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Chemistry

Construction de peptides cycliques à l’aide d’un centre de sulfonium sur attache

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64289
Automatic Translation
*1, *1,2, *1, 3, 1,2, 1, 3, 1,2, 1,2
1Pingshan Translational Medicine Center, Shenzhen Bay Laboratory, 2Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School, 3Department of Radiation Oncology, the First Affiliated Hospital, Anhui Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole présente la synthèse de peptides cycliques via la bisalkylation entre la cystéine et la méthionine et la réaction thiol-yne facile déclenchée par le centre propargylsulfonium.

Abstract

Ces dernières années, les peptides cycliques ont attiré une attention croissante dans le domaine de la découverte de médicaments en raison de leurs excellentes activités biologiques et, par conséquent, ils sont maintenant utilisés cliniquement. Il est donc essentiel de rechercher des stratégies efficaces pour synthétiser des peptides cycliques afin de promouvoir leur application dans le domaine de la découverte de médicaments. Cet article rapporte un protocole détaillé pour la synthèse efficace de peptides cycliques en utilisant la résine ou la bisalkylation intramoléculaire (intermoléculaire). En utilisant ce protocole, des peptides linéaires ont été synthétisés en tirant parti de la synthèse peptidique en phase solide avec cystéine (Cys) et méthionine (Met) couplées simultanément sur la résine. De plus, des peptides cycliques ont été synthétisés par bisalkylation entre Met et Cys à l’aide d’une attache accordable et d’un centre de sulfonium sur l’attache. L’ensemble de la voie synthétique peut être divisé en trois processus principaux: la déprotection de Cys sur la résine, le couplage de l’agent de liaison et la cyclisation entre Cys et Met dans une solution de clivage d’acide trifluoroacétique (TFA). De plus, inspiré par la réactivité du centre sulfonium, un groupe propargyle a été attaché au Met pour déclencher l’addition de thiol-yne et former un peptide cyclique. Après cela, les peptides bruts ont été séchés et dissous dans de l’acétonitrile, séparés, puis purifiés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Le poids moléculaire du peptide cyclique a été confirmé par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS), et la stabilité de la combinaison peptidique cyclique avec le réducteur a été confirmée par HPLC. De plus, le décalage chimique dans le peptide cyclique a été analysé par des spectres de résonance magnétique nucléaire de 1H (RMN de 1H). Dans l’ensemble, ce protocole visait à établir une stratégie efficace de synthèse des peptides cycliques.

Introduction

Les interactions protéine-protéine (IPP)1 jouent un rôle central dans la recherche et le développement de médicaments. La construction de peptides stabilisés avec une conformation fixe par des moyens chimiques est l’une des méthodes les plus importantes pour développer des motifs mimétiques des IPP2. À ce jour, plusieurs peptides cycliques ciblant les IPP ont été développés pour un usage clinique3. La plupart des peptides sont contraints à une conformation en α-hélice pour diminuer l’entropie conformationnelle et améliorer la stabilité métabolique, l’affinité de liaison à la cible et la perméabilité cellulaire 4,5. Au cours des 2 dernières décennies, les chaînes latérales de Cys6,7, lysine8,9, tryptophane 10, arginine 11 et Met12,13 ont été insérées dans des acides aminés non naturels pour fixer le peptide dans une conformation cyclique. De tels peptides cycliques peuvent cibler un espace chimique unique ou des sites spéciaux, déclenchant ainsi une réaction covalente pour former une liaison covalente protéine-peptide14,15,16,17. Dans un rapport récent de Yu et al., un chloroacétamide a été ancré sur le domaine des ligands peptidiques, assurant une réaction de conjugaison covalente avec une excellente spécificité protéique18. De plus, des ogives électrophiles, telles que l’acrylamide et le fluorure d’arylsulfonyle (ArSO2F), ont été incorporées dans des peptides par Walensky et al.19 pour former des inhibiteurs covalents peptidiques stabilisés et améliorer l’effet antitumoral des inhibiteurs peptidiques. Par conséquent, il est très important d’introduire un groupe fonctionnel supplémentaire afin de modifier de manière covalente les ligands protéine-peptide20. Ces groupes réagissent non seulement avec les protéines de la chaîne latérale, mais stabilisent également la structure secondaire du peptide21. Cependant, l’application de protéines modifiées par covalence induites par des ligands peptidiques est limitée en raison de la voie synthétique compliquée et de la liaison non spécifique des groupes chimiques22,23. Des stratégies efficaces pour la synthèse de peptides cycliques sont donc nécessaires de toute urgence.

