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Bioengineering

पीढ़ी, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग, और मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियक स्फेरॉइड की बायोबैंकिंग

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64365
Automatic Translation
1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, *1, *1
1Utrecht Regenerative Medicine Center, Circulatory Health Laboratory, University Utrecht, Department of Cardiology, University Medical Center Utrecht, 2Amsterdam Cardiovascular Sciences, Department of Physiology, Amsterdam University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स से कार्डियक स्फेरॉइड (सीएस) की पीढ़ी और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए प्रोटोकॉल का एक सेट है, जिसे उच्च-थ्रूपुट, बहुआयामी प्रारूप में संवर्धित किया गया है। यह त्रि-आयामी मॉडल रोग मॉडलिंग, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक मजबूत मंच के रूप में कार्य करता है, और क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद इसकी कार्यक्षमता बनाए रखता है।

Abstract

मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (HIPSC-CMs) मानव हृदय रोग मॉडलिंग और चिकित्सीय के लिए सर्वोपरि महत्व के हैं। हमने हाल ही में दो आयामों (2 डी) में एचआईपीएससी-सीएम के बड़े पैमाने पर विस्तार के लिए एक लागत प्रभावी रणनीति प्रकाशित की है। दो प्रमुख सीमाएं सेल अपरिपक्वता और तीन आयामी (3 डी) व्यवस्था की कमी और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) प्लेटफार्मों में स्केलेबिलिटी हैं। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, विस्तारित कार्डियोमायोसाइट्स 3 डी कार्डियक सेल संस्कृति और ऊतक इंजीनियरिंग तकनीकों की पीढ़ी के लिए एक आदर्श सेल स्रोत बनाते हैं। उत्तरार्द्ध कार्डियोवैस्कुलर क्षेत्र में बड़ी क्षमता रखता है, जो अधिक उन्नत और शारीरिक रूप से प्रासंगिक एचटीएस प्रदान करता है। यहां, हम 96-वेल-प्रारूप में कार्डियक स्फेरॉइड (सीएस) की पीढ़ी, रखरखाव और ऑप्टिकल विश्लेषण के लिए आसान स्केलेबिलिटी के साथ एक एचटीएस-संगत वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं। ये छोटे सीएस वर्तमान इन विट्रो रोग मॉडल और / या 3 डी ऊतक इंजीनियरिंग प्लेटफार्मों के लिए पीढ़ी में मौजूद अंतर को भरने के लिए आवश्यक हैं। सीएस एक अत्यधिक संरचित आकृति विज्ञान, आकार और सेलुलर संरचना प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, सीएसएस के रूप में संवर्धित एचआईपीएससी-सीएम बढ़ी हुई परिपक्वता और मानव हृदय की कई कार्यात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि सहज कैल्शियम हैंडलिंग और सिकुड़ा हुआ गतिविधि। पूर्ण वर्कफ़्लो के स्वचालितीकरण द्वारा, सीएस की पीढ़ी से कार्यात्मक विश्लेषण तक, हम उच्च-थ्रूपुट (एचटी) इमेजिंग और कैल्शियम हैंडलिंग विश्लेषण द्वारा प्रदर्शित इंट्रा-और इंटर-बैच प्रजनन क्षमता को बढ़ाते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल हृदय रोगों के मॉडलिंग और पूरी तरह से स्वचालित एचटीएस वर्कफ़्लो में एक जटिल 3 डी सेल वातावरण के भीतर एकल-कोशिका स्तर पर दवा / चिकित्सीय प्रभावों का आकलन करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, अध्ययन पूरे स्फेरॉइड के दीर्घकालिक संरक्षण और बायोबैंकिंग के लिए एक सीधी प्रक्रिया का वर्णन करता है, जिससे शोधकर्ताओं को अगली पीढ़ी के कार्यात्मक ऊतक भंडारण बनाने का अवसर मिलता है। दीर्घकालिक भंडारण के साथ संयुक्त एचटीएस दवा की खोज और परीक्षण, पुनर्योजी चिकित्सा और व्यक्तिगत उपचारों के विकास सहित क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला में ट्रांसलेशनल अनुसंधान में काफी योगदान देगा।

Introduction

मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) की खोज ने सेलुलर स्तर पर मानव विकास और बीमारी का अध्ययन करने के लिए अभूतपूर्व अवसर प्रदान किए। पिछले एक दशक में, विकास ता्मक सबक का उपयोग करते हुए, कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) 1,2,3,4 में एचआईपीएससी के कुशल भेदभाव को सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल स्थापित किए गए हैं। HIPSC-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (HIPSC-CMs) आनुवंशिक रूप से विरासत योग्य कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों (CVDs) के मॉडलिंग, नई दवाओं के लिए हृदय सुरक्षा का परीक्षण, और कार्डियक पुनर्योजी रणनीतियों 5,6,7,8 के लिए एक संसाधन के रूप में काम कर सकते हैं। एचआईपीएससी के निर्देशित कार्डियक भेदभाव के बावजूद, अनिश्चित सीएम नंबर कार्डियक क्षेत्र में एक चुनौती बनी हुई है, क्योंकि परिपक्व एचआईपीएससी-सीएम आम तौर पर गैर-प्रोलिफेरेटिव होते हैं, और प्राथमिक मानव कोशिकाएं उच्च मात्रा में उपलब्ध नहीं होती हैं।

हाल ही में, हमने वर्णन किया कि कम सेल-घनत्व संस्कृति के साथ सहवर्ती डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग सक्रियण के परिणामस्वरूप एचआईपीएससी-सीएम 9,10 की बड़े पैमाने पर प्रोलिफेरेटिव प्रतिक्रिया (250 गुना तक) हुई। कल्चर फ्लास्क प्रारूप में सीरियल पासिंग के माध्यम से एचआईपीएससी-सीएम के बड़े पैमाने पर विस्तार के लिए यह लागत प्रभावी रणनीति बड़ी संख्या में कार्यात्मक एचआईपीएससी-सीएम के मानकीकरण और गुणवत्ता नियंत्रण की सुविधा प्रदान करती है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न दाताओं से एचआईपीएससी-सीएम के बड़े बैचों की मांग को बनाए रखने के लिए, एचआईपीएससी-सीएम की बायोबैंकिंगका वर्णन किया गया है। हालांकि, इन मानक संस्कृति व्यंजनों में बीजित कार्डियोमायोसाइट मोनोलेयर हृदय में मौजूद जटिल 3 डी संरचना का प्रतिनिधि नहीं हैं। इसके अलावा, एचआईपीएससी-सीएम की अपरिपक्वता एक बाधा बनी हुई है, इस प्रकार विवो कार्डियोवैस्कुलर वातावरण के जैविक और शारीरिक फेनोटाइप की नकल करने में कम हो गई है।

नोवेल 3 डी इन विट्रो मॉडल विकसित किए गए हैं जहां एचआईपीएससी-सीएम आत्म-संगठन11,12, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) रीमॉडेलिंग 13, बढ़ी हुई परिपक्वता 14,15,16, और सिंक्रनाइज़ संकुचन 17,18,19 जैसे करीबी शारीरिक व्यवहार दिखाते हैं . 3 डी मॉडल का उपयोग दवा की खोज, दवा कार्डियोटॉक्सिसिटी परीक्षण, रोग मॉडलिंग, पुनर्योजी उपचार, और यहां तक कि पहले नैदानिकपरीक्षणों 20,21,22,23,24 के लिए किया गया है। सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले मॉडलों में से एक फाइब्रिन-आधारित इंजीनियर हृदय ऊतक (ईएचटी) है, जो ऊतक जैसी व्यवस्था और हृदय संकुचन 13,17,25 प्रदर्शित करता है। इससे पहले, हमने दिखाया कि विस्तारित एचआईपीएससी-सीएम से उत्पन्न ईएचटी ने विस्तारित एचआईपीएससी-सीएम के साथ तुलनीय अनुबंध प्रदर्शित किया, जो विस्तार के बाद असंबद्ध सेलुलर कार्यक्षमता का प्रदर्शन करताहै। फिर भी, भले ही एचआईपीएससी-सीएम से ईएचटी की पीढ़ी अच्छी तरह से स्थापित की गई है, एचटी मूल्यांकन मंच की स्थापना के बारे में आगे के विकास की उम्मीद है। यहां, 96-वेल प्रारूप में बड़ी संख्या में स्व-एकत्रित कार्डियक स्फेरॉइड (सीएस) की तेजी से पीढ़ी उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) उद्देश्यों के लिए 3 डी स्थितियों में सुधार की अनुमति देती है।

