Summary
פיתחנו מיקרוסקופ הולוגרפי בעל שני פוטונים שיכול לדמיין, להעריך ולתפעל פעילות עצבית באמצעות רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה, במטרה להבהיר את הפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות הקשורות לפעילות עצבית חריגה.
Abstract
ההתקדמות האחרונה בתחום הדימות הביולוגי האופטי והאופטוגנטיקה אפשרה הדמיה ומניפולציה של תופעות ביולוגיות, כולל פעילות תאית, בבעלי חיים חיים. בתחום מדעי המוח, פעילות עצבית מפורטת הקשורה לתפקודי המוח, כגון למידה וזיכרון, נחשפה כעת, וניתן לבצע מניפולציה מלאכותית בפעילות זו כדי לבטא תפקודים מוחיים. עם זאת, ההערכה הקונבנציונלית של פעילות עצבית על ידי שני פוטונים Ca2+ הדמיה יש את הבעיה של רזולוציה טמפורלית נמוכה. בנוסף, מניפולציה של פעילות עצבית על ידי אופטוגנטיקה קונבנציונלית באמצעות סיב אופטי יכול רק בו זמנית לווסת את הפעילות של נוירונים עם אותו רקע גנטי, מה שמקשה על שליטה בפעילות של נוירונים בודדים. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו לאחרונה מיקרוסקופ עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה עבור יישומים ביולוגיים על ידי שילוב אופטוגנטיקה עם טכנולוגיה הולוגרפית דיגיטלית שיכולה לשנות קרני לייזר אינפרא אדום פמטו-שניות. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים להדמיה, הערכה ומניפולציה של פעילות עצבית, כולל הכנת דגימות ותפעול של מיקרוסקופ הולוגרפי בעל שני פוטונים (איור 1). פרוטוקולים אלה מספקים מידע מרחבי-זמני מדויק על הפעילות העצבית, אשר עשוי להיות שימושי להבהרת הפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות המובילות להפרעות בפעילות העצבית.
Introduction
הדמיית Ca2+ של שני פוטונים היא טכניקה שימושית להערכת הפעילות העצבית. זה יכול לשמש כדי לזהות לא רק את הפעילות העצבית הנדרשת להתנהגות וזיכרון בבעלי חיים נורמליים1,2, אלא גם פעילות עצבית חריגה המתרחשת מודלים עכבריים של הפרעות נוירופסיכיאטריות 3,4. הטכניקה שימשה להבהרת הבסיס העצבי של תפקודי המוח. עם זאת, למרות שהוא יכול לספק תמונות ברזולוציה גבוהה ובאיכות גבוהה, הרזולוציה הטמפורלית שלו נמוכה מזו של השיטה האלקטרופיזיולוגית 1,3.
אופטוגנטיקה סייעה לחדש את האופן שבו מדעני מוח מבינים את תפקוד המוח5. בהתחשב במגבלות הטכניות, רוב המחקר האופטוגנטי השתמש בסכמות הפעלה ברזולוציה מרחבית נמוכה, ובכך הגביל את סוגי המניפולציות של הפעילות העצבית שניתן לבצע בהתאם. עם זאת, מניפולציה של פעילות עצבית בסקאלות מרחביות-זמניות עדינות יותר יכולה להיות שימושית להבנה מלאה יותר של חישוב עצבי והפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות. טכנולוגיה הולוגרפית מדויקת מרחבית שיכולה לעצב פמטו-שנייה ליד קרני לייזר אינפרא אדום מבטיחה להתגבר על האתגר הזה ופותחת כמה מחלקות ניסוי חדשות שהיו בלתי אפשריות בעבר 6,7. טכנולוגיה זו מאפשרת למדעני מוח לחשוף את ההיבטים הבסיסיים והפתולוגיות של קודים עצביים חושיים, קוגניטיביים והתנהגותיים שהיו מעבר להישג יד.
הקרנה הולוגרפית כוללת יצירת תבניות אור רצויות כדי לגשת לתאים בודדים ולרשתות פונקציונליות באופן סלקטיבי. ניסויי In vivo דורשים העברת אור אופטימלית כדי לתקוף תאים במוח החי. אור אינפרא אדום חודר עמוק יותר לתוך רקמה חיה וניתן להשתמש בו לעירור לא ליניארי של שני פוטונים (2PE)8,9,10. לפיכך, ניתן להשתמש במיקרוסקופ הולוגרפי של שני פוטונים, המשלב הקרנה הולוגרפית ו-2PE, כדי להעריך ולתפעל פעילויות עצביות כדי לחקור רשתות סלולריות ותפקודיות in vivo. יישומים ביולוגיים עדכניים של מיקרוסקופיה הולוגרפית של שני פוטונים הבהירו את הפעילות העצבית והמעגלים החשמליים הדרושים ללמידה בקליפת המוח הראייתית 11,12, נורת הריח13 וההיפוקמפוס14.
מעבדות רבות ברחבי העולם דיווחו על תוצאות מלהיבות ושיפורים באמצעות מערכות הגירוי ההולוגרפי שלהן 15,16,17,18,19,20,21,22,23. במערכת המתוארת כאן, ניתן לבנות את מערכת הגירוי ההולוגרפי כמכשיר הרחבה למיקרוסקופ קונבנציונלי. אפנן האור המרחבי הפאזה בלבד (SLM) הוא התקן המפתח לאפנון חזית גל מישורית לכל צורה, ואפקט ההתאבכות משמש לשליטה בעוצמה ובמיקום של המוקדים. איור 2 מראה גירוי הולוגרפי והדמיית נתיבי אור. נתיב האור הראשון מיועד למצב הדמיה של סריקה נקודתית והוא מורכב מראש סריקה וגלאי תמונה. נתיב האור השני מיועד לגירוי הולוגרפי באורך גל של 1040 ננומטר והוא מורכב מ-SLM1. נתיב האור השלישי מיועד להארה הולוגרפית באורך גל של 920 ננומטר והוא מורכב מ-SLM2 וחיישן תמונה. מצב ההדמיה ההולוגרפית יכול להקליט עוצמות מאזורי עניין מרובים על ידי הארת נקודות מרובות בדגימה. בדרך זו, ניתן להגדיל את מהירות ההקלטה לכמה מאות מסגרות לשנייה. כדי להשיג דימות סריקה נקודתית או הדמיית הארה הולוגרפית, הלייזר 920 ננומטר פוצל לשני נתיבים על ידי מפצל קרן ביחס קבוע של 3:7. כל האלמנטים האופטיים היו מיושרים על לוח לחם אופטי במידות של 600 מ"מ × 600 מ"מ. האור המווסת נכנס דרך יציאת האור בצד הגוף המיקרוסקופי, ואילו אור ההדמיה הסורק הנקודתי נכנס דרך ראש הסריקה בחלק העליון של הגוף המיקרוסקופי. אורות אלה שולבו ממש מעל עדשת האובייקט ויצרו מוקדים במישור הדגימה. בנוסף, התוכנה בהתאמה אישית אפשרה לזרימת העבודה הרגילה להיות פשוטה ועקבית.
