Summary
Nous avons développé un microscope holographique à deux photons capable de visualiser, d’évaluer et de manipuler l’activité neuronale en utilisant une résolution spatio-temporelle élevée, dans le but d’élucider la pathogenèse des troubles neuropsychiatriques associés à une activité neuronale anormale.
Abstract
Les progrès récents de la bioimagerie optique et de l’optogénétique ont permis la visualisation et la manipulation de phénomènes biologiques, y compris les activités cellulaires, chez les animaux vivants. Dans le domaine des neurosciences, une activité neuronale détaillée liée aux fonctions cérébrales, telles que l’apprentissage et la mémoire, a maintenant été révélée, et il est devenu possible de manipuler artificiellement cette activité pour exprimer les fonctions cérébrales. Cependant, l’évaluation conventionnelle de l’activité neuronale par imagerie à deux photons Ca2+ pose le problème de la faible résolution temporelle. En outre, la manipulation de l’activité neuronale par l’optogénétique conventionnelle à travers la fibre optique ne peut réguler simultanément l’activité des neurones ayant le même bagage génétique, ce qui rend difficile le contrôle de l’activité des neurones individuels. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment développé un microscope à haute résolution spatio-temporelle pour des applications biologiques en combinant l’optogénétique avec une technologie holographique numérique capable de modifier les faisceaux laser infrarouges femtosecondes. Ici, nous décrivons les protocoles de visualisation, d’évaluation et de manipulation de l’activité neuronale, y compris la préparation d’échantillons et le fonctionnement d’un microscope holographique à deux photons (Figure 1). Ces protocoles fournissent des informations spatio-temporelles précises sur l’activité neuronale, ce qui peut être utile pour élucider la pathogenèse des troubles neuropsychiatriques qui conduisent à des anomalies de l’activité neuronale.
Introduction
L’imagerie à deux photons Ca2+ est une technique utile pour l’évaluation de l’activité neuronale. Il peut être utilisé pour identifier non seulement l’activité neuronale requise pour le comportement et la mémoire chez les animaux normaux1,2 mais aussi une activité neuronale anormale qui se produit dans des modèles murins de troubles neuropsychiatriques 3,4. La technique a été utilisée pour élucider la base neuronale des fonctions cérébrales. Cependant, bien qu’il puisse fournir des images à haute résolution et de haute qualité, sa résolution temporelle est inférieure à celle de la méthode électrophysiologique 1,3.
L’optogénétique a contribué à innover dans la façon dont les neuroscientifiques comprennent le fonctionnement du cerveau5. Compte tenu des limites techniques, la majorité de la recherche optogénétique a utilisé des schémas d’activation à faible résolution spatiale, limitant ainsi les types de manipulations de l’activité neuronale pouvant être effectuées en conséquence. Cependant, la manipulation de l’activité neuronale à des échelles spatio-temporelles plus fines peut potentiellement être utile pour une compréhension plus complète du calcul neuronal et de la pathogenèse des troubles neuropsychiatriques. La technologie holographique spatialement précise qui peut façonner des faisceaux laser femtosecondes dans le proche infrarouge promet de surmonter ce défi et ouvre plusieurs nouvelles classes expérimentales qui étaient auparavant impossibles 6,7. Cette technologie permet aux neuroscientifiques de découvrir les aspects fondamentaux et les pathologies des codes neuronaux sensoriels, cognitifs et comportementaux qui étaient hors de portée.
La projection holographique implique la génération de modèles lumineux souhaités pour accéder sélectivement aux cellules individuelles et aux réseaux fonctionnels. Les expériences in vivo nécessitent une transmission optimale de la lumière aux cellules cibles du cerveau vivant. La lumière infrarouge pénètre plus profondément dans les tissus vivants et peut être utilisée pour l’excitation non linéaire à deux photons (2PE)8,9,10. Ainsi, la microscopie holographique à deux photons, qui combine la projection holographique et la 2PE, peut être utilisée pour évaluer et manipuler les activités neuronales afin de sonder les réseaux cellulaires et fonctionnels in vivo. Les applications biologiques récentes de la microscopie holographique à deux photons ont élucidé l’activité neuronale et les circuits nécessaires à l’apprentissage dans le cortex visuel 11,12, le bulbe olfactif13 et l’hippocampe14.