कुल मिलाकर, 3 डी सेल संस्कृति के रूप में सीएस का लाभ उनकी उच्च प्रजनन क्षमता और मापनीयता है। विशेष रूप से, रोबोटिक नमूना हैंडलिंग के साथ संयुक्त सीएस सीएस संस्कृति, दवा उपचार और उच्च-सामग्री विश्लेषण 20 को मानकीकृत और स्वचालित करसकते हैं। यहां, हम उच्च शुद्धता और उच्च गुणवत्ता वाले सीएस उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसे ऑप्टिकल कैल्शियम अधिग्रहण और विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके सीए2 + क्षणिक माप करके कार्डियक फ़ंक्शन के लिए कुशलतापूर्वक क्रायोप्रिजर्व और स्क्रीनिंग की जा सकती है। यह मॉडल सैकड़ों से हजारों स्फेरॉइड17,18 पर उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन करने के लिए एक सरल लेकिन शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।

Protocol

नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए गए एचआईपीएससी-सीएम पहले वर्णित एचआईपीएससी संवर्धन और सीएम भेदभाव प्रोटोकॉल26,27 के अनुसार उत्पन्न हुए थे। वैकल्पिक रूप से, एचआईपीएससी-सीएम का विस्तार किया जा सकता है और सीएस प्रोटोकॉल (धारा 4)10 शुरू करने से पहले हाल ही में प्रकाशित किया गया है।

1. सेल संस्कृति मीडिया, समाधान और एलिकोट की तैयारी

  1. बेसल माध्यम तैयार करें
    1. पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और माध्यम (आरपीएमआई 1640) को कमरे के तापमान (आरटी) में बराबर करें और सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से पिघल गया है। मध्यम के 500 एमएल और 5 एमएल पेन /स्ट्रेप को मिलाएं। 8 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें; उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक बराबर करें।
  2. RPMI + B27 तैयार करें
    1. बी 27 पूरक और बेसल माध्यम को आरटी में बराबर करें। पूरक को पूरी तरह से पिघलाना सुनिश्चित करें। बेसल माध्यम के 490 एमएल और 50x B27 पूरक के 10 एमएल मिलाएं। 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें; उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक बराबर करें।
  3. HIPSC-CM री-प्लेटिंग मीडिया तैयार करें
    1. आरपीएमआई + बी 27 मीडिया में प्रोटीन काइनेज (रॉक) अवरोधक (2 एसएम अंतिम एकाग्रता) और 10% नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन (केएसआर) युक्त आरएचओ-संबद्ध, कुंडलित-कॉइल जोड़ें। आवश्यकतानुसार आरएम मीडिया में सीधे रॉक अवरोधक जोड़ें। एक बार पूरक होने के बाद संस्कृति मीडिया को स्टोर न करें।
  4. सीएम को मीडिया को पिघलाने की तैयारी करें
    1. सेल सर्वाइवल सप्लीमेंट (जैसे, रेविटेसेल) की 1:100 एकाग्रता जोड़ें और आरपीएमआई + बी 27 मीडिया में 20% केएसआर जोड़ें और उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक बराबर करें।
  5. परिपक्वता पूरक तैयार करें
    1. पहले वर्णित परिपक्वता मध्यम सूत्र28 में शामिल हैं: 3 एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम एल-लैक्टेट, 5 मिलीग्राम / एमएल विटामिन बी 12, 0.82 एमएम बायोटिन, 5 एमएम क्रिएटिन मोनोहाइड्रेट, 2 एमएम टॉरिन, 2 एमएम एल-कार्निटाइन, 0.5 एमएम एस्कॉर्बिक एसिड, 1 एक्स एनईएए, 0.5% (डब्ल्यू / वी) एल्बुमैक्स, 1 एक्स बी 27, और 1% केओएसआर। परिपक्वता पूरक की एक पूर्ण बोतल (500 एमएल) तैयार करने के लिए, ग्लूकोज के बिना डीएमईएम की एक बोतल से 65 एमएल निकालें और 2.7 ग्राम ग्लूकोज, 5.6 ग्राम एल-लैक्टेट, 0.025 मिलीग्राम विटामिन बी 12, 1 मिलीग्राम बायोटिन, 3.73 ग्राम क्रिएटिन मोनोहाइड्रेट, 1.25 ग्राम टॉरिन, 1.975 ग्राम एल-कार्निटाइन, 0.7125 ग्राम एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक करें। एनईएए के 50 एमएल, एल्ब्यूमैक्स के 12.5 ग्राम, और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 एमएल।
    2. 0.22 μm छिद्र पॉलीथेरसल्फोन (PES) झिल्ली के साथ एक बाँझ डिस्पोजेबल फ़िल्टर इकाई के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    3. 45 एमएल (परिपक्वता माध्यम के 500 एमएल तैयार करने के लिए) या 4.5 एमएल (परिपक्वता माध्यम के 50 एमएल तैयार करने के लिए) में एलिकोट करें। 6 महीने तक 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. परिपक्वता मीडिया तैयार करें
    1. बी 27 पूरक, नॉकआउट एसआर, पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, परिपक्वता पूरक28, और आरटी में डीएमईएम नो-ग्लूकोज माध्यम को बराबर करें। 50x B27 पूरक के 10 एमएल, पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 एमएल, नॉकआउट एसआर के 5 एमएल और परिपक्वता पूरक के 45 एमएल के साथ डीएमईएम नो ग्लूकोज माध्यम के 435 एमएल मिलाएं। 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें; उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर बराबर करें।
  7. फ़्लोर उज्ज्वल माध्यम तैयार करें
    1. आरटी में पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और डीएमईएम फ्लोरोब्राइट माध्यम को बराबर करें। सुनिश्चित करें कि पूरक पूरी तरह से पिघल गया है। 5 एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डीएमईएम फ्लोरब्राइट माध्यम के 500 एमएल मिलाएं। 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें; उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर बराबर करें।
  8. गैर-आयनिक डिटर्जेंट समाधान तैयार करें
    1. पीबीएस के साथ 20% डब्ल्यू / वी गैर-आयनिक डिटर्जेंट पाउडर (जैसे, एफ -127) मिलाएं। 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें और 6 महीने तक 4 °C पर स्टोर करें; उपयोग से पहले आरटी पर समतुल्य करें।
  9. कैल्शियम डाई माध्यम तैयार करें
    1. गैर-आयनिक डिटर्जेंट समाधान (0.04% v / v की अंतिम सांद्रता) और कैल्शियम डाई (जैसे, Cal520 AM) के 0.1x को फ्लोर उज्ज्वल माध्यम में मिलाएं। एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, Cal520 के 10 μL और गैर-आयनिक डिटर्जेंट समाधान के 20 μL जोड़ें। पूरी तरह से घुलने तक मिलाएं। कोशिकाओं में जोड़ने से पहले समाधान को अंधेरे में रखें।

2. बफर की तैयारी

  1. परमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग बफर तैयार करें: इस बफर में 10 एमएल पीबीएस, 5% डब्ल्यूटी / वी बीएसए और 0.3% वी / वी ट्राइटन-एक्स -100 शामिल हैं।
  2. फ्लो साइटोमेट्री बफर तैयार करें: इस बफर में 50 एमएल पीबीएस, 1% डब्ल्यूटी / वी बीएसए और 0.3% वी / वी ट्राइटन-एक्स -100 शामिल हैं।
  3. फ्लो साइटोमेट्री वाशिंग बफर: इस बफर में 50 एमएल पीबीएस और 1% डब्ल्यूटी / वी बीएसए होता है।
  4. स्फेरॉइड वाशिंग बफर (एसडब्ल्यूबी): इस बफर में ट्राइटन-एक्स -100 का 1 एमएल, 10% का 2 एमएल (डीपीबीएस में डब्ल्यू / वी) एसडीएस, और पीबीएस के 1 एल में 2 ग्राम बीएसए होता है।
    नोट: SWB को 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. एम्बेडिंग समाधान (ईएस) तैयार करें: एम्बेडिंग समाधान के 100 एमएल तैयार करने के लिए, ग्लिसरॉल के 9.09 एमएल डीएच2ओ, 1 एमएल ट्राइस बफर (1 एम, पीएच 8.0), और ईडीटीए (0.5 एम) के 200 μL के साथ ग्लिसरॉल मिलाएं। 22.7 ग्राम फ्रुक्टोज जोड़ें और घुलने तक अंधेरे में आरटी पर मिलाएं। स्पष्ट होने पर, 22.2 ग्राम फ्रुक्टोज जोड़ें और घुलने तक मिलाएं। फिर 15 ग्राम यूरिया जोड़ें और घुलने तक मिलाएं (अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें)।
  6. पीबीटी (ट्वीन -20 के साथ पीबीएस) बफर तैयार करें। इस बफर में पीबीएस/ट्वीन-20 (0.1% v/v) होता है। पीबीएस के 1 एल के लिए, ट्वीन -20 का 1 एमएल जोड़ें।

