Summary
Мы разработали двухфотонный голографический микроскоп, который может визуализировать, оценивать и манипулировать нейронной активностью с использованием высокого пространственно-временного разрешения с целью выяснения патогенеза нервно-психических расстройств, связанных с аномальной нейронной активностью.
Abstract
Последние достижения в области оптической биовизуализации и оптогенетики позволили визуализировать и манипулировать биологическими явлениями, включая клеточную активность, у живых животных. В области нейробиологии в настоящее время выявлена детальная нейронная активность, связанная с функциями мозга, такими как обучение и память, и стало возможным искусственно манипулировать этой активностью для выражения функций мозга. Однако традиционная оценка нейронной активности с помощью двухфотонной визуализацииCa 2+ имеет проблему низкого временного разрешения. Кроме того, манипулирование нейронной активностью обычной оптогенетикой через оптическое волокно может только одновременно регулировать активность нейронов с одинаковым генетическим фоном, что затрудняет контроль активности отдельных нейронов. Чтобы решить эту проблему, мы недавно разработали микроскоп с высоким пространственно-временным разрешением для биологических применений, объединив оптогенетику с цифровой голографической технологией, которая может модифицировать фемтосекундные инфракрасные лазерные лучи. Здесь мы описываем протоколы визуализации, оценки и манипулирования нейронной активностью, включая подготовку образцов и работу двухфотонного голографического микроскопа (рис. 1). Эти протоколы предоставляют точную пространственно-временную информацию о нейронной активности, которая может быть полезна для выяснения патогенеза нервно-психических расстройств, которые приводят к аномалиям нейронной активности.
Introduction
Двухфотонная визуализация Ca2+ является полезным методом для оценки нейронной активности. Он может быть использован для идентификации не только нейронной активности, необходимой для поведения и памяти у нормальных животных1,2, но и аномальной активности нейронов, которая возникает в мышиных моделях нервно-психических расстройств 3,4. Этот метод был использован для выяснения нейронной основы функций мозга. Однако, хотя он может обеспечить высокое разрешение и высокое качество изображений, его временное разрешение ниже, чем у электрофизиологического метода 1,3.
Оптогенетика помогла внедрить инновации в понимание нейробиологами функций мозга5. Учитывая технические ограничения, в большинстве оптогенетических исследований использовались схемы активации с низким пространственным разрешением, что ограничивало типы манипуляций с нейронной активностью, которые могут быть выполнены соответствующим образом. Тем не менее, манипулирование нейронной активностью в более тонких пространственно-временных масштабах потенциально может быть полезно для более полного понимания нейронных вычислений и патогенеза нервно-психических расстройств. Пространственно точная голографическая технология, которая может формировать фемтосекундные лазерные лучи ближнего инфракрасного диапазона, обещает преодолеть эту проблему и открывает несколько новых экспериментальных классов, которые ранее были невозможны 6,7. Эта технология позволяет нейробиологам раскрыть фундаментальные аспекты и патологии сенсорных, когнитивных и поведенческих нейронных кодов, которые были вне досягаемости.
Голографическая проекция включает в себя генерацию желаемых световых паттернов для избирательного доступа к отдельным ячейкам и функциональным сетям. Эксперименты in vivo требуют оптимального пропускания света для клеток-мишеней в живом мозге. Инфракрасный свет проникает глубже в живую ткань и может быть использован для нелинейного двухфотонного возбуждения (2PE)8,9,10. Таким образом, двухфотонная голографическая микроскопия, сочетающая голографическую проекцию и 2PE, может быть использована для оценки и манипулирования нейронной активностью для исследования клеточных и функциональных сетей in vivo. Недавние биологические применения двухфотонной голографической микроскопии прояснили нейронную активность и схемы, необходимые для обучения в зрительной коре 11,12, обонятельной луковице13 и гиппокампе14.
Многочисленные лаборатории по всему миру сообщили о захватывающих результатах и улучшениях с использованием своих систем голографической стимуляции 15,16,17,18,19,20,21,22,23. В системе, описанной здесь, голографическая система стимуляции может быть построена как дополнительное устройство для обычного микроскопа. Фазовый пространственный модулятор света (SLM) является ключевым устройством для модуляции плоского волнового фронта любой формы, а интерференционный эффект используется для управления интенсивностью и расположением фокусов. На рисунке 2 показана голографическая стимуляция и визуализация световых путей. Первый световой тракт предназначен для режима визуализации с точечным сканированием и состоит из сканирующей головки и детекторов изображения. Второй световой путь предназначен для голографической стимуляции с длиной волны 1040 нм и состоит из SLM1. Третий световой тракт предназначен для голографической подсветки с длиной волны 920 нм и состоит из SLM2 и датчика изображения. Режим голографической визуализации может регистрировать интенсивность из нескольких областей интереса, освещая несколько точек в образце. Таким образом, скорость записи может быть увеличена до нескольких сотен кадров в секунду. Чтобы получить точечное сканирование или голографическое освещение, лазер с длиной волны 920 нм был разделен на два пути с помощью светоделителя с фиксированным соотношением 3:7. Все оптические элементы были выровнены на оптической макетной плате с размерами 600 мм × 600 мм. Модулированный свет проникал через световой порт на боковой стороне микроскопического тела, в то время как точечный сканирующий визуализирующий свет проникал через сканирующую головку в верхней части микроскопического тела. Эти огни были интегрированы чуть выше линзы объектива и создавали фокусы в плоскости образца. Кроме того, специально разработанное программное обеспечение позволило сделать обычный рабочий процесс простым и последовательным.