Inspiré par les multiples stratégies des peptides cycliques 2,24,25,26, ce protocole tente de développer une méthode simple et efficace pour stabiliser les peptides. De plus, nous avons noté que le groupe de chaînes latérales d’un peptide stable pouvait réagir de manière covalente avec une protéine cible lorsqu’elle était spatialement proche des ligands peptidiques. Le manque de Met chimiquement modifié a été comblé par le groupe Deming en 2013 en développant une nouvelle méthode de production de méthioninepeptidique 27 sélectivement modifiée. Sur la base de ce contexte, Shi et al. se sont concentrés sur le développement de la fermeture en anneau des chaînes latérales pour former un centre de sel de sulfonium. Lorsque le ligand peptidique se combine avec la protéine cible, le groupe sel de sulfonium réagit de manière covalente avec la protéine Cys spatialement proche. Ces dernières années, Shi et al. ont conçu une nouvelle méthode pour stabiliser le peptide cyclique28. Le sel de sulfonium sur le peptide cyclique a été réduit par un agent réducteur avec un groupe sulfhydryle qui a été réduit de manière réversible à Met. Cependant, la réaction avait une faible efficacité, ce qui était nocif pour les études d’application biologique ultérieures. Dans la présente étude, une réaction de fermeture de cycle Met-Cys et bromure de propargyle-Cys a été conçue, avec un seul sel de sulfonium restant sur la chaîne latérale du peptide cyclique. Le sel de sulfonium a agi comme une nouvelle ogive qui a réagi de manière covalente avec la protéine Cys à proximité spatiale. En bref, un peptide muté par Cys et Met a été cyclisé par alkylation intramoléculaire, ce qui a entraîné la génération d’un centre de sulfonium sur l’attache. Dans ce processus, la formation d’un pont de chaîne latérale était essentielle pour les peptides cycliques. Dans l’ensemble, ce protocole décrit une cyclisation détaillée des peptides à base de sulfonium qui est réalisée en utilisant des conditions de réaction et des opérations simples. L’objectif est de développer une méthode potentielle pour d’autres applications biologiques à grande échelle.

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Protocol

1. Préparation de l’équipement

ATTENTION : La morpholine, le N,N-diméthylformamide (DMF), le dichlorométhane (DCM), la N,N-diisopropyléthylamine (DIPEA), le TFA, la morpholine, la pipéridine, l’éther diéthylique et le méthanol sont toxiques, volatils et corrosifs. Ces réactifs peuvent nuire au corps humain par inhalation, ingestion ou contact cutané. Pour toutes les expériences chimiques, utilisez un équipement de protection, y compris des gants jetables, des manteaux expérimentaux et des lunettes de protection.

  1. Construire tous les substrats peptidiques sur la résine Rink-amide 4-méthylbenzhydrylamine (MBHA) par synthèse peptidique en phase solide (SPPS)29 manuelle standard, comme illustré à la figure 1.
  2. Utiliser l’une ou l’autre des deux options pour construire des peptides linéaires : premièrement, synthétiser le peptide en utilisant l’agent de condensation 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N, N',N'-tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HATU) et un réactif de DIPEA; ou deux, synthétiser en utilisant le 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) et le N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) comme réactif de condensation amide. Sélectionnez un protocole approprié pour la synthèse peptidique en fonction de la séquence du peptide.
  3. Pour établir un dispositif manuel de synthèse peptidique, installez un équipement d’extraction en phase solide sous vide modifié dans une hotte et connectez-le à un robinet d’arrêt à trois voies. Ensuite, placez une cartouche filtrante en polypropylène ou un réacteur en verre sur l’équipement lorsqu’il est connecté à l’azote (N2) gazeux.
    REMARQUE: Pour modifier l’équipement d’extraction sous vide en phase solide, retirez le tube d’extraction et conservez le système scellé sous vide.
  4. Chargez la résine MBHA dans les colonnes remplies de résine et dissolvez-la dans du DMF. Régler l’interrupteur des robinets d’arrêt à trois voies pour le bouillonnement de N2 , puis retirer le solvant dans la colonne à l’aide d’une pompe de travail connectée à un système de vide. Calculez la quantité d’acide aminé ou d’agent de condensation requise à l’aide de la formule suivante:
    Acide aminé (g) et agent de condensation (g) = échelle de résine (g) × capacité de charge de résine (mM/g) × équivalent (5 eq) × masse moléculaire (g/M)
    REMARQUE: Choisissez la quantité de résine chargée en fonction de la longueur du peptide de couplage. Plusieurs équivalents (eq) d’acides aminés sont utilisés pour réagir plus complètement. Les solvants liquides doivent être convertis en volume par densité. L’égaliseur 5 montre que la quantité d’entrée du composé calculé est amplifiée par un facteur de cinq.