3. छोटे अणुओं की तैयारी

  1. डीएमएसओ में 50 μL के 10 mM एलिकोट में थियाज़ोविविन (रॉक अवरोधक) पाउडर का पुनर्गठन करें और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रकाश से रक्षा करें।
  2. डीएमएसओ में कैल -520 एएम के प्रत्येक 10 μL के 2.5 mM एलिकोट तैयार करें और उन्हें 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रकाश से रक्षा करें।

4. कार्डियक स्फेरॉइड पीढ़ी

नोट: बड़ी मात्रा में सीएस के लिए, 2 एमएल एचआईपीएससी-सीएम री-प्लेटिंग मीडिया के साथ 6-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट में 1 मिलियन सीएम तक बीज। इस अध्ययन में 96-वेल प्लेट के प्रति कुएं में न्यूनतम 2,500 (2.5 k CS) से 20,000 (20k CS) HIPSC-CMs का उपयोग किया गया था।

  1. एक 96-वेल प्लेट के लिए, न्यूनतम 2 x 106 मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (HIPSC-CMs) 10 युक्त एक सेल कल्चर तैयार करें।
  2. जब सुसंस्कृत HIPSC-CM संगम तक पहुंचते हैं, तो प्रत्येक कुएं में बाँझ कार्डियक डिटेचमेंट समाधान (जैसे, ट्रिपल) के 0.1 एमएल / सेमी2 जोड़ें। प्लेट को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके, एकल सेल निलंबन बनाने के लिए 2 एमएल गर्म बेसल माध्यम के साथ फ्लश करके कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से अलग करें। एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप (4x आवर्धन) के साथ टुकड़ी की पुष्टि करें; कोशिकाएं सफेद दिखेंगी और उनका आकार गोल होगा।
  4. सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और 300 x g पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और एचआईपीएससी-सीएम री-प्लेटिंग मीडिया के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  6. 1,000 μL पिपेट टिप का उपयोग करके, यांत्रिक रूप से सेल गोली को अलग करें। समाधान तीन या चार मिश्रणों के बाद सजातीय दिखाई देता है। कोशिकाओं की गणना करें। पुन: चढ़ाना माध्यम के 100 μL में कोशिकाओं की उचित मात्रा को प्रत्येक अल्ट्रा-लो अटैचमेंट राउंड-बॉटम 96-वेल में स्थानांतरित करें।
  7. 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में 70 आरपीएम पर कक्षीय शेकर पर सीएस की प्लेट रखें। इनक्यूबेटर की स्थिति को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 21% ओ2 और 90% आर्द्रता पर सेट करें।
  8. प्रत्येक कुएं से 50 μL माध्यम को एस्पिरेट करें और पहले 48 घंटे के लिए प्रति कुएं आरपीएमआई + बी 27 माध्यम के 100 μL जोड़ें।
    नोट: आकस्मिक आकांक्षा और स्फेरॉइड टूटने से बचने के लिए हमेशा 96-वेल प्लेट में माध्यम का 50 μL रखें।
  9. प्रत्येक कुएं से माध्यम के 100 μL को एस्पिरेटेड करें और प्रति कुएं परिपक्वता माध्यम के 100 μL जोड़ें। परिपक्वता माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखें और हर 2-3 दिनों में माध्यम को ताज़ा करें।

5. सीएस का क्रायोप्रिजर्वेशन

नोट: सीएस को दीर्घकालिक भंडारण के लिए क्रायोप्रिजर्व किया जा सकता है। क्रायोप्रिजर्वेशन को सीएस की पीढ़ी के बाद तीसरे दिन से किया जा सकता है। सीएस को सीधे 96-वेल प्लेट के कुओं में या क्रायोवियल्स में सीएस निलंबन के रूप में क्रायोप्रिजर्व किया जा सकता है।

  1. प्लेट को 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखकर प्लेट को प्री-कूल करें।
  2. 70 x g पर 3 मिनट के लिए स्फेरॉइड प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. सतह पर तैरने वाले को 50 μL तक निकालें और प्रति अच्छी तरह से 200 μL बर्फ-ठंडा HIPSC फ्रीजिंग माध्यम जोड़ें।
    नोट: प्रक्रिया की पूरी अवधि के लिए सीएस निलंबन को बर्फ पर रखें। स्फेरॉइड के साथ 6-वेल प्लेट के मामले में, 500 μL फ्रीजिंग मीडियम क्रायोवियल में एक अच्छी तरह से फ्रीज करें।
  4. प्लेट सीलिंग फिल्म के साथ प्लेट को सील करें।
    नोट: 96-वेल प्लेट को पॉलीस्टाइनिन बॉक्स में संग्रहीत करने की आवश्यकता होती है या, जब उपलब्ध नहीं होता है, तो चरण 5.5.1 में वर्णित सिलिकॉन मोल्ड बनाया जा सकता है।
  5. अच्छी तरह से प्लेट और फ्रीजर के बीच समान गर्मी विनिमय सुनिश्चित करने के लिए, प्लेट को पॉलीस्टाइनिन बॉक्स में या सिलिकॉन मोल्ड में सावधानीपूर्वक रखें।
    1. सिलिकॉन मोल्ड तैयार करने के लिए: सिलिकॉन इलास्टोमेर किट के दो घटकों को 10: 1 अनुपात में सख्ती से मिलाएं। 15-20 मिनट के लिए वैक्यूम पंप का उपयोग करके समाधान को डी-बबल करें। इसके बाद, 10 मिनट के लिए वैक्यूम पंप का उपयोग करके कुएं की प्लेट और डी-बबल के निचले हिस्से के अंदर घोल डालें। मोल्ड को एक ओवन में रखें और प्लेट से छीलने वाले अर्ध-लचीले इलास्टोमर प्राप्त करने के लिए 8 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इलाज करें।
  6. पॉलीस्टाइनिन बॉक्स या तैयार सिलिकॉन मोल्ड में कम से कम 4 घंटे के लिए प्लेट को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  7. लंबे समय तक भंडारण के लिए प्लेट को तरल नाइट्रोजन टैंक या -150 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें।

6. कार्डियक स्फेरॉइड का पिघलना

नोट: त्वरित पिघलने की प्रक्रिया सुनिश्चित करने के लिए एक समय में एक से अधिक प्लेट को पिघलाएं नहीं।

  1. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस प्रीहीटेड बेसल माध्यम के 20 एमएल तैयार करें।
  2. तरल नाइट्रोजन से सीएस के साथ सेल प्लेट एकत्र करें और इसे 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें। इनक्यूबेटर की स्थिति को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 21% ओ2 और 90% आर्द्रता पर सेट करें।
  3. सतह पर तैरने वाला और सेल गोली को हटा दें, और प्रत्येक को गर्म बेसल माध्यम में फिर से निलंबित करें। प्रति अच्छी तरह से 200 μL मध्यम का उपयोग करें।
  4. 70 x g पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  5. चरण 6.3 और 6.4 दोहराएँ।
  6. सेल पेलेट के रहने तक सतह पर तैरने वाले को हटा दें और प्रत्येक कुएं में 200 μL CM पिघलने का माध्यम जोड़ें।
  7. 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में 70 आरपीएम पर कक्षीय शेकर पर सीएस की प्लेट रखें। इनक्यूबेटर की स्थिति को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 21% ओ2 और 90% आर्द्रता पर सेट करें।
  8. प्रत्येक कुएं से माध्यम के 50 μL को एस्पिरेट करें और पहले 48 घंटे के लिए प्रति अच्छी तरह से आरपीएमआई + बी 27 माध्यम का 100 μL जोड़ें।
  9. प्रत्येक कुएं से माध्यम के 100 μL को एस्पिरेट करें और प्रति अच्छी तरह से 100 μL परिपक्वता माध्यम जोड़ें। परिपक्वता मीडिया में कोशिकाओं को बनाए रखें और हर 2-3 दिनों में माध्यम को ताज़ा करें।

7. इंट्रासेल्युलर सीए2 + क्षणिकों का आकलन

नोट: सीएस कुल 3 सप्ताह के लिए संस्कृति में हैं; ठंड से 2 सप्ताह पहले, और पिघलने के 1 सप्ताह बाद। 'ताजा' नियंत्रण उम्र से मेल खाते हैं।