В этой статье представлен полный протокол использования голографической стимуляции или освещения для измерения нейронной активности и оценки функциональной связи между нейронами. В демонстрационных целях мы описываем здесь операцию на головном мозге, нацеленную на область задних конечностей первичной соматосенсорной коры (S1HL) мозга мыши, а также метод оценки и манипулирования нейронной активностью с использованием двухфотонной голографической микроскопии. Экспериментальная процедура разделена на четыре части. Сначала головная пластина была прикреплена к черепу мыши с помощью зубного цемента. Во-вторых, вирусный вектор, экспрессирующий jGCaMP8f или GCaMP6m-P2A-ChRmine, был стереотаксически введен в S1HL. В-третьих, была откалибрована голографическая система стимуляции или освещения. В-четвертых, после послеоперационного восстановления и экспрессии этих двух белков была выполнена визуализация in vivo Ca2+ для оценки нейронной активности и функциональной связи между нейронами с помощью двухфотонной голографической микроскопии.
Protocol
Все экспериментальные протоколы были одобрены комитетами по уходу за животными и их использованию Высшей школы медицины Нагойского университета (номер одобрения: M220295-003).
1. Имплантация пластины головы (рис. 1А)
- Вводите анестетик (смесь 74 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина) внутрибрюшинно, чтобы обезболить мышь. Часто проверяйте анестезиологический статус мыши, оценивая педальные рефлексы.
- После анестезии поместите мышь в стереотаксический инструмент. Нанесите глазную мазь (см. Таблицу материалов), чтобы предотвратить высыхание роговицы при имплантации головной пластины.
- Побрейте операционную область и продезинфицируйте кожу тремя чередующимися скрабами с повидон-йодом или хлоргексидином, а затем 70% спиртовыми салфетками. Аккуратно обнажите череп и очистите его ватными палочками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть стерилизованы, и все процедуры должны выполняться соответствующим образом. Любой оставшийся мусор (например, волосы или засохшая кровь) вызывает воспалительные реакции. Поэтому любой мусор следует удалять под стереоскопом с помощью ватных палочек, смоченных стерильной водой или 70% спиртом. - Используйте стереотаксические координаты — переднюю и заднюю = 0,5 мм, медиальную и латеральную = 1,5 мм от брегмы — чтобы найти центр трепанации черепа и обозначить его маркером.
- Поместите изготовленную на заказ головную пластину в центре черепа. Далее нанесите зубной цемент (см. Таблицу материалов), чтобы прочно зафиксировать его на черепе. Применяйте легкое давление до тех пор, пока головная пластина не вступит в плотный контакт с передней и задней частью черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает около 20 минут и имеет решающее значение для уменьшения артефактов движения в мозге во время двухфотонной визуализации. Размеры налобника составляют 20 мм × 40 мм × 1 мм с отверстием в форме домашней пластины с одним краем длиной 15 мм, двумя смежными сторонами длиной 3 мм и двумя оставшимися сторонами длиной 10 мм. - Смешайте цемент из стоматологической адгезивной смолы на акриловой основе следующим образом: половина ложки порошка, три капли жидкости и одна капля катализатора (см. Таблицу материалов). Чтобы предотвратить высыхание, нанесите этот смешанный стоматологический адгезивный смоляной цемент на неповрежденную поверхность черепа мыши с головной пластиной.
- Поместите мышь в теплую клетку, пока она не оправится от анестезии. Не оставляйте мышь без присмотра, пока она не придет в сознание настолько, чтобы поддерживать лежачее положение грудины.
2. Хирургическое вмешательство и инъекция аденоассоциированного вируса (AAV) (рис. 1B)
- Выполнить трепанацию черепа или вирусную инъекцию без удаления цемента из стоматологической адгезивной смолы из черепа через 1 день после имплантации пластины головы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой процедуры вводите мышам анестезию (смесь 74 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина) внутрибрюшинно мыши. - Чтобы избежать отека мозга, вводите дексаметазон натрия фосфат (1,32 мг / кг) внутрибрюшинно за 1 ч до операции.
- Обезболивают мышь с пластины головы 1% изофлурановой анестезией с помощью испарителя (системы доставки анестезии) при поддержании температуры тела с помощью грелки. Нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- Под стереоскопом выполните круговую трепанацию черепа диаметром примерно 2 мм с помощью бормашины. Чтобы уменьшить повреждение головного мозга, осторожно работайте с бормашиной с постоянным легким движением и легким давлением вниз.