במאמר זה, פרוטוקול מלא מוצג לשימוש בגירוי הולוגרפי או תאורה כדי למדוד פעילות עצבית ולהעריך את הקישוריות התפקודית בין נוירונים. למטרות הדגמה, אנו מתארים כאן ניתוח מוח המתמקד באזור הגפיים האחוריות של קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית (S1HL) במוח העכבר ושיטה להעריך ולתפעל פעילות עצבית באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי של שני פוטונים. ההליך הניסיוני מחולק לארבעה חלקים. ראשית, לוחית הראש הייתה מקובעת לגולגולת העכבר באמצעות מלט דנטלי. שנית, וקטור ויראלי המבטא jGCaMP8f או GCaMP6m-P2A-ChRmine הוזרק באופן סטריאוטקטי לתוך S1HL. שלישית, מערכת הגירוי או התאורה ההולוגרפית כוילה. רביעית, לאחר התאוששות לאחר הניתוח וביטוי של שני חלבונים אלה, בוצעה הדמיה של In vivo Ca2+ כדי להעריך את הפעילות העצבית והקישוריות התפקודית בין נוירונים באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי של שני פוטונים.
Protocol
כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת נגויה (מספר אישור: M220295-003).
1. השתלת לוחית ראש (איור 1A)
- יש לבצע את חומר ההרדמה (תערובת של 74 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין) באופן תוך-צפקי כדי להרדים את העכבר. בדוק את מצב ההרדמה של העכבר לעתים קרובות על ידי הערכת רפלקסי הדוושה.
- לאחר ההרדמה, הניחו את העכבר במכשיר סטריאוטקסי. יש למרוח משחת עיניים (ראו טבלת חומרים) כדי למנוע התייבשות הקרנית בעת השתלת לוחית הראש.
- יש לגלח את אזור הניתוח ולחטא את העור בשלושה סבבים לסירוגין של פילינג פובידון-יוד או כלורהקסידין ולאחר מכן מגבונים 70% אלכוהול. בזהירות לחשוף את הגולגולת ולנקות אותו עם צמר גפן.
הערה: יש לעקר את כל כלי הניתוח, ולבצע את כל ההליכים בהתאם. כל פסולת שנותרה (למשל, שיער או דם יבש) גורמת לתגובות דלקתיות. לכן, כל פסולת יש להסיר תחת סטריאוסקופ באמצעות צמר גפן רטוב עם מים סטריליים או 70% אלכוהול. - השתמש בקואורדינטות הסטריאוטקטיות - קדמיות ואחוריות = 0.5 מ"מ, מדיאלי וצדדי = 1.5 מ"מ מברגמה - כדי למצוא את מרכז הקרניוטומיה ולתייג אותו בעט טוש.
- הניחו לוחית ראש בהתאמה אישית במרכז הגולגולת. לאחר מכן, מרחו מלט דנטלי (ראו טבלת חומרים) כדי לקבע אותו היטב לגולגולת. הפעילו לחץ קל עד שלוחית הראש יוצרת מגע יציב עם החלק הקדמי והאחורי של הגולגולת.
הערה: שלב זה נמשך כ-20 דקות והוא קריטי להפחתת ארטיפקטים תנועתיים במוח במהלך דימות של שני פוטונים. מידות לוחית הראש הן 20 מ"מ × 40 מ"מ × 1 מ"מ עם פתח בצורת צלחת ביתית עם קצה אחד באורך 15 מ"מ, שני צדדים סמוכים באורך 3 מ"מ ושני הצדדים הנותרים באורך 10 מ"מ. - ערבבו יחד מלט שרף דבק דנטלי על בסיס אקרילי באופן הבא: חצי כף אבקה, שלוש טיפות נוזל וטיפת זרז אחת (ראו טבלת חומרים). כדי למנוע התייבשות, יש למרוח את מלט השרף הדנטלי המעורב הזה על משטח הגולגולת השלם של העכבר עם לוחית הראש.
- הניחו את העכבר בכלוב חם עד שיתאושש מההרדמה. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה עצם החזה.
2. ניתוח והזרקת וירוס הקשור לאדנו (AAV) (איור 1B)
- ביצוע קרניוטומיה או הזרקה ויראלית ללא הסרת מלט השרף הדנטלי מהגולגולת יום אחד לאחר השתלת לוחית הראש.
הערה: יש לבצע הרדמה (תערובת של 74 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין) תוך צפקית לעכבר במהלך הליך זה. - כדי למנוע בצקת מוחית, לנהל dexamethasone נתרן פוספט (1.32 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally 1 שעה לפני הניתוח.
- מרדימים את העכבר עם לוחית הראש עם 1% הרדמה איזופלורנית באמצעות וופורייזר (מערכת אספקת הרדמה) תוך שמירה על טמפרטורת הגוף עם כרית חימום. יש למרוח משחת עיניים למניעת התייבשות הקרנית.
