Summary
この出版物は、脂質ベースの賦形剤(LBE)の固体状態を調査するためのゴールドスタンダードとしてのX線回折および示差走査熱量測定の応用を示しています。LBEの固体状態変化とその医薬品の性能への影響を理解することは、堅牢な脂質ベースの剤形を製造するための重要な要素です。
Abstract
脂質ベースの賦形剤(LBE)は、低毒性、生体適合性、天然ベースであり、その用途は医薬品製造の持続可能性をサポートします。しかしながら、主要な課題は、それらの不安定な固体であり、医薬品の安定性に影響を与える。溶融温度や粘度、レオロジーなど、脂質の加工に不可欠な物理的特性は、その分子構造と結晶性に関連しています。添加剤、ならびに製造プロセスに関与する熱的および機械的ストレスは、脂質の固体状態、ひいてはその医薬品の性能に影響を与えます。したがって、固体の変化を理解することは非常に重要です。この研究では、粉末X線回折と示差走査熱量測定(DSC)の組み合わせが、脂質の固体状態の特性評価のゴールドスタンダードとして紹介されています。X線回折は、多形と結晶成長をスクリーニングするための最も効率的な方法です。多形配列とラメラ長は、それぞれX線回折の広角領域と小角領域で特徴付けられます。小角X線散乱(SAXS)領域は、結晶成長を調べるためにさらに使用できます。相転移および分離を示すことができる。DSCは、脂質の熱挙動をスクリーニングし、脂質マトリックス中の添加剤および/または医薬品有効成分(API)の混和性を推定し、状態図を提供するために使用されます。LBEをコーティング材料またはカプセル化マトリックスとして使用して、脂質コーティングされた多粒子システムおよび脂質ナノ懸濁液をそれぞれ提供する4つのケーススタディが提示されています。脂質の固体状態と保存中のその潜在的な変化が調査され、APIリリースの変化と相関します。偏光顕微鏡や走査型電子顕微鏡などの定性的顕微鏡法は、ミクロレベルの結晶化を調べるための補完的なツールです。選択した製造プロセスに基づいて、さらに分析方法を追加する必要があります。構造-機能-加工性の関係を注意深く理解して、堅牢で安定した脂質ベースの医薬品を設計する必要があります。
Introduction
脂質は、長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含む材料のクラスです。それらは、脂肪酸、アシルグリセロール、ステロールおよびステロールエステル、ワックス、リン脂質、スフィンゴ脂質など、幅広い化学構造をカバーしています1。医薬品賦形剤としての脂質の使用は、徐放性製剤を提供するためにワックスマトリックスに薬物を包埋するために1960年に開始されました2。それ以来、脂質ベースの賦形剤(LBE)は、修飾薬物放出、味マスキング、薬物カプセル化、薬物バイオアベイラビリティの向上など、さまざまな用途で大きな注目を集めています。LBEは、ホットメルトコーティング、噴霧乾燥、固体脂質押出、3D印刷、打錠、高圧均質化など、用途の広い製造プロセスを介して、幅広い医薬品剤形に適用できます。錠剤、口腔内崩壊フィルム、多粒子系、ナノ粒子および微粒子、ペレット、および3Dプリント形態などの剤形は、結果2、3、4である。
LBEは、「安全と一般に認識されている」ステータス、低毒性、優れた生体適合性、および改善された患者耐性を備えています。それらの天然起源と幅広い入手可能性により、グリーンで持続可能な医薬品製造に力を与えることができます。それにもかかわらず、LBEの使用は不安定な剤形と関連している。保存後の脂質ベースの製品の特性の変化は広く報告されています。LBEの固体状態および脂質多型の存在は、脂質ベースの剤形の不安定性の主な理由と考えられている5、6、7、8。
脂質の機械的および物理的特性は、それらの結晶化特性およびそれらの結晶ネットワークの構造と密接に関連しており、構造組織の明確な階層を示しています。脂質が医薬品の製造に使用される場合、結晶構造は、温度、有機溶媒、せん断、機械的力など、適用されるプロセスパラメータの影響を受け、医薬品の性能に影響を与えます5,7,9,10,11,12 .この構造と機能の関係を理解するためには、脂質の結晶化や結晶構造の基礎と、それらをスクリーニングするための分析方法を知ることが重要です。
分子レベルでは、脂質結晶の最小単位は「単位格子」と呼ばれます。単位格子の規則的な3次元反復は、縦方向よりも横方向に沿って強い分子相互作用を伴う結晶格子を構築し、脂質結晶の層状構造を説明する。炭化水素鎖の繰り返し断面充填は、サブセル1、12、13として知られています(図1)。ラメラは脂質分子の横方向のパッキングです。結晶パッケージにおいて、異なるラメラ間の界面はメチル末端基からなる一方、極性グリセロール基はラメラ14の内部部分に配置される。ラメラ中の各脂肪酸鎖を区別するために、単一の脂肪酸鎖からなるサブ層を表すリーフレットという用語が採用される。アシルグリセロールは、二重(2L)または三重(3L)のリーフレット鎖長14で配置することができる。ラメラの表面エネルギーは、それらをエピタキシャル的に互いに積み重ねるように駆り立て、ナノ結晶子を提供する。冷却温度や速度などのさまざまな処理要因が、積層ラメラの数に影響を与え、それによって結晶子の厚さ(~10-100 nm)に影響します。微結晶の凝集はミクロスケールでの球晶の形成をもたらし、球晶の凝集は定義された巨視的挙動を持つLBEの結晶ネットワークを提供する13。
固体遷移は分子レベルから始まります。あるサブセルから別のサブセルへの幾何学的遷移は、ポリモーフィズムと呼ばれます。α型、β型、およびβ型の3つの主要な多形は、通常、アシルグリセロールに見られ、安定性の向上に従って順序付けられます。末端基に対するラメラの傾きは、多形転移の間に起こる1,13。貯蔵およびメルト媒介多型遷移は、LBEによって経験される。貯蔵転移は、準安定形態がその融解温度未満で貯蔵されるときに起こるが、融解媒介転移は、温度が準安定形態の融点を超えて上昇し、より安定な形態の融解および連続結晶化を引き起こすときに起こる。
さらに、相分離および結晶成長も起こり得る。相分離は、初期の多相結晶化および1相以上の成長によって駆動される。焼結、分子相互作用、微細構造的特徴、および異物を含む粒子間相互作用も、結晶成長を引き起こす可能性があります1,5。
LBEの固体転移と剤形の性能への影響を監視することは非常に重要です。とりわけ、示差走査熱量測定(DSC)とX線回折、特に同時小広角X線散乱(SWAXS)は、脂質固体を評価するための2つのゴールドスタンダードです。