  1. संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद, पिघले हुए सीएस कैल्शियम हैंडलिंग ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए इष्टतम हैं। कोशिकाओं से सीए 2 + के उत्थान और रिलीज का आकलन करने के लिए कैल्शियम डाई (जैसे,Cal520AM ) का उपयोग करें।
  2. उन्हें प्रति कुएं 100 μL कैल्शियम डाई माध्यम के साथ उपचारित करें और इनक्यूबेटर में 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेटर की स्थिति को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 21% ओ2 और 90% आर्द्रता पर सेट करें।
    नोट: Cal520AM प्रकाश-संवेदनशील है। अंधेरे में सभी लोडिंग प्रक्रियाओं और प्रयोगों का प्रदर्शन करें।
  3. कैल्शियम अधिग्रहण और विश्लेषण प्रणाली तैयार करें।
    1. माइक्रोस्कोप को शक्ति दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पर्यावरण नियंत्रण विकल्प चालू है।
    2. पृष्ठभूमि क्षेत्र को कम करने के लिए कैमरे और फ्रेमिंग एपर्चर आयामों को समायोजित करें।
      नोट: यहां, लीका थंडर डीएमआई 8 माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था; अन्य माइक्रोस्कोप सिस्टम भी लागू होते हैं जब तक कि वे 30 फ्रेम / सेकंड (एफपीएस) से ऊपर नमूना दर की अनुमति नहीं देते हैं।
  4. 10 सेकंड के भीतर 2-10 चोटियों की लगातार धारा के साथ एक वीडियो रिकॉर्ड करें और 96-वेल प्लेट में स्कैन करें, शुरू में बाईं ओर जाएं, फिर पूरी प्लेट को कवर करने के लिए जिग-जैग फैशन में नीचे की ओर जाएं। 488 एनएम लेजर का उपयोग करके कैल्शियम सिग्नल को मापें; कैल्शियम रिलीज के दौरान एक उज्ज्वल हरे संकेत के साथ एक काली पृष्ठभूमि के विपरीत सेट करें।
  5. सीए2 + ट्रांसिएंट्स प्राप्त करने के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लोरेसेंस ट्रेस विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, साइटसीर, वाला साइंसेज) के साथ डेटा का विश्लेषण करें।

8. अलग कार्डियक स्फेरॉइड के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण

नोट: इस अध्ययन में, पिघलने की प्रक्रिया से पहले और बाद में सीएस की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग किया गया था।

  1. 70 x g पर 3 मिनट के लिए स्फेरॉइड क्षति और सेंट्रीफ्यूज से बचने के लिए 5 एमएल पाइप का उपयोग करके 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सीएस एकत्र करें। सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें और पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
  2. 200 x g पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और कार्डियक डिटेचमेंट समाधान (जैसे, ट्रिपल) के 1 एमएल जोड़कर सीएस को अलग करें। ट्यूब को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके, यांत्रिक रूप से 2 एमएल बेसल माध्यम के साथ फ्लश करके कोशिकाओं को अलग करें जब तक कि माइक्रोस्कोप के नीचे देखे जाने पर एकल कोशिकाओं को नहीं देखा जा सकता है।
  4. 200 x g पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  5. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और 1x PBS में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (PFA) समाधान के 200 μL के साथ सीएम को ठीक करें। आरटी पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. 200 x g पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें और पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
    नोट: विराम बिंदु: निश्चित HIPSC-CM को 4 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. सेल निलंबन को एफएसीएस ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेंट्रीफ्यूज को 200 x g पर 3 मिनट के लिए स्थानांतरित करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और परमेबिलाइजेशन बफर के50 μL में 1 x 10 5 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  8. कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  9. इम्यूनोफ्लोरेसेंस फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए, चरण 8.9.1-8.9.4 करें।
    1. फ्लो साइटोमेट्री बफर (50 μL) में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें जिसमें 1:300 के कमजोर पड़ने पर α-एक्टिनिन एंटीबॉडी होता है। एक अन्य एफएसीएस ट्यूब में, संबंधित आइसोटाइप नियंत्रण (उदाहरण के लिए, एफआईटीसी माउस आईजीएम, आइसोटाइप [1: 200 कमजोर पड़ने]) के साथ फ्लो साइटोमेट्री बफर (50 μL) में 1 x 105 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। इसी तरह, नकारात्मक नियंत्रण के लिए फ्लो साइटोमेट्री बफर के50 μL में 1 x 10 5 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    2. कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. फ्लो साइटोमेट्री बफर के 2.5 एमएल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें; सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और इस धोने के चरण को दो बार दोहराएं।
    4. द्वितीयक-एंटीबॉडी बकरी-विरोधी माउस (1: 300 कमजोर पड़ने) के साथ फ्लो साइटोमेट्री बफर के 50 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया गया।
      नोट: ट्यूब को अंधेरे में रखें क्योंकि द्वितीयक-एंटीबॉडी समाधान प्रकाश-संवेदनशील है।
  10. प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ व्यवहार्यता जांच के लिए, प्रति नमूना 150 μL PI (1: 1,000) जोड़ें और 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: ट्यूब को अंधेरे में रखें क्योंकि पीआई समाधान प्रकाश-संवेदनशील है।
  11. पूरक चित्र 1 में दिखाए गए मानक गेटिंग रणनीति के अनुसार गेट समायोजित करें और प्रवाह साइटोमीटर के साथ कोशिकाओं का विश्लेषण करें।

9. पूरे 3 डी स्फेरॉइड के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

नोट: यह प्रोटोकॉल इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग पर पूरे ऑर्गेनोइड्स के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल पर आधारित है, जिसे पहलेप्रकाशित किया गया था और कार्डियक स्फेरॉइड के लिए समायोजित किया गया था। प्रक्रिया के दौरान, सभी पिपेट टिप्स और शंक्वाकार ट्यूबों को 1% डब्ल्यूटी / वी बीएसए-पीबीएस के साथ लेपित किया जा सकता है ताकि स्फेरॉइड को प्लास्टिक से चिपकने से रोका जा सके। सामग्री को कोट करने के लिए, 1% बीएसए-पीबीएस में डुबकी लगाएं। यांत्रिक व्यवधान से बचने के लिए, 5 एमएल पाइप का उपयोग करके स्फेरॉइड को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें।