De nombreux laboratoires du monde entier ont rapporté des résultats et des améliorations passionnants en utilisant leurs systèmes de stimulation holographique 15,16,17,18,19,20,21,22,23. Dans le système décrit ici, le système de stimulation holographique peut être construit comme un dispositif complémentaire pour un microscope conventionnel. Le modulateur de lumière spatiale (SLM) est le dispositif clé pour moduler un front d’onde plan à n’importe quelle forme, et l’effet d’interférence est utilisé pour contrôler l’intensité et l’emplacement des foyers. La figure 2 montre la stimulation holographique et l’imagerie des trajets de la lumière. Le premier chemin lumineux est destiné au mode d’imagerie ponctuelle et se compose d’une tête de balayage et de détecteurs d’images. Le deuxième chemin de lumière est destiné à la stimulation holographique avec une longueur d’onde de 1040 nm et consiste en un SLM1. Le troisième chemin lumineux est destiné à l’éclairage holographique avec une longueur d’onde de 920 nm et se compose d’un SLM2 et d’un capteur d’image. Le mode d’imagerie holographique peut enregistrer les intensités de plusieurs régions d’intérêt en éclairant plusieurs points de l’échantillon. De cette façon, la vitesse d’enregistrement peut être augmentée à quelques centaines d’images par seconde. Pour réaliser l’imagerie par balayage ponctuel ou l’imagerie d’illumination holographique, le laser 920 nm a été divisé en deux chemins par un séparateur de faisceau avec un rapport fixe de 3:7. Tous les éléments optiques ont été alignés sur une breadboard optique de dimensions de 600 mm × 600 mm. La lumière modulée est entrée par le port lumineux sur le côté du corps microscopique, tandis que la lumière d’imagerie à balayage ponctuel est entrée par la tête de balayage au sommet du corps microscopique. Ces lumières ont été intégrées juste au-dessus de la lentille de l’objectif et ont créé des foyers dans le plan d’échantillonnage. De plus, le logiciel sur mesure a permis au flux de travail régulier d’être simple et cohérent.
Dans cet article, un protocole complet est présenté pour l’utilisation de la stimulation holographique ou de l’illumination pour mesurer l’activité neuronale et évaluer la connectivité fonctionnelle entre les neurones. À des fins de démonstration, nous décrivons ici une chirurgie cérébrale ciblant la zone des membres postérieurs du cortex somatosensoriel primaire (S1HL) du cerveau de la souris et une méthode pour évaluer et manipuler l’activité neuronale à l’aide de la microscopie holographique à deux photons. La procédure expérimentale est divisée en quatre parties. Tout d’abord, la plaque de tête a été fixée au crâne de la souris à l’aide de ciment dentaire. Deuxièmement, un vecteur viral exprimant jGCaMP8f ou GCaMP6m-P2A-ChRmine a été injecté stéréotaxiquement dans le S1HL. Troisièmement, le système de stimulation holographique ou d’éclairage a été calibré. Quatrièmement, après récupération postopératoire et expression de ces deux protéines, l’imagerie in vivo Ca2+ a été réalisée pour évaluer l’activité neuronale et la connectivité fonctionnelle entre les neurones avec la microscopie holographique à deux photons.
Protocol
Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par les comités de soin et d’utilisation des animaux de la Graduate School of Medicine de l’Université de Nagoya (numéro d’approbation : M220295-003).
1. Implantation de la plaque de tête (figure 1A)
- Administrer l’anesthésique (un mélange de 74 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine) par voie intrapéritonéale pour anesthésier la souris. Vérifiez fréquemment l’état anesthésique de la souris en évaluant les réflexes de pédale.
- Après l’anesthésie, placez la souris dans un instrument stéréotaxique. Appliquez une pommade oculaire (voir le tableau des matières) pour empêcher la cornée de se dessécher lorsque la plaque frontale est implantée.
- Rasez la zone chirurgicale et désinfectez la peau avec trois cycles alternés de gommages à la povidone iodée ou à la chlorhexidine, suivis de lingettes alcoolisées à 70%. Exposez soigneusement le crâne et nettoyez-le avec des cotons-tiges.
REMARQUE: Tous les instruments chirurgicaux doivent être stérilisés et toutes les procédures doivent être effectuées en conséquence. Tout débris restant (p. ex. cheveux ou sang séché) provoque des réactions inflammatoires. Par conséquent, tous les débris doivent être enlevés sous un stéréoscope à l’aide de coton-tiges humidifiés avec de l’eau stérile ou de l’alcool à 70%. - Utilisez les coordonnées stéréotaxiques - antérieure et postérieure = 0,5 mm, médiale et latérale = 1,5 mm du bregma - pour trouver le centre de la craniotomie et l’étiqueter avec un marqueur.
- Placez une plaque de tête sur mesure au centre du crâne. Ensuite, appliquez du ciment dentaire (voir le tableau des matériaux) pour le fixer fermement au crâne. Appliquez une légère pression jusqu’à ce que la plaque de tête entre en contact ferme avec l’avant et l’arrière du crâne.
REMARQUE: Cette étape prend environ 20 minutes et est essentielle pour réduire les artefacts de mouvement dans le cerveau pendant l’imagerie à deux photons. Les dimensions de la plaque de tête sont de 20 mm × 40 mm × 1 mm avec une ouverture en forme de plaque d’accueil avec un bord de 15 mm de long, deux côtés adjacents de 3 mm de long et les deux autres côtés de 10 mm de long. - Mélangez ensemble un ciment de résine adhésive dentaire à base d’acrylique comme suit : une demi-cuillère de poudre, trois gouttes de liquide et une goutte de catalyseur (voir le tableau des matériaux). Pour éviter le séchage, appliquez ce ciment de résine adhésive dentaire mixte sur la surface intacte du crâne de la souris avec la plaque de tête.