DSCは、時間と温度の関数として熱流に関連する対象材料のエンタルピー変化を測定するために一般的に使用されます。この方法は、融解および結晶化の可能な経路、異なる多形形態の対応する温度およびエンタルピー、ならびに脂質組成の微量画分および主要画分などの脂質の熱挙動のスクリーニングに広く使用されている。これらのデータは、不均一性、多相、および脂質多型5、7、13を描写するために使用することができる。
X線回折技術は、固体状態での構造決定のための最も強力な方法です。ラメラが繰り返される秩序あるナノ構造を持つ脂質結晶からのX線ビームの反射は、ブラッグの法則を使用して調査できます。
d = λ/2sinθ (式 1)
ここで、λは1.542 ÅのX線波長、θは散乱ビームの回折角、dは繰り返し層の面間間隔であり、脂質のラメラ長として定義されます。X線の小角領域は、長い間隔のパターンを検出し、ラメラの長さ(d)を計算するために完全に使用できます。繰り返し距離dが大きいほど、dはsinθに反比例するため、散乱角(1-15°、小角領域)は小さくなります。脂質のサブセル配置は、X線回折の広角領域における短い間隔パターンとして特徴付けることができる。脂質の長い間隔と短い間隔の両方のパターン(ラメラ長とサブセル配置)を使用して、モノトロピック多型変換を示すことができます。たとえば、α形(六角形)は、鎖の傾斜角の変化により、ラメラの長さ(ロングスペーシングパターン、小角領域、1〜15°)および断面パッキングモード(ショートスペーシングパターン、広角領域、16〜25°)の変化により、β(三斜晶)に変更できます(図2)。
SAXS領域から得られた情報は、シェラー式15を介してその厚さ(D)を測定することにより、結晶成長を調べるためにさらに使用できます。
D = Kλ/FWHMcosθ (式 2)
ここで、FWHMは、バックグラウンドとピークの間の中間の高さで測定された回折極大のラジアン単位の幅であり、一般に半値全幅(FWHM)として知られています。θは回折角です。λはX線波長(1.542 Å)であり、K(シェラー定数)は結晶の形状に関する情報を提供する無次元数です(詳細な形状情報がない場合、K = 0.9が適切な近似値です)。Scherrer方程式は、ピークの広がりが結晶子サイズに反比例するため、最大約100nmの平均結晶サイズを推定できることに注意してください。したがって、その応用は、ナノプレートレットの厚さ、および間接的に凝集ラメラの数を決定するのに有用である。医薬製剤開発における脂質の結晶特性および対応する製品性能の不安定性をスクリーニングするためにこの周知のアプローチを使用する例は、5、12、16、17、18に見出すことができる。
確立された分析技術を通じて、各開発段階におけるLBEの固体状態を監視することは、高性能製造プロセスと安定した脂質ベースの医薬品を設計するための効果的な戦略を提供します。
この出版物は、固体の変化と、医薬品剤形からの医薬品有効成分(API)の放出プロファイルの変化との相関を監視するためのLBEの包括的な固体分析の重要なアプリケーションを示しています。ホットメルトコーティング による 脂質コーティングAPI結晶に基づく多粒子システム、および高圧均質化 によって 生成されたナノ脂質懸濁液がケーススタディとして取り上げられています。この出版物の焦点は、分析ツールとしての粉末X線回折とDSCの応用です。最初の2つの例は、コーティングされたサンプルからのAPI放出の変化に対する多形変換と結晶成長の影響をそれぞれ示しています。最後の例は、脂質の安定した固体状態と、脂質被覆多粒子系およびナノ脂質懸濁液における医薬品の安定した性能との間の相関関係を明らかにしている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.示差走査熱量測定(DSC)
- 楽器の準備
- イントラクーラー、オートサンプラー、および機器制御とデータ分析用のソフトウェアを備えた示差走査熱量計を使用してください。
- 窒素ガス供給のスイッチを入れ、圧力を0.2〜0.5バールに設定し、DSC装置と自動サンプルチェンジャーの電源を入れます。
- ソフトウェアを開き、[ はい ]ボタンをクリックしてスタンバイモードをアクティブにします。デバイスの平衡化を少なくとも1時間許可する
- 炉を窒素でパージし、[新しいメソッド]アイコンをクリックして、[メソッド定義]に移動します。概要ウィンドウで温度変調オプションをアクティブにします。 ヘッダー タブに移動し、「サンプル」をクリックしてメソッドを選択します。
- [温度プログラム]タブに移動し、[パージ2 MFC]と[保護MFC]を50 mL / minで選択します。
- 次の測定方法を挿入します:20°Cでのスタンバイ、20°Cから脂質の融解温度以上まで5 K / minでの加熱サイクル、この温度で5分間の等温保持、5 K / minで0°Cへの冷却サイクル-20°C、プログラムの最高温度より10°C高い温度での最終緊急リセット温度、 最終待機温度は20°Cです。
- キャリブレーションタブに移動し、適切な温度と感度のファイルを選択します。メソッドを保存する
- サンプル調製と測定
- 各サンプルの3〜4 mgをアルミニウムるつぼに計量します。各るつぼにロードされた正確な重量を記録し、穴を開けた蓋でアルミニウムるつぼを密封します。
- るつぼをオートサンプラートレイに置き、各サンプルのソフトウェアおよびロード関連の方法でオートサンプラーモードをアクティブにします。
- 各サンプルのサンプル位置、サンプル名、重量、および参照るつぼの位置を[サンプルトレイビュー]ウィンドウに入力し、測定を開始します。
- データ分析
- データ分析用のソフトウェアを使用して生データを開き、「X時間/ X温度」ボタンをクリックして温度と熱流をプロットします。
- ポップアウトされたウィンドウで、「等温セグメントを非表示にする」をクリックします。画面の左側で、分析する曲線のみを選択します(たとえば、「追加」データの選択を解除します)。
- 脂質の熱挙動を、温度の関数として、それぞれ熱の形で吸収または放出されたエネルギーの吸熱および発熱イベントとして確認します。
- 曲線をクリックし、[評価]と[面積]の順にクリックして、融合エンタルピーを吸熱曲線下の面積として計算します。
- ピークの開始と終点の前後に摂氏2〜3度の周りに垂直線を移動して、積分境界を選択します。
- ピーク積分の線形ベースラインを選択します。曲線とベースラインの間の面積は、エンタルピーの変化に比例します。[適用]をクリックして計算を終了します。同様に、結晶化エンタルピーを発熱曲線下の面積として計算します
- 融解温度の開始(To)を決定するには、解析する曲線をクリックし、次に評価と開始をクリックします。
- 定量化境界を選択するには、垂直線を曲線の最も直線なセクションに移動します。これは通常、ピークの前後5〜10°Cです。次に、解析する曲線をクリックして融解温度を決定し、評価とピークの順に続きます。得られた値がピーク最大値である。