- Удаляйте костные отломки несколько раз с помощью аспирационной системы. После удаления костных фрагментов используйте раствор искусственной спинномозговой жидкости (ACSF), чтобы удалить и промыть любой мусор, оставшийся на поверхности мозга. Повторите эту процедуру очистки несколько раз, чтобы подавить воспалительные реакции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор ACSF (140 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 5 мМ HEPES, 2,0 мМ CaCl2 и 1,0 мМ MgCl2) хранили при 4 °C в течение 1 месяца после растворения и фильтрации реагента (размер пор = 0,22 мкм). - Используя систему впрыска под давлением (см. Таблицу материалов), установите соответствующее давление (около 10 фунтов на квадратный дюйм в импульсах длительностью 4 мс) для введения 500 нл раствора AAV через стеклянный капилляр с диаметром наконечника 10-20 мкм (приготовленный с помощью съемника микропипетки) в течение 10 мин.
- Определите, вводится ли раствор AAV в мозг, проверив, снижается ли постепенно уровень раствора AAV в стеклянном капилляре.
- Оставьте стеклянный капилляр на месте еще на 10 минут, чтобы предотвратить обратный поток. Повторите три раза, чтобы ввести в мозг в общей сложности 1,5 мкл раствора AAV.
- Чтобы оценить и манипулировать нейронной активностью в пирамидных клетках слоя 2/3 (L2/3), введите раствор AAV (для визуализации Ca 2+: AAV2 / 1-Syn-jGCaMP8f-WPRE в концентрации 1,28 × 1014 векторных геномов / мл, разбавленный 1: 1 в физиологическом растворе; для визуализации Ca2+ с оптогенетикой: AAV2 / 8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE в 1,73 × 1014 векторных геномов / мл, разбавленный 1: 1 в физиологическом растворе) в область задней лапы первичной соматосенсорной коры мышей дикого типа (S1, центрирован на расстоянии 0,5 мм сзади и 1,5 мм сбоку от брегмы, на глубине 150 мкм от поверхности).
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор AAV следует вводить через 2-3 недели и 1-2 недели перед визуализацией для экспрессии jGCaMP8f и GCaMP6m-P2A-ChRmine соответственно. - После нанесения 2% (мас./об.) легкоплавкой агарозы на поверхность мозга S1 с помощью микропипетки поместите стеклянное окно над трепанацией черепа с двумя покровными стеклами. Прикрепите два покровных стекла (маленький диаметр 2,0 мм и большой диаметр 4,5 мм; см. Таблицу материалов) с помощью УФ-отверждаемого клея.
- Прижмите покровное стекло к агарозе, пока она еще жидкая; Это препятствует образованию пузырьков воздуха в агарозе. Запечатайте края черепного окна цементом из стоматологической и адгезивной смолы (рис. 1C).
- Извлеките мышь из стереотаксического инструмента и верните ее в клетку. Поместите мышь в теплую клетку и не возвращайтесь в клетку с другими животными, пока она полностью не оправится от анестезии. Тщательно поддерживайте стерильные условия во время операции по выживанию.
- В течение первых 72 ч после операции проверяйте состояние здоровья мыши, наблюдая за общим поведением. Если есть какие-либо отклонения в общем поведении, подкожно вводят противовоспалительные и обезболивающие средства.
3. Подготовка к голографической стимуляции или системе освещения (рис. 3)
- Откалибруйте голографическую систему стимуляции, поместив поверхность красного флуоресцентного предметного стекла (литая акриловая подложка) на плоскость образца. Переведите микроскоп в режим визуализации в реальном времени со слабым возбуждающим светом и запустите файл calibration_GUI.m. Проверьте панель параметров и нажмите кнопку Сохранить .
- Нажмите кнопку Z Scan на панели шага 1. Он автоматически сгенерирует три случайных пятна во всех 21 осевых плоскостях, на расстоянии 2 мкм от каждой плоскости.
- Переместите ползунок и проверьте живое изображение. Найдите идеальную плоскость, в которой пятна кажутся самыми маленькими и яркими, а затем нажмите кнопку « Сохранить ». Это автоматически сгенерирует смещенный сферический волновой фронт для цифровой голограммы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вам не удается найти самые яркие пятна флуоресценции, измените минимальное и максимальное значения диапазона сканирования и повторите попытку. - Нажмите кнопку «Перейти » на панели шага 2, а затем щелкните шесть точек в левом квадрате. Проверьте живое изображение. Если имеется шесть различимых пятен флуоресценции, введите их оси x и y в поля редактирования и нажмите кнопку «Сохранить ». Это автоматически сгенерирует коэффициенты аффинного преобразования для координации калибровки между голографической стимуляцией и системой визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Номер пары осей и номер выбранной точки должны совпадать по порядку. Если вы не уверены или на изображении нет пятен, попробуйте еще раз и создайте уникальный точечный узор или выберите меньший диапазон вокруг центра поля зрения (FOV). - Нажмите кнопку «Сканировать » на панели шага 3. Он сгенерирует 441 цифровую голограмму для выполнения одноточечного сканирования по полю зрения за 21 × 21 шаг.