- תחת סטריאוסקופ, בצע קרניוטומיה עגולה בקוטר של כ -2 מ"מ באמצעות מקדחה דנטלית. כדי להפחית את הנזק המוחי, הפעל את מקדח השיניים בזהירות עם תנועה קלה מתמדת ולחץ קל כלפי מטה.
- הסר שברי עצם מספר פעמים באמצעות מערכת יניקה. לאחר הסרת שברי העצם, השתמש בתמיסת נוזל עמוד שדרה מלאכותי (ACSF) כדי להסיר ולשטוף את כל הפסולת שנותרה על פני המוח. חזור על הליך ניקוי זה מספר פעמים כדי לדכא תגובות דלקתיות.
הערה: תמיסת ACSF (140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 5 mM HEPES, 2.0 mM CaCl 2 ו- 1.0 mM MgCl2) אוחסנה ב- 4 °C למשך חודש אחד לאחר המסת המגיב וסינון (גודל נקבוביות = 0.22 מיקרומטר). - באמצעות מערכת הזרקת לחץ (ראה טבלת חומרים), הגדר את הלחץ המתאים (כ -10 PSI בפולסים עם משך של 4 מילישניות) כדי להזריק 500 nL של תמיסת AAV דרך נימי זכוכית בקוטר קצה של 10-20 מיקרומטר (מוכן עם מושך מיקרופיפטה) למשך 10 דקות.
- קבע אם תמיסת ה- AAV ניתנת למוח על ידי בדיקה אם רמת תמיסת ה- AAV בנימי הזכוכית יורדת בהדרגה.
- השאירו את נימי הזכוכית במקומם למשך 10 דקות נוספות כדי למנוע זרימה חוזרת. חזור על הפעולה שלוש פעמים כדי לתת סך של 1.5 μL של תמיסת AAV לתוך המוח.
- כדי להעריך ולתפעל את הפעילות העצבית בתאים פירמידליים בשכבה 2/3 (L2/3), הזריקו תמיסת AAV (להדמיית Ca 2+: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE ב-1.28 × 1014 גנומים וקטוריים/מ"ל, מדוללים 1:1 במי מלח; להדמיית Ca2+ עם אופטוגנטיקה: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE ב-1.73 × 1014 גנומים וקטוריים/מ"ל, מדולל 1:1 במי מלח) לאזור הכפות האחוריות של קליפת המוח הסומטוסנסורית-חושית הראשונית של עכברי בר (S1, ממורכז ב-0.5 מ"מ אחורי ו-1.5 מ"מ רוחבי מהברגמה, עומק 150 מיקרומטר מפני השטח).
הערה: יש להזריק את תמיסת ה- AAV לאחר 2-3 שבועות ו- 1-2 שבועות לפני ההדמיה עבור ביטוי jGCaMP8f ו- GCaMP6m-P2A-ChRmine, בהתאמה. - לאחר יישום של 2% (w/v) אגרוז נמס נמוך על פני השטח במוח של S1 באמצעות מיקרופיפטה, הניחו חלון זכוכית מעל הקרניוטומיה עם שתי כוסות כיסוי. חברו את שתי כוסות הכיסוי (קטנות בקוטר 2.0 מ"מ וגדולות בקוטר 4.5 מ"מ; ראו טבלת חומרים) בדבק הניתן לריפוי UV.
- לחץ על הכיסוי כנגד האגרוז בעודו נוזלי; זה מונע היווצרות של בועות אוויר באגרוז. אטמו את שולי חלון הגולגולת במלט שרף דנטלי ודביק (איור 1C).
- הוציאו את העכבר מהמכשיר הסטריאוטקסי והחזירו אותו לכלוב שלו. הכניסו את העכבר לכלוב חם ואל תחזרו לכלוב עם בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין מההרדמה. שמור בזהירות על תנאים סטריליים במהלך ניתוח הישרדות.
- במשך 72 השעות הראשונות לאחר הניתוח, בדוק את מצב הבריאות של העכבר על ידי התבוננות בהתנהגות כללית. אם יש חריגות בהתנהגות הכללית, תת עורית להזריק חומרים אנטי דלקתיים משככי כאבים.
3. הכנה למערכת הגירוי או התאורה ההולוגרפית (איור 3)
- כייל את מערכת הגירוי ההולוגרפי על ידי הצבת פני השטח של שקופית פלואורסצנטית אדומה (מצע אקרילי יצוק) במישור הדגימה. מקם את המיקרוסקופ במצב הדמיה חיה עם נורית עירור חלשה והפעל קובץ calibration_GUI.m. בדוק את חלונית הפרמטרים ולחץ על להציל לחצן.
- לחץ על לחצן סריקה Z בחלונית שלב 1. הוא ייצור באופן אוטומטי שלוש נקודות אקראיות בכל 21 מישורי הצירים, בהפרש של 2 מיקרומטר מכל מישור.
- הזז את פס השקופיות ובדוק את התמונה החיה. מצא מישור מושלם שבו הכתמים נראים הקטנים והבהירים ביותר, ולאחר מכן לחץ על הלחצן שמור . פעולה זו תיצור באופן אוטומטי חזית גל כדורית של היסט עבור ההולוגרמה הדיגיטלית.
הערה: אם אינך מצליח למצוא את כתמי הפלואורסצנטיות הבהירים ביותר, שנה את ערכי המינימום והמקסימום של טווח הסריקה ונסה שוב. - לחץ על לחצן Go בחלונית שלב 2 ולאחר מכן לחץ על שישה מקומות בריבוע הימני. בדוק את התמונה החיה. אם יש שישה כתמים פלואורסצנטיים מובחנים, הקלד את ציר x ו- y שלהם בתיבות העריכה ולחץ על הלחצן שמור . פעולה זו תיצור באופן אוטומטי מקדמי התמרת אפין כדי לתאם את הכיול בין מערכת הגירוי ההולוגרפי למערכת ההדמיה.