2. Préparation de la résine

REMARQUE: Choisissez la quantité de résine chargée en fonction de la longueur du peptide de couplage.

  1. Peser 302 mg de résine Rink-amide MBHA (0,331 mM/g chargé) dans une colonne (réservoir de 20 mL). Ajouter 5-10 mL de DCM ou de DMF dans la colonne pour faire gonfler la résine sous N2 bouillonnant pendant 30 min.
  2. Ensuite, fermez l’interrupteur N2 , puis allumez l’interrupteur d’aspiration de la pompe à vide pour retirer le solvant. Ensuite, lavez les résines séquentiellement avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) 5x.

3. Déprotection FMOC N-terminal

REMARQUE: La déprotection par morpholine nécessite 30 min, et la déprotection par pipéridine prend 5 min.

  1. Préparer la solution de déprotection N-terminale de 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc) : préparer un volume suffisant (500 mL) de pipéridine à 20 % (v/v) ou de morpholine à 50 % (v/v) dans du DMF dans un récipient en verre pour la déprotection du groupe Fmoc.
  2. Ajouter 10 mL de la solution de déprotection dans la colonne, introduire la bulleN2 dans la solution pendant 30 min ou 5 min 2x et répéter les procédures de déprotection 2x.
  3. Vidangez la solution à l’aide d’une pompe à vide et lavez la résine séquentiellement avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) 5x.
  4. Détecter la résine sous forme de solution de couleur jaune foncé par 5% de ninhydrine (test Kaiser) après chaque déprotection pour confirmer l’absence du groupe Fmoc avant l’étape de couplage. En détail, ajoutez 1 mL de DMF à une petite quantité de résine et ajoutez 200 μL de ninhydrine à 5% dans un tube de verre chauffé à 130 °C pendant 3 minutes pour évaluer les changements de couleur de la résine.
  5. Vidangez la solution à l’aide d’une pompe à vide et lavez la résine séquentiellement avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) 5x.

4. Couplage du peptide linéaire (Figure 2)

REMARQUE: Lorsque les séquences peptidiques synthétiques contiennent deux unités répétitives ou plus, la procédure de couplage peut être effectuée directement en sélectionnant le type d’acide aminé, tel que Fmoc-AA-OH ou Fmoc-AAA-OH, etc. Certains acides aminés spéciaux avec une entrave stérique et des peptides avec des séquences d’acides aminés plus longues sont nécessaires pour prolonger correctement le temps de réaction pour le couplage.

  1. Pour une seule étape de couplage, prenons l’exemple du couplage du résidu Cys (synthétiser des échelles de résine de 300 mg). Préparer une solution de mélange comprenant du Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) et HATU (5 eq, 206 mg) ou du Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) et du HOBT (5 eq, 106 mg) dans un tube en polypropylène et la dissoudre dans 3 mL de DMF.
  2. Ajouter 173 μL de DIPEA (10 eq) ou 154 μL de DIC (10 eq) à la solution de Cys pour activer l’acide aminé. Laisser le mélange pré-activer pendant 1 min. Ajouter le mélange à la colonne avec de la résine et le buller avec N 2 pendant2 h.
    REMARQUE : Le temps de réaction spécifique requis doit être normalisé pour détecter la ninhydrine à 5 %.
  3. Après le couplage, ajouter 1 mL de DMF à une petite quantité de résine et ajouter 200 μL de ninhydrine à 5 % dans un tube de verre chauffé à 130 °C pendant 3 min. Observez le changement de résine en incolore pour confirmer l’absence d’un groupe amino libre avant l’étape de déprotection.
  4. Vidangez la solution à l’aide d’une pompe à vide et lavez la résine séquentiellement avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) 5x.
  5. Ajouter 10 mL de la solution de déprotection dans la colonne, faire des bulles avec N2 pendant 30 min ou 5 min 2x, ajouter une solution fraîche et répéter les procédures de déprotection 2x.
  6. Répétez les étapes suivantes : déprotection du groupe Fmoc ; détection de la déprotection de la résine; laver la résine; couplage de l’acide aminé; détection de la réaction de couplage. Répétez l’étape de couplage jusqu’à ce que tous les peptides soient synthétisés.
    REMARQUE: Utilisez le test de Kaiser pour vérifier si chaque étape de la déprotection est terminée ou si chaque étape du couplage d’acides aminés est approfondie. Alternativement, une petite quantité de peptide peut être clivée de la résine et vérifiée par LC-MS pour un couplage réussi.

