Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generering, screening med hög genomströmning och biobankning av humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda hjärtsfäroider

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64365
Automatic Translation
1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, *1, *1
1Utrecht Regenerative Medicine Center, Circulatory Health Laboratory, University Utrecht, Department of Cardiology, University Medical Center Utrecht, 2Amsterdam Cardiovascular Sciences, Department of Physiology, Amsterdam University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Här presenteras en uppsättning protokoll för generering och kryokonservering av hjärtsfäroider (CS) från humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter odlade i ett multidimensionellt format med hög genomströmning. Denna tredimensionella modell fungerar som en robust plattform för sjukdomsmodellering, screening med hög genomströmning och bibehåller dess funktionalitet efter kryokonservering.

Abstract

Humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) är av största vikt för modellering och behandling av mänskliga hjärtsjukdomar. Vi publicerade nyligen en kostnadseffektiv strategi för den massiva expansionen av hiPSC-CM i två dimensioner (2D). Två stora begränsningar är cellomogenhet och brist på tredimensionellt (3D) arrangemang och skalbarhet i high-throughput screening (HTS) plattformar. För att övervinna dessa begränsningar utgör de expanderade kardiomyocyterna en idealisk cellkälla för generering av 3D-hjärtcellsodling och vävnadsteknik. Den senare har stor potential inom det kardiovaskulära området, vilket ger mer avancerad och fysiologiskt relevant HTS. Här beskriver vi ett HTS-kompatibelt arbetsflöde med enkel skalbarhet för generering, underhåll och optisk analys av hjärtsfäroider (CS) i ett 96-brunnsformat. Dessa små CS är avgörande för att fylla luckan i nuvarande in vitro-sjukdomsmodeller och / eller generering för 3D-vävnadstekniska plattformar. CS: erna presenterar en mycket strukturerad morfologi, storlek och cellulär sammansättning. Dessutom visar hiPSC-CMs odlade som CS ökad mognad och flera funktionella egenskaper hos det mänskliga hjärtat, såsom spontan kalciumhantering och kontraktil aktivitet. Genom automatisering av hela arbetsflödet, från generering av CS till funktionell analys, ökar vi reproducerbarheten inom och mellan satser, vilket demonstreras av high-throughput (HT) avbildning och kalciumhanteringsanalys. Det beskrivna protokollet möjliggör modellering av hjärtsjukdomar och bedömning av läkemedels-/terapeutiska effekter på encellsnivå inom en komplex 3D-cellmiljö i ett helautomatiserat HTS-arbetsflöde. Dessutom beskriver studien ett enkelt förfarande för långtidskonservering och biobankning av helsfäroider, vilket ger forskare möjlighet att skapa nästa generations funktionella vävnadsförvaring. HTS kombinerat med långtidslagring kommer väsentligt att bidra till translationell forskning inom ett brett spektrum av områden, inklusive läkemedelsupptäckt och testning, regenerativ medicin och utveckling av personliga terapier.

Introduction

Upptäckten av mänskligt inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) erbjöd oöverträffade möjligheter att studera mänsklig utveckling och sjukdom på cellnivå. Under det senaste decenniet, med hjälp av utvecklingslektioner, har olika protokoll upprättats för att säkerställa effektiv differentiering av hiPSC till kardiomyocyter (CM) 1,2,3,4. hiPSC-härledda kardiomyocyter (hiPSC-CM) kan fungera som en resurs för modellering av genetiskt ärftliga hjärt-kärlsjukdomar (CVD), testning av hjärtsäkerhet för nya läkemedel och hjärtregenerativa strategier 5,6,7,8. Trots den riktade hjärtdifferentieringen av hiPSC förblir obestämda CM-nummer en utmaning inom hjärtfältet, eftersom mogna hiPSC-CM i allmänhet är icke-proliferativa och primära humana celler inte är tillgängliga i stora mängder.

Nyligen beskrev vi att samtidig Wnt-signalaktivering med låg celldensitetskultur resulterade i ett massivt proliferativt svar (upp till 250 gånger) av hiPSC-CMs 9,10. Denna kostnadseffektiva strategi för massiv expansion av hiPSC-CM via seriell passering i odlingskolvformat underlättar standardisering och kvalitetskontroll av ett stort antal funktionella hiPSC-CM. Dessutom, för att hålla jämna steg med efterfrågan på stora partier hiPSC-CMs från olika givare, har biobankningen av hiPSC-CMs beskrivits10. Kardiomyocytmonolager sådda i dessa standardodlingsrätter är emellertid inte representativa för den komplexa 3D-strukturen som finns i hjärtat. Dessutom har omogenheten hos hiPSC-CM förblivit ett hinder och därmed misslyckats med att efterlikna den biologiska och fysiologiska fenotypen i den kardiovaskulära miljön in vivo.

Nya 3D-in vitro-modeller har utvecklats där hiPSC-CMs visar närmare fysiologiskt beteende såsom självorganisation 11,12, extracellulär matris (ECM) remodeling 13, förbättrad mognad 14,15,16 och synkroniserad kontraktion17,18,19 . 3D-modeller har använts för läkemedelsupptäckt, läkemedelskardiotoxicitetstestning, sjukdomsmodellering, regenerativa terapier och till och med de första kliniska prövningarna 20,21,22,23,24. En av de mest använda modellerna är den fibrinbaserade konstruerade hjärtvävnaden (EHT), som uppvisar ett vävnadsliknande arrangemang och hjärtkontraktilitet13,17,25. Tidigare visade vi att EHT genererade från expanderade hiPSC-CMs uppvisade jämförbar kontraktilitet med dem från oexpanderade hiPSC-CMs, vilket visade kompromisslös cellulär funktionalitet efter expansion9. Även om genereringen av EHT från hiPSC-CM har varit väletablerad, förväntas dock ytterligare utveckling när det gäller inrättandet av en HT-utvärderingsplattform. Här möjliggör den snabba genereringen av ett stort antal självaggregerande hjärtsfäroider (CS) i 96-brunnsformat en förbättring av 3D-förhållandena för high-throughput screening (HTS) ändamål.