הערה: יש להתאים לפי הסדר בין מספר זוג הצירים למספר הספוט שלחצת עליו. אם אינכם בטוחים, או אם אין כתמים בתמונה, נסו שוב ליצור דוגמת ספוט ייחודית או בחרו טווח קטן יותר סביב מרכז שדה הראייה (FOV). - לחץ על לחצן סרוק בחלונית שלב 3. היא תיצור 441 הולוגרמות דיגיטליות לביצוע סריקה נקודתית יחידה ברחבי ה-FOV ב-21 ×-21 שלבים.
- תחילה, בדוק את התמונות בעת שינוי תבניות בתיבת הרשימה. לאחר מכן, התאימו את עוצמת הלייזר לקבלת תמונות ספוט בטווח הדינמי של התקן ההדמיה (לדוגמה, כדי להימנע מתמונות רוויות מדי).
- לאחר מכן, התאם את זמן המרווח בתיבת העריכה; זמן המרווח צריך להיות יותר מפי שניים מזמן מרווח ההקלטה. לבסוף, הכנס את מכשיר ההדמיה למצב הקלטה ולחץ על לשחק לחצן. אם ההפעלה תושלם, יוצגו מחרוזות "הצג אישור" בחלון הפקודה. הפסק את ההקלטה וערם תמונות רציפות מוקלטות בשיטת העוצמה המרבית.
- לחץ על צור זיכרון עבודה בחלונית שלב 4 ובחר תמונה מוערמת מלמעלה. לאחר מכן סגרו את חלון calibration_GUI. הוא ייצור באופן אוטומטי מפת משקל כדי לפצות על העוצמה הלא מאוזנת בכל נקודה.
הערה: לקבלת תיאור מפורט יותר, עיין בסעיף 2; ניתן להוריד את קוד Matlab מכאן (https://github.com/ZenKG/SLM_control).
4. הדמיה Ca2+ באמצעות חיישן תמונה עם תאורה הולוגרפית (איור 4)
- הניחו את העכבר המוזרק באמצעות לוחית ראש מתחת למיקרוסקופ (איור 1D).
הערה: במהלך הליך זה, העכבר מרוסן במצב ערות, אך מסוגל לברוח מגירויים לא נוחים. - בצע הדמיה של שני פוטונים (מצב סריקה נקודתית) באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי ולייזר Ti:sapphire נעול מצב המכוון ל- 920 ננומטר עם מטרה של 25x (ראה טבלת חומרים).
- הפעל את תוכנת ההדמיה המסחרית (ראה רשימת חומרים). במצב הדמיה חיה, התאם את המתח של גלאי התמונה (ראה רשימת חומרים) ואת עוצמת לייזר ההדמיה כדי למטב את בהירות הנוירונים המבטאים jGCaMP8f. צלם תמונות של תאי העצב המבטאים חלבון זה.
הערה: עוצמת לייזר ההדמיה (920 ננומטר) היא 20-30 mW. ה-FOV היה 512 מיקרומטר ×-512 מיקרומטר בעומק של 100-150 מיקרומטר מפני השטח של קליפת המוח. - כדי להאיר תאי עצב ספציפיים המבטאים jGCaMP8f באמצעות תאורה הולוגרפית, הפעל את קובץ הסקריפט SLMcontrol.m. לחצו על תמונת ההפניה ובחרו בתמונה שהושגה למעלה. לאחר מכן, לחצו על כפתור הספוט כדי לבחור פיקסלים מסוימים בתאי העצב בתמונה בלחיצת עכבר רציפה (איור 4A). אם הבחירה הושלמה, לחץ על לחצן Enter בלוח המקשים כדי לסיים אותה.
הערה: ההולוגרמה הדיגיטלית מחושבת ומוצגת באופן אוטומטי ב-SLM. ניתן גם לבקר מחדש בתבנית זו על-ידי לחיצה על תיבת רשימה. הרזולוציה המרחבית של נקודה בודדת שנוצרה על ידי SLM הייתה בערך 1.2 מיקרומטר לאורך הכיוון הרוחבי ו~8.3 מיקרומטר לאורך הציר האופטי. השתמשנו בעדשה אובייקטיבית בעלת צמצם מספרי גבוה (1.1) כדי להשיג גירוי הולוגרפי מקומי יותר. טבלה 1 מסכמת דוחות קודמים ומערכת זו ביחס לרזולוציה המרחבית של גירוי הולוגרפי. - כדי לזהות פעילות עצבית ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות חיישן תמונה (ראו טבלת חומרים), הגדירו את זמן החשיפה, אזור ההדמיה והבינינג (איור 4B) לפני ביצוע רכישת התמונה (איור 4C).
הערה: עוצמת לייזר ההארה ההולוגרפית (920 ננומטר) המגרה באופן רציף תא עצב אחד היא 2 mW, וזה מספיק כדי לזהות פעילות עצבית. לדוגמה, כדי להשיג קצב פריימים של 100 הרץ להדמיה, זמן החשיפה הוא 9 אלפיות השנייה, אזור ההדמיה הוא 400 מיקרומטר × 400 מיקרומטר, והבינינג הוא 4. - לאחר הניסוי, החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו.
5. הדמיה של שני פוטונים (מצב סריקה נקודתית) עם אופטוגנטיקה באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי (איור 2)
- חזור על שלבים 4.1 ו- 4.2.
- הפעל את תוכנת ההדמיה המסחרית (ראה רשימת חומרים). במצב הדמיה חיה, כוונן את המתח של גלאי התמונה (ראה טבלת חומרים) ואת עוצמת לייזר ההדמיה כדי למטב את בהירות תאי העצב המבטאים GCaMP6m-P2A-ChRmine. צלמו תמונות של תאי עצב שמבטאים את החלבונים האלה (איור 1E).
- חזור על שלב 4.4.
- כדי לחקור את הקישוריות התפקודית בתוך תאי עצב L2/3, השתמש ב- SLM כדי ליצור תבניות הולוגרפיות של גירוי אופטוגנטי (ChRmine; 1,040 ננומטר) ושלב אותו עם דימות Ca 2+ בשני פוטונים (GCaMP6m; 920 ננומטר, 512 × 512 פיקסלים, 2 הרץ או 30 הרץ, זום דיגיטלי2x, מצב סריקה נקודתית; איור 4D-H).