5. Bisalkylation entre Met et Cys (Figure 3)

  1. Construire un peptide linéaire avec Met et Cys en répétant les étapes 4.1-4.6. Ajouter 10 mL de méthanol anhydre à la colonne avec de la résine pour déshydrater et sécher avec N2 pour la prochaine utilisation (répéter 2x) après couplage peptidique linéaire.
  2. Peser 100 mg de la résine obtenue à l’étape précédente dans une colonne (réservoir de 20 mL) et laver la résine avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) avant l’étape de couplage.
  3. Préparez une solution pour supprimer le groupe de protection Cys trt(trityl). Préparer un volume suffisant (100 mL) de mélange TFA/TIS/DCM (3:5:92) dans un récipient en verre pour enlever le groupe protectiove.
  4. Ajouter 5 à 10 mL de la solution de TFA/TIS/DCM (3:5:92) dans la colonne pour retirer le groupe de protection pendant 10 min. Répétez six fois avec N2 bouillonnant jusqu’à ce que la couleur jaune disparaisse complètement.
  5. Vidangez la solution à l’aide d’une pompe à vide et lavez la résine séquentiellement avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) 5x.
  6. Préparez une solution pour réagir avec des Cys déprotégés. Préparer un volume suffisant (50 mL) de solution de mélange (DMF) comprenant un agent de liaison dihalogéné (2 eq) et du DIPEA (4 eq) pour réagir avec des Cys déprotégés.
  7. Ajouter 5 à 10 mL de la solution réactionnelle à la colonne pour réagir avec les Cys déprotégés pendant au moins 3 h avec des bulles de N2 . Déshydrater avec du méthanol anhydre et sécher avec duN2 pour la prochaine utilisation.
  8. Vidangez la solution à l’aide d’une pompe à vide et lavez la résine séquentiellement avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) 5x.
  9. Préparer une solution pour la cyclisation peptidique : préparer un volume suffisant (20 mL) de mélange TFA (TFA:TIS:H 2 O = 95:2.5:2.5) dans un récipient en verre dans la hotte pour la cyclisation peptidique.
  10. Ajouter 5 à 10 mL de la solution de mélange TFA dans le tube en polypropylène et fendre la résine sous le cocktail TFA pendant 3 h.
    ATTENTION : L’AGT est très corrosif et irritant; Le processus de clivage peptidique doit être effectué dans une hotte.
  11. Effectuer les étapes 7.1-7.5 pour obtenir une solution peptidique linéaire par purification en phase liquide en phase inverse (HPLC). Lyophiliser la solution pour la prochaine utilisation.

6. cyclisation du sel de propargylsulfonium (figure 4)