- Placez la souris dans une cage chaude jusqu’à ce qu’elle se soit remise de l’anesthésie. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris suffisamment conscience pour maintenir la position couchée sternale.
2. Chirurgie et injection de virus adéno-associés (AAV) (Figure 1B)
- Effectuer une craniotomie ou une injection virale sans retirer le ciment de résine adhésive dentaire du crâne 1 jour après l’implantation de la plaque de tête.
NOTE: Administrer une anesthésie (un mélange de 74 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine) par voie intrapéritonéale à la souris au cours de cette procédure. - Pour éviter l’œdème cérébral, administrer du phosphate de sodium de dexaméthasone (1,32 mg/kg) par voie intrapéritonéale 1 h avant la chirurgie.
- Anesthésiez la souris avec la plaque de tête avec une anesthésie à l’isoflurane à 1% à l’aide d’un vaporisateur (système d’administration d’anesthésie) tout en maintenant la température corporelle avec un coussin chauffant. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir le dessèchement de la cornée.
- Sous un stéréoscope, effectuer une craniotomie circulaire d’environ 2 mm de diamètre à l’aide d’une perceuse dentaire. Pour réduire les lésions cérébrales, utilisez la perceuse dentaire avec précaution avec un léger mouvement constant et une légère pression vers le bas.
- Enlevez les fragments d’os plusieurs fois à l’aide d’un système d’aspiration. Après avoir retiré les fragments d’os, utilisez une solution de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour enlever et laver tous les débris restant à la surface du cerveau. Répétez cette procédure de nettoyage plusieurs fois pour supprimer les réactions inflammatoires.
REMARQUE : La solution ACSF (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 2,0 mM CaCl 2 et 1,0 mM MgCl2) a été conservée à 4 °C pendant 1 mois après la dissolution et la filtration du réactif (taille des pores = 0,22 μm). - À l’aide d’un système d’injection sous pression (voir le tableau des matériaux), régler la pression appropriée (environ 10 PSI dans les impulsions d’une durée de 4 ms) pour injecter 500 nL de solution AAV à travers un capillaire en verre d’un diamètre de pointe de 10 à 20 μm (préparé avec un extracteur de micropipettes) pendant 10 min.
- Déterminez si la solution AAV est administrée au cerveau en vérifiant si le niveau de la solution AAV dans le capillaire en verre diminue progressivement.
- Laissez le capillaire en verre en place pendant 10 minutes supplémentaires pour éviter le refoulement. Répétez trois fois pour administrer un total de 1,5 μL de solution AAV dans le cerveau.
- Pour évaluer et manipuler l’activité neuronale dans les cellules pyramidales de couche 2/3 (L2/3), injecter une solution AAV (pour l’imagerie Ca 2+ : AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE à 1,28 × 10 14 génomes vectoriels / mL, dilué 1:1 dans une solution saline; pour l’imagerie Ca2+ avec optogénétique: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE à 1,73 ×10 14 génomes vectoriels / mL, dilué 1:1 dans une solution saline) dans la zone de la patte postérieure du cortex somatosensoriel primaire de souris de type sauvage (S1, centré à 0,5 mm en arrière et à 1,5 mm latéral du bregma, à 150 μm de profondeur de la surface).
REMARQUE: La solution AAV doit être injectée à 2-3 semaines et 1-2 semaines avant l’imagerie pour l’expression de jGCaMP8f et GCaMP6m-P2A-ChRmine, respectivement. - Après une application de 2 % (p/v) d’agarose à bas point de fusion sur la surface du cerveau de S1 à l’aide d’une micropipette, placer une fenêtre en verre sur la craniotomie avec deux verres de couverture. Fixez les deux verres de couverture (petit diamètre 2,0 mm et grand 4,5 mm de diamètre; voir le tableau des matériaux) avec un adhésif durcissable aux UV.
- Pressez le verre de couverture contre l’agarose alors qu’elle est encore liquide; Cela empêche la formation de bulles d’air dans l’agarose. Scellez les bords de la fenêtre crânienne avec du ciment de résine dentaire et adhésive (figure 1C).
- Retirez la souris de l’instrument stéréotaxique et remettez-la dans sa cage. Placez la souris dans une cage chaude et ne retournez pas dans la cage avec d’autres animaux avant qu’elle ne se soit complètement remise de l’anesthésie. Maintenez soigneusement les conditions stériles pendant la chirurgie de survie.
- Pendant les 72 premières heures après la chirurgie, vérifiez l’état de santé de la souris en observant le comportement général. S’il y a des anomalies dans le comportement général, injecter par voie sous-cutanée des agents anti-inflammatoires et analgésiques.
3. Préparation du système de stimulation ou d’éclairage holographique (Figure 3)
- Calibrer le système de stimulation holographique en plaçant la surface d’une lame de fluorescence rouge (substrat acrylique coulé) sur le plan d’échantillonnage. Placez le microscope en mode d’imagerie en direct avec une faible lumière d’excitation et exécutez le fichier calibration_GUI.m. Vérifiez le volet des paramètres et cliquez sur le bouton Enregistrer .