- Во-первых, проверьте изображения при изменении шаблонов в списке. Затем отрегулируйте мощность лазера для получения точечных изображений в динамическом диапазоне устройства визуализации (например, чтобы избежать чрезмерно насыщенных изображений).
- Затем отрегулируйте интервальное время в поле редактирования; Интервальное время должно быть более чем в два раза больше времени интервала записи. Наконец, переведите устройство обработки изображений в режим записи и нажмите кнопку «Воспроизвести ». Если воспроизведение завершится, в командном окне отобразятся строки «Показать ОК». Остановите запись и сложите записанные последовательные изображения, используя метод максимальной интенсивности.
- Нажмите «Создать WM» на панели шага 4 и выберите изображение с наложением сверху. Затем закройте окно calibration_GUI. Он автоматически сгенерирует карту веса, чтобы компенсировать несбалансированную интенсивность в каждой точке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более подробного описания, пожалуйста, обратитесь к 2; код Matlab можно скачать здесь (https://github.com/ZenKG/SLM_control).
4. Визуализация Ca2+ с использованием датчика изображения с голографической подсветкой (рис. 4)
- Поместите мышь с инъекцией AAV с головной пластиной под микроскоп (рис. 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой процедуры мышь удерживается в бодрствующем состоянии, но может избежать неприятных раздражителей. - Выполните двухфотонную визуализацию (режим точечного сканирования) с помощью голографического микроскопа и Ti:сапфирового лазера с синхронизацией мод, настроенного на 920 нм, с 25-кратным объективом (см. Таблицу материалов).
- Включите коммерческое программное обеспечение для обработки изображений (см. Таблицу материалов). В режиме визуализации в реальном времени отрегулируйте напряжение детектора изображения (см. Таблицу материалов) и мощность лазера визуализации, чтобы оптимизировать яркость нейронов, экспрессирующих jGCaMP8f. Захватите изображения нейронов, экспрессирующих этот белок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность лазера визуализации (920 нм) составляет 20-30 мВт. Поле зрения составляло 512 мкм × 512 мкм на глубине 100-150 мкм от поверхности коры. - Чтобы осветить определенные нейроны, экспрессирующие jGCaMP8f, голографической подсветкой, запустите файл сценария SLMcontrol.m. Щелкните значок Эталонное изображение и выберите изображение, полученное выше. Затем нажмите кнопку «Пятно », чтобы выбрать определенные пиксели на нейронах на изображении, непрерывно щелкая мышью (рис. 4A). Если выбор завершен, нажмите кнопку Enter на клавиатуре, чтобы завершить его.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цифровая голограмма автоматически рассчитывается и отображается на SLM. К этому шаблону также можно вернуться, щелкнув список. Пространственное разрешение одного пятна, генерируемого SLM, составляло приблизительно 1,2 мкм вдоль поперечного направления и ~8,3 мкм вдоль оптической оси. Мы использовали линзу объектива с высокой числовой апертурой (1.1) для достижения более локализованной голографической стимуляции. В таблице 1 обобщены предыдущие отчеты и эта система в отношении пространственного разрешения голографической стимуляции. - Чтобы обнаружить нейронную активность с высоким временным разрешением с помощью датчика изображения (см. Таблицу материалов), установите время экспозиции, область изображения и биннинг (рис. 4B) перед получением изображения (рис. 4C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность голографического лазера подсветки (920 нм), который непрерывно стимулирует один нейрон, составляет 2 мВт, что достаточно для обнаружения нейронной активности. Например, для достижения частоты кадров 100 Гц для визуализации время экспозиции составляет 9 мс, область изображения — 400 мкм × 400 мкм, а биннинг — 4. - После эксперимента верните мышь в ее домашнюю клетку.
5. Двухфотонная визуализация (режим точечного сканирования) с оптогенетикой с использованием голографического микроскопа (рис. 2)
- Повторите шаги 4.1 и 4.2.
- Включите коммерческое программное обеспечение для обработки изображений (см. Таблицу материалов). В режиме визуализации в реальном времени отрегулируйте напряжение детектора изображения (см. Таблицу материалов) и мощность лазера визуализации, чтобы оптимизировать яркость нейронов, экспрессирующих GCaMP6m-P2A-ChRmine. Сделайте снимки нейронов, экспрессирующих эти белки (рис. 1E).
- Повторите шаг 4.4.
- Чтобы исследовать функциональную связность нейронов L2/3, используйте SLM для создания голографических паттернов оптогенетической стимуляции (ChRmine; 1,040 нм) и объедините его с двухфотонной визуализацией Ca2+ (GCaMP6m; 920 нм, 512 × 512 пикселей, 2 Гц или 30 Гц, 2-кратный цифровой зум, режим точечного сканирования; Рисунок 4D-H).
- Для этого протокола установите интенсивность лазера визуализации на 920 нм при 10-20 мВт и поле зрения как 256 мкм × 256 мкм, измеренное на глубине 100-150 мкм от поверхности коры. Установите время выдержки пикселя на уровне 1,5 мкс для 2 Гц или 100 нс для 30 Гц.