Sammantaget är fördelen med CS som 3D-cellodling deras höga reproducerbarhet och skalbarhet. I synnerhet kan CS i kombination med robotprovhantering standardisera och automatisera CS-kultur, läkemedelsbehandling och analys med högt innehåll20. Här beskriver vi optimerade protokoll för att generera CS med hög renhet och hög kvalitet, som effektivt kan kryokonserveras och screenas för hjärtfunktion genom att utföra Ca2+ transienta mätningar med hjälp av ett optiskt kalciumförvärv och analyssystem. Denna modell ger ett enkelt men kraftfullt verktyg för att utföra skärmar med hög genomströmning på hundratals till tusentals sfäroider17,18.

Protocol

OBS: hiPSC-CMs som användes i denna studie genererades enligt tidigare beskrivna hiPSC-odlings- och CM-differentieringsprotokoll26,27. Alternativt kan hiPSC-CM utökas och fryskonserveras som nyligen publicerats innan CS-protokollet startas (avsnitt 4)10.

1. Beredning av cellodlingsmedier, lösningar och alikvoter

  1. Förbered basalmedium
    1. Balansera penicillin-streptomycin och mediet (RPMI 1640) till rumstemperatur (RT) och se till att det har tinat helt. Blanda 500 ml av mediet och 5 ml penna / strep. Förvaras vid 4 °C i upp till 8 veckor. balansera till 37 °C före användning.
  2. Förbered RPMI + B27
    1. Balansera B27-tillägget och det basala mediet till RT. Se till att tina tillägget helt. Blanda 490 ml av basmediet och 10 ml av 50x B27-tillskottet. Förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor. balansera till 37 °C före användning.
  3. Förbered hiPSC-CM-ompläteringsmedia
    1. Tillsätt Rho-associerad, coiled-coil innehållande proteinkinas (ROCK) -hämmare (2 μM slutlig koncentration) och 10% knockout serumersättning (KSR) till RPMI + B27-media. Tillsätt ROCK-hämmare direkt till RM-mediet efter behov. Förvara inte kulturmedier när de har kompletterats.
  4. Förbered CM upptiningsmedia
    1. Tillsätt en 1:100 koncentration av cellöverlevnadstillskott (t.ex. Revitacell) och 20% KSR till RPMI + B27-media och balansera till 37 °C före användning.
  5. Förbered mognadstillägg
    1. Den tidigare beskrivna mognadsmedieformeln28 består av: 3 mM glukos, 10 mM L-laktat, 5 mg / ml vitamin B12, 0,82 mM biotin, 5 mM kreatinmonohydrat, 2 mM taurin, 2 mM L-karnitin, 0,5 mM askorbinsyra, 1x NEAA, 0,5% (w / v) albumax, 1x B27 och 1% KOSR. För att förbereda en hel flaska (500 ml) mognadstillägg, ta bort 65 ml från en flaska DMEM utan glukos och komplettera med 2,7 g glukos, 5,6 g L-laktat, 0,025 mg vitamin B12, 1 mg Biotin, 3,73 g kreatinmonohydrat, 1,25 g taurin, 1,975 g L-karnitin, 0,7125 g askorbinsyra, 50 ml NEAA, 12,5 g albumax och 5 ml penicillin-streptomycin.
    2. Filtrera genom en steril engångsfilterenhet med ett 0,22 μm porpolyetersulfonmembran (PES).
    3. Alikvot till 45 ml (för att bereda 500 ml mognadsmedium) eller 4,5 ml (för att bereda 50 ml mognadsmedium). Förvaras vid 20 °C i upp till 6 månader.
  6. Förbered mognadsmedia
    1. Balansera B27-tillskottet, knockout SR, penicillin-streptomycin, mognadstillägget28 och DMEM no-glukosmediet vid RT. Se till att tina tillägget helt. Blanda 435 ml DMEM inget glukosmedium med 10 ml 50x B27-tillskott, 5 ml penicillin-streptomycin, 5 ml knockout SR och 45 ml mognadstillägg. Förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor. balansera vid 37 °C före användning.
  7. Förbered fluor ljust medium
    1. Ekvilibrera penicillin-streptomycin och DMEM fluorobrite medium vid RT. Se till att tillägget är helt tinas. Blanda 500 ml av DMEM-fluorbritmediet med 5 ml penicillin-streptomycin. Förvaras vid 4 °C i upp till 1 månad. balansera vid 37 °C före användning.
  8. Bered den icke-joniska tvättmedelslösningen
    1. Blanda 20 % vikt/volym icke-joniskt tvättmedelspulver (t.ex. F-127) med PBS. Filtrera med ett filter på 0,22 μm och förvara vid 4 °C i upp till 6 månader. jämvikt vid rumstemperatur före användning.
  9. Förbered kalciumfärgmedium
    1. Blanda den icke-joniska tvättmedelslösningen (slutlig koncentration på 0,04 % v/v) och 0,1 x av kalciumfärgämnet (t.ex. Cal520 AM) i fluorljust medium. Tillsätt 10 μl Cal520 och 20 μL av den icke-joniska tvättmedelslösningen i ett 50 ml E-rör. Blanda tills det är helt upplöst. Håll lösningen i mörkret innan du lägger till cellerna.