  1. Construire un peptide linéaire avec Met et Cys en répétant les étapes 4.1-4.6. Ajouter 10 mL de méthanol anhydre à la colonne avec la résine pour déshydratation et sécher avec N2 pour la prochaine utilisation (répéter deux fois) après couplage peptidique linéaire.
  2. Peser 100 mg de la résine obtenue à l’étape précédente dans une colonne (réservoir de 20 mL) et laver la résine avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) avant l’étape de couplage.
  3. Effectuer les étapes 7.1-7.5 pour obtenir une solution peptidique linéaire par CLHP, et lyophiliser l’échantillon, comme mentionné, pour la prochaine utilisation.
  4. Préparer une solution aqueuse HCOOH à 1 % (en volume) et du bromure de propargyle à 1,0 mM (5 eq) et ajouter à la solution peptidique Met (0,2 mM, 1 éq; 0,2 mL de MeCN/H2O[1:1, v/v]).
  5. Ensuite, agiter la réaction de couplage du Met et du bromure de propargyle à température ambiante pendant 12 h.
  6. Après la réaction, dissoudre le produit dans un tube en polypropylène dans de l’acétonitrile et le filtrer à travers une membrane de filtre de 0,22 μm. Ensuite, purifiez immédiatement la solution par CLHP en phase inverse et lyophilisez-la en poudre pour la prochaine utilisation.
  7. Dans la dernière étape, ajouter le peptide avec du bromure de propargyle dans un tube en polypropylène, maintenir le pH de la solution réactionnelle à 8,0 en ajoutant une solution de (NH4)2CO3 et agiter le mélange réactionnel à 37 °C pendant 12 h. Cette étape permet d’obtenir le peptide cyclique du sel de propargylsulfonium.
  8. Recueillir le dernier mélange réactionnel : le dissoudre dans un tube en polypropylène dans de l’acétonitrile et le filtrer à travers une membrane filtrante de 0,22 μm. Ensuite, purifiez immédiatement la solution par CLHP en phase inverse et lyophilisez-la en poudre pour la prochaine utilisation.

7. Purification des peptides cycliques

  1. Construire des substrats peptidiques linéaires sur la résine Rink-amide MBHA en répétant les étapes 4.1-4.6. Ajouter 10 mL de méthanol anhydre à la colonne avec de la résine pour déshydratation et sécher avec N2 pour la prochaine utilisation (répéter deux fois) après couplage peptidique linéaire.
  2. Préparer un volume suffisant de cocktail de clivage (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) dans la hotte. Ajouter 1 à 5 mL de solution de mélange TFA dans le tube en polypropylène et fendre la résine sous le cocktail TFA pendant 3 h.
  3. Ensuite, sécher séquentiellement la résine sous une vapeur deN2 dans la colonne. Alternativement, utilisez un dispositif filtrant pour filtrer la résine et recueillir la solution peptidique. Ensuite, ajoutez 20 mL d’éther à la solution peptidique pour précipiter le peptide, centrifugez à 3 500 x g pendant 5 minutes et répétez deux fois. Recueillir le précipité peptidique brut et le sécher sous un flux deN2 pour l’étape suivante.
  4. Dissoudre 200 mg de peptide brut dans un tube en polypropylène dans 4 mL de solution acétonitrile-eau et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Transférer le peptide dans un flacon de CLHP. Placer l’insert dans l’échantillonneur automatique d’un système HPLC semi-préparatif en phase inverse équipé d’une colonne C18 de 5 μm, 4,6 mm x 250 mm et d’une boucle d’injection de 1 mL.
  5. Purifier et isoler le peptide en utilisant un programme de gradient de 5% à 95% d’acétonitrile dans l’eau avec 0,1% de TFA sur 30 min tout en surveillant les spectres HPLC en utilisant des UV à 254 nm. Confirmer le poids moléculaire du peptide par LC-MS, recueillir la solution du peptide et lyophiliser en poudre pour la prochaine utilisation.