- עבור פרוטוקול זה, הגדר את עוצמת לייזר ההדמיה ל- 920 ננומטר, ב- 10-20 mW, ואת ה- FOV כ- 256 מיקרומטר ×- 256 מיקרומטר שנמדד בעומק של 100-150 מיקרומטר מפני השטח של קליפת המוח. הגדר את זמן השהייה של הפיקסלים ל- 1.5 μs עבור 2 הרץ או 100 ns עבור 30 הרץ.
- כדי לראות אם גירוי הולוגרפי יחיד גרם לתגובת סידן בתאי העצב, השתמשו גם ב-2 הרץ וגם ב-30 הרץ כקצב פריימים של ההדמיה. קבעו את עוצמת לייזר הגירוי ההולוגרפי (1,040 ננומטר) שמגרה תא עצב בודד ב-10 מילי-וואט, וזה מספיק כדי לגרום לפעילות עצבית (איור 4D).
הערה: הרזולוציה המרחבית של נקודה בודדת הנוצרת על-ידי SLM היא בערך 1.2 מיקרומטר לאורך הכיוון הרוחבי ו~8.3 מיקרומטר לאורך הציר האופטי. טווח הנפח הנגיש בכיוון הצידי הוא סביב 500 מיקרומטר × 500 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר בכיוון הצירי. בנוסף, אישרנו באמצעות דימות Ca2+ בקצב פריימים של 2 הרץ או 30 הרץ שלא רק תא עצב אחד, אלא גם תאי עצב מרובים יכולים להיות מגורים הולוגרפית בו זמנית (איור 4E).
- בצע רכישת תמונה באמצעות הפרוטוקול הבא: צלם בו-זמנית את תגובת Ca2+ ב- 920 ננומטר עם 10 גירויים הולוגרפיים ב- 1,040 ננומטר עם מרווחים של 8 שניות (0.125 הרץ) למשך זמן של 50 אלפיות השנייה לאחר פרק זמן בסיסי של 10 שניות. לאחר השלמת כל הניסויים, העכברים מומתים.
הערה: Ca2+ transients, אם קיימים, התעוררו על-ידי גירוי הולוגרפי, כאשר שיאם הופיע בתוך 1 שניות לאחר הגירוי (איור 4F-H).
6. ניתוח תמונה והערכה של קישוריות תפקודית (איור 4)
- פתחו את התמונות הגולמיות שנשמרו בשלבים 4.5 או 5.5 באמצעות ImageJ. כדי לפצות על תזוזה של מישור מוקד, השתמש בתוסף TurboReg של ImageJ.
הערה: אם התיקון עם TurboReg אינו מספיק, מומלץ להשתמש ב- CaImAn (http://github.com/simonsfoundation) כדי לתקן את תזוזת מישור המוקד. - כדי להעריך פעילות עצבית, קבע את אזורי העניין (ROIs) ב- L2/3 באמצעות אלגוריתם אוטומטי (CaImAn). זהה ונתח ארעיים Ca2+ לאחר הגדרת עוצמת פלואורסצנטיות בסיסית (F0) וערך הסף.
הערה: F0 הוא ערך האחוזוןה-35 של עוצמת הפלואורסצנטיות הנרכשת במהלך תקופת ההדמיה הבסיסית. Ca2+ transients מסומנים על ידי Δ F/F 0 (Δ F = F-F0), כאשר F הוא האות הפלואורסצנטי המיידי. אם הערך Δ F הוא מעל 2 S.D. מ- F0, אנו מעריכים ארעי Ca2+ משמעותי. - כדי להגדיר קישוריות תפקודית בתאי עצב L2/3, גירו תאי עצב מטרה ומדדו בהתאם את תגובות GCaMP6m בתאי עצב מגורה וסביבתם (איור 4F-H).
Representative Results
מוצגות הקלטות מייצגות שהתקבלו בשיטה המתוארת כאן. In vivo הדמיה Ca2+ באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי דורשת 2-4 שבועות כדי להשלים את השתלת לוחית הראש והזרקת AAV לרכישת נתונים. לכן, כדי להשיג תוצאות יציבות, חשוב להפחית את חפצי התנועה במוח. השתלת לוחית הראש (שלב 1.5) ומיקום חלון הגולגולת (שלב 2.9) הם שלבים חשובים מאוד בתהליך זה. יתר על כן, חשוב גם לבחור AAV (AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1) המבטא בו זמנית מחוון סידן ואופסין בתא עצב יחיד (שלב 2.8).
איור 4A מראה נקודה להארה הולוגרפית של תמונת נוירון נרכשת באמצעות סקריפט MATLAB מותאם אישית. אם תאורה הולוגרפית הייתה מאירה בהצלחה את תאי העצב המבטאים jGCaMP8f, ניתן היה לקבל עקבות Ca2+ באמצעות חיישן תמונה (איור 4B), כפי שמוצג באיור 4C.
קישוריות תפקודית בין תאי עצב הוערכה באמצעות גירוי הולוגרפי (איור 4D), כפי שמוצג באיור 4E. מאחר שקישוריות תפקודית בין תאי עצב היא אחת מתכונות המעגלים העצביים שמשתנה בפתוגנזה של עכבר מודל כאב24, אנו מתארים הליך פשוט כדי להעריך אותה. איור 4F מראה תמונה טיפוסית של תאי עצב L2/3 ב-S1HL באמצעות GCaMP6m. כאשר תא עצב אחד (עיגול כתום) היה מגורה באופן הולוגרפי, תא עצב אחר (עיגול אדום) היה פעיל בו זמנית; לפיכך, מספר הקישוריות התפקודית בין תאי עצב היה אחד (איור 4G).