  1. 5 एमएल पाइप के साथ 15 एमएल लेपित ट्यूब में सीएस एकत्र करें। स्फेरॉइड आंखों को दिखाई देते हैं। प्रति एंटीबॉडी संयोजन ~ 20-50 स्फेरॉइड एकत्र करें। सेंट्रीफ्यूज 3 मिनट के लिए 70 x g पर और सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें।
  2. लेपित 1 एमएल टिप का उपयोग करके 1x PBS में 1 mL बर्फ-ठंडा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (PFA) समाधान में स्फेरॉइड को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
  3. 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिक्स करें। 20 मिनट के बाद, धीरे से लेपित 1 एमएल टिप का उपयोग करके स्फेरॉइड को फिर से निलंबित करें। यह सभी स्फेरॉइड के बीच निर्धारण को समान करता है।
  4. ट्यूब में 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पीबीएस जोड़ें और ट्यूब को उल्टा करके धीरे से मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और 3 मिनट के लिए 70 x g पर घूमें।
    नोट: इस चरण से, युक्तियों और शंक्वाकार ट्यूबों की कोटिंग की आमतौर पर आवश्यकता नहीं होती है क्योंकि निर्धारण के बाद सीएस टिप से चिपके नहीं रहते हैं।
  5. बर्फ-ठंडे एसडब्ल्यूबी (एसडब्ल्यूबी के 200 μL प्रति कुएं) में गोली को पुन: निलंबित करके सीएस को अवरुद्ध करें और स्फेरॉइड को 24-वेल सस्पेंशन कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करें।
    नोट: एक बड़े गोली से सीएस को अलग-अलग धुंधला करने के लिए कई कुओं में विभाजित किया जा सकता है। प्रति एंटीबॉडी संयोजन ~ 20-50 सीएस का उपयोग करें।
  6. कम से कम 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. संदर्भ के रूप में सेवा करने के लिए एक खाली कुएं में एसडब्ल्यूबी के 200 μL जोड़ें।
    नोट: इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के लिए, एंटीबॉडी उपयोग को कम करने के लिए 48- या 96-वेल प्लेटों का भी उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, प्रति अच्छी तरह से छोटी मात्रा के कारण धुंधलापन और धोने के परिणाम कम हो सकते हैं।
  8. प्लेट को 5 मिनट के लिए 45 ° कोण पर झुकाकर, प्लेट के तल पर बसने दें।
  9. SWB को हटा दें, CS को SWB के 200 μL में छोड़ दें (200 μL की न्यूनतम मात्रा का अनुमान लगाने के लिए संदर्भ का अच्छी तरह से उपयोग करें)।
  10. प्राथमिक एंटीबॉडी 2x केंद्रित (उदाहरण के लिए, एक्टिनिन [1:200] और ट्रोपोनिन टी [1:200]) के साथ SWB के 200 μL जोड़ें और रॉकिंग / शेकिंग (क्षैतिज शेकर पर 40 आरपीएम) के दौरान रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  11. अगले दिन, प्रत्येक कुएं में 1 एमएल एसडब्ल्यूबी जोड़ें।
  12. प्लेट को 5 मिनट के लिए 45 ° कोण पर छोड़कर स्फेरॉइड को प्लेट के तल पर बसने दें।
  13. प्लेट में 200 μL छोड़कर SWB को हटा दें। 1 एमएल एसडब्ल्यूबी जोड़ें और धीमी रॉकिंग / झटकों के साथ 2 घंटे के लिए धो लें।
  14. चरण 9.12 और 9.13 को दो बार दोहराएं।
  15. 5 मिनट के लिए प्लेट को 45 ° पर झुकाकर CS को प्लेट के तल पर बसने दें। SWB को हटा दें, प्रत्येक कुएं में 200 μL छोड़ दें
  16. द्वितीयक एंटीबॉडी, संयुग्मित एंटीबॉडी और डाई 2x केंद्रित (उदाहरण के लिए, DAPI [1 μg/mL], माउस-AF488 [1:500], खरगोश-AF568 [1:500]) के साथ SWB के 200 μL जोड़ें, और धीरे-धीरे हिलाते हुए अंधेरे में 4 °C पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  17. अगले दिन, चरण 9.12 और 9.13 को दो बार दोहराएं।
  18. सावधानीपूर्वक सीएस को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 3 मिनट के लिए 70 x g पर स्पिन करें।
  19. सीएस को बाधित किए बिना पाइपिंग द्वारा जितना संभव हो उतना एसडब्ल्यूबी को हटा दें।
  20. 200 μL टिप का उपयोग करके एम्बेडिंग समाधान (ES; कम से कम 50 μL, RT पर) जोड़ें और बुलबुला गठन को रोकने के लिए धीरे-धीरे पुन: निलंबित करें और 20 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
  21. इस बीच, नेल पॉलिश या सिलिकॉन सीलेंट के साथ ग्लास स्लाइड पर एक चौकोर कंटेनर बनाएं।
  22. 200 μL टिप के अंत को काट लें और ईएस में CS को वर्ग कंटेनर के बीच में स्थानांतरित करें।
  23. शीर्ष पर एक चौकोर कवरस्लिप रखें। हवा के बुलबुले को कम करने के लिए, कवरस्लिप के एक तरफ पहले रखें, फिर धीरे-धीरे कवरस्लिप को एक तरफ से दूसरी तरफ कम करें जब तक कि सतह के नीचे कोई फंसी हुई हवा न हो, और फिर कवरस्लिप को छोड़ दें।
  24. नेल पॉलिश या सिलिकॉन सीलेंट पर सील करने के लिए कवरस्लिप के सभी किनारों पर धीरे से धक्का दें।
  25. आरटी पर रात भर स्लाइड छोड़ दें। अगले दिन, स्लाइड इमेजिंग के लिए तैयार है।
    नोट: ईएस द्वारा ऑप्टिकल क्लियरिंग मामूली ऊतक संकोचन का कारण बन सकती है। हालांकि, यह सीएस के समग्र आकृति विज्ञान को प्रभावित नहीं कर सकता है। धुंधला प्रक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस (कम से कम 1 सप्ताह के लिए) या -20 डिग्री सेल्सियस (कम से कम 6 महीने के लिए) पर संग्रहीत करके यहां रोका जा सकता है।

Representative Results

चित्रा 1 ए में दिखाया गया प्रोटोकॉल पहले विस्तारित एचआईपीएससी-सीएम से सीएस की पीढ़ी का वर्णन करता है। सीएस अल्ट्रा-लो अटैचमेंट राउंड-बॉटम प्लेटों में दिन 1 पोस्ट-सीडिंग द्वारा 3 डी संरचना प्राप्त करते हैं और इसे 6 सप्ताह तक सुसंस्कृत किया जा सकता है (चित्रा 1 बी)। जैसा कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा मूल्यांकन किया गया है, 3 सप्ताह के सीएस में अधिकांश कोशिकाओं ने α-एक्टिनिन और ट्रोपोनिन टी जैसे सरकोमेरिक प्रोटीन व्यक्त किए और नियमित सार्कोमेरे संगठन (चित्रा 1 सी) प्रदर्शित किया। α-एक्टिनिन सकारात्मक कोशिकाओं की मात्रा का परिमाणीकरण के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण किया गया था। इम्यूनोफ्लोरेसेंस परिणामों के अनुसार, फ्लो साइटोमेट्री डेटा ने दोनों दिन 0 (76.9% ± 16.6%) और 3 सप्ताह के सीएस (71.1% ± 22.7%) (चित्रा 1 डी) में α-एक्टिनिन के तुलनीय उच्च स्तर का प्रदर्शन किया, जो संवर्धन के दौरान एक स्थिर और अत्यधिक शुद्ध सेलुलर संरचना को दर्शाता है। एचआईपीएससी-सीएम व्युत्पन्न स्फेरॉइड (दिन 42) बनाम एचआईपीएस-सीएम-सीएम में जंक्शनों (जीजेए 1, जेपीएच 2, और पीकेपी 2), डेसमोसोम (डीईएस), और माइटोकॉन्ड्रिया (एटीपी 5 ए) के लिए कार्डियक जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई थी। इन जीनों की अभिव्यक्ति सेल-सेल इंटरैक्शनऔर परिपक्वता की एक पहचान है।

इसके बाद, सीएस के कार्यात्मक गुणों, अर्थात् बीटिंग रेट और सीए2 + हैंडलिंग, का मूल्यांकन अलग-अलग समय बिंदुओं पर किया गया था (चित्रा 2)। कैल्शियम क्षणिक मापदंडों जैसे कि वृद्धि समय, पीक समय, क्षय समय, और कैल्शियम क्षणिक अवधि (सीटीडी 90) का मूल्यांकन किया गया था जैसा कि चित्रा 2 ए, बी में दर्शाया गया है। पीढ़ी के बाद पहले 3 हफ्तों में सीएस को हराने का प्रतिशत समान है, लेकिन सप्ताह 6 (डब्ल्यूके 6) सीएस (चित्रा 2 सी) में काफी गिरावट आई है। डब्ल्यूके 1 की तुलना में डब्ल्यूके 3 पर बीटिंग रेट काफी कम हो गया था और, सीएस को हराने के प्रतिशत के समान, नाटकीय रूप से डब्ल्यूके 6 (चित्रा 2 डी) पर गिर गया। Wk6 पर, CS में गिरावट देखी गई, जो बीटिंग रेट और CS को पीटने की संख्या दोनों में गिरावट की व्याख्या कर सकती है। कैल्शियम क्षणिक मापदंडों के मापन ने Wk2 (चित्रा 2E) पर काफी अधिक शिखर मूल्य का संकेत दिया, जबकि Wk1 की तुलना में Wk3 पर वृद्धि समय, क्षय समय और CTD90 में काफी वृद्धि हुई थी (चित्र 2F-H) ). एक साथ लिया गया, इन परिणामों से पता चलता है कि एचआईपीएससी-सीएम-व्युत्पन्न स्फेरॉइड लगभग 2 और 3 सप्ताह के बाद कार्यात्मक रूप से इष्टतम हैं।