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Representative Results

Tous les peptides linéaires ont été synthétisés sur la résine Rink-amide MBHA par synthèse manuelle standard en phase solide Fmoc. Un hexapeptide cyclique modèle (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2) a été construit comme décrit à la figure 5A. Notamment, un nouveau centre chiral sur attache a été généré par l’alkylation Met, avec les deux épimères de peptide cyclique (Ia, Ib) confirmés par HPLC en phase inverse. De plus, la conversion et le rapport des épimères ont été déterminés à l’aide de l’intégration de la CLHP en phase inverse. Les peptides cycliques Ac-(cyclo-I)-WMAAAC-NH2 1-Ia et 1-Ib, générés à partir de l’hexapeptide Ac-WMAAAC-NH2, présentaient des temps de rétention distincts et des masses moléculaires identiques (Figure 5B). Ensuite, la tolérance du peptide cyclique à différents groupes fonctionnels a été testée plus avant, comme le montre la figure 5C. L’efficacité de fermeture de boucle des 10 peptides linéaires a été évaluée à l’aide d’un agent de liaison di-halogéné, les résultats montrant que tous les peptides ont généré efficacement les peptides cycliques correspondants. Par rapport aux autres peptides cycliques, un peptide cyclique hexacyclique modèle avec des taux de conversion élevés produisait un rapport différentiel de 1:1 des épimères et pouvait être séparé par CLHP. Cependant, dans certains cas, les épimères peptidiques n’ont pas pu être séparés dans des conditions CLHP, probablement parce que le centre chiral du sulfonium de l’épimère n’était pas très stable et qu’il était lentement racémisé en mélanges d’épimères. L’efficacité de réaction des épimères (1-Ia) avec les pyridinrthiols (PyS) (10 mM) a ensuite été examinée par HPLC. La figure 5D montre les traces HPLC de la conversion dépendante du temps entre le peptide cyclique (1 mM) et son produit conjugué. Les traces montrent clairement la réduction dépendante du temps du peptide 1-Ia avec PyS dans PBS (pH 7,4).

Une autre stratégie pour la fermeture du cycle peptidique était que, d’abord, un groupe propargyle était attaché à Met, puis le centre propargylsulfonium formé déclenchait une réaction thiol-yne pour générer un peptide cyclique. Dans cette stratégie, la taille de l’anneau et la séquence peptidique n’ont pas affecté la réaction de cyclisation, le peptide contenant deux ou trois acides aminés étant simplement utilisé comme modèle pour fermer la boucle. La voie synthétique de cyclisation intramoléculaire des peptides est décrite à la figure 6A. De plus, un peptide modèle Met propargylé simplifié a été construit comme décrit à la figure 6B. Les résultats ont montré que le rendement du peptide modèle MC pouvait atteindre 80% lorsque le pH de la solution réactionnelle était réglé à 8,0 (MC fait référence à un peptide cyclique modèle synthétisé par cette voie; Figure 6A). De plus, le peptide modèle MC a été isolé et purifié par CLHP (Figure 6D), et son poids moléculaire a été confirmé par LC-MS (Figure 6C). Comme le montre la figure 6E, le changement chimique a été caractérisé par la RMN de 1H et la cohérence quantique unique hétéronucléaire (HSQC). En outre, le dithiothréitol (DTT) a été ajouté pour tenter d’ouvrir le cycle sulfonium afin d’explorer la stabilité de MC. Les résultats n’ont montré aucun produit d’addition ou d’ouverture de l’anneau après 24 h (figure 6F).