- Чтобы увидеть, вызвал ли один голографический стимул кальциевую реакцию в нейронах, используйте как 2 Гц, так и 30 Гц в качестве частоты кадров изображения. Установите интенсивность голографического стимулирующего лазера (1,040 нм), который стимулирует один нейрон, на уровне 10 мВт, что достаточно для индуцирования нейронной активности (рис. 4D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пространственное разрешение одного пятна, генерируемого SLM, составляет примерно 1,2 мкм вдоль поперечного направления и ~8,3 мкм вдоль оптической оси. Диапазон доступного объема в боковом направлении составляет от 500 мкм × 500 мкм и 100 мкм в осевом направлении. Кроме того, мы подтвердили с помощью визуализации Ca2+ с частотой кадров 2 Гц или 30 Гц, что не только один нейрон, но и несколько нейронов могут быть голографически стимулированы одновременно (рис. 4E).
- Выполняйте получение изображения по следующему протоколу: одновременно визуализируйте отклик Ca2+ на длине волны 920 нм с 10 голографическими стимулами на длине волны 1,040 нм с интервалом 8 с (0.125 Гц) в течение 50 мс после базового периода 10 с. После того, как все эксперименты завершены, мышей усыпляют.
ПРИМЕЧАНИЕ: Переходные процессы Ca2+, если они присутствуют, вызывались голографической стимуляцией, причем их пик появлялся в течение 1 с после стимуляции (рис. 4F-H).
6. Анализ изображений и оценка функциональной связности (рис. 4)
- Откройте необработанные изображения, сохраненные на шагах 4.5 или 5.5, с помощью ImageJ. Для компенсации смещения фокальной плоскости используйте подключаемый модуль ImageJ TurboReg.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если коррекция с помощью TurboReg недостаточна, рекомендуется использовать CaImAn (http://github.com/simonsfoundation) для коррекции смещения фокальной плоскости. - Чтобы оценить нейронную активность, определите области интереса (ROI) в L2/3 с помощью автоматизированного алгоритма (CaImAn). Обнаружение и анализ переходных процессов Ca2+ после определения базовой интенсивности флуоресценции (F0) и порогового значения.
ПРИМЕЧАНИЕ: F0 - это 35-е процентильное значение интенсивности флуоресценции, полученное в течение исходного периода визуализации. Переходные процессы Ca2+ обозначаются Δ F/F 0 (Δ F = F-F0), гдеF — мгновенный сигнал флуоресценции. Если значение Δ F превышает 2 S.D. от F0, мы оцениваем значимый переходный процесс Ca2+. - Чтобы определить функциональную связность в нейронах L2/3, стимулировать нейроны-мишени и соответственно измерить ответы GCaMP6m в стимулированных и окружающих нейронах (рис. 4F-H).
Representative Results
Представлены репрезентативные записи, полученные с помощью описанного здесь способа. В естественных условиях Визуализация Ca2+ с использованием голографической микроскопии занимает 2-4 недели от имплантации головной пластины и инъекции AAV до сбора данных. Поэтому для получения стабильных результатов важно уменьшить артефакты движения в головном мозге. Имплантация головной пластины (шаг 1.5) и установка черепного окна (шаг 2.9) являются очень важными этапами в этом процессе. Кроме того, также важно выбрать AAV (AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1), который одновременно экспрессирует индикатор кальция и опсин в одном нейроне (шаг 2.8).
На рисунке 4A показано место для голографического освещения полученного изображения нейрона с использованием специально разработанного сценария MATLAB. Если голографическое освещение успешно осветило нейроны, экспрессирующие jGCaMP8f, следы Ca2+ могут быть получены с помощью датчика изображения (рис. 4B), как показано на рисунке 4C.
Функциональная связь между нейронами оценивалась с помощью голографической стимуляции (рис. 4D), как показано на рисунке 4E. Поскольку функциональная связь между нейронами является одним из свойств нейронных схем, которое изменяется в патогенезе мыши с моделью боли24, мы описываем простую процедуру для ее оценки. На рисунке 4F показано типичное изображение нейронов L2/3 в S1HL, визуализированное с помощью GCaMP6m. Когда один нейрон (оранжевый круг) был голографически стимулирован, другой нейрон (красный круг) был одновременно активен; таким образом, количество функциональных связей между нейронами составляло единицу (рис. 4G).