चित्रा 3 धड़कन दर और कैल्शियम हैंडलिंग पर स्फेरॉइड आकार के प्रभाव को दर्शाता है। 2.5 x 10 4, 5 x 104, 10 x 104, और 20 x 104 HIPSC-CM को 96-वेल प्लेट के एक कुएं में प्रति स्थिति कुल 24 CS/कुओं के लिए बीज बोकर CS उत्पन्न किए गए थे (चित्र 3A)। जैसा कि अपेक्षित था, स्फेरॉइड आकार में वृद्धि हुई क्योंकि उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई, 17 ±8 से 36 μm से 351 ± 65 μm (चित्रा 3 ए, दाएं पैनल)। सीए2 + ट्रांसिएंट्स को चार अलग-अलग सीडिंग घनत्व (चित्रा 3 बी) पर 3 सप्ताह के सीएस में मापा गया था। बीटिंग सीएस के माप ने संकेत दिया कि छोटे आकार के सीएस (2.5के- और 5के-सीएस) का केवल 50% धड़क रहा था, जबकि बड़े आकार-बीटिंग सीएस (10के- और 20के-सीएस) का प्रतिशत काफी अधिक (लगभग 85%) था (चित्रा 3 सी)। एक समान बीटिंग दर (लगभग 28 बीपीएम) 5K-, 10K-, और 20K-CSs द्वारा दिखाई गई थी, जो 2.5K-CSs (चित्रा 3D) की तुलना में काफी अधिक थी। कैल्शियम छवियों के चरम मान सभी परीक्षण की गई स्थितियों (चित्रा 3 ई) में समान थे, हालांकि, वृद्धि समय (चित्रा 3 एफ), क्षय समय (चित्रा 3 जी), और सीटीडी 90 (चित्रा 3 एच) छोटे लोगों (2.5 के- और 5 के-सीएस) की तुलना में बड़े आकार-सीएस (10 के- और 20 के-सीएस) में काफी वृद्धि हुई थी। एक साथ लिया गया, इन परिणामों से पता चलता है कि एचआईपीएससी-सीएम-व्युत्पन्न स्फेरॉइड कैल्शियम हैंडलिंग स्क्रीनिंग के लिए इष्टतम हैं जब 10K- और 20K HIPSC-CMs / वेल के बीच एक सीडिंग घनत्व का उपयोग किया जाता है।

इसके बाद, हमने सीएस की व्यवहार्यता और कार्य पर क्रायोप्रिजर्वेशन के प्रभाव का मूल्यांकन किया। विश्लेषण से पहले, पिघले हुए सीएस को 1 सप्ताह के लिए संस्कृति में बनाए रखा गया था (चित्रा 4 ए)। जैसा कि फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा 4B) और कैल्सीन-एएम (चित्रा 4C) सेल व्यवहार्यता परीक्षणों दोनों द्वारा दिखाया गया है, क्रायोप्रिजर्वेशन ने CS के भीतर सेल व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं किया। इसके अतिरिक्त, पिघले हुए CS ने ताजा आयु-मिलान CS (चित्रा 4D) की तुलना में सरकोमेरिक प्रोटीन के समान अभिव्यक्ति स्तर दिखाए। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि बाद में कार्डियक फ़ंक्शन विश्लेषण और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए सीएस को कुशलतापूर्वक क्रायोप्रिजर्व किया जा सकता है।

अंत में, बीटिंग गतिविधि और सीए2 + हैंडलिंग को ताजा और क्रायोसंरक्षित सीएस (चित्रा 5) दोनों में मापा गया था। 2, 5 और 7 दिनों में पिघलने के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर सीटी बजाने का प्रतिशत मापा गया था। जबकि अधिकांश ताजा सीएस ने समय के साथ पिटाई गतिविधि दिखाई, स्पष्ट रूप से क्रायोप्रिजर्व्ड सीएस को अपनी बीटिंग गतिविधि को पुनर्प्राप्त करने के लिए 1 सप्ताह तक संवर्धन की आवश्यकता थी (चित्रा 5 बी)। ताजा बनाम पिघले हुए सीएस की धड़कन दर में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं हुआ; हालांकि, कुछ जमे हुए सीएस (चित्रा 5 सी) में कोई सहज धड़कन गतिविधि नहीं देखी गई थी। यद्यपि ताजा (चित्रा 5 डी) की तुलना में जमे हुए / पिघले हुए सीएस में पीक मान काफी कम हो गए थे, लेकिन ताजा की तुलना में जमे हुए / पिघले हुए सीएस के वृद्धि समय, क्षय समय और सीटीडी 90 में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया (चित्रा 5 ई-जी)। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि, पिघलने के बाद, बीटिंग गतिविधि और सीए2 + क्षणिक को मापने से पहले कम से कम 1 सप्ताह के लिए इनक्यूबेटर में सीएस को ठीक करने देना महत्वपूर्ण है।

एक साथ लिया गया, इन परिणामों से पता चलता है कि एचआईपीएससी-सीएम-व्युत्पन्न स्फेरॉइड का क्रायोप्रिजर्वेशन कार्डियोमायोसाइट व्यवहार्यता, सरकोमेरिक संरचना और उनकी कार्यात्मक विशेषताओं जैसे सहज धड़कन गतिविधि और कैल्शियम हैंडलिंग को संरक्षित करता है। इस प्रकार, एचआईपीएससी-सीएम-व्युत्पन्न स्फेरॉइड विट्रो में कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को सटीक रूप से पुन: उत्पन्न करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Figure 1
चित्र 1: कार्डियक स्फेरॉइड की पीढ़ी। (ए) डब्ल्यूएनटी-आधारित निर्देशित कार्डियक भेदभाव का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, एचआईपीएससी-सीएम का बाद में विस्तार, और सीएस की पीढ़ी। biorender.com के साथ बनाया गया। (बी) सीएस संवर्धन के विभिन्न समय बिंदुओं पर उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां। स्केल बार, 200 μm. Wk सप्ताह का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) 3 सप्ताह के सीएस में कार्डियक सरकोमेरिक प्रोटीन α-एक्टिनिन और ट्रोपोनिन टी के लिए प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। इम्यूनोफ्लोरेसेंस: होचस्ट (नीला), α-एक्टिनिन (हरा), और ट्रोपोनिन टी (लाल)। स्केल बार, 200 μm. दाईं ओर ज़ूम-इन मर्ज की गई तस्वीर सरकोमेरे संगठन को प्रदर्शित करती है। स्केल बार, 50 μm. (D) CS के गठन से पहले (दिन 0) और 3 सप्ताह बाद α-एक्टिनिन पॉजिटिव कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री परिमाणीकरण (n = 14-23 प्रति स्थिति)। (ई) आरटी-क्यूपीसीआर ने सेल जंक्शनों, मध्यवर्ती फिलामेंट्स और माइटोकॉन्ड्रिया से संबंधित विभिन्न कार्डियक जीनों के अभिव्यक्ति स्तर को स्थापित करने के लिए 90 दिनों (2 डी) के लिए संवर्धित एचआईपीएससी-सीएम पर प्रदर्शन किया और 42 दिनों के लिए सुसंस्कृत स्फेरॉइड नमूने। (एन = 1-3 बैच)। डेटा को एसडी एनएस (गैर-महत्वपूर्ण) ± रूप में दर्शाया जाता है जैसा कि अप्रकाशित टी-टेस्ट द्वारा गणना की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पीढ़ी के बाद अलग-अलग हफ्तों में सीएस में बीटिंग दर और कैल्शियम हैंडलिंग। (ए) साइटेसीर सॉफ्टवेयर में वाला विज्ञान विश्लेषण एल्गोरिदम द्वारा गणना किए गए कैल्शियम क्षणिक मापदंडों के उदाहरण। (बी) पीढ़ी के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं (हफ्तों) पर सीएस के प्रतिनिधि कैल्शियम क्षणिक निशान और टाइम-लैप्स छवियां। स्केल बार, 200 μm. (C) सहज पिटाई गतिविधि के समय पाठ्यक्रम परिमाणीकरण को CS को पीटने के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। (ई-एच) कैल्शियम क्षणिकों का परिमाणीकरण जो चरम मूल्य, वृद्धि समय, क्षय समय और सीटीडी 90 दिखाता है। दिखाए गए डेटा एसडी ± माध्य हैं। जैविक प्रतिकृति = तीन, तकनीकी प्रतिकृति = 38, 50, 66, और 7, क्रमशः। * पी < 0.05, **** पी < 0.001; वन-वे एनोवा के बाद टुकी का पोस्ट हॉक मल्टीपल-तुलना परीक्षण हुआ। संक्षिप्त रूप; सीटीडी = कैल्शियम क्षणिक अवधि, डब्ल्यूके = सप्ताह, सीएस = मानव कार्डियक स्फेरॉइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: विभिन्न सेल सीडिंग घनत्वों का उपयोग करके उत्पन्न सीएस में बीटिंग दर और कैल्शियम हैंडलिंग। (ए) हाईपीएससी-सीएम की विभिन्न संख्याओं का उपयोग करके उत्पन्न सीएस के ब्राइट-फील्ड इमेजिंग (बाएं) और आकार माप (दाएं)। स्केल बार, 200 μm. (B) 2.5K-20K-CS के प्रतिनिधि कैल्शियम क्षणिक निशान और टाइम-लैप्स छवियां। (C, D) 2.5K-20K-CS की बीटिंग प्रतिशत और बीटिंग दर। (ई-एच) पीक मान, वृद्धि समय, क्षय समय, और 2.5K-20K-CS में CTD90। डेटा एसडी ± माध्य है। जैविक प्रतिकृति = तीन, तकनीकी प्रतिकृति = 28-39। * पी < 0.05, **** पी < 0.001; वन-वे एनोवा के बाद टुकी का पोस्ट हॉक मल्टीपल-तुलना परीक्षण हुआ। संक्षिप्तरूप: सीटीडी = कैल्शियम क्षणिक अवधि, डब्ल्यूके = सप्ताह, के = एक्स 1,000 कोशिकाएं, सीएस = कार्डियक स्फेरॉइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. कार्डियक स्फेरॉइड की व्यवहार्यता और संरचना पर क्रायोप्रिजर्वेशन का प्रभाव। (ए) सीएस उत्पादन, बाद में बायोबैंकिंग और पिघलने का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) ताजा और क्रायोसंरक्षित सीएस दोनों में फ्लो साइटोमेट्री सेल व्यवहार्यता परीक्षण। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 5 मिनट के लिए 10% ट्राइटन-एक्स समाधान के साथ एक उपचार का उपयोग किया गया था। (एन = 4 प्रति स्थिति)। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप < में दर्शाया गया है। वन-वे एनोवा के बाद टुकी का पोस्ट हॉक मल्टीपल-तुलना परीक्षण हुआ। (सी) संवर्धन के 7 दिनों के बाद ताजा बनाम पिघले हुए सीएस में कैल्सीन-एएम सेल व्यवहार्यता परीक्षण (एन = 15-17 प्रति स्थिति, ***पी < 0.001, युग्मित टी-टेस्ट द्वारा; स्केल बार, 200 μm)। (डी) ताजा और पिघले हुए सीएस में α-एक्टिनिन और ट्रोपोनिन टी अभिव्यक्ति के लिए प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र (बाएं) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन। इम्यूनोफ्लोरेसेंस: होचस्ट (नीला), α-एक्टिनिन (हरा), और ट्रोपोनिन टी (लाल)। दाईं ओर विलय किए गए चित्र CS. स्केल बार, 50 μm. संक्षिप्तीकरण: X = पसंद का पिघलने वाला दिन, PI = प्रोपिडियम आयोडाइड, Cal-AM = कैल्सीन-AM, EthD-I = Ethidium Homodimer I. कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: ताजा बनाम पिघले हुए सीएस में कैल्शियम क्षणिकता(ए) क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले और पिघलने के 1 सप्ताह बाद सीएस के प्रतिनिधि कैल्शियम क्षणिक निशान और टाइम-लैप्स छवियां। (बी) ताजा और जमे हुए / पिघले हुए कार्डियक स्फेरॉइड का बीटिंग प्रतिशत। सलाखों व्यक्तिगत प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) ताजा और जमे हुए / पिघले हुए कार्डियक स्फेरॉइड की धड़कन दर। (डी-जी) कैल्शियम क्षणिक मापदंडों का परिमाणीकरण: पीक मान, वृद्धि समय, क्षय समय और सीटीडी 90। डेटा एसडी ± माध्य है। * पी < 0.05, ****पी < 0.001; वन-वे एनोवा के बाद टुकी का पोस्ट हॉक मल्टीपल-तुलना परीक्षण हुआ। संक्षिप्त रूप; सीटीडी = कैल्शियम क्षणिक अवधि, सीएस = कार्डियक स्फेरॉइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि गेटिंग रणनीतियाँ। (ए) शुद्ध आबादी बनाम नकारात्मक नियंत्रण और आइसोटाइप नियंत्रण में α-एक्टिनिन पॉजिटिव एचआईपीएससी-सीएम के लिए प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति। α-एक्टिनिन पॉजिटिव विश्लेषण कोशिकाओं की संख्या 25 x 105 है। संक्षिप्त रूप; एसएससी = साइड स्कैटर, पीआई + = प्रोपिडियम आयोडाइड पॉजिटिव। (बी) ताजा, पिघला हुआ, सकारात्मक नियंत्रण (ट्राइटन-एक्स), और नकारात्मक नियंत्रण (बिना दाग वाले) दोनों में व्यवहार्यता विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