Figure 1
Figure 1 : Schéma de la configuration expérimentale d’un peptide en phase solide à base de Fmoc pour la synthèse de peptides. La colonne peptidique a été placée sur le réacteur en phase solide via des robinets d’arrêt à trois voies avec de l’azote ou de l’argon bouillonnant à travers la colonne pendant la synthèse peptidique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Peptides CM linéaires synthétiques intermoléculaires sur résine. Tous les peptides linéaires ont été synthétisés sur la résine Rink-amide MBHA par synthèse manuelle standard en phase solide Fmoc. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Voies synthétiques de cyclisation peptidique via Cys et bisalkylation Met. Les peptides linéaires contenant Met et Cys ont été construits en peptides cycliques stabilisés. Tout d’abord, le Cys protégé par TRT a été déprotégé avec 3% TFA dans DCM. Ensuite, un linker di-halogéné (2 eq) et un DIPEA (4 eq) ont été ajoutés pour réagir avec Cys pendant 3 h. Enfin, la cyclisation entre Cys et Met a été achevée lorsque la résine a été clivée dans une solution de clivage TFA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Voies synthétiques pour la cyclisation peptidique via Cys et Met thiol-yne. Tout d’abord, les peptides linéaires ont été purifiés et caractérisés par HPLC et LC-MS. La réaction s’est produite dans les conditions suivantes : une solution comprenant le composé (0,2 mM, 1,0 eq) dans 0,2 mL de MeCN/H2O (1:1, v/v), une solution aqueuse HCOOH à 1 % (en volume) et du bromure de propargyle (1,0 mM, 5,0 eq) a été agitée à température ambiante pendant12h à un pH de 8,0. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Schéma de synthèse de peptides cycliques utilisant la bisalkylation entre Cys et Met. (A) Illustration schématique de la cyclisation peptidique par Cys et Met. (B) Le spectre CLHP et LC-MS des épimères (1-Ia et 1-Ib). (C) La tolérance fonctionnelle aux résidus des différents peptides a été testée. (D) traces CLHP de la conversion dépendante du temps entre les épimères (1-Ia; 1 mM) et leurs produits conjugués. Ce chiffre est une modification de celui rapporté par Wang et al.30. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Schéma de synthèse de peptides cycliques utilisant une réaction de type thiol-yne. (A) Construction facile de la cyclisation peptidique par la réaction thiol-yne. MC fait référence à un peptide cyclique modèle synthétisé par la voie. (B) cyclisation peptidique intramoléculaire de différents peptides linéaires. a = 1 mL de solution aqueuse de 1 M (NH4)2CO3. b = 1 % Et3N dans 1 mL de MeCN/H2O (1:1). Abréviations : Ahx = acide 6-aminocaproïque. Le rendement a été calculé comme le pourcentage du produit déterminé par pesée. La conversion représentait la quantité de matière de départ qui a réagi par HPLC. (C) Le spectre LC-MS du peptide de cyclisation MC. (D) Le spectre CLHP du peptide de cyclisation MC. (E) Caractérisationdes spectres RMN 1 H et HSQC des peptides cycliques MC. (F) Spectres RMN 1H de la conversion dépendante du temps entre le peptide cyclique MC et la TNT en D2O pendant 3 h, 6 h, 12 h et 24 h. Ce chiffre est une modification de celui rapporté par Hou et al.31. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’approche synthétique décrite dans cet article fournit une méthode de synthèse de peptides cycliques à l’aide de Cys et Met dans la séquence peptidique, dans laquelle les peptides linéaires de base sont construits par des techniques courantes de synthèse peptidique en phase solide. Pour la bisalkylation de peptides cycliques entre Cys et Met, l’ensemble de la voie synthétique peut être divisé en trois processus majeurs : la déprotection des Cys sur la résine, le couplage de l’agent de liaison, et la cyclisation entre Cys et Met dans une solution de clivage d’acide trifluoroacétique. Notamment, le retrait du groupe protecteur de Cys s’est avéré être une étape critique pour la réaction ultérieure de fermeture de l’anneau. Par conséquent, trt-Cys a été déprotégé, et cela a été fait jusqu’à ce que la solution n’ait plus de couleur jaune apparente. D’autres études ont montré que les peptides cycliques développés par la bisalkylation entre la méthodologie Cys et Met pouvaient être étendus à la fermeture de boucle dans une variété de peptides, à condition que le peptide contienne les acides aminés Cys et Met. En outre, la séquence peptidique et le linker pourraient également être ajustés en fonction de la conception expérimentale (Figure 5). Il était donc nécessaire de surveiller la synthèse par LC-MS.

Pour les peptides cycliques dans la réaction de type thiol-yne, tout d’abord, les peptides linéaires ont également été construits par des techniques courantes de synthèse de peptides en phase solide sur résine, les réactions suivantes étant effectuées dans la solution en phase liquide. Les peptides bruts ont ensuite été clivés de la résine et purifiés par HPLC en phase inverse. Une solution de peptides et de bromure de propargyle a été ajoutée à la réaction pendant 12 h, ainsi que 0,2 mL de MeCN/H2O(1:1, v/v) et une solution aqueuse HCOOH à 1 %, et les produits ont ensuite été purifiés immédiatement par CLHP en phase inverse. Étonnamment, la réaction de fermeture de l’anneau s’est produite lorsque le pH de la solution réactionnelle a été augmenté à 8,0. Cette étude a développé une méthode qui contraint le peptide à une structure de conformation cyclique avec une bonne stabilité via une réaction de type thiol-yne. De plus, il a fallu ajuster le solvant pour la fermeture de la boucle peptidique en raison de l’hydrophilie et de l’hydrophobicité des peptides étant différentes. Par exemple, le pH du peptide hydrophile a été ajusté par (NH4)2CO 3, et le peptide hydrophobe a ensuite été ajusté par un solvant mixte (solution à 1 % et3 Ndans 50 % MeCN/H2O; Graphique 6).