2. Förberedelse av buffertar

  1. Förbered permeabilisering och blockeringsbuffert: Denna buffert innehåller 10 ml PBS, 5% vikt / v BSA och 0,3% v / v Triton-X-100.
  2. Förbered flödescytometribufferten: Denna buffert innehåller 50 ml PBS, 1% vikt / v BSA och 0,3% v / v Triton-X-100.
  3. Tvättbuffert för flödescytometri: Denna buffert innehåller 50 ml PBS och 1% vikt / v BSA.
  4. Sfäroid tvättbuffert (SWB): Denna buffert innehåller 1 ml Triton-X-100, 2 ml 10% (w/v i DPBS) SDS och 2 g BSA i 1 L PBS.
    OBS: SWB kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor.
  5. Förbered inbäddningslösningen (ES): För att förbereda 100 ml av inbäddningslösningen, blanda 50 ml glycerol med 9,09 mldH2O, 1 ml Tris-buffert (1 M, pH 8,0) och 200 μL EDTA (0,5 M). Tillsätt 22,7 g fruktos och blanda vid rumstemperatur i mörker tills det är upplöst. När det är klart, tillsätt 22,2 g fruktos och blanda tills det är upplöst. Tillsätt sedan 15 g urea och blanda tills det är upplöst (förvara vid 4 °C i mörker).
  6. Förbered PBT-buffert (PBS med Tween-20). Denna buffert innehåller PBS/Tween-20 (0,1 % v/v). För 1 liter PBS tillsätts 1 ml Tween-20.

3. Beredning av små molekyler

  1. Bered tiazovivin (ROCK-hämmare) pulver i 10 mM alikvoter på 50 μl i DMSO och förvara vid -20 °C i upp till 6 månader. Skydda mot ljus.
  2. Bered 2,5 mM alikvoter på 10 μL vardera av Cal-520 AM i DMSO och förvara dem vid -20 °C i upp till 6 månader. Skydda mot ljus.

4. Generering av hjärtsfäroid

OBS: För större mängder CS, frö upp till 1 miljon CM i en 6-brunns ultralåg fästplatta med 2 ml hiPSC-CM-ompläteringsmedia. Denna studie använde minst 2 500 (2,5 k CS) upp till 20 000 (20 k CS) hiPSC-CM per brunn på en 96-brunnsplatta.

  1. Bered en cellkultur med minst 2 x 106 humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CMs)10 för en platta med 96 brunnar.
  2. När de odlade hiPSC-CMs når sammanflöde, tillsätt 0,1 ml / cm2 steril hjärtavskiljningslösning (t.ex. tryple) till varje brunn. Inkubera plattan vid 37 °C i 15 minuter.
  3. Använd en 5 ml pipet, dissociera cellerna mekaniskt genom att spola med 2 ml varmt basalmedium för att göra en enda cellsuspension. Bekräfta frigöringen med ett ljusfältmikroskop (4x förstoring); Cellerna kommer att se vita ut och ha en rund form.
  4. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera i 3 minuter vid 300 x g.
  5. Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml hiPSC-CM-återpläteringsmedium.
  6. Använd en 1 000 μL pipetspets och dissociera cellpelleten mekaniskt. Lösningen verkar homogen efter tre eller fyra blandningar. Räkna cellerna. Överför lämplig mängd celler i 100 μL av ompläteringsmediet till varje 96-brunnsbrunn med ultralåg fastsättning runt botten.
  7. Placera plattan av CS på en orbital shaker vid 70 rpm i inkubatorn i 24 h. Ställ in inkubatorförhållandena på 37 °C, 5% CO2, 21%O2 och 90% luftfuktighet.
  8. Aspirera 50 μL medium från varje brunn och tillsätt 100 μL RPMI + B27 medium per brunn under de första 48 timmarna.
    OBS: Förvara alltid 50 μL av mediet i 96-brunnsplattan för att undvika oavsiktlig aspiration och sfäroidbrott.
  9. Aspirera 100 μL av mediet från varje brunn och tillsätt 100 μL av mognadsmediet per brunn. Behåll cellerna i mognadsmediet och uppdatera mediet var 2-3: e dag.

5. Kryokonservering av CS

OBS: CS kan frysas för långvarig lagring. Kryokonservering kan utföras från dag 3 efter generering av CS. CS kan fryskonserveras direkt i brunnarna på en 96-brunnsplatta eller som en CS-suspension i kryovialer.

  1. Förkyl plattan genom att lägga plattan på is i 10 minuter.
  2. Centrifugera sfäroidplattan i 3 minuter vid 70 x g.
  3. Ta bort supernatanten tills 50 μl återstår och tillsätt 200 μl iskallt hiPSC-frysmedium per brunn.
    OBS: Håll CS-suspensionen på is under hela proceduren. När det gäller en 6-brunnsplatta med sfäroider, frys en brunn i ett 500 μL frysmedium kryovial.
  4. Försegla plattan med plåttätningsfilm.
    OBS: 96-brunnsplattan måste förvaras i en polystyrenlåda eller, när den inte är tillgänglig, kan en kiselform tillverkas enligt beskrivningen i steg 5.5.1.
  5. För att säkerställa enhetlig värmeväxling mellan brunnsplattan och frysen, placera plattan försiktigt i en polystyrenlåda eller i en kiselform.
    1. För att förbereda kiselformen: Blanda kraftigt två komponenter i kiselelastomersatsen i förhållandet 10: 1. Avbubbla lösningen med en vakuumpump i 15-20 minuter. Gjut sedan lösningen inuti brunnplattans nedre del och avbubbla med en vakuumpump i 10 minuter. Placera formen i en ugn och härda vid 60 ° C i 8 timmar för att få en halvflexibel elastomer som skalas av plattan.
  6. Frys plattan vid -80 °C i minst 4 timmar i polystyrenboxen eller den förberedda kiselformen.
  7. Överför plattan till en tank med flytande kväve eller en frys på -150 °C för långtidsförvaring.