- Cliquez sur le bouton Z Scan dans le volet de l’étape 1. Il générera automatiquement trois points aléatoires dans les 21 plans axiaux, à 2 μm de distance de chaque plan.
- Déplacez la barre de défilement et vérifiez l’image en direct. Trouvez un plan parfait où les taches apparaissent les plus petites et les plus lumineuses, puis cliquez sur le bouton Enregistrer . Cela générera automatiquement un front d’onde sphérique décalé pour l’hologramme numérique.
Remarque : Si vous ne parvenez pas à trouver les taches de fluorescence les plus brillantes, modifiez les valeurs minimale et maximale de la plage de balayage et réessayez. - Cliquez sur le bouton OK dans le volet de l’étape 2, puis cliquez sur six emplacements sur le carré de gauche. Vérifiez l’image en direct. S’il y a six taches de fluorescence distinctes, tapez leurs axes x et y dans les zones d’édition et cliquez sur le bouton Enregistrer . Cela générera automatiquement des coefficients de transformation affine pour coordonner l’étalonnage entre la stimulation holographique et le système d’imagerie.
REMARQUE : Le numéro de la paire d’axes et le numéro du point cliqué doivent correspondre dans l’ordre. Si vous n’êtes pas sûr, ou s’il n’y a pas de taches dans votre image, veuillez réessayer et générer un motif de points unique ou choisir une plage plus petite autour du centre du champ de vision (FOV). - Cliquez sur le bouton Analyser dans le volet de l’étape 3. Il générera 441 hologrammes numériques pour effectuer un balayage ponctuel à travers le champ de vision en 21 × 21 étapes.
- Tout d’abord, vérifiez les images tout en modifiant les motifs dans la zone de liste. Ensuite, réglez la puissance laser pour obtenir des images ponctuelles dans la plage dynamique de l’appareil d’imagerie (par exemple, pour éviter les images trop saturées).
- Par la suite, ajustez l’intervalle de temps dans la zone d’édition; Le temps d’intervalle doit être supérieur à deux fois le temps d’intervalle d’enregistrement. Enfin, mettez le périphérique d’imagerie en mode d’enregistrement et cliquez sur le bouton Lecture . Si la lecture se termine, il y aura des chaînes « display OK » affichées dans la fenêtre de commande. Arrêtez l’enregistrement et empilez les images séquentielles enregistrées à l’aide de la méthode de l’intensité maximale.
- Cliquez sur Générer WM dans le volet de l’étape 4 et choisissez une image empilée ci-dessus. Fermez ensuite la fenêtre calibration_GUI. Il générera automatiquement une carte de poids pour compenser l’intensité déséquilibrée à chaque endroit.
NOTE: Pour une description plus détaillée, veuillez vous référer à 2; le code Matlab peut être téléchargé ici (https://github.com/ZenKG/SLM_control).
4. Imagerie Ca2+ à l’aide d’un capteur d’image avec éclairage holographique (Figure 4)
- Placez la souris injectée par AAV avec une plaque de tête sous le microscope (Figure 1D).
REMARQUE: Au cours de cette procédure, la souris est retenue dans l’état d’éveil, mais est capable d’échapper à des stimuli inconfortables. - Effectuer une imagerie à deux photons (mode de balayage ponctuel) à l’aide d’un microscope holographique et d’un laser Ti:saphir à mode verrouillé réglé sur 920 nm avec un objectif 25x (voir Tableau des matériaux).
- Activez le logiciel d’imagerie commercial (voir Tableau des matériaux). En mode d’imagerie en direct, réglez la tension du détecteur d’images (voir Tableau des matériaux) et la puissance du laser imageur pour optimiser la luminosité des neurones exprimant jGCaMP8f. Capturez des images des neurones exprimant cette protéine.
REMARQUE: L’intensité du laser d’imagerie (920 nm) est de 20-30 mW. Le champ de vision était de 512 μm × 512 μm à une profondeur de 100-150 μm de la surface corticale. - Pour illuminer des neurones spécifiques exprimant jGCaMP8f avec une illumination holographique, exécutez le fichier de script SLMcontrol.m. Cliquez sur l’image de référence et choisissez l’image acquise ci-dessus. Cliquez ensuite sur le bouton Spot pour choisir des pixels spécifiques sur les neurones de l’image en cliquant continuellement sur la souris (Figure 4A). Si la sélection est terminée, appuyez sur le bouton Entrée du clavier pour la finaliser.
REMARQUE: L’hologramme numérique est automatiquement calculé et affiché sur le SLM. Ce modèle peut également être revisité en cliquant sur une zone de liste. La résolution spatiale d’un seul point généré par le SLM était d’environ 1,2 μm le long de la direction transversale et de ~8,3 μm le long de l’axe optique. Nous avons utilisé une lentille d’objectif à grande ouverture numérique (1.1) pour obtenir une stimulation holographique plus localisée. Le tableau 1 résume les rapports précédents et ce système en ce qui concerne la résolution spatiale de la stimulation holographique. - Pour détecter l’activité neuronale avec une résolution temporelle élevée à l’aide d’un capteur d’image (voir le tableau des matériaux), définissez le temps d’exposition, la zone d’imagerie et le regroupement (Figure 4B) avant d’effectuer l’acquisition d’images (Figure 4C).