2. 小角・広角X線散乱(SWAXS)
- 楽器の準備
- X線散乱装置を使用し、密閉管X線発生装置に固定され、制御ユニットと関連ソフトウェアを備えた点集束カメラを構成します。
- 50 kV、1 mAのクーパー(λ = 1.54 Å)をX線源として使用し、2つの直線的に配置された高感度検出器を使用して、小角と広角の両方のX線散乱領域をカバーします。
- X線被曝から保護するための安全要件を確保してください。
- コントロールユニットの冷却水システム、真空ポンプ、ガスバルブ、および電源および安全制御システムの電源を入れます。
- 検出器の電圧制御バルブとパージバルブを10〜20 mL/minのガス流量でオンにします。
- X線管とスタンバイオプションの電源を入れ、約10分待ちます。スタンバイモードをオフにし、X線管の電源を入れてフルパワー(>50kV)にし、少なくとも30分待ちます。
- 制御ソフトウェアを起動し、[TPFのリセット]をクリックします。タグステンフィルターを選択し、位置を設定します。位置に移動して、タングステンフィルターの位置を固定します
- サンプル調製と測定
- サンプルが微粉末として入手可能であることを確認してください。必要に応じて、サンプルを低温で穏やかに粉砕して微粉末にします。
- 外径約2 mmの特殊なガラスキャピラリーにサンプルを充填し、キャピラリーに空気が閉じ込められないようにします。ガラスキャピラリーをワックスで密封し、キャピラリーホルダーに注意深く入れます。
- サンプル回転のためにモーターのスイッチを入れ、圧力が5mbarを下回るまで真空バルブを閉じます。
- ソフトウェアで、位置分解能を1024に選択して測定設定を修正します。露光時間を1200秒に固定します。
- [ツール]をタップしてエネルギー制限を設定し、[エネルギーと解像度]をクリックして、[再起動]をクリックします。エネルギー制限を400〜900の適切な範囲に設定します。
- 安全シャッターを開き、測定を開始します。測定ウィンドウに最大80カウント/秒が表示されていることを確認します。これが指定されていない場合は、フィルターの位置を調整します。
- データ分析
- データをp00ファイルとしてエクスポートします。データは、チャネル番号と回折角に対する透過と吸収の強度で構成されています。
- 評価用のデータを統計ソフトウェアに転送し、タングステンフィルターで測定した散乱質量を使用して強度を正規化してデータを補正します。
- 回折角[(2Θ)2xtheta]に対する正規化強度のプロットを作成します。
- 「スクリーンリーダー」の機能を使用して、SAXSおよびWAXS領域の回折ピークを見つけます。
- ブラッグの式を適用して、WAXS領域とSAXS領域のそれぞれ短いd間隔と長いd間隔に最大強度の回折ピークを計算します。
- SAXS領域のピーク位置の比率を計算して、脂質の結晶対称性(例えば、層状、六方晶、立方晶)を調べる。
- SAXS領域のメイン回折ピークを使用して、結晶子の厚さ(D)を定量化します。古典的な最小二乗 法を介して ピークをガウス関数に適合させ、分析、ピークとベースライン、ピークアナライザー、ダイアログを開くをクリックしてFWHMを取得します。
- ポップアウトされたウィンドウで、「Fit Peaks Pro」オプションを選択します。y = 0の一定のベースラインを選択し、SAXS領域のメイン回折ピークを選択し、「フィットコントロール」をクリックしてピークフィットパラメータを選択します。
- ガウスアンプ関数を選択します。パラメータy_0、xc_1、A_1を固定として設定し、フィットからFWHMを取得します。シェラー方程式を使用して、結晶子の厚さを計算します。
3. 溶出試験
- コーティングされた多粒子システムからのAPIリリース
- 溶解試験にはUSP装置2(パドル)を使用してください。
- 溶出試験容器にpH 6.8のリン酸緩衝液を満たし、37°Cに加熱する。
- APIの単回投与に相当するコーティング粒子のサンプルを3倍秤量し、サンプルを溶出試験容器に入れます。
- 100rpmの速度でパドルを始動します。
- 次のサンプリングポイントで1mLのサンプルを採取するようにオートサンプラーを設定します:30分、60分、90分、2時間、4時間、6時間、8時間、10時間、12時間、18時間、および24時間。
- 適切なHPLC法5、7、17を介してサンプルを分析します。
- 累積 API リリースと時間をプロットしてデータを分析します。
- 長期間(25°C、相対湿度60%)および加速(40°C、相対湿度70%)で保存されたサンプルの実験を実施します。
- 固体脂質ナノ粒子(SLN)からのAPIリリース
- ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)に0.02%(w/w)のジパルミトイルホスファチジルコリンを混合し、次の組成で模擬肺液(SLF)を調製します:KCl(2.683 mM)、KH2 PO 4 (1.47 mM)、NaCl(136.893 mM)、Na2HPO4·2H2O(8.058 mM)、CaCl2·2H2O(0.884mM)、およびMgCl2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O26H2O(0.492 mM)。37°Cで予熱します。
- 各サンプルについて、3連で7,000Daの制御されたカットオフのセルロースメンブレンバッグを備えた透析カセットを使用します。
- サンプリング時間ごとに1つの透析カセットを割り当てます:0.5時間、1.5時間、3時間、5時間、7時間、および24時間。透析カセットをSLFに浸して2分間水和します。次に、柔らかいペーパータオルで表面を慎重に乾かします。
- 600 μgのデキサメタゾンに相当する3 mLのサンプル(脂質ナノ懸濁液)を各カセットに注入します。
- 各カセットを37°C(シンク条件)の200 mLのSLFに浸し、125 rpmでシステムを攪拌します。
- 決定された各サンプリング時間にシリンジを使用してカセット内から200mgのサンプルを採取します。
- 開発されたHPLC-MSメソッド18を使用してAPI含有量を決定します。
- 18に記載のマスバランスによりSLNから放出されたAPIを、SLN中のAPIの総量とサンプリング後のAPIの残量との差として簡単に計算する。
- 保存されたサンプルに対してこのプロセスを繰り返します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
脂質コートAPI結晶における脂質多形転移とAPI放出の相関:
モノステアリン酸グリセロールでコーティングされたAPI結晶は、コーティング直後、および加速条件下(40°C、相対湿度75%)7で3か月保存した後にDSCおよびX線 で 測定されます。モノステアリン酸グリセリルは、40%〜55%のモノグリセリド、30%〜45%のジグリセリド、および5%〜15%のグリセリド、主にトリステアリン19を含む多相系である。サブα、α、βプライム、およびβの多型形態は、モノステアリン20について報告されています。トリステアリンおよび1,2−ジステアリンは、α、β素数、およびβ多型形態を示す14。
T0サンプルおよび加速条件下で保存されたサンプルのDSCデータを 図3Aに示します。T0試料上の加熱サイクルは、10°Cまでの広い吸熱事象を示し、これは、1−モノステアリンおよび1−モノパルミチン21について記載される可逆的サブα/α転移と相関し得る。To=54.0°Cおよび46.7での2つの吸熱事象は、β型および低融点の共存相と相関している。共存相は、X線データにおいて、57.3 Åの層状相に組織され、混合物の異なる成分に対応する多形α形態に対応する4.16 Åの短いd間隔として見ることができる。T0サンプルの脂質コーティングのラメラ配置は、SAXS回折図7の3次反射に対応する18.7 Åの利用可能な高調波ピークにより与えられます(図3B)。
加速条件下で3ヶ月間保存した後のサンプルのDSCデータは、To=55.7°Cで吸熱を示し、残りのα体ではTm=60.2°C、β体の融解のメインイベントとしてTm=63.8°Cの2つの重複イベントが見られました。多型転移は、分子の傾きによるラメラの厚さの57.3 Åから50.4 Åへの減少と組み合わせて、β型に典型的な4.66 Å、4.58 Å、4.37 Å、3.92 Å、および3.83 Åの短いd間隔を検出することによってX線データで確認されます7。
T0でのコーティングからのAPIの放出プロファイルと加速条件下での3か月の保存後(図3C)を比較すると、放出プロファイルに有意な変化が見られ、これは、より高密度のサブセル配置を伴うα型からβ型への明らかな多形変換によって説明でき、撥水性表面7,21をもたらします。
脂質コーティングされたAPI結晶における脂質コーティングの結晶成長、電位相分離、および放出変化の相関:API結晶は、トリパルミチンとポリソルベート65の混合物を90:10%w/w比でコーティングしています。トリパルミチンは純度99%5のトリグリセリドです。トリグリセリドは一般に、結晶パックの密度の増加と安定性の増加によって順序付けられた、α、β素数、およびβ多形の形態を示します。
ポリソルベート65は、親水性親油性バランス(HLB)値が10.5、融解温度が32°Cの乳化剤です。 トリグリセリドは通常、溶融物からα多形で結晶化されます。特定の添加剤は、αのβへの変換を誘導し、その中にはポリソルベート65があります。さらに、ポリソルベート65は系内で不純物として作用し、より低い駆動力でトリパルミチンの不均一な結晶化を引き起こし、結晶成長を引き起こします。
加速条件下で保存されたT0サンプルおよびサンプルのDSCおよびX線データを図4A,Bに示します。T0サンプルのDSC測定の加熱サイクルは、トリパルミチン5のポリモフィックβ体に対応する64.8°Cにピークを持つ鋭い吸熱イベントを示しています。これはWAXS領域でも検出可能であり、β型のサブセルの特徴である4.6 Åの短い間隔を示しています(図4A、B)。データは、明らかに、T0サンプルで、そしてもちろん保存されたサンプルでポリソルベート65の存在下で誘導されたトリパルミチンの多型β型を示しています。対応する層の厚さは、d = 2π/q001 = 42Å5としてブラッグの式を使用して計算されます。
T0試料及び保存試料の結晶厚(D)は、上述したシェラー式を用いて測定することができる。計算の結果、T0サンプルでは24 nmの結晶厚さ、保存されたサンプルでは37 nmの厚さの増加が示され、それぞれ5.7ラメラと8.8ラメラに相当します。
T0でのコーティングからのAPIの放出プロファイルと加速条件下での3か月の保存後を比較すると、保存後の放出プロファイルに有意な変化が再び示されます(図4C)。
トリパルミチンとポリソルベート65の混合物は二相系であるという事実のために、トリパルミチンの結晶子成長は、特にポリソルベート65がその液体溶融形態である加速条件(40°C、75%相対湿度)下でのポリソルベート相の存在によって引き起こされる。加速条件下でのポリソルベート相の相転移および成長は、毛細管現象および重力による液体材料の運動による可能性が最も高い5,22。その結果、コーティング5 からの API リリースが変更されます。
脂質の安定した固体と脂質ベースの医薬品の安定した性能との相関:2つの異なる脂質ベースの医薬品が評価されます:(a)脂質ベースの賦形剤17でコーティングされたAPI結晶で構成される固体剤形と(b)APIを装填した懸濁固体脂質ナノ粒子で構成される液体剤形18.両方の製品に使用されるLBEは、脂肪酸で完全にまたは部分的にエステル化されたグリセロールのオリゴマーヒドロキシエーテルからなる脂質分子のグループである脂肪酸のポリグリセリンエステル(PGFA)です。PGFAは、α型への単相結晶化、多形転移の欠如、およびそれらの分子、ナノ、および微細構造の全体的な安定性によって特徴付けられます23。
最初の生成物では、API結晶を、パルミチン酸とステアリン酸で部分的にエステル化した3つのグリセロール単位で構成されるPGFAであるPG3-C16 / C18pでコーティングしました。加速条件下で保存されたT0および3ヶ月保存サンプルのDSCおよびX線データを図5に示す。DSC分析(図5A)は、To=54.2°CのPG3-C16/C18pの多形形態が1つだけ存在することに対応する最初の加熱サイクルにおける単一の融解ピークを示しています。 冷却サイクルは、Tc = 45.4°Cの1つの単一ピークの存在による脂質の単相結晶化を明らかにします。 保存されたサンプルは、多型や相分離のない変化のないサーモグラムも明らかにします。PG3-C16/C18pの安定した固体状態は、SWAXSパターンによって確認されます(図5B)。WAXS領域は、T0および保存されたサンプル17におけるd=4.15Åの短い間隔に対応するピークを示す。このような短いd間隔は、TAG1,13のα形式に関連しています。保存後の未変化のWAXSシグナルは、PG3-C16/C18pの多型がないことを裏付けています。 SAXS領域は、2L配置のラメラ構造に対応する、d = 63.7 Åの長いd間隔にメインピークを示します。シェラー分析によって得られたT0サンプルの結晶子サイズ(D)は、4つの積層ラメラに対応する23nmを示しています。保存後のラメラの厚さ(63.5 Å)または結晶成長(4つのラメラ)の変化は見られません。T0サンプルと保存後の放出プロファイルを比較すると(図5C)、開発した製品の優れた安定性が示されています。PG3-C16/C18pによって提供される脂質マトリックスの安定した固体は、生成物の放出プロファイルの安定した性能をもたらす17。