6. Upptining av hjärtsfäroider

OBS: Tina inte mer än en platta åt gången för att säkerställa en snabb upptiningsprocess.

  1. Bered 20 ml 37 °C förvärmt basmedium i ett 50 ml koniskt rör.
  2. Samla cellplattan med CS från flytande kväve och placera den i inkubatorn i 15 minuter. Ställ in inkubatorförhållandena på 37 °C, 5% CO2, 21%O2 och 90% luftfuktighet.
  3. Ta bort supernatanten och cellpelletresterna och återsuspendera varje brunn i ett varmt basmedium. Använd 200 μL medium per brunn.
  4. Centrifugera i 3 min vid 70 x g.
  5. Upprepa steg 6.3 och 6.4.
  6. Ta bort supernatanten tills cellpelleten finns kvar och tillsätt 200 μL CM upptiningsmedium i varje brunn.
  7. Placera plattan av CS på en orbital shaker vid 70 rpm i en inkubator i 24 timmar. Ställ in inkubatorförhållandena på 37 °C, 5% CO2, 21%O2 och 90% luftfuktighet.
  8. Aspirera 50 μL av mediet från varje brunn och tillsätt 100 μL RPMI + B27-medium per brunn under de första 48 timmarna.
  9. Aspirera 100 μL av mediet från varje brunn och tillsätt 100 μL mognadsmedium per brunn. Behåll cellerna i mognadsmediet och uppdatera mediet var 2-3: e dag.

7. Bedömning av intracellulära Ca2+ transienter

OBS: CSs är i kultur i totalt 3 veckor; 2 veckor före frysning och 1 vecka efter upptining. De "färska" kontrollerna är åldersmatchade.

  1. Efter 1 veckas odling är de tinade CS: erna optimala för kalciumhantering optisk avbildning. Använd ett kalciumfärgämne (t.ex. Cal520AM) för att bedöma upptag och frisättning av Ca2+ från cellerna.
  2. Behandla dem med 100 μL kalciumfärgmedium per brunn och inkubera i 60 minuter i inkubatorn. Ställ in inkubatorförhållandena på 37 °C, 5% CO2, 21%O2 och 90% luftfuktighet.
    Cal520AM är ljuskänslig. Utför alla laddningsprocedurer och experiment i mörkret.
  3. Förbered kalciumförvärvs- och analyssystemet.
    1. Slå mikroskopet och se till att miljökontrollalternativet är på.
    2. Justera kamerans och inramningens bländarmått för att minimera bakgrundsområdet.
      OBS: Här användes Leica Thunder DMi8-mikroskopet; Andra mikroskopsystem är också tillämpliga tills de tillåter en samplingsfrekvens över 30 bilder / sekund (FPS).
  4. Spela in en video med en konsekvent ström av 2-10 toppar inom 10 s och skanna över 96-brunnsplattan, först flytta till vänster, sedan nedåt på ett sicksack-sätt för att täcka hela plattan. Mät kalciumsignalen med en 488 nm laser; Ställ in kontrasten på en svart bakgrund med en ljusgrön signal under kalciumfrisättning.
  5. Efter att ha förvärvat Ca2+ transienter, analysera data med programvaran för fluorescensspåranalys (t.ex. CyteSeer, Vala Sciences) enligt tillverkarens instruktioner.

8. Flödescytometrianalyser av dissocierade hjärtsfäroider

OBS: I denna studie användes flödescytometri för att bestämma livskraften hos CS före och efter upptiningsprocessen.