REMARQUE: L’intensité du laser d’illumination holographique (920 nm) qui stimule continuellement un neurone est de 2 mW, ce qui est suffisant pour détecter l’activité neuronale. Par exemple, pour atteindre une fréquence d’images de 100 Hz pour l’imagerie, le temps d’exposition est de 9 ms, la zone d’imagerie est de 400 μm × 400 μm et le regroupement est de 4. - Après l’expérience, remettez la souris dans sa cage d’origine.
5. Imagerie à deux photons (mode de balayage ponctuel) avec optogénétique à l’aide d’un microscope holographique (Figure 2)
- Répétez les étapes 4.1 et 4.2.
- Activez le logiciel d’imagerie commercial (voir Tableau des matériaux). En mode d’imagerie en direct, réglez la tension du détecteur d’images (voir Tableau des matériaux) et la puissance du laser imageur pour optimiser la luminosité des neurones exprimant GCaMP6m-P2A-ChRmine. Capturez des images des neurones exprimant ces protéines (Figure 1E).
- Répétez l’étape 4.4.
- Pour étudier la connectivité fonctionnelle dans les neurones L2/3, utilisez un SLM pour générer des modèles holographiques de stimulation optogénétique (ChRmine; 1 040 nm) et combinez-le avec l’imagerie Ca 2+ à deux photons (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 pixels, 2 Hz ou 30 Hz, zoom numérique2x, mode de balayage ponctuel; Figure 4D-H).
- Pour ce protocole, réglez l’intensité du laser imageur à 920 nm, à 10-20 mW, et le champ de vision à 256 μm × 256 μm mesuré à une profondeur de 100-150 μm de la surface corticale. Définissez le temps de séjour des pixels sur 1,5 μs pour 2 Hz ou 100 ns pour 30 Hz.
- Pour voir si un seul stimulus holographique a provoqué une réponse calcique dans les neurones, utilisez à la fois 2 Hz et 30 Hz comme fréquence d’images d’imagerie. Régler l’intensité du laser de stimulation holographique (1 040 nm) qui stimule un seul neurone à 10 mW, ce qui est suffisant pour induire une activité neuronale (Figure 4D).
NOTE: La résolution spatiale d’un seul point généré par le SLM est d’environ 1,2 μm le long de la direction transversale et ~8,3 μm le long de l’axe optique. La gamme de volume accessible dans le sens latéral est d’environ 500 μm × 500 μm et 100 μm dans le sens axial. Nous avons également confirmé avec l’imagerie Ca2+ à une fréquence d’imagerie de 2 Hz ou 30 Hz que non seulement un neurone, mais plusieurs neurones peuvent être stimulés holographiquement simultanément (Figure 4E).
- Effectuez l’acquisition d’images avec le protocole suivant : imagez simultanément la réponse Ca2+ à 920 nm avec 10 stimuli holographiques à 1 040 nm avec des intervalles de 8 s (0,125 Hz) pendant une durée de 50 ms après une période de référence de 10 s. Une fois toutes les expériences terminées, les souris sont euthanasiées.
REMARQUE : Les transitoires de Ca2+, s’ils sont présents, ont été évoqués par stimulation holographique, leur pic apparaissant dans les 1 s suivant la stimulation (Figure 4F-H).
6. Analyse d’images et évaluation de la connectivité fonctionnelle (Figure 4)
- Ouvrez les images brutes enregistrées aux étapes 4.5 ou 5.5 à l’aide d’ImageJ. Pour compenser le déplacement du plan focal, utilisez le plug-in ImageJ TurboReg.
REMARQUE: Si la correction avec TurboReg n’est pas suffisante, il est recommandé d’utiliser CaImAn (http://github.com/simonsfoundation) pour corriger le déplacement du plan focal. - Pour évaluer l’activité neuronale, déterminez les régions d’intérêt (ROI) en L2/3 à l’aide d’un algorithme automatisé (CaImAn). Détecter et analyser les transitoires Ca2+ après avoir défini l’intensité de fluorescence de base (F0) et la valeur seuil.
REMARQUE : F0 est la valeur du 35ecentile de l’intensité de fluorescence acquise au cours de la période d’imagerie de base. Les transitoires Ca2+ sont notés Δ F/F 0 (Δ F = F-F0), oùF est le signal de fluorescence instantané. Si la valeur Δ F est supérieure à 2 S.D. à partir de F0, nous évaluons un transitoire Ca2+ significatif. - Définir la connectivité fonctionnelle dans les neurones L2/3, stimuler les neurones cibles et mesurer les réponses GCaMP6m dans les neurones stimulés et environnants, en conséquence (Figure 4F-H).