कार्डियक दवा की खोज गैर-मानव पशु और सेलुलर मॉडल पर निर्भरता से बाधित होती है, जिसमें अपर्याप्त थ्रूपुट और शारीरिक निष्ठा होती है ताकि सही ढंग से रीडआउट किया जा सके। एचटी इंस्ट्रूमेंटेशन और फिजियोलॉजिकल प्रोब के साथ युग्मित एचआईपीएससी-सीएम जीव विज्ञान में हृदय रोग मॉडलिंग और दवा की खोज के शुरुआती चरणों में मानव मॉडल को फिर से पेश करने की क्षमता है। हमने एक 3 डी कार्डियक ऊतक पीढ़ी विधि विकसित की है जो एक इष्टतम हृदय रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म के लिए उच्च गुणवत्ता और कार्यात्मक सीएस का उत्पादन करती है। इसके अतिरिक्त, औद्योगिक ईवी उत्पादन के लिए 3 डी बायोरिएक्टर सिस्टम में स्फेरॉइड तकनीक का संयोजन ईवी-आधारित चिकित्सा के नैदानिक अनुवाद की दिशा में एक आवश्यक कदम की अनुमति देता है। यहां वर्णित विधि कई महत्वपूर्ण कारकों पर निर्भर करती है और मौजूदा प्रोटोकॉल 9,10,28,29 का एक संस्करण है। इन विधियों में शामिल हैं: 1) 3 डी ऊतक निर्माण की पीढ़ी, 2) स्क्रीनिंग से पहले इष्टतम सेल संख्या और समय, 3) उपकरणों की संवेदनशीलता और उच्च-थ्रूपुट क्षमता में सुधार, और 4) किसी भी कार्यात्मक विश्लेषण से पहले स्फेरॉइड को फ्रीज करने में सक्षम होना। पहले वर्णित प्रोटोकॉल के विपरीत, प्रस्तावित प्रोटोकॉल प्रति दिन 1,500 स्फेरॉइड की पीढ़ी और एचटीएस के लिए उपयुक्तता का वर्णन करता है। मौजूदा 96-वेल कैल्शियम इमेजिंग सिस्टम या 24-अच्छी तरह से मल्टीप्लेक्स इंजीनियर हृदय ऊतकों का उपयोग करके 10 प्रतिकृतियों के लिए 6 x 0.5 लॉग खुराक से अधिक सौ यौगिकों के पारंपरिक विश्लेषण के लिए लगभग 500 मिलियन से 3 बिलियन एचआईपीएससी-सीएम31,32 की आवश्यकता होती है। प्रस्तावित आवेदन पारंपरिक प्रणालियों की तुलना में कार्डियक स्क्रीनिंग को कम खर्चीला और समय प्रभावी बनाता है क्योंकि 96-वेल प्लेटों को वर्णित विधि की तुलना में सीडिंग घनत्व का केवल 10% आवश्यक था। इसके अलावा, पिछले प्रोटोकॉल की तुलना में, जैसे कि हैंगिंग-ड्रॉप विधि, अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेटों में स्व-एकत्रीकरण द्वारा स्फेरॉइड की पीढ़ी एकल माइक्रोटिश्यू33 की उच्च गुणवत्ता वाली स्वचालित इमेजिंग को सक्षम बनाती है।

यह छोटा 3 डी मॉडल विवो कार्डियोवैस्कुलर वातावरण के जैविक और शारीरिक फेनोटाइप की नकल करता है। जैसा कि पहले दिखाया गया है, 2 डी मोनोलेयर सेल संस्कृतियों की तुलना में 3 डी कार्डियक ऊतक संरचनाओं में कैल्शियम क्षणिक नाटकीय रूप से वृद्धि करतेहैं।