  1. Samla CS i ett 15 ml koniskt rör med en 5 ml pipet för att undvika sfäroidskador och centrifugera i 3 minuter vid 70 x g. Aspirera supernatanten och tillsätt 1 ml PBS.
  2. Centrifugera i 3 minuter vid 200 x g. Aspirera supernatanten och dissociera CS genom att tillsätta 1 ml hjärtavskiljningslösning (t.ex. tryple). Inkubera röret vid 37 °C i 15 minuter.
  3. Använd en 5 ml pipet, dissociera cellerna mekaniskt genom spolning med 2 ml basalmedium tills enskilda celler kan ses när de observeras under mikroskopet.
  4. Centrifugera i 3 minuter vid 200 x g.
  5. Aspirera supernatanten och fixera CM med 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) lösning i 1x PBS. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
  6. Centrifugera i 3 minuter vid 200 x g. Aspirera supernatanten och tillsätt 1 ml PBS.
    OBS: Pauspunkt: De fasta hiPSC-CM kan förvaras vid 4 °C i upp till 4 veckor.
  7. Överför cellsuspensionen till ett FACS-rör och centrifugera i 3 minuter vid 200 x g. Aspirera supernatanten och resuspendera 1 x 105 celler i 50 μL av permeabiliseringsbufferten.
  8. Inkubera cellerna i 30 minuter vid 4 °C.
  9. För analys av immunofluorescensflödescytometri, utför steg 8.9.1-8.9.4.
    1. Resuspendera cellerna i flödescytometribufferten (50 μl) innehållande α-aktininantikroppen vid en spädning av 1:300. I ett annat FACS-rör, resuspendera 1 x 105 celler i flödescytometribufferten (50 μL) med respektive isotypkontroll (t.ex. FITC-mus IgM, κ-isotyp [1:200 utspädning]). På liknande sätt resuspendera 1 x 105 celler i 50 μL flödescytometribuffert för negativ kontroll.
    2. Inkubera cellerna i 30 minuter vid 4 °C.
    3. Tillsätt 2,5 ml flödescytometribuffert och centrifugera cellerna vid 200 x g i 3 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och upprepa tvättsteget två gånger.
    4. Resuspendera cellerna i 50 μl flödescytometribuffert med sekundär-antikropp get-anti-mus (1:300 spädning).
      OBS: Placera röret i mörker eftersom den sekundära antikroppslösningen är ljuskänslig.
  10. För viabilitetskontroll med propidiumjodid (PI), tillsätt 150 μl PI per prov (1:1 000) och inkubera i 15 minuter.
    OBS: Placera röret i mörkret eftersom PI-lösningen är ljuskänslig.
  11. Justera grindarna enligt standardgrindstrategin som visas i kompletterande figur 1 och analysera cellerna med en flödescytometer.

9. Immunofluorescensfärgning av hela 3D-sfäroider

OBS: Detta protokoll är baserat på protokollet för högupplöst 3D-avbildning av hela organoider vid immunofluorescerande märkning, som tidigare publicerats29 och justerats för hjärtsfäroider. Under proceduren kan alla pipettspetsar och koniska rör beläggas med 1% vikt / v BSA-PBS för att förhindra att sfäroiderna fastnar på plast. För att belägga materialen, doppa i 1% BSA-PBS. Var försiktig så att du inte skadar sfäroiderna genom att använda 5 ml pipet, undvik mekaniska störningar.

  1. Samla CS i ett 15 ml belagt rör med en 5 ml pipet. Sfäroiderna är synliga för ögat. Samla ~ 20-50 sfäroider per antikroppskombination. Centrifugera i 3 minuter vid 70 x g och aspirera supernatanten.
  2. Återsuspendera försiktigt sfäroiderna i 1 ml iskall 4% paraformaldehydlösning (PFA) i 1x PBS med en belagd 1 ml spets.
  3. Fixera vid 4 °C i 45 min. Efter 20 minuter, suspendera sfäroiderna försiktigt med en belagd 1 ml spets. Detta jämnar fixering bland alla sfäroider.
  4. Tillsätt 10 ml iskall PBS till röret och blanda försiktigt genom att vända röret. Inkubera i 10 minuter vid 4 °C och snurra ned vid 70 x g i 3 minuter.
    OBS: Från detta steg och framåt behövs i allmänhet inte beläggning av spetsar och koniska rör eftersom CS inte fastnar på spetsen efter fixering.
  5. Blockera CS genom att återsuspendera pelleten i iskall SWB (200 μL SWB per brunn) och överför sfäroiderna till en 24-brunns suspensionsodlingsplatta.
    OBS: CS från en stor pellets kan delas över flera brunnar för att utföra olika färgningar. Använd ~ 20-50 CS per antikroppskombination.
  6. Inkubera vid 4 °C i minst 15 minuter.
  7. Tillsätt 200 μL SWB i en tom brunn för att fungera som referensbrunn.
    OBS: För immunofluorescerande färgning kan 48- eller 96-brunnsplattor också användas för att minska antikroppsanvändningen. Färgnings- och tvättresultaten kan dock minskas på grund av den mindre volymen per brunn.
  8. Låt sfäroiderna sätta sig i botten av plattan genom att låta plattan lutas i 45° vinkel i 5 minuter.
  9. Ta bort SWB och lämna CS i 200 μL av SWB (använd referensbrunnen för att uppskatta den minsta volymen på 200 μL).
  10. Tillsätt 200 μL SWB med de primära antikropparna 2x koncentrerade (t.ex. ɑ-aktinin [1:200] och Troponin T [1:200]) och inkubera över natten vid 4 °C medan du gungar/skakar (40 rpm på en horisontell skakapparat).
  11. Nästa dag, tillsätt 1 ml SWB till varje brunn.
  12. Låt sfäroiderna sätta sig i botten av plattan genom att lämna plattan i 45° vinkel i 5 minuter.
  13. Ta bort SWB och lämna 200 μL i plattan. Tillsätt 1 ml SWB och tvätta i 2 timmar med långsam gungning/skakning.
  14. Upprepa steg 9.12 och 9.13 två gånger till.
  15. Låt CS sätta sig i botten av plattan genom att låta plattan luta vid 45 ° i 5 minuter. Ta bort SWB och lämna 200 μL i varje brunn
  16. Tillsätt 200 μL SWB med sekundära antikroppar, konjugerade antikroppar och färgämnen 2x koncentrerade (t.ex. DAPI [1 μg/ml], mus-AF488 [1:500], kanin-AF568 [1:500]) och inkubera över natten vid 4 °C i mörkret, medan du långsamt gungar/skakar.
  17. Nästa dag, upprepa steg 9.12 och 9.13 två gånger till.
  18. Överför försiktigt CS till ett 1,5 ml rör och snurra ner vid 70 x g i 3 minuter.
  19. Ta bort så mycket av SWB som möjligt genom pipettering utan att störa CS: erna.
  20. Tillsätt inbäddningslösningen (ES; minst 50 μl, vid rumstemperatur) med en spets på 200 μl med änden avskuren och sjunk försiktigt igen för att förhindra bubbelbildning och inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter.
  21. Under tiden skapar du en fyrkantig behållare på en glasskiva med antingen nagellack eller silikon tätningsmedel.
  22. Skär av änden av en 200 μL spets och överför CS i ES till mitten av den fyrkantiga behållaren.
  23. Lägg en fyrkantig täckplatta ovanpå. För att minska luftbubblor, placera ena sidan av täckglaset först, sänk sedan långsamt täckglaset från ena sidan till den andra tills det inte finns någon fångad luft under ytan och släpp sedan täckglaset.
  24. Tryck försiktigt på alla kanter på täckglaset för att försegla det till nagellacket eller silikontätningsmedlet.
  25. Lämna bilden över natten på RT. Nästa dag är bilden klar för avbildning.
    OBS: Optisk rensning av ES kan orsaka mindre vävnadskrympning. Detta kan dock inte påverka den övergripande morfologin hos de landsspecifika parterna. Färgningsproceduren kan pausas här genom att förvara objektglasen vid 4 °C (i minst 1 vecka) eller vid -20 °C (i minst 6 månader).