איור 1: מתווה סכמטי של הליך הניסוי . (A) קיבוע לוחית הראש לגולגולת. (B) הזרקה סטריאוטקטית של AAV לאזור הכף האחורית של קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית (S1HL). (ג) השתלת חלון הגולגולת. כדי להעריך ולתפעל פעילות עצבית, הדמיה של In vivo Ca2+ מבוצעת בעכברים ערים (D) עם גירוי הולוגרפי (E). סימני הבזק מציינים גירוי הולוגרפי או תאורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מערכת המשמשת למיקרוסקופ הולוגרפי. (A) תמונות של נתיבי האור של הגירוי וההארה ההולוגרפיים (משמאל) ליד המיקרוסקופ (באמצע) עם חיישן תמונה (מימין). (B) אלה הן תמונות מוגדלות של גירוי הולוגרפי ונתיבי אור הארה סביב SLM בהתאמה (שמאל וימין) ונתיב אור סורק נקודתי סביב ראש סריקה (באמצע ומימין). (C) סכמה של נתיבי הגירוי וההדמיה האופטיים. SLMs בפאזה בלבד משמשים להצגת הולוגרמות דיגיטליות, ומרחיב קרן (שילוב של L1 ו- L2) ומערכת ממסר 4f (שילוב של L3 ו- L4 לגירוי הולוגרפי ו- L4 ו- L5 לתאורה הולוגרפית) ממוקמים לפני ואחרי SLMs בהתאמה כדי לוודא שכל הולוגרמה דיגיטלית מצולמת באישון היציאה של עדשה אובייקטיבית טבילה במים, עם גודל תמונה מעט חסר מילוא. כדי לדכא רכיבים שיוריים מסדר אפס, בלוק קרן ממוקם במישור הביניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תרשים זרימה של אופן כיול מערכת הגירוי או התאורה ההולוגרפית. תרשים זרימה זה מתאר שלבים לכיול מערכת גירוי הולוגרפי או תאורה למרחב הדגימה ולמערכת ההדמיה. אנא בקר בשלב 3, הכנה למערכת הגירוי או התאורה ההולוגרפית, לקבלת הוראות מפורטות והורד תוכנית לדוגמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות מייצגות של הדמיה וקישוריות תפקודית באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי . (A) כדי להאיר תאי עצב מסוימים המבטאים jGCaMP8f או GCaMP6m-P2A-ChRmine, התמונה של תאי עצב נלכדת, ואז נוצרת נקודה על תא העצב באמצעות סקריפט MATLAB מותאם אישית. (B) הגדרת חיישן התמונה (זמן חשיפה, אזור הדמיה ואגירה). (C) תמונה מייצגת ועקבות של תאי עצב המבטאים jGCaMP8f בהדמיה של 100 הרץ עם תאורה הולוגרפית וחיישן תמונה. (D) גרף זה מראה את התגובה העצבית לגירוי הולוגרפי (1,040 ננומטר) בכל עוצמת לייזר (נתונים מ-GCaMP6m-P2A-ChRmine המבטאים תאי עצב בקצב פריימים של הדמיה של 2 הרץ [n = 16]). קווי שגיאה מציינים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. (E) עקבות Ca2+ מייצגים במהלך גירוי הולוגרפי (קווים אנכיים כחולים) של 10 תאי עצב שונים בקצב פריימים של 2 הרץ (משמאל) ו-30 הרץ (מימין). ב 2 הרץ ו 30 הרץ Ca2+ עקבות, אותו צבע מציין את אותו נוירון. (F) דיאגרמה סכמטית המעריכה קשרים תפקודיים בין נוירונים. כאשר תא העצב הכתום מגורה, תאי העצב האדומים מגיבים באותו הזמן, מה שמצביע על כך שיש קישוריות תפקודית בין תאי העצב האלה. (G) תמונה טיפוסית של נוירוני S1HL המבטאים GCaMP6m ב-WT. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (H) עקבות Ca2+ אופייניות במהלך גירוי הולוגרפי (קווים אנכיים כחולים) בקצב פריימים של 2 הרץ (עליון) ו-30 הרץ (תחתון). תא העצב המגורה מוקף בעיגול כתום, תאי עצב מגיבים מוקפים באדום, ותאי עצב שאינם מגיבים מוקפים באפור. ניתן לזהות תגובה עצבית לגירוי הולוגרפי הן במהירויות הדמיה של 2 הרץ והן במהירויות הדמיה של 30 הרץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| המערך שלנו 6 | Prakash, R. et al. 25 | מרשל, J. H. et al. 12 | רובינסון, נ. ט. מ. ואח' 14 | |
| רזולוציה רוחבית | 1.2 מיקרומטר | 1.27 מיקרומטר | ― | 2.22 מיקרומטר |
| רזולוציה צירית | 8.3 מיקרומטר | 56.86 מיקרומטר | 15.5 מיקרומטר | 10.26 מיקרומטר |
| עדשה אובייקטיבית/צמצם מספרי | 25x/1.1 | 20x/0.5 | 16x/0.8 | 16x/0.8 |
טבלה 1: סיכום דוחות קודמים ומערכת זו לרזולוציה מרחבית של גירוי הולוגרפי. מתוארים הרזולוציה הצידית, הרזולוציה הצירית והעדשה האובייקטיבית המשמשת במהלך המדידה.