Рисунок 1: Схематический план экспериментальной процедуры . (А) Фиксация пластины головы к черепу. (B) Стереотаксическая инъекция AAV в область задней лапы первичной соматосенсорной коры (S1HL). (C) Имплантация черепного окна. Для оценки нейронной активности и управления ею in vivo Ca2+ визуализация выполняется у бодрствующих мышей (D) с голографической стимуляцией (E). Следы вспышки указывают на голографическую стимуляцию или освещение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Система, используемая для голографического микроскопа. (A) Изображения световых путей голографической стимуляции и освещения (слева) рядом с микроскопом (посередине) с датчиком изображения (справа). (B) Это увеличенные изображения световых путей голографической стимуляции и освещения вокруг соответствующих SLM (слева и справа) и светового пути точечного сканирования вокруг сканирующей головки (посередине и справа). (C) Схема оптических путей стимуляции и визуализации. Для отображения цифровых голограмм используются только фазовые SLM, а расширитель луча (комбинация L1 и L2) и релейная система 4f (комбинация L3 и L4 для голографической стимуляции и L4 и L5 для голографического освещения) размещаются до и после соответствующих SLM, чтобы убедиться, что каждая цифровая голограмма отображается на выходном зрачке объектива с погружением в воду. с немного недозаполненным размером изображения. Для подавления остаточных составляющих нулевого порядка в промежуточной плоскости размещен лучевой блок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Блок-схема калибровки голографической системы стимуляции или освещения. На этой блок-схеме описаны этапы калибровки голографической системы стимуляции или освещения для пространства образца и системы визуализации. Пожалуйста, посетите шаг 3 «Подготовка к голографической стимуляции или системе освещения», чтобы получить подробные инструкции и загрузить образец программы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты визуализации и функциональной связи с использованием голографического микроскопа . (A) Чтобы осветить конкретные нейроны, экспрессирующие jGCaMP8f или GCaMP6m-P2A-ChRmine, изображение нейронов захватывается, а затем на нейроне формируется пятно с использованием специально разработанного сценария MATLAB. (B) Настройка датчика изображения (время экспозиции, область изображения и биннинг). (C) Репрезентативное изображение и следы нейронов, экспрессирующих jGCaMP8f, в визуализации с частотой 100 Гц с голографической подсветкой и датчиком изображения. (D) На этом графике показана нейронная реакция на голографическую стимуляцию (1,040 нм) при каждой мощности лазера (данные из GCaMP6m-P2A-ChRmine, экспрессирующих нейроны с частотой кадров изображения 2 Гц [n = 16]). Столбцы погрешности указывают на стандартную погрешность среднего значения. (E) Репрезентативные следы Ca2+ во время голографической стимуляции (синие вертикальные линии) 10 различных нейронов с частотой кадров 2 Гц (слева) и 30 Гц (справа). В следах Ca2+ с частотой 2 Гц и 30 Гц один и тот же цвет указывает на один и тот же нейрон. (F) Принципиальная схема, оценивающая функциональные связи между нейронами. Когда оранжевый нейрон стимулируется, красные нейроны реагируют одновременно, указывая на то, что между этими нейронами существует функциональная связь. (G) Типичное изображение нейронов S1HL, экспрессирующих GCaMP6m в WT. Масштабная линейка = 10 мкм. (H) Типичные следы Ca2+ во время голографической стимуляции (синие вертикальные линии) при частоте кадров изображения 2 Гц (верхняя) и 30 Гц (нижняя). Стимулированный нейрон обведен оранжевым цветом, реагирующие нейроны обведены красным, а неотвечающие нейроны обведены серым. Нейронная реакция на голографическую стимуляцию может быть обнаружена как на скоростях визуализации 2 Гц, так и на 30 Гц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Наша установка 6 | Пракаш, Р. и др. 25 | Marshel, J. H. et al. 12 | Робинсон, Н. Т. М. и др. 14 | |
| Боковое разрешение | 1,2 мкм | 1,27 мкм | ― | 2,22 мкм |
| Осевое разрешение | 8,3 мкм | 56,86 мкм | 15,5 мкм | 10.26 мкм |
| Объектив/числовая апертура | 25x/1.1 | 20х/0,5 | 16х/0,8 | 16х/0,8 |
Таблица 1: Резюме предыдущих отчетов и этой системы пространственного разрешения голографической стимуляции. Описано боковое разрешение, осевое разрешение и объектив, используемые во время измерения.
Discussion
Чтобы понять функцию мозга, необходимо точно оценить нейронную схему, лежащую в основе функции мозга, извлекая динамику нейронной активности. Кроме того, важно определить, как изменяется эта нейронная схема, чтобы выяснить патогенез нервно-психических расстройств. Действительно, известно, что нейронная активность повышена у мышей с болезньюАльцгеймера 4 и синдромом ломкой Х-хромосомой26 и мышей с нарушенной функцией белого вещества3. Более того, в мышиной модели воспалительной боли повышенная синхронизация нейронной активности и функциональной связи между нейронами связана с симптомами24. Двухфотонная голографическая микроскопия позволяет одновременно наблюдать активность отдельных нейронов и функциональные связи между нейронами, что необходимо для понимания нейронных схем. Мы использовали 25-кратный объектив с числовой апертурой = 1.1 с длинами волн 1,040 нм. Теоретическая функция разброса точек представляет собой гауссово распределение с полной шириной при половине максимума 0,5 мкм в поперечном направлении и 1,7 мкм в осевом направлении. Однако фактическая числовая апертура составляет менее 1,1, а измеренный размер пятна на флуоресцентном шарике составляет 1,2 мкм в поперечном направлении и 8,3 мкм в осевом. Учитывая, что диаметр нейрона составляет примерно 15 мкм, а погрешность калибровки находится в пределах 3 мкм, нацеливание в целом хорошее. Однако на клетки в осевом направлении может влиять более длинное пятноразмером 6. Здесь мы описали вирусную инъекцию, хирургическое вмешательство, калибровку голографических систем стимуляции или освещения, а также протоколы визуализации для оценки и манипулирования нейронной активностью у живых мышей с использованием нашей системы микроскопии.