Representative Results

Protokollet som visas i figur 1A beskriver genereringen av CS från tidigare expanderade hiPSC-CM. CS: erna förvärvar en 3D-struktur vid dag 1 efter sådd i ultralåga fästplattor med rundbotten och kan odlas i upp till 6 veckor (figur 1B). Som bedömt genom immunofluorescensfärgning uttryckte majoriteten av cellerna i 3 veckor gamla CS sarkomeriska proteiner såsom α-aktinin och troponin T och uppvisade regelbunden sarkomerorganisation (figur 1C). För kvantifiering av α-aktininpositiva celler utfördes flödescytometrianalys. I enlighet med immunofluorescensresultaten visade flödescytometridata jämförbara höga nivåer av α-aktinin i både dag 0 (76,9% ± 16,6%) och 3 veckor gamla CS (71,1% ± 22,7%) (figur 1D), vilket indikerar en konstant och mycket ren cellulär sammansättning under odling. Det fanns ett ökat uttryck av hjärtgenerna för korsningar (GJA1, JPH2 och PKP2), desmosomer (DES) och mitokondrier (ATP5A) i hiPSC-CM-härledda sfäroider (dag 42) jämfört med hiPSC-CMs odlade i 2D i 90 dagar (figur 1E). Uttrycket av dessa gener är ett kännetecken för cell-cellinteraktion och mognad30.

Därefter bedömdes de funktionella egenskaperna hos CS, nämligen slaghastighet och Ca2+ hantering, vid olika tidpunkter (figur 2). Transienta kalciumparametrar såsom stigtid, topptid, sönderfallstid och transient kalciumduration (CTD90) utvärderades enligt figur 2A,B. Andelen som slår CS är liknande under de första 3 veckorna efter generation men sjönk signifikant i vecka 6 (Wk6) CS (Figur 2C). Slagfrekvensen minskade signifikant vid Wk3 jämfört med Wk1 och, i likhet med andelen som slog CS, sjönk dramatiskt vid Wk6 (figur 2D). Vid Wk6 observerades CS-försämring, vilket kan förklara minskningen av både slaghastigheten och antalet slag CS. Mätning av kalciumtransienta parametrar indikerade ett signifikant högre toppvärde vid Wk2 (figur 2E), medan stigtiden, sönderfallstiden och CTD90 ökade signifikant vid Wk3 jämfört med Wk1 (figur 2F-H ). Sammantaget visar dessa resultat att hiPSC-CM-härledda sfäroider är funktionellt optimala runt vecka 2 och 3 efter generationen.

Figur 3 visar effekten av sfäroidstorlek på slaghastigheten och kalciumhanteringen. CS genererades genom sådd av 2,5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 10 4 och 20 x 10 4 hiPSC-CMs i en brunn på en 96-brunnsplatta för totalt 24 CS / brunnar per tillstånd (figur 3A). Som förväntat ökade sfäroidstorleken när antalet använda celler ökade, från 178 ± 36 μm till 351 ± 65 μm (figur 3A, höger panel). Ca2+ transienter mättes i 3 veckor gamla CS vid de fyra olika sådddensiteterna (Figur 3B). Mätningar av att slå CS indikerade att endast cirka 50% av de mindre storleks-CS (2.5K- och 5K-CSs) slog, medan andelen större storleksslagande CSs (10K- och 20K-CSs) var signifikant högre (cirka 85%) (Figur 3C). En liknande slaghastighet (cirka 28 slag per minut) visades av 5K-, 10K- och 20K-CS, vilket var signifikant högre jämfört med 2.5K-CS (figur 3D). Toppvärdena för kalciumbilder var likartade under alla testade förhållanden (figur 3E), men stigtiden (figur 3F), sönderfallstiden (figur 3G) och CTD90 (figur 3H) ökade signifikant i större storlek-CS (10K- och 20K-CS) jämfört med de mindre (2.5K- och 5K-CSs). Sammantaget visar dessa resultat att hiPSC-CM-härledda sfäroider är optimala för screening av kalciumhantering när en sådddensitet mellan 10K- och 20K hiPSC-CMs/brunn används.