Discussion
כדי להבין את תפקוד המוח, יש צורך להעריך במדויק את המעגלים העצביים העומדים בבסיס תפקוד המוח על ידי חילוץ הדינמיקה של הפעילות העצבית. יתר על כן, חיוני לזהות כיצד מעגל עצבי זה משתנה כדי להבהיר את הפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות. ואכן, ידוע כי הפעילות העצבית מוגברת במודלים עכבריים של מחלת אלצהיימר4 ותסמונת X שביר26 ובעכברים עם תפקוד לקוי של החומר הלבן3. יתר על כן, במודל עכבר של כאב דלקתי, סנכרון מוגבר של פעילות עצבית וקישוריות תפקודית בין נוירונים קשורה לסימפטומים24. מיקרוסקופיה הולוגרפית של שני פוטונים מאפשרת לנו לצפות בו זמנית בפעילות של נוירונים בודדים ובקשרים הפונקציונליים בין נוירונים, דבר הכרחי להבנת מעגלים עצביים. השתמשנו בעדשה אובייקטיבית 25x עם צמצם מספרי = 1.1 עם אורכי גל של 1,040 ננומטר. פונקציית התפשטות הנקודות התאורטית היא התפלגות גאוסית עם רוחב מלא בחצי מקסימום של 0.5 מיקרומטר לרוחב ו-1.7 מיקרומטר אקסיאלית. עם זאת, הצמצם המספרי בפועל קטן מ-1.1, וגודל הכתם הנמדד על חרוז פלואורסצנטי הוא 1.2 מיקרומטר לרוחב, ו-8.3 מיקרומטר באופן אקסיאלי. בהתחשב בכך שקוטר תא העצב הוא בערך 15 מיקרומטר ושגיאת הכיול היא בטווח של 3 מיקרומטר, המטרה היא בדרך כלל טובה. עם זאת, תאים בכיוון הציר עשויים להיות מושפעים מגודל הכתם הארוך יותר6. במאמר זה תיארנו את ההזרקה הנגיפית, הניתוח, הכיול של מערכות גירוי או תאורה הולוגרפיות ופרוטוקולי הדמיה להערכה ומניפולציה של הפעילות העצבית בעכברים חיים באמצעות מערכת המיקרוסקופ שלנו.
לוקח 2-4 שבועות להשלים את כל הליכי הניסוי, החל מהשתלת לוחית ראש והזרקת וירוסים ועד לרכישת נתונים להדמיית in vivo Ca2+ באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי. התהליך מורכב ומייגע, והצלחתו הסופית של הניסוי תלויה במספר גורמים, כולל מצב חלון הגולגולת, המושפע מדלקת לאחר הניתוח, הבחירה הנכונה של מחוון Ca2+ ואופסין, והאם ניתן לתקן ממצאי תנועה בתמונות הנרכשות. בפרט, שני שלבים חשובים לתוצאה מוצלחת. הראשון נוגע לקיבוע לוחית הראש וניתוח; חשוב מאוד שלוחית הראש תהיה מקובעת היטב לראש העכבר עם מלט דנטלי. כמו כן, חשוב לנקות שוב ושוב שברי עצם ודם קרוש באמצעות ACSF קר במהלך הניתוח. מאחר שהיצמדות להליך זה מפחיתה דלקת, צפינו בהצלחה בדינמיקה של מיקרוגליה, התאים האחראים על מערכת החיסון של המוח, מבלי להפעיל את התהליכים ואת עמוד השדרה שלהם או את המיקרו-מבנים של תאי עצב27,28. הנושא השני הוא הערכה ומניפולציה של פעילות עצבית. בחרנו AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 כדי לבטא את מחוון Ca2+ ואופסין בתא עצב אחד בו זמנית. הסיבה לכך היא שקשה להדביק ביעילות נוירון אחד עם סוגים שונים של AAV. סיבה נוספת לבחירה זו הייתה ש-ChRmine יכול להפעיל ביעילות פעילות עצבית ב-1,040 ננומטר באמצעות לייזר12 בעל שני פוטונים. לאחרונה, דווח כי ChRmine, על ידי מוטציה המבנה שלה מבוסס על מידע מבני המתקבל על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים קריו, משפר את הפונקציה שלה29, אשר נחשב שימושי עבור ניתוח תפקוד המטרה בתחום מדעי המוח. לאור סוגיות אלה, יש צורך לשתף שיטות יעילות להערכה ומניפולציה של נוירונים בעת קריאת פעילות עצבית וכתיבת מידע באמצעות מיקרוסקופיה הולוגרפית.
ההתקדמות האחרונה בדימות ובאופטוגנטיקה חשפה את הפעילות העצבית המפורטת המעורבת בתפקודי מוח כגון למידה וזיכרון, וניתן לבצע מניפולציה מלאכותית בפעילות עצבית זו כדי לבטא תפקודי מוח30. עם זאת, שיטות קונבנציונליות למניפולציה של פעילות עצבית הן פולשניות מאוד בגלל החדרת סיבים אופטיים למוח ומכיוון שקבוצה של תאים המבטאים אופסין מגורה בו זמנית, מה שלא מאפשר לתמרן את הפעילות העצבית בדיוק זמני ומרחבי. השיטה שלנו יכולה לתמרן את הפעילות העצבית על ידי גירוי נוירונים ספציפיים בלבד במוח, ובכך לאפשר מניפולציה של הפעילות העצבית עם דפוסי גירוי ספציפיים ורזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. יתר על כן, חשוב לציין כי קישוריות תפקודית בין נוירונים ניתנת להערכה רק במספר קטן של תאי עצב באמצעות ניסויי פרוסות מוח31; עם זאת, טכניקה זו מאפשרת הערכה בו זמנית של נוירונים מרובים בבעלי חיים חיים.