इसके बाद, हमने पाया कि सीडिंग घनत्व और उचित संवर्धन समय भी एक सफल सीएस स्क्रीनिंग के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। प्रति स्फेरॉइड 10K-20K HIPSC-CM की घनत्व और पीढ़ी के बाद 2-3 सप्ताह के बीच स्क्रीनिंग इष्टतम थी, जबकि बहुत छोटे या बहुत पुराने स्फेरॉइड परेशान कैल्शियम हैंडलिंग दिखाते हैं (चित्रा 2 और चित्रा 3)। इसलिए, बीजारोपण घनत्व को यथासंभव सुसंगत बनाए रखना महत्वपूर्ण है, क्योंकि आकार कार्यात्मक मापदंडों को प्रभावित करता है। इसके अलावा, हालांकि यह ऑप्टिकल विधि एक पूरे ऊतक के रूप में जीवित 3 डी संस्कृतियों के लिए अच्छे परिणाम प्रदान करती है, (उप-) सेलुलर स्तर पर बड़े स्फेरॉइड के भीतर डेटा प्राप्त करना समय लेने वाली हिस्टोलॉजी विधियों पर भरोसा किए बिना चुनौतीपूर्ण है। हाल ही में, कई दृष्टिकोण प्रकाशित किए गए हैं जो "ऑप्टिकल क्लियरिंग" का उपयोग करते हैं, जो मार्करों के एकल-सेल परिमाणीकरण के अवसर के साथ पूरे 3 डी स्फेरॉइड के अधिग्रहण को सक्षम बनाता है। यहां, हमने सीएस कटाई से छवि विश्लेषण के लिए 3-दिवसीय प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया, जिसे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी29 (चित्रा 1 सी और चित्रा 4 डी) का उपयोग करके 3 डी इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया गया है।

अंत में, 3 डी कार्डियक ऊतक अनुप्रयोगों और वाणिज्यिक अनुप्रयोगों में वृद्धि के साथ, विभिन्न दाताओं से दीर्घकालिक भंडारण और रोगी-विशिष्ट बायोबैंकिंग की मांग बढ़ रही है। क्रायोप्रिजर्वेशन समय के साथ कई बैचों से एचटीएस-प्लेट्स उत्पन्न करने के लिए एक प्रभावी रणनीति है। एचआईपीएससी-सीएम की ठंड को पहले वर्णित किया गया है और अन्य सुसंस्कृत सेलप्रकारों 10,35,36 की तुलना में अलग नहीं है। हाल ही में, 2 डी कोशिकाओं के साथ फ्रीजिंग प्लेटों के लिए दृष्टिकोण37 वर्णित किए गए हैं। यहां, हमने पाया कि पीएससी क्रायोप्रिजर्वेशन किट तीन अन्य (डेटा नहीं दिखाया गया) की तुलना में सबसे इष्टतम स्थिति है और स्फेरॉइड के कुशल ठंड के लिए इस माध्यम का उपयोग किया। क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद, व्यवहार्यता अधिक रहती है (चित्रा 4 बी, सी), लेकिन सीएस के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुण प्रभावित होते हैं और पिघलने के बाद इनक्यूबेशन की अवधि की आवश्यकता होती है। दरअसल, पिघलने के 1 सप्ताह बाद, सीएस ने सहज धड़कन गतिविधि और कैल्शियम हैंडलिंग प्रदर्शित की। हालांकि, यह वर्णित किया गया है कि ताजा और पुनर्प्राप्त एचआईपीएससी-सीएम हमेशा समान आणविक औरशारीरिक गुण नहीं दिखाते हैं। इस सीमा पर विचार करने की आवश्यकता है जब क्रायोप्रिजर्व्ड एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग दवा-प्रेरित कार्डियक रीड-आउट का आकलन करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, हालांकि हम प्रभावी रूप से प्रति स्फेरॉइड कोशिकाओं की संख्या और कैल्शियम क्षणिक इमेजिंग के इष्टतम समय को संशोधित करते हैं, कार्डियक स्फेरॉइड को एंडोथेलियल कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स, सेल-सेल जंक्शनों और बाह्य मैट्रिक्स, जैसे चिटोसन, कोलेजन IV, फाइब्रोनेक्टिन, मैट्रिगेल, या लैमिनिन के साथ हाइपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स कोशिकाओं को मिलाकर बेहतर बनाया जा सकताहै। 40. कुल मिलाकर, हम कुशलतापूर्वक सीएस उत्पन्न करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं जो रोग मॉडलिंग और एचटी दवा स्क्रीनिंग जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम साइटेसीर सॉफ्टवेयर पैकेज और स्वचालित 3 डी कैल्शियम विश्लेषण के अनुकूलन के लिए वाला विज्ञान को स्वीकार करना चाहते हैं। हम पीएलएन फाउंडेशन (आरएम) से अनुदान सहायता स्वीकार करना चाहते हैं। पी.ए.डी. और एफ.एस. CUREPLAN Leducq द्वारा समर्थित हैं। जे.पी.जी.एस. यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) के H2020-EVICARE (# 725229) द्वारा समर्थित है। जेडब्ल्यूबी यूएमसी यूट्रेक्ट क्लिनिकल फैलोशिप, नीदरलैंड हार्ट इंस्टीट्यूट फैलोशिप और सीवीओएन-डोसिस युवा प्रतिभा अनुदान द्वारा समर्थित है; नीदरलैंड हार्ट फाउंडेशन (सीवीओएन-डोसिस 2014-40)। एन.सी. को वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (RegmedXB # 024.003.013) और मैरी स्कलोडोव्स्का-क्यूरी एक्शन्स (अनुदान समझौता बचाव # 801540) द्वारा गुरुत्वाकर्षण कार्यक्रम "सामग्री संचालित पुनर्जनन" द्वारा समर्थित किया गया है। वी.एस.-पी. एलायंस फंड (यूएमसीयू, यूयू, टीयू / ई) द्वारा समर्थित है। ए.वी.एम. यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित परियोजना ब्रेव (एच 2020, आईडी: 874827) द्वारा समर्थित है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 wells suspenion plate  Corning  3738
96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate Corning CLS3474-24EA
Albumax Thermo Fisher Scientific 11020021
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) antibody Sigma-Aldrich A7811 Dilution: 1:200
Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932) Abcam ab45932 Dilution: 1:200
Ascorbic acid  Sigma-Aldrich A8960
B-27 supplement  Thermo Fisher Scientific 17504-044
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Bovine serum albumin fraction V (BSA) Roche 10735086001
Cal-520, AM  Abcam ab171868
Confocal microscope Leica  DMi8 
Confocal microscope software  Leica  Las X
Conical tubes 15 mL Greiner Bio-One 5618-8271
Creatine monohydrate  Sigma-Aldrich C3630
DAPI  Thermo Fisher Scientific D3571 Concentration: 1 µg/mL
DMEM no glucose  Thermo Fisher Scientific 11966025
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020
Fructose  Sigma-Aldrich 76050771.05
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glycerol Boom 76050771.05
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029 Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A11011 Dilution: 1:500
Horizontal shaker IKA 4003000
Human induced pluripotent stem cell lines (Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank) CVI-273 (control 1)
Human induced pluripotent stem cell lines Germany  141 (control 2) 144 (control 3)
Hydrochloric acid (HCl)  Ajax Firechem 265.2.5L-PL 10 M stock solution, corrosive
Isotype control, FITC mouse IgM κ isotype BD 556652
KnockOut Serum Replacement  Thermo Fisher Scientific 10828 Protect from light
L-carnitine Sigma-Aldrich C0283
Myocyte calcium and contractility system Leica  Thunder, DMi8
Non essential amino acids (NEAA) Thermo Fisher Scientific 11140
Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0–7.6 Santa Cruz SC281692 Hazardous
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin/streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140
PES Membrane Vacuum Filter system Corning  431097
PI/RNase Staining Solution Invitrogen F10797 Dilution: 1:1000
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
PSC Cryopreservation Kit Thermo Fisher Scientific A2644601
RevitaCell Thermo Fisher Scientific A2644501
RPMI 1640 medium  Thermo Fisher Scientific 11875
Silicone Elastomer Kit SYLGARD 184
Sodium dodecyl sulfate solution (10%) Sigma-Aldrich 71736
Sodium L-Lactate Sigma-Aldrich 71718
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Tris Fisher  Scientific  11486631
Triton X-100 Merck X100-1L Hazardous
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
TrypLE Select Enzyme (10x) Thermo Fisher Scientific A1217701
Tween-20  Sigma-Aldrich P1379
Urea  Sigma-Aldrich 51456
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V6629
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) Tocris  1254 Protect from light

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 193
पीढ़ी, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग, और मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियक स्फेरॉइड की बायोबैंकिंग
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Maas, R. G. C., Beekink, T., Chirico, N., Snijders Blok, C. J. B., Dokter, I., Sampaio-Pinto, V., van Mil, A., Doevendans, P. A., Buikema, J. W., Sluijter, J. P. G., Stillitano, F. Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids. J. Vis. Exp. (193), e64365, doi:10.3791/64365 (2023).

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