Для завершения всех экспериментальных процедур, от имплантации головной пластины и инъекции вируса до сбора данных для визуализации in vivo Ca2+ с использованием голографической микроскопии, требуется 2-4 недели. Процесс сложный и трудоемкий, и конечный успех эксперимента зависит от множества факторов, в том числе от состояния черепного окна, на которое влияет послеоперационное воспаление, правильного выбора индикатора Ca2+ и опсина, а также от того, можно ли исправить артефакты движения на полученных изображениях. В частности, для успешного исхода важны два шага. Первый касается фиксации пластины головы и хирургического вмешательства; Крайне важно, чтобы пластина головы была надежно закреплена на голове мыши с помощью стоматологического цемента. Кроме того, во время операции важно многократно очищать костные фрагменты и свернувшуюся кровь с помощью холодного ACSF. Поскольку соблюдение этой процедуры уменьшает воспаление, мы успешно наблюдали динамику микроглии, клеток, ответственных за иммунную систему мозга, не активируя их процессы и шипы или микроструктуры нейронов27,28. Второй вопрос — это оценка и манипулирование нейронной активностью. Мы выбрали AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 для одновременной экспрессии индикатора Ca2+ и опсина в одном нейроне. Это связано с тем, что трудно эффективно заразить один нейрон разными типами AAV. Другой причиной такого выбора было то, что ChRmine может эффективно активировать нейронную активность на длине волны 1040 нм с помощью двухфотонного лазера12. Недавно сообщалось, что ChRmine, мутируя свою структуру на основе структурной информации, полученной с помощью криоэлектронной микроскопии, улучшает свою функцию29, что считается полезным для анализа целевой функции в области нейробиологии. В свете этих вопросов необходимо поделиться эффективными методами оценки и манипулирования нейронами при считывании нейронной активности и записи информации с помощью голографической микроскопии.
Последние достижения в области визуализации и оптогенетики выявили детальную нейронную активность, связанную с функциями мозга, такими как обучение и память, и можно искусственно манипулировать этой нейронной активностью для выражения функций мозга30. Тем не менее, традиционные методы манипулирования нейронной активностью являются очень инвазивными из-за введения оптических волокон в мозг и потому, что одновременно стимулируется группа клеток, экспрессирующих опсин, что делает невозможным манипулирование нейронной активностью с временной и пространственной точностью. Наш метод может манипулировать нейронной активностью, стимулируя только определенные нейроны в головном мозге, что позволяет манипулировать нейронной активностью с помощью определенных паттернов стимуляции и высокого пространственно-временного разрешения. Кроме того, важно отметить, что функциональная связь между нейронами может быть оценена только в небольшом количестве нейронов с помощью экспериментов с срезами мозга31; Однако этот метод позволяет одновременно оценивать несколько нейронов у живых животных.
Одним из основных ограничений современных голографических микроскопов является необходимость фиксации головы мыши, что ограничивает поведение мыши. Недавно был разработан миниатюрный двухфотонный микроскоп32, и с дальнейшей миниатюризацией устройства может быть возможна визуализация in vivo Ca2+ с голографической стимуляцией у свободно движущихся мышей. Кроме того, потенциал этого микроскопа может быть расширен за счет улучшения временного разрешения изображения и объединения его с высокочувствительными к напряжению флуоресцентными белками33.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами на научные исследования в инновационных областях (19H04753, 19H05219 и 25110732 до H.W.), Грантами в помощь для трансформационных исследовательских областей (A) (20H05899 для H.W., 20H05886 для O.M. и 21H05587 для D.K.), Содействие совместным международным исследованиям (B) (20KK0170 для H.W.), Грант на научные исследования (B) (18H02598 для H.W.), Грант на научные исследования (A) (от 21H04663 до O. M.), Грант для начинающих ученых (от 20K15193 до X. Q.), Номер гранта JST CREST JPMJCR1755, Япония, и номер гранта JST A-STEP JPMJTR204C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x Objective | Nikon | N25X-APO-MP | Objective |
| A1MP | Nikon | A1MP | Microscope |
| AnesII | Bio machinery | AnesII | Anesthesia delivery system |
| C2 plus | Nikon | C2 plus | Microscope |
| DECADRON Phosphate Injection | Aspen | 21N024 | Avoid cerebral edema |
| Dental Drill | Jota | C1.HP.005 | Dental drill |
| Electric Microinjector | NARISHIGE | IM-31 | Pressure injection system |
| FEATHERS | FEARGER | FA-10 | Shaving |
| G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER | GC | 2110271 | Resin cement primer for dental adhesion |
| G-CEM ONE neo | GC | 43093 | Resin cement for dental adhesion |
| Glass Capillary with Filament | NARISHIGE | GDC-1 | Glass capillary |