Au cours des dernières années, diverses technologies de ligature ont été développées pour synthétiser des peptides cycliques, ces technologies générant des liaisons peptidiques naturelles et des liaisons squelettiques non naturelles32. Cependant, des défis subsistent dans le domaine des peptides cycliques synthétiques. Tout d’abord, la séquence d’acides aminés du peptide a un effet stérique, et l’efficacité de la cyclisation peut être affectée par les résidus proches du site de cyclisation. Deuxièmement, la structure spatiale des peptides est diversifiée et il peut être nécessaire de choisir soigneusement le site de connexion lors de la fermeture de l’anneau sur le même site. Enfin, les séquences peptidiques contiennent des acides aminés hydrophiles ou hydrophobes et, par conséquent, la solubilité du solvant réactionnel doit être prise en compte. Par conséquent, davantage d’efforts devraient être déployés pour identifier la cyclisation au site, la solubilité et les isomères afin de développer davantage les applications cycliques des peptides dans l’industrie pharmaceutique.

Dans cette recherche, une série de protocoles de macrocyclisation faciles utilisant la bisalkylation entre Cys et Met ou via une réaction de type thiol-yne ont été conçus pour résoudre les défis de la synthèse de peptides cycliques. Heureusement, ces réactions étaient faciles, très efficaces et sans catalyseur métallique. Il a été démontré que les méthodes développées fonctionnent à la fois de manière intermoléculaire et intramoléculaire et ont une tolérance fonctionnelle satisfaisante du groupe. De plus, ces méthodes ont été développées pour introduire la cyclisation par contraintes, garantissant que la chaîne peptidique est plus stabilisée conformationnellement, améliorant ainsi l’affinité de liaison aux protéines cibles et réduisant la liaison aux protéines non spécifiques. En outre, en utilisant des conceptions raisonnables, la sélectivité du site de réaction pourrait également être améliorée en formant un peptide de cyclisation stabilisé conformationnellement. Dans l’ensemble, la cyclisation de la chaîne peptidique a généré des composés biologiquement actifs, ce qui indique que les peptides cycliques sont des candidats médicaments prometteurs.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous reconnaissons le soutien financier du Programme national de R&D clé de la Chine (2021YFC2103900); les subventions de la Fondation chinoise des sciences naturelles (21778009 et 21977010); la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (2022A1515010996 et 2020A1515010521): le Comité de l’innovation scientifique et technologique de Shenzhen (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 et JCYJ20200109140406047); et la subvention Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions (2019SHIBS0004). Les auteurs remercient le soutien de la revue Chemical Science , The Royal Society of Chemistry pour la référence 30 et The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, pour la référence 31.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3-bis(bromomethyl)-benzen Energy D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid Energy A46873
1H NMR and HSQC Bruker  AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate Energy E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) Energy A1797
2-mercaptopyridine Energy Y31130
6-Aminocaproic acid Energy A010678
Acetic anhydride Energy A01021454
Acetonitrile Aldrich 9758
Ammonium carbonate Energy 12980
Dichloromethane (DCM) Energy W330229
Digital Heating Cooling Drybath  Thermo Scientific 88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA) Energy W320014
Dimethyl formamide (DMF) Energy B020051
Dithiothreitol Energy A10027
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU2020  LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30701
Fmoc-His(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30902
Fmoc-Ile-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31201
Fmoc-Met-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31301
Fmoc-Pro-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31901
Fmoc-Val-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R32001
Formic acid Energy W810042
High Performance Liquid
Chromatography		 SHIMADZU LC-2030
Methanol Aldrich 9758
Morpholine Aldrich M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide Energy B010023
Ninhydrin Reagent Energy N7285
Propargyl bromide Energy W320293
Rink Amide MBHA resin Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates  Thermo Scientific 60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium Energy T1350
Three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
Triethylamine Energy B010737
Trifluoroacetic acid (TFA) J&K 101398
Triisopropylsilane (TIS) Energy T1533

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References

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Chimie numéro 187 Peptides cycliques bisalkylation/désalkylation bromure de propargyle stabilisation cystéine méthionine
Construction de peptides cycliques à l’aide d’un centre de sulfonium sur attache
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Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu,… More

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu, Z., Lian, C., Zhang, M., Liang, W., Yin, F., Li, Z. Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center. J. Vis. Exp. (187), e64289, doi:10.3791/64289 (2022).

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