Därefter utvärderade vi kryokonserveringens inverkan på CS: s livskraft och funktion. Före analysen bibehölls upptinade CS i kulturen i 1 vecka (figur 4A). Som framgår av både flödescytometri (figur 4B) och Calcein-AM (figur 4C) cellviabilitetstester påverkade kryokonservering inte cellviabiliteten inom CS. Dessutom visade upptinade CS liknande uttrycksnivåer av sarkomeriska proteiner jämfört med de färska åldersmatchade CS (figur 4D). Dessa data indikerar att CS effektivt kan kryokonserveras för efterföljande hjärtfunktionsanalys och screening med hög genomströmning.

Slutligen mättes slagaktiviteten och Ca2+ hantering i både färska och kryokonserverade CS (figur 5). Procentandelen att slå CS mättes vid olika tidpunkter efter upptining vid 2, 5 respektive 7 dagar. Medan de flesta av de färska CS: erna visade slagaktivitet över tiden, behövde de kryokonserverade CS: erna helt klart upp till 1 veckas odling för att återställa sin slagaktivitet (figur 5B). Det fanns ingen signifikant förändring i slagfrekvensen för tinade CS kontra färska; Ingen spontan slagaktivitet observerades dock vid vissa frysta CS (figur 5C). Även om toppvärdena minskade signifikant i frysta/tinade CS jämfört med färska (figur 5D), observerades inga signifikanta förändringar i stigtid, sönderfallstid och CTD90 för frysta/tinade CS jämfört med färska (figur 5E-G). Dessa data indikerar att det efter upptining är viktigt att låta CS återhämta sig i inkubatorn i minst 1 vecka innan man mäter slagaktivitet och Ca2+ övergående.

Sammantaget visar dessa resultat att kryokonservering av hiPSC-CM-härledda sfäroider bevarar kardiomyocytlivskraften, den sarkomeriska strukturen och deras funktionella egenskaper såsom spontan slagaktivitet och kalciumhantering. Således representerar hiPSC-CM-härledda sfäroider en lämplig modell för att exakt rekapitulera hjärtelektrofysiologi in vitro.