Representative Results
Des enregistrements représentatifs obtenus à l’aide de la méthode décrite ici sont présentés. In vivo L’imagerie Ca2+ à l’aide de la microscopie holographique nécessite 2 à 4 semaines entre l’implantation de la plaque frontale et l’injection AAV et l’acquisition des données. Par conséquent, pour obtenir des résultats stables, il est important de réduire les artefacts de mouvement dans le cerveau. L’implantation de la plaque de tête (étape 1.5) et la mise en place de la fenêtre crânienne (étape 2.9) sont des étapes très importantes de ce processus. De plus, il est également important de choisir un AAV (AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1) qui exprime simultanément l’indicateur de calcium et l’opsine dans un seul neurone (étape 2.8).
La figure 4A montre un endroit pour l’illumination holographique d’une image de neurone acquise à l’aide d’un script MATLAB personnalisé. Si l’illumination holographique éclairait avec succès les neurones exprimant jGCaMP8f, des traces Ca2+ pourraient être obtenues avec un capteur d’image (Figure 4B), comme le montre la Figure 4C.
La connectivité fonctionnelle entre les neurones a été évaluée à l’aide de la stimulation holographique (Figure 4D), comme le montre la Figure 4E. Parce que la connectivité fonctionnelle entre les neurones est l’une des propriétés des circuits neuronaux qui est altérée dans la pathogenèse d’une souris modèle de douleur24, nous décrivons une procédure simple pour l’évaluer. La figure 4F montre une image typique des neurones L2/3 dans S1HL visualisée à l’aide de GCaMP6m. Lorsqu’un neurone (cercle orange) était stimulé holographiquement, un autre neurone (cercle rouge) était simultanément actif; ainsi, le nombre de connectivités fonctionnelles entre les neurones était de un (Figure 4G).
Figure 1 : Schéma de la procédure expérimentale. (A) Fixation de la plaque de tête au crâne. (B) Injection stéréotaxique d’AAV dans la région de la patte postérieure du cortex somatosensoriel primaire (S1HL). (C) Implantation de la fenêtre crânienne. Pour évaluer et manipuler l’activité neuronale, l’imagerie in vivo Ca2+ est réalisée chez des souris éveillées (D) avec stimulation holographique (E). Les marques de flash indiquent une stimulation ou un éclairage holographique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Système utilisé pour le microscope holographique. (A) Images des trajets lumineux holographiques de stimulation et d’illumination (à gauche) près du microscope (au milieu) avec un capteur d’image (à droite). (B) Il s’agit d’images agrandies de trajectoires lumineuses de stimulation holographique et d’illumination autour des SLM respectifs (gauche et droite) et d’un chemin de lumière de balayage ponctuel autour d’une tête de balayage (milieu et droite). (C) Un schéma des chemins optiques de stimulation et d’imagerie. Les SLM de phase uniquement sont utilisés pour afficher les hologrammes numériques, et un expanseur de faisceau (une combinaison de L1 et L2) et un système de relais 4f (une combinaison de L3 et L4 pour la stimulation holographique et L4 et L5 pour l’éclairage holographique) sont placés avant et après les SLM respectifs pour s’assurer que chaque hologramme numérique est imagé à la pupille de sortie d’un objectif d’immersion dans l’eau, avec une taille d’image légèrement sous-remplie. Pour supprimer les composants résiduels d’ordre zéro, un bloc de poutre est placé sur le plan intermédiaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Organigramme montrant comment calibrer le système de stimulation ou d’éclairage holographique. Cet organigramme décrit les étapes permettant d’étalonner un système de stimulation holographique ou d’éclairage à l’espace d’échantillonnage et au système d’imagerie. Veuillez consulter l’étape 3, préparation du système de stimulation holographique ou d’éclairage, pour obtenir des instructions détaillées et télécharger un exemple de programme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats représentatifs de l’imagerie et de la connectivité fonctionnelle à l’aide d’un microscope holographique. (A) Pour éclairer des neurones spécifiques exprimant jGCaMP8f ou GCaMP6m-P2A-ChRmine, l’image des neurones est capturée, puis une tache est formée sur le neurone à l’aide d’un script MATLAB personnalisé. (B) Le réglage du capteur d’image (temps d’exposition, zone d’imagerie et rangement). (C) Image représentative et traces de neurones exprimant jGCaMP8f en imagerie 100 Hz avec éclairage holographique et capteur d’image. (D) Ce graphique montre la réponse neuronale à la stimulation holographique (1 040 nm) à chaque puissance laser (données des neurones exprimant GCaMP6m-P2A-ChRmine à une fréquence d’imagerie de 2 Hz [n = 16]). Les barres d’erreur indiquent l’erreur type de la moyenne. (E) Traces représentatives de Ca2+ lors de la stimulation holographique (lignes verticales bleues) de 10 neurones différents à des fréquences d’imagerie de 2 Hz (à gauche) et 30 Hz (à droite). Dans les traces 2 Hz et 30 Hz Ca2+, la même couleur indique le même neurone. (F) Diagramme schématique évaluant les connexions fonctionnelles entre les neurones. Lorsque le neurone orange est stimulé, les neurones rouges répondent en même temps, indiquant qu’il existe une connectivité fonctionnelle entre ces neurones. (G) Une image typique des neurones S1HL exprimant GCaMP6m en WT. Barre d’échelle = 10 μm. (H) Traces typiques de Ca2+ lors de la stimulation holographique (lignes verticales bleues) à des fréquences d’imagerie de 2 Hz (supérieure) et 30 Hz (inférieure). Le neurone stimulé est entouré en orange, les neurones qui répondent sont entourés en rouge et les neurones non répondeurs sont entourés en gris. La réactivité neuronale à la stimulation holographique peut être détectée à des vitesses d’imagerie de 2 Hz et 30 Hz. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Notre configuration 6 | Prakash, R. et coll. 25 | Marshel, J. H. et coll. 12 | Robinson, N. T. M. et coll. 14 | |
| Résolution latérale | 1,2 μm | 1,27 μm | ― | 2,22 μm |
| Résolution axiale | 8,3 μm | 56,86 μm | 15,5 μm | 10,26 μm |
| Objectif / Ouverture numérique | 25x/1.1 | 20x/0,5 | 16x/0,8 | 16x/0,8 |
Tableau 1: Résumé des rapports précédents et de ce système pour la résolution spatiale de la stimulation holographique. La résolution latérale, la résolution axiale et la lentille d’objectif utilisée pendant la mesure sont décrites.