| Image Detector | Hamamatsu | H10770PA-40 | GaAsP photocathode photomultiplier tube |
| Imaging Software | Nikon | NISelements | Imaging software |
| Isoflurane Inhalation Solution | Pfizer | 229KAR | Anesthetics |
| iXon EMCCD Camera | Andor | iXon Life 888 | Image sensor |
| Ketamine | daiitisannkyou | s9-018506 | Anesthetics |
| Leica-M60 | Leica | M60 | Stereoscope |
| Linicon | Linicon | LV-125 | Vacuum pump |
| Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser | Coherent | Chameleon Discovery NX | Femtosecond laser |
| Mos-Cure | U-VIX | mini 365 | Portable LED UV Light Source |
| PEN Bright | SHOFU INC. | PEN Bright | Dental light curing unit |
| Puller | SUTTER instaument | P-97 | Puller |
| Stereotaxic Instrument (for Mice) | NARISHIGE | SR-6M-H | Stereotaxic instrument |
| Stereotaxic Micromanipulator | NARISHIGE | SM-15R | Stereotaxic micromanipulator |
| Super-Bond CATALYST V | SUN MEDICAL | 8070 | Dental adhesive resin cement |
| Super-Bond Dental Adhesive Monomer | SUN MEDICAL | 8071 | Dental adhesive monomer |
| Super-Bond Teeth Color Polymer Powder | SUN MEDICAL | 145052000 | Teeth color polymer powder |
| Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% | Santen Pharmaceutical | TRN3952 | Eye ointment |
| UlTIMATE XL | NSK | Y141446 | Dental laboratory micromotor control unit |
| UV Curing Optical Adhesives | THORLABS | NOA61 | UV Curing Optical Adhesives |
| Xylazine | Bayer | KP0F2BK | Anesthetics |
References
- Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nature Neuroscience. 17 (7), 987-994 (2014).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Kato, D., et al. Motor learning requires myelination to reduce asynchrony and spontaneity in neural activity. Glia. 68 (1), 193-210 (2020).
- Busche, M. A., et al. Tau impairs neural circuits, dominating amyloid-β effects, in Alzheimer models in vivo. Nature Neuroscience. 22 (1), 57-64 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Quan, X., Kato, D., Daria, V., Matoba, O., Wake, H. Holographic microscope and its biological application. Neuroscience Research. 179, 57-64 (2022).
- Adesnik, H., Abdeladim, L. Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics. Nature Neuroscience. 24 (10), 1356-1366 (2021).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Carrillo-Reid, L., Han, S., Yang, W., Akrouh, A., Yuste, R. Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles. Cell. 178 (2), 447-457 (2019).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Gill, J. V., et al. Precise holographic manipulation of olfactory circuits reveals coding features determining perceptual detection. Neuron. 108 (2), 382-393 (2020).
- Robinson, N. T. M., et al. Targeted activation of hippocampal place cells drives memory-guided spatial behavior. Cell. 183 (6), 1586-1599 (2020).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Mardinly, A. R., et al. Precise multimodal optical control of neural ensemble activity. Nature Neuroscience. 21 (6), 881-893 (2018).
- Yang, W., Carrillo-Reid, L., Bando, Y., Peterka, D. S., Yuste, R. Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. Elife. 7, 32671 (2018).
- Forli, A., et al. Two-photon bidirectional control and imaging of neuronal excitability with high spatial resolution in vivo. Cell Reports. 22 (11), 3087-3098 (2018).
- Pégard, N. C., et al. Three-dimensional scanless holographic optogenetics with temporal focusing (3D-SHOT). Nature Communications. 8 (1), 1228 (2017).
- Dal Maschio, M., Donovan, J. C., Helmbrecht, T. O., Baier, H. Linking neurons to network function and behavior by two-photon holographic optogenetics and volumetric imaging. Neuron. 94 (4), 774-789 (2017).
- Russell, L. E., et al. All-optical interrogation of neural circuits in behaving mice. Nature Protocols. 17 (7), 1579-1620 (2022).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V.
- Hernandez, O., et al. Three-dimensional spatiotemporal focusing of holographic patterns. Nature Communications. 7, 11928 (2016).
- Okada, T., et al. Pain induces stable, active microcircuits in the somatosensory cortex that provide a therapeutic target. Science Advances. 7 (12), 8261 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Gonçalves, J. T., Anstey, J. E., Golshani, P., Portera-Cailliau, C. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Haruwaka, K., et al. Dual microglia effects on blood brain barrier permeability induced by systemic inflammation. Nature Communications. 10 (1), 5816 (2019).
- Kishi, K. E., et al. Structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin ChRmine. Cell. 185 (4), 672-689 (2022).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Ko, H., et al. The emergence of functional microcircuits in visual cortex. Nature. 496 (7443), 96-100 (2013).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).
- Villette, V., et al. ultrafast two-photon imaging of a high-gain voltage indicator in awake behaving mice. Cell. 179 (7), 1590-1608 (2019).