第2の生成物については、水性ナノ懸濁液の形態のAPI負荷固体脂質ナノ粒子(SLN)を、脂質マトリックスとしてPG2−C18fを使用し、乳化剤18としてポロクサマー188を用いて調製した。PG2-C18fは、ステアリン酸で完全にエステル化された2つのグリセロール単位で構成されるPGFA分子です。ポロクサマー188は、29の高いHLBを有する非イオン性ブロックポリマーである。化学構造は、ポリオキシプロピレンとポリオキシエチレンの部分で構成されています。APIは脂質マトリックスにカプセル化されます。この製品内では、脂質の固体状態は、処理条件だけでなく、水とナノ粒子の相互作用や乳化剤と脂質の相互作用によっても影響を受ける可能性があります。T0および加速条件下での3ヶ月の保存後のナノ懸濁液のDSCおよびX線データを 図6に示す。DSC分析では、To = 55.3°Cでの吸熱イベントとそれに続く100°Cまでの広い吸熱が示されています。 PG2-C18fのSLNの融解と広い吸熱に起因する最初のイベントは、水の蒸発によるものです。ポロクサマー188は水相に溶解しているので、最初のサイクルでは吸熱は描かれません。保存されたサンプルのDSC分析では、安定した熱挙動が示され、変化は見られません。脂質多型は通常、ナノサイズのシステムで加速されますが、SWAXS分析により、脂質マトリックスの安定した挙動が確認されます。新たに製造されたSLNで結晶化した後、および加速条件(6m/AC)でサンプルを6か月間保存した後のPG2-C18fについて測定された4.15 Åの短いd間隔は、安定α型の存在を示しています。PG2-C18fのラメラ厚さは、T0(56.5 Å)および保存後(56.3 Å)のSLN内で変化を示していません。脂質の層状構造は、18.7 Åの高調波信号によって証明されます。Scherrer分析によるPG2-C18fの結晶子サイズ(D)は10.8 nm(2つのラメラ)であり、ナノ懸濁液(11.7 nm、2つのラメラ)の保存後に結晶成長を示さないことがわかりました18。製薬業界でのSLNの使用は、粒子の凝集やゲル化、カプセル化の喪失(APIの排出)、不安定な放出プロファイルなど、保存後の安定性の問題が十分に報告されているため、妨げられてきました。代わりに、本明細書に示されるように、安定な脂質マトリックスPG2−C18fの適用は、 図7に提示される製品性能をもたらす。粒子凝集なし、安定した放出プロファイル、および安定したカプセル化効率が示されています。SLNの一般的な不安定性は、脂質多型および他の固体状態遷移に起因している24。多形脂質は、貯蔵中に密度の低い結晶形(α型)からより密度の高い結晶形(β素体およびβ型)への遷移を被ります。この多形転移は、特に、表面積が乳化剤によって十分に安定化されていない場合、製造されたナノ粒子の表面積に影響を与える可能性がある。結果として生じるのは、凝集またはゲル化などのインスタビライトであり得る。また、結晶密度がαからβに変化すると、脂質マトリックス内のAPIに十分なスペースが失われ、APIの排出、カプセル化効率の変化、および放出プロファイルが発生します。SLNのサイズが小さいことを考慮すると(この研究ではx50 = 234.3 nm)、結晶成長が製品性能に与える影響も重要になります。安定した固体を有する脂質マトリックスの使用は、安定した製品性能をもたらした18。
図1:TAG分子、サブセル、ラメラ、結晶血小板のチューンフォークとチェアの構成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:X線回折図の広角領域と小角領域におけるトリパルミチンの短い間隔(左手)と長い間隔(右手)のパターン。 (A)アルファ型、(B)ベータ型。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:モノステアリン酸グリセロールでコーティングされたAPI結晶:コーティング材料としての脂質の固体分析、および新たに調製したサンプル(T0)および加速条件下での3か月保存後のAPI放出プロファイル(AC)。 (A)DSC、(B)SWAXS、および(C)放出プロファイル。この数値は7 から変更されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:トリパルミチンとポリソルベート65でコーティングされたAPI結晶(90:10%w / w):コーティング材料の固体分析と、新しく調製されたサンプル(T0)および加速条件下での3か月の保存後のAPI放出(AC)。 (A) DSC, (B) SWAXS, (C) API リリースプロファイル。この数値は5 から変更されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:PG3-C16/C18pでコーティングされたAPI結晶:コーティング材料としてのPG3-C16/C18pの固体分析、および新たに調製したサンプル(T0)および加速条件下での3か月保存後のAPIリリースプロファイル(AC)。 (A) DSC, (B) SWAXS, (C) API リリースプロファイル。この数値は17 から変更されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:新たに調製したSLNサンプル(T0)、加速条件下で3ヶ月間保存した後(AC)、および生脂質賦形剤の固体分析 。 (A)DSCおよび(B)SWAXS。この数値は18から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:新たに調製したSLN(T0)および加速条件下での3か月および6か月の保管後(3m / AC、6m / AC)の製品性能 。 (A)粒度分布、(B)放出プロファイル、(C)カプセル化効率。この数値は18から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
粉末X線回折とDSCは、LBEの固体分析のゴールドスタンダードとしてこの原稿に記載されています。粉末X線回折は、測定中のサンプルの固体操作を最小限に抑えながら、 その場で測定を処理するという優れた利点があります。さらに、同じ充填された毛細血管は、初期測定後に異なる条件下で保存して、保存中の固体変化を調べることができます。本研究では、X線の広角領域と小角領域に着目し、約100nmまでの寸法の構造データを提供することを可能にしました。
