picos de fusão e cristalização, bem como a entalpia de cada evento, fornece informações úteis sobre as formas polimórficas disponíveis, possíveis transições polimórficas e diferentes transições de fase. No entanto, ao contrário da difração de raios X, o calor aplicado nas medidas de DSC pode manipular o comportamento de estado sólido dos lipídios e causar transição polimórfica e de fase durante as medições. Portanto, é altamente recomendável evitar o uso exclusivo desta técnica para análise do estado sólido lipídico. Este método deve ser utilizado como técnica complementar à difração de raios X. O DSC acoplado e a difração de raios X têm sido amplamente utilizados na indústria alimentícia para análise do estado sólido lipídico 30,31,32,33,34. Sua aplicação na indústria farmacêutica limita-se bastante à detecção de alterações polimórficas nos IFAs 35,36,37. A outra desvantagem do uso exclusivo do DSC é a caracterização de sistemas lipídicos multifásicos, pois a intensidade dos eventos térmicos é dependente da concentração. Além disso, eventos térmicos sobrepostos podem ocorrer. O DSC modulado por temperatura pode ser utilizado para a caracterização de sistemas multifásicos, o que possibilita a separação de eventos cinéticos e transições sobrepostas38,39.
Os seguintes pontos devem ser observados para a implementação dos ensaios de DSC descritos no protocolo: (i) Com base nos experimentos, um segundo ciclo de aquecimento pode ser aplicado, se necessário. (ii) Devido ao comportamento constante da capacidade térmica específica (Cp) dos lipídios durante a análise, a seleção de uma linha de base linear é apropriada. iii) Para obter o início da fusão (To), devem ser definidos os limites de cálculo. Os limites mínimo e máximo devem incluir o ponto extremo da curva derivada e o intervalo mais linear da linha de base. O ponto de intersecção entre a tangente flexional e a linha de base é determinado como Para.
No caso de termogramas com picos bem separados, recomenda-se considerar a entalpia de cada evento calculando a área sob a curva. Os dados são úteis para explicar o grau de transição polimórfica ou de fase no sistema, em combinação com os dados de difração de raios X.
Este manuscrito trata dos padrões ouro para análise de LBEs e seus produtos farmacêuticos. Outros métodos analíticos podem ser utilizados como métodos complementares. Exemplos são métodos microscópicos qualitativos, como microscopia de luz polarizada e microscopia eletrônica de varredura, para investigar o efeito da tensão de processo na taxa de cristalização e, consequentemente, na forma e morfologia dos cristais. A abordagem do desenvolvimento de produtos farmacêuticos à base de lipídios deve ser baseada na caracterização de LBEs físico-químicos, para definir seus atributos críticos relevantes para processos de fabricação selecionados e prever sua processabilidade. As interações excipiente-API também devem ser cuidadosamente examinadas para cada API40 individual. Devem ser acrescentados outros métodos analíticos com base no processo de fabrico seleccionado. A relação estrutura-função-processabilidade deve ser entendida cuidadosamente para projetar produtos farmacêuticos robustos e estáveis à base de lipídios.
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Disclosures
Os autores divulgam todo e qualquer conflito de interesse.
Acknowledgments
O Centro de Investigação em Engenharia Farmacêutica (RCPE) é financiado no âmbito do COMET - Centros de Competência para Excelentes Tecnologias pela BMK, BMDW, Land Steiermark e SFG. O programa COMET é gerido pela FFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Cassettes with a cellulose membrane bag with a cut-off of 7000 Da, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer 7K | Fisher Scientific Inco, USA | ||
| Control software of x-ray system | HECUS dedicated house equipment | ||
| Control unit of x-ray system | HECUS dedicated house equipment | ||
| Differential scanning calorimeter (DSC) aluminum crucibles and lids | Netzsch, Germany | ||
| Differential scanning calorimeter DSC 204 F1 Phoenix (NETZSCH, Germany). | Netzsch, Germany | ||
| Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) | Sigma-Aldrich | 850355P | |
| Dissolution paddle apparatus II, Erweka DT 828 LH | Erweka GmbH, Langen, Germany | ||
| Dynasan 116 | IOI OLEO | Tripalmitin | |
| Geleol | Gattefosse | Glyceryl monosterarate | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Kolliphor P 188 | BASF Chem Trade | Poloxamer 188 | |
| MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Netzsch DSC 204F1 Software Version 8.0.1 | Netzsch, Germany | 6.239.2-64.51.00 | |
| Origin Pro (OriginLab, Northampton, MA) (statistical software | OriginLab, Northampton, MA | ||
| Proteous Analysis Software | Netzsch, Germany | ||
| Tween 65 | Polysorbate 65 | ||
| Witepsol PMF 1683 | IOI OLEO | Triglycerol ester of stearatic/palmitic acid (partially esterified) | |
| Witepsol PMF 282 | IOI OLEO | Diglycerol ester of stearic acid | |
| X-ray HECUS system composed of a point-focusing camera and two linearly positioned sensitive detectors | HECUS dedicated house equipment |
References
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