Discussion
Pour comprendre la fonction cérébrale, il est nécessaire d’évaluer avec précision les circuits neuronaux sous-jacents à la fonction cérébrale en extrayant la dynamique de l’activité neuronale. De plus, il est essentiel d’identifier comment ce circuit neuronal est modifié pour élucider la pathogenèse des troubles neuropsychiatriques. En effet, on sait que l’activité neuronale est élevée chez les modèles murins de la maladie d’Alzheimer4 et du syndrome de l’X fragile26 et chez les souris présentant une fonction de substance blanche altérée3. De plus, dans un modèle murin de douleur inflammatoire, une synchronisation accrue de l’activité neuronale et de la connectivité fonctionnelle entre les neurones est associée à des symptômes24. La microscopie holographique à deux photons nous permet d’observer simultanément l’activité des neurones individuels et les connexions fonctionnelles entre les neurones, ce qui est nécessaire pour comprendre les circuits neuronaux. Nous avons utilisé un objectif 25x avec une ouverture numérique = 1,1 avec des longueurs d’onde de 1 040 nm. La fonction théorique d’étalement ponctuel est une distribution gaussienne de pleine largeur à la moitié maximum de 0,5 μm latéralement et de 1,7 μm axialement. Cependant, l’ouverture numérique réelle est inférieure à 1,1 et la taille du point mesurée sur une bille de fluorescence est de 1,2 μm latéralement et de 8,3 μm axialement. Étant donné que le diamètre du neurone est d’environ 15 μm et que l’erreur d’étalonnage se situe à moins de 3 μm, le ciblage est généralement bon. Cependant, les cellules dans la direction axiale peuvent être affectées par la taille plus longue de la tache6. Ici, nous avons décrit l’injection virale, la chirurgie, l’étalonnage de systèmes de stimulation holographique ou d’éclairage, et les protocoles d’imagerie pour évaluer et manipuler l’activité neuronale chez des souris vivantes à l’aide de notre système de microscopie.
Il faut 2 à 4 semaines pour compléter toutes les procédures expérimentales, de l’implantation de la plaque frontale et de l’injection de virus à l’acquisition de données pour l’imagerie in vivo Ca2+ à l’aide de la microscopie holographique. Le processus est complexe et laborieux, et le succès final de l’expérience dépend de multiples facteurs, y compris l’état de la fenêtre crânienne, qui est affectée par l’inflammation postopératoire, le choix approprié de l’indicateur Ca2+ et de l’opsine, et si les artefacts de mouvement dans les images acquises peuvent être corrigés. En particulier, deux étapes sont importantes pour un résultat positif. Le premier concerne la fixation et la chirurgie de la plaque frontale; Il est crucial que la plaque de tête soit fermement fixée à la tête de la souris avec du ciment dentaire. En outre, il est important de nettoyer à plusieurs reprises les fragments d’os et le sang coagulé en utilisant ACSF froid pendant la chirurgie. Puisque l’adhésion à cette procédure réduit l’inflammation, nous avons observé avec succès la dynamique de la microglie, les cellules responsables du système immunitaire du cerveau, sans activer leurs processus et leurs épines ou les microstructures des neurones27,28. Le deuxième problème est l’évaluation et la manipulation de l’activité neuronale. Nous avons choisi AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 pour exprimer l’indicateur Ca2+ et l’opsine dans un neurone simultanément. En effet, il est difficile d’infecter efficacement un neurone avec différents types d’AAV. Une autre raison de ce choix était que ChRmine peut activer efficacement l’activité neuronale à 1 040 nm en utilisant un laser à deux photons12. Récemment, il a été rapporté que ChRmine, en mutant sa structure sur la base d’informations structurelles obtenues par cryo-microscopie électronique, améliore sa fonction29, qui est considérée comme utile pour l’analyse de la fonction cible dans le domaine des neurosciences. À la lumière de ces questions, il est nécessaire de partager des méthodes efficaces d’évaluation et de manipulation des neurones lors de la lecture de l’activité neuronale et de l’écriture d’informations à l’aide de la microscopie holographique.