Ultra SAXS(USAXS)は、結晶子ナノプレートレット(CNP)の凝集と結晶成長をより大きな次元で追跡するために使用できます。この方法は、約100〜1,000nmの領域におけるCNPサイズを分析するために特定のシステムにおいて首尾よく適用されている15、26、27。液体系における脂質結晶の特性評価には、より高い分解能が必要です。放射光およびより高い強度のX線束を提供することは、通常、そのような特徴付け28のために使用される。シンクロトロンX線回折および小角中性子散乱(SANS)は、液晶およびリポソームなどの多層自己乳化システムの特性評価のための強力なツールであり、この記事の範囲ではありません25、28、29。液体系は、より長い期間の放射時間を調整することによって、プロトコルに記載されているX線セットアップを使用して特徴付けることもできます。
脂質とその組成の固体状態をスクリーニングするためのX線を実施するために注意すべき点は、(i)一般に、放射時間は、サンプルの性質と機器の設定に基づいて個別に選択する必要があります。(ii)シグナルの強度は、ブレンド中の材料濃度に正比例します。したがって、最初に、多相組成物の物理的混合物をスクリーニングすることが重要です。これにより、LBEで処理された組成物中のアモルファスAPIの再結晶を調査する場合に、アモルファス固体分散体(ASD)のデータの誤った解釈を回避できます。このような組成物中の結晶のごく一部を検出するには、信号が予想される領域を拡大することが重要です。 (iii)キャピラリーに充填するための微粉末を提供するためにサンプルを粉砕することは、外部の熱とストレスを避けるために低温で実行する必要があります。これにより、サンプル中の脂質の固体状態が変化する可能性があります。毛細血管の密な充填は、粒子間の空気の閉じ込めを回避し、粒子によるX線の完璧な散乱を確実にするために重要です。
DSCは、脂質の熱挙動をスクリーニングし、脂質マトリックス中の添加剤やAPIの混和性を推定し、状態図を提供するための強力なツールです。融解と結晶化のオンセットとピーク、および各イベントのエンタルピーを含む熱力学的イベントは、利用可能な多形形態、可能な多形転移、およびさまざまな相転移に関する有用な情報を提供します。ただし、X線回折とは対照的に、DSC測定で加えられた熱は、脂質の固体挙動を操作し、測定中に多形および相転移を引き起こす可能性があります。したがって、脂質固体分析にこの手法を単独で使用することは避けることを強くお勧めします。この方法は、X線回折の補完的な技術として使用する必要があります。結合DSCおよびX線回折は、脂質固体分析のために食品業界で広く使用されている30、31、32、33、34。製薬業界でのそのアプリケーションは、API35、36、37の多型変化の検出にかなり限定されています。DSCの単独使用の他の欠点は、熱事象の強度が濃度に依存するため、多相脂質系の特性評価である。さらに、オーバーラップする熱イベントが発生する可能性があります。温度変調DSCは、多相システムの特性評価に使用でき、運動イベントと重複遷移の分離を可能にします38,39。
プロトコルに記載されているDSC試験を実施するために、以下の点に留意すべきである:(i)実験に基づいて、必要に応じて第2の加熱サイクルを適用することができる。(ii)分析中の脂質の比熱容量(Cp)の一定の挙動により、線形ベースラインの選択が適切です。(iii)融解開始(To)を得るためには、計算の限界を定義する必要があります。最小制限と最大制限には、微分曲線の極値とベースラインの最も線形な範囲を含める必要があります。変曲接線とベースラインの交点は、Toとして決定されます。
ピークが十分に分離されているサーモグラムの場合は、曲線下の面積を計算することによって各イベントのエンタルピーを考慮することをお勧めします。このデータは、X線回折データと組み合わせて、系内の多形または相転移の程度を説明するのに役立ちます。
この原稿は、LBEとその医薬品の分析のためのゴールドスタンダードを扱っています。他の分析方法を補完的な方法として使用することができる。例としては、偏光顕微鏡や走査型電子顕微鏡などの定性的な顕微鏡法があり、結晶化速度、ひいては結晶の形状と形態に対するプロセス応力の影響を調査します。脂質ベースの医薬品開発のアプローチは、物理化学的LBEの特性評価に基づいて、選択された製造プロセスに関連する重要な属性を定義し、それらの処理可能性を予測する必要があります。賦形剤−API相互作用もまた、個々のAPI40ごとに注意深くスクリーニングされるべきである。選択した製造プロセスに基づいて、さらに分析方法を追加する必要があります。構造-機能-加工性の関係を注意深く理解して、堅牢で安定した脂質ベースの医薬品を設計する必要があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、あらゆる利益相反を開示します。
Acknowledgments
研究センター製薬工学(RCPE)は、BMK、BMDW、ランドシュタイヤーマーク、SFGによる優れた技術のためのコンピテンスセンターであるCOMETの枠組みの中で資金提供されています。COMETプログラムはFFGによって管理されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Cassettes with a cellulose membrane bag with a cut-off of 7000 Da, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer 7K | Fisher Scientific Inco, USA | ||
| Control software of x-ray system | HECUS dedicated house equipment | ||
| Control unit of x-ray system | HECUS dedicated house equipment | ||
| Differential scanning calorimeter (DSC) aluminum crucibles and lids | Netzsch, Germany | ||
| Differential scanning calorimeter DSC 204 F1 Phoenix (NETZSCH, Germany). | Netzsch, Germany | ||
| Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) | Sigma-Aldrich | 850355P | |