אחת המגבלות העיקריות של המיקרוסקופים ההולוגרפיים הנוכחיים היא הצורך לתקן את ראש העכבר, מה שמגביל את התנהגות העכבר. לאחרונה פותח מיקרוסקופ ממוזער של שני פוטונים32, ועם מזעור נוסף של המכשיר, הדמיה של in vivo Ca2+ עם גירוי הולוגרפי עשויה להיות אפשרית בעכברים הנעים בחופשיות. בנוסף, ניתן להרחיב את הפוטנציאל של מיקרוסקופ זה על ידי שיפור הרזולוציה הטמפורלית של הדמיה ושילובה עם חלבונים פלואורסצנטיים רגישים מאוד למתח33.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים בסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (19H04753, 19H05219 ו-25110732 ל-H. W.), מענקים בסיוע לתחומי מחקר טרנספורמטיביים (A) (20H05899 ל-H. W., 20H05886 ל-O. M. ו-21H05587 ל-D. K.), טיפוח מחקר בינלאומי משותף (B) (20KK0170 ל-H. W.), מענק סיוע למחקר מדעי (B) (18H02598 ל-H. W.), מענק סיוע למחקר מדעי (A) (21H04663 עד O. M.), מענק סיוע למדענים בתחילת הקריירה (20K15193 עד X. Q.), JST CREST מספר מענק JPMJCR1755, יפן, ומספר מענק JST A-STEP JPMJTR204C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x Objective | Nikon | N25X-APO-MP | Objective |
| A1MP | Nikon | A1MP | Microscope |
| AnesII | Bio machinery | AnesII | Anesthesia delivery system |
| C2 plus | Nikon | C2 plus | Microscope |
| DECADRON Phosphate Injection | Aspen | 21N024 | Avoid cerebral edema |
| Dental Drill | Jota | C1.HP.005 | Dental drill |
| Electric Microinjector | NARISHIGE | IM-31 | Pressure injection system |
| FEATHERS | FEARGER | FA-10 | Shaving |
| G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER | GC | 2110271 | Resin cement primer for dental adhesion |
| G-CEM ONE neo | GC | 43093 | Resin cement for dental adhesion |
| Glass Capillary with Filament | NARISHIGE | GDC-1 | Glass capillary |
| Image Detector | Hamamatsu | H10770PA-40 | GaAsP photocathode photomultiplier tube |
| Imaging Software | Nikon | NISelements | Imaging software |
| Isoflurane Inhalation Solution | Pfizer | 229KAR | Anesthetics |
| iXon EMCCD Camera | Andor | iXon Life 888 | Image sensor |
| Ketamine | daiitisannkyou | s9-018506 | Anesthetics |
| Leica-M60 | Leica | M60 | Stereoscope |
| Linicon | Linicon | LV-125 | Vacuum pump |
| Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser | Coherent | Chameleon Discovery NX | Femtosecond laser |
| Mos-Cure | U-VIX | mini 365 | Portable LED UV Light Source |
| PEN Bright | SHOFU INC. | PEN Bright | Dental light curing unit |
| Puller | SUTTER instaument | P-97 | Puller |
| Stereotaxic Instrument (for Mice) | NARISHIGE | SR-6M-H | Stereotaxic instrument |
| Stereotaxic Micromanipulator | NARISHIGE | SM-15R | Stereotaxic micromanipulator |
| Super-Bond CATALYST V | SUN MEDICAL | 8070 | Dental adhesive resin cement |
| Super-Bond Dental Adhesive Monomer | SUN MEDICAL | 8071 | Dental adhesive monomer |
| Super-Bond Teeth Color Polymer Powder | SUN MEDICAL | 145052000 | Teeth color polymer powder |
| Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% | Santen Pharmaceutical | TRN3952 | Eye ointment |
| UlTIMATE XL | NSK | Y141446 | Dental laboratory micromotor control unit |
| UV Curing Optical Adhesives | THORLABS | NOA61 | UV Curing Optical Adhesives |
| Xylazine | Bayer | KP0F2BK | Anesthetics |
References
- Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nature Neuroscience. 17 (7), 987-994 (2014).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Kato, D., et al. Motor learning requires myelination to reduce asynchrony and spontaneity in neural activity. Glia. 68 (1), 193-210 (2020).
- Busche, M. A., et al. Tau impairs neural circuits, dominating amyloid-β effects, in Alzheimer models in vivo. Nature Neuroscience. 22 (1), 57-64 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Quan, X., Kato, D., Daria, V., Matoba, O., Wake, H. Holographic microscope and its biological application. Neuroscience Research. 179, 57-64 (2022).
- Adesnik, H., Abdeladim, L. Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics. Nature Neuroscience. 24 (10), 1356-1366 (2021).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Carrillo-Reid, L., Han, S., Yang, W., Akrouh, A., Yuste, R. Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles. Cell. 178 (2), 447-457 (2019).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Gill, J. V., et al. Precise holographic manipulation of olfactory circuits reveals coding features determining perceptual detection. Neuron. 108 (2), 382-393 (2020).
- Robinson, N. T. M., et al. Targeted activation of hippocampal place cells drives memory-guided spatial behavior. Cell. 183 (6), 1586-1599 (2020).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Mardinly, A. R., et al. Precise multimodal optical control of neural ensemble activity. Nature Neuroscience. 21 (6), 881-893 (2018).
- Yang, W., Carrillo-Reid, L., Bando, Y., Peterka, D. S., Yuste, R. Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. Elife. 7, 32671 (2018).
- Forli, A., et al. Two-photon bidirectional control and imaging of neuronal excitability with high spatial resolution in vivo. Cell Reports. 22 (11), 3087-3098 (2018).
- Pégard, N. C., et al. Three-dimensional scanless holographic optogenetics with temporal focusing (3D-SHOT). Nature Communications. 8 (1), 1228 (2017).
- Dal Maschio, M., Donovan, J. C., Helmbrecht, T. O., Baier, H. Linking neurons to network function and behavior by two-photon holographic optogenetics and volumetric imaging. Neuron. 94 (4), 774-789 (2017).
- Russell, L. E., et al. All-optical interrogation of neural circuits in behaving mice. Nature Protocols. 17 (7), 1579-1620 (2022).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V.
- Hernandez, O., et al. Three-dimensional spatiotemporal focusing of holographic patterns. Nature Communications. 7, 11928 (2016).
- Okada, T., et al. Pain induces stable, active microcircuits in the somatosensory cortex that provide a therapeutic target. Science Advances. 7 (12), 8261 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Gonçalves, J. T., Anstey, J. E., Golshani, P., Portera-Cailliau, C. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Haruwaka, K., et al. Dual microglia effects on blood brain barrier permeability induced by systemic inflammation. Nature Communications. 10 (1), 5816 (2019).
- Kishi, K. E., et al. Structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin ChRmine. Cell. 185 (4), 672-689 (2022).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Ko, H., et al. The emergence of functional microcircuits in visual cortex. Nature. 496 (7443), 96-100 (2013).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).
- Villette, V., et al. ultrafast two-photon imaging of a high-gain voltage indicator in awake behaving mice. Cell. 179 (7), 1590-1608 (2019).