Les progrès récents de l’imagerie et de l’optogénétique ont révélé l’activité neuronale détaillée impliquée dans les fonctions cérébrales telles que l’apprentissage et la mémoire, et il est possible de manipuler artificiellement cette activité neuronale pour exprimer les fonctions cérébrales30. Cependant, les méthodes conventionnelles de manipulation de l’activité neuronale sont très invasives en raison de l’insertion de fibres optiques dans le cerveau et parce qu’un groupe de cellules exprimant l’opsine est simultanément stimulé, ce qui rend impossible la manipulation de l’activité neuronale avec une précision temporelle et spatiale. Notre méthode peut manipuler l’activité neuronale en stimulant uniquement des neurones spécifiques dans le cerveau, permettant ainsi la manipulation de l’activité neuronale avec des modèles de stimulation spécifiques et une résolution spatio-temporelle élevée. En outre, il est important de noter que la connectivité fonctionnelle entre les neurones ne peut être évaluée que dans un petit nombre de neurones à l’aide d’expériences de coupe de cerveau31; Cependant, cette technique permet l’évaluation simultanée de plusieurs neurones chez des animaux vivants.
L’une des principales limites des microscopes holographiques actuels est la nécessité de fixer la tête de la souris, ce qui limite le comportement de la souris. Récemment, un microscope miniaturisé à deux photons a été développé32, et avec la miniaturisation supplémentaire du dispositif, l’imagerie in vivo Ca2+ avec stimulation holographique peut être possible chez des souris en mouvement libre. De plus, le potentiel de ce microscope pourrait être élargi en améliorant la résolution temporelle de l’imagerie et en la combinant avec des protéines fluorescentes sensibles à la tension33.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Grants-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (19H04753, 19H05219, et 25110732 à H. W.), Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (A) (20H05899 à H. W., 20H05886 à O. M., et 21H05587 à D. K.), Fostering Joint International Research (B) (20KK0170 à H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (18H02598 à H. W.), Subvention pour la recherche scientifique (A) (21H04663 à O. M.), subvention pour les scientifiques en début de carrière (20K15193 à X. Q.), JST CREST Grant Number JPMJCR1755, Japon, et JST A-STEP GRANT NUMBER JPMJTR204C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x Objective | Nikon | N25X-APO-MP | Objective |
| A1MP | Nikon | A1MP | Microscope |
| AnesII | Bio machinery | AnesII | Anesthesia delivery system |
| C2 plus | Nikon | C2 plus | Microscope |
| DECADRON Phosphate Injection | Aspen | 21N024 | Avoid cerebral edema |
| Dental Drill | Jota | C1.HP.005 | Dental drill |
| Electric Microinjector | NARISHIGE | IM-31 | Pressure injection system |
| FEATHERS | FEARGER | FA-10 | Shaving |
| G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER | GC | 2110271 | Resin cement primer for dental adhesion |
| G-CEM ONE neo | GC | 43093 | Resin cement for dental adhesion |
| Glass Capillary with Filament | NARISHIGE | GDC-1 | Glass capillary |
| Image Detector | Hamamatsu | H10770PA-40 | GaAsP photocathode photomultiplier tube |
| Imaging Software | Nikon | NISelements | Imaging software |
| Isoflurane Inhalation Solution | Pfizer | 229KAR | Anesthetics |
| iXon EMCCD Camera | Andor | iXon Life 888 | Image sensor |
| Ketamine | daiitisannkyou | s9-018506 | Anesthetics |
| Leica-M60 | Leica | M60 | Stereoscope |
| Linicon | Linicon | LV-125 | Vacuum pump |
| Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser | Coherent | Chameleon Discovery NX | Femtosecond laser |
| Mos-Cure | U-VIX | mini 365 | Portable LED UV Light Source |
| PEN Bright | SHOFU INC. | PEN Bright | Dental light curing unit |
| Puller | SUTTER instaument | P-97 | Puller |
| Stereotaxic Instrument (for Mice) | NARISHIGE | SR-6M-H | Stereotaxic instrument |
| Stereotaxic Micromanipulator | NARISHIGE | SM-15R | Stereotaxic micromanipulator |
| Super-Bond CATALYST V | SUN MEDICAL | 8070 | Dental adhesive resin cement |
| Super-Bond Dental Adhesive Monomer | SUN MEDICAL | 8071 | Dental adhesive monomer |
| Super-Bond Teeth Color Polymer Powder | SUN MEDICAL | 145052000 | Teeth color polymer powder |
| Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% | Santen Pharmaceutical | TRN3952 | Eye ointment |
| UlTIMATE XL | NSK | Y141446 | Dental laboratory micromotor control unit |
| UV Curing Optical Adhesives | THORLABS | NOA61 | UV Curing Optical Adhesives |
| Xylazine | Bayer | KP0F2BK | Anesthetics |
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