| Dissolution paddle apparatus II, Erweka DT 828 LH | Erweka GmbH, Langen, Germany | ||
| Dynasan 116 | IOI OLEO | Tripalmitin | |
| Geleol | Gattefosse | Glyceryl monosterarate | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Kolliphor P 188 | BASF Chem Trade | Poloxamer 188 | |
| MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Netzsch DSC 204F1 Software Version 8.0.1 | Netzsch, Germany | 6.239.2-64.51.00 | |
| Origin Pro (OriginLab, Northampton, MA) (statistical software | OriginLab, Northampton, MA | ||
| Proteous Analysis Software | Netzsch, Germany | ||
| Tween 65 | Polysorbate 65 | ||
| Witepsol PMF 1683 | IOI OLEO | Triglycerol ester of stearatic/palmitic acid (partially esterified) | |
| Witepsol PMF 282 | IOI OLEO | Diglycerol ester of stearic acid | |
| X-ray HECUS system composed of a point-focusing camera and two linearly positioned sensitive detectors | HECUS dedicated house equipment |
References
- Sato, K. Crystallization behaviour of fats and lipids a review. Chemical Engineering Science. 56 (7), 2255-2265 (2001).
- Becker, K., Salar-Behzadi, S., Zimmer, A. Solvent-free melting techniques for the preparation of lipid-based solid oral formulations. Pharmaceutical Research. 32 (5), 1519-1545 (2015).
- Rosiaux, Y., Jannin, V., Hughes, S., Marchaud, D. Solid lipid excipients - Matrix agents for sustained drug delivery. Journal of Controlled Release. 188, 18-30 (2014).
- Siepmann, J., et al. Lipids and polymers in pharmaceutical technology: lifelong companions. International Journal of Pharmaceutics. 558, 128-142 (2019).
- Lopes, D., et al. Microphase separation in solid lipid dosage forms as the cause of drug release instability. International Journal of Pharmaceutics. 517 (1-2), 403-412 (2017).
- Reitz, C., Kleinebudde, P. Solid lipid extrusion of sustained release dosage forms. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 67 (2), 440-448 (2007).
- Salar-Behzadi, S., Corzo, C., Schaden, L., Laggner, P., Zimmer, A. Correlation between the solid state of lipid coating and release profile of API from hot melt coated microcapsules. International Journal of Pharmaceutics. 565, 569-578 (2019).
- Windbergs, M., Gueres, S., Strachan, C. J., Kleinebudde, P. Two-step solid lipid extrusion as a process to modify dissolution behavior. AAPS PharmSciTech. 11 (1), 2-8 (2010).
- Schertel, S., Salar-Behzadi, S., Zimmer, A. Impact of surface properties of core material on the stability of hot melt-coated multiparticulate systems. Pharmaceutics. 13 (3), 366 (2021).
- Tang, D., Marangoni, A. G. Microstructure and fractal analysis of fat crystal networks. Journal of the American Oil Chemists' Society. 83, 377-388 (2006).
- Corzo, C., et al. Lipid-microparticles for pulmonary delivery of active pharmaceutical ingredients: Impact of lipid crystallization on spray-drying processability. International Journal of Pharmaceutics. 610, 121259 (2021).
- Acevedo, N. C. Characterization of the nanostructure of triacylglycerol crystal networks. Structure-Function Analysis of Edible Fats. Marangoni, A. G. , AOCS Press. Urbana, USA. (2012).
- Marangoni, A. G.
- Sato, K. Crystallization of lipids. Fundamentals and Applications in Food, Cosmetics, and Pharmaceuticals. Sato, K. , Wiley. Blackwell, NJ, USA. (2018).
- Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Toward nanoscale engineering of triacylglycerol crystal networks. Crystal Growth and Design. 10 (8), 3334-3339 (2010).
- Lopes, D. G., et al. Role of lipid blooming and crystallite size in the performance of highly soluble drug-loaded microcapsules. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (12), 4257-4265 (2015).
- Salar-Behzadi, S., et al. Novel approach for overcoming the stability challenges of lipid-based excipients. Part 2: Application of polyglycerol esters of fatty acids as hot melt coating excipients. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 148, 107-117 (2020).
- Corzo, C., Meindl, C., Lochmann, D., Reyer, S., Salar-Behzadi, S. Novel approach for overcoming the stability challenges of lipid-based excipients. Part 3: Application of polyglycerol esters of fatty acids for the next generation of solid lipid nanoparticles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 152, 44-55 (2020).
- Tylor, A. K. Glyceryl monostearate. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Quinn, M. E. , Pharmaceutical Press and American Pharmacists Association. UK, USA. 290-293 (2009).
- Lutton, R. S., Jackson, F. L. The polymorphism of 1- monostearin and 1-monopalmitin. Journal of the American Chemical Society. 70 (7), 2445-2449 (1948).
- Fang, W., Mayama, H., Tsujii, K. Spontaneous formation of fractal structures on triglyceride surfaces with reference to their super water-repellent properties. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (3), 564-571 (2007).
- Maleky, F., Marangoni, A. Nanoscale effects on oil migration through triacylglycerol polycrystalline colloidal networks. Soft Matter. 7, 6012-6024 (2011).
- Corzo, C., et al. Novel approach for overcoming the stability challenges of lipid-based excipients. Part 1: Screening of solid-state and physical properties of polyglycerol esters of fatty acids as advanced pharmaceutical excipients. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 148, 134-147 (2020).
- Gordillo-Galeano, A., Mora-Huertas, C. E. Solid lipid nanoparticles and nanostructured lipid carriers: A review emphasizing on particle structure and drug release. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 133, 285-308 (2018).
- Fan, Y., Marioli, M., Zhang, K. Analytical characterization of liposomes and other lipid nanoparticles for drug delivery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 192, 113642 (2021).
- Peyronel, F., Pink, D. A., Marangoni, A. G. Triglyceride nanocrystal aggregation into polycrystalline colloidal networks: Ultra-small angle X-ray scattering, models and computer simulation. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 19 (5), 459-470 (2014).
- Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Functionalization of non-interesterified mixtures of fully hydrogenated fats using shear processing. Food and Bioprocess Technology. 7 (2), 575-587 (2014).
- Dong, Y. D., Boyd, B. J. Applications of X-ray scattering in pharmaceutical science. International Journal of Pharmaceutics. 417 (1-2), 101-111 (2011).
- Di Cola, E., Grillo, I., Ristori, S. Small angle X-ray and neutron scattering: Powerful tools for studying the structure of drug-loaded liposomes. Pharmaceutics. 8 (2), 10 (2016).
- Lopez, C., Lesieur, P., Bourgaux, C., Ollivin, M. Thermal and structural behavior of anhydrous milk fat. 3. Influence of cooling rate. Journal of Dairy Science. 88 (2), 511-526 (2005).
- Kalnin, D., Garnaud, G., Amenitsch, H. Ollivon. Monitoring fat crystallization in aerated food emulsions by combined DSC and time-resolved synchrotron X-ray diffraction. Food Research International. 35 (10), 927-934 (2002).
- Bugeat, S., et al. Unsaturated fatty acid enriched vs. control milk triacylglycerols: Solid and liquid TAG phases examined by Synchrotron radian X-ray diffraction coupled with DSC. Food Research International. 67, 91-101 (2015).
- Brubach, J. B., et al. Structural and thermal characterization of glyceryl behenate by X-ray diffraction coupled to differential calorimetry and infrared spectroscopy. International Journal of Pharmaceutics. 336 (2), 248-256 (2007).
- Chong, C. L., et al. Thermal and structural behaviour of crude palm oil: Crystallisation at very low cooling rate. European Journal of Lipid Science and Technology. 109 (4), 410-421 (2007).
- Askin, S., et al. A simultaneous differential scanning calorimetry-X-ray diffraction study of olanzapine crystallization from amorphous solid dispersions. Molecular Pharmaceutics. 17 (11), 4364-4374 (2020).
- Clout, A., et al. Simultaneous differential scanning calorimetry - synchrotron X-ray powder diffraction: A powerful technique for physical form characterization in pharmaceutical materials. Analytical Chemistry. 88 (20), 10111-10117 (2016).
- Jendrzejewska, I., Goryczka, T., Pietrasik, E., Klimontko, J., Jampilek, J. X-ray and thermal analysis of selected drugs containing acetaminophen. Molecules. 25 (24), 5909 (2020).
- Righetti, M. C. Crystallization of Polymers Investigated by Temperature-Modulated DSC. Materials. 10 (4), 442 (2017).
- Sauer, B. B., Kampert, W. G., Neal Blanchard, E., Threefoot, S. A., Hsiao, B. S. Temperature modulated DSC studies of melting and crystallization in polymers exhibiting multiple endotherms. Polymer. 41 (3), 1099-1108 (2000).
- Ali, F., Kumar, R., Lal Sahu, P., Singh, G. N. Physicochemical characterization and compatibility study of roflumilast with various pharmaceutical excipients. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 130, 1627-1641 (2017).