Figure 1
Figur 1: Generering av hjärtsfäroider . (A) Schematisk representation av Wnt-baserad riktad hjärtdifferentiering, efterföljande expansion av hiPSC-CMs och generering av CSs. Skapad med biorender.com. (B) Ljusfältsbilder vid olika tidpunkter för CS-odling. Skalstång, 200 μm. Wk representerar veckan. (C) Representativa immunofluorescensbilder för hjärtsarkomeriska proteiner α-aktinin och troponin T i 3 veckor gamla CS. Immunofluorescens: Hoechst (blå), α-aktinin (grön) och troponin T (röd). Skalstång, 200 μm. Den inzoomade sammanslagna bilden till höger visar sarkomerorganisationen. Skalstapel, 50 μm. (D) Flödescytometrikvantifiering av α-aktininpositiva celler före (dag 0) och 3 veckor efter bildandet av CS. (n = 14-23 per tillstånd. (E) RT-qPCR utförs på hiPSC-CMs odlade i 90 dagar (2D) och sfäroidprover odlade i 42 dagar för att fastställa uttrycksnivåer för olika hjärtgener relaterade till cellkorsningar, mellanliggande filament och mitokondrier. (n = 1-3 satser). Data representeras som medelvärde ± SD. NS (icke-signifikant) beräknat med ett oparat t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Slagfrekvens och kalciumhantering i CS vid olika veckor efter generation. (A) Exempel på transienta kalciumparametrar beräknade med Vala sciences analysalgoritm i Cyteseer Software. (B) Representativa transienta kalciumspår och timelapse-bilder av CS vid olika tidpunkter (veckor) efter generationen. Skalstapel, 200 μm. (C) Tidsförloppskvantifiering av spontan slagaktivitet uttrycks som procentandelen av att slå CS. (D) Slagfrekvens av CS under odlingstiden. (E-H) Kvantifiering av kalciumtransienter som visar toppvärde, stigtid, sönderfallstid och CTD90. Data som visas är medelvärde ± SD. Biologiska replikat = tre, tekniska replikat = 38, 50, 66 respektive 7. *p < 0,05, ****p < 0,001; envägs ANOVA följt av Tukeys post hoc-test för flera jämförelser. Förkortningar; CTD = kalciumövergående duration, Wk = vecka, CSs = humana hjärtsfäroider. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Slaghastighet och kalciumhantering i CS genererade med olika cellsådddensiteter. (A) Ljusfältsavbildning (vänster) och storleksmätningar (höger) av CS genererade med olika antal hiPSC-CM. Skalstapel, 200 μm. (B) Representativa kalciumtransienta spår och timelapse-bilder av 2.5K-20K-CSs. (C,D) Slagprocent och slagfrekvens på 2.5K-20K-CS. (E-H) Toppvärde, stigtid, sönderfallstid och CTD90 i 2.5K-20K-CS. Data är medelvärde ± SD. Biologiska replikat = tre, tekniska replikat = 28-39. *p < 0,05, ****p < 0,001; envägs ANOVA följt av Tukeys post hoc-test för flera jämförelser. Förkortningar: CTD = kalcium övergående duration, Wk = vecka, k = x 1000 celler, CSs = hjärtsfäroider. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4. Effekt av kryokonservering på hjärtsfäroidernas livskraft och struktur. (A) Schematisk representation av CS-generering, efterföljande biobankning och upptining. (B) Test av flödescytometricellviabilitet i både färska och kryokonserverade CS. Som en positiv kontroll användes en behandling med 10% Triton-X lösning i 5 minuter. (n = 4 per villkor). Data representeras som medelvärde ± SD. ** **p < 0,001; envägs ANOVA följt av Tukeys post hoc-test för flera jämförelser. (C) Calcein-AM-cellviabilitetstest i färska kontra tinade CS efter 7 dagars odling (n = 15-17 per tillstånd, ** **p < 0,001, genom parat t-test; skalstång, 200 μm). (D) Representativt ljusfält (vänster) och immunofluorescensfärgning för α-aktinin och troponin T-uttryck i färska och tinade CS. Immunofluorescens: Hoechst (blå), α-aktinin (grön) och troponin T (röd). De sammanslagna bilderna till höger visar sarkomerstrimmor i CS: erna. Skalstång, 50 μm. Förkortningar: X = valfri upptiningsdag, PI = propidiumjodid, Cal-AM = calcein-AM, EthD-I = Ethidium Homodimer I. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Kalciumtransienter i färska kontra tinade CS. (A) Representativa kalciumtransienta spår och time-lapse-bilder av CS före kryokonservering och 1 vecka efter upptining. (B) Slagprocent av färska och frysta/tinade hjärtsfäroider. Staplar representerar enskilda experiment. (C) Slagfrekvens av färska och frysta/tinade hjärtsfäroider. (D-G) Kvantifiering av kalciumövergående parametrar: toppvärde, stigtid, sönderfallstid och CTD90. Data är medelvärde ± SD. *p < 0,05, ****p < 0,001; envägs ANOVA följt av Tukeys post hoc-test för flera jämförelser. Förkortningar; CTD = kalciumövergående duration, CSs = hjärtsfäroider. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur 1: Representativa grindstrategier för flödescytometrianalys. (A) Representativ grindstrategi för α-aktininpositivt hiPSC-CM i en ren population kontra negativ kontroll och isotypkontroll. Antalet α-aktininpositiva analyserade celler är 25 x 105. Förkortningar; SSC = sidospridning, PI+ = propidiumjodid positiv. B) Representativ grindstrategi för viabilitetsanalysen i både färsk, tinad, positiv kontroll (Triton-X) och negativ kontroll (ofärgad). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Hjärtläkemedelsupptäckt hindras av ett beroende av icke-mänskliga djur- och cellulära modeller med otillräcklig genomströmning och fysiologisk trohet för att korrekt utföra avläsningar. hiPSC-CM-biologi i kombination med HT-instrumentering och fysiologiska sonder har potential att återinföra mänskliga modeller i de tidigaste stadierna av modellering av hjärtsjukdomar och läkemedelsupptäckt. Vi utvecklade en 3D-metod för generering av hjärtvävnad som producerar högkvalitativa och funktionella CS för en optimal plattform för modellering av hjärtsjukdomar och läkemedelsscreening. Dessutom möjliggör kombinationen av sfäroidtekniken i 3D-bioreaktorsystem för industriell EV-produktion ett nödvändigt steg mot klinisk översättning av EV-baserad terapi. Metoden som beskrivs här bygger på flera avgörande faktorer och är en variant av befintliga protokoll 9,10,28,29. Dessa metoder inkluderar: 1) generering av 3D-vävnadskonstruktioner, 2) det optimala cellantalet och tidpunkten före screeningen, 3) förbättring av instrumentens känslighet och höga genomströmningskapacitet och 4) att kunna frysa sfäroiderna före någon funktionell analys. Till skillnad från tidigare beskrivna protokoll beskriver det föreslagna protokollet genereringen av upp till 1 500 sfäroider per dag och lämpligheten för HTS. Konventionell analys av hundra föreningar över 6 x 0,5 logdoser för 10 replikat med befintliga 96-brunns kalciumavbildningssystem eller 24-brunns multiplexerade konstruerade hjärtvävnader kräver cirka 500 miljoner till 3 miljarder hiPSC-CMs31,32. Den föreslagna applikationen gör hjärtscreeningar mindre kostsamma och tidseffektiva jämfört med konventionella system eftersom 96-brunnsplattorna endast krävde 10% av sådddensiteten jämfört med den beskrivna metoden. Dessutom, jämfört med tidigare protokoll, såsom hanging-drop-metoden, möjliggör generering av sfäroider genom självaggregering i ultralåga fästplattor högkvalitativ automatiserad avbildning av enskilda mikrovävnader33.

Denna lilla 3D-modell efterliknar den biologiska och fysiologiska fenotypen i den kardiovaskulära miljön in vivo . Som tidigare visats ökar kalciumtransienter dramatiskt i 3D-hjärtvävnadskonstruktioner jämfört med 2D-monolagercellkulturer34.

Därefter fann vi att sådddensiteten och rätt odlingstid också är kritiska faktorer för en framgångsrik CS-screening. Densiteterna för 10K-20K hiPSC-CMs per sfäroid och screening mellan vecka 2-3 efter generation var optimala, medan för små eller för gamla sfäroider visar störd kalciumhantering (figur 2 och figur 3). Därför är det viktigt att hålla sådddensiteterna så konsekventa som möjligt, eftersom storleken påverkar de funktionella parametrarna. Även om denna optiska metod ger goda resultat för levande 3D-kulturer som en hel vävnad, är det utmanande att erhålla data inom större sfäroider på (sub-) cellulär nivå utan att förlita sig på tidskrävande histologimetoder. Nyligen har flera metoder publicerats som använde "optiskt clearing", vilket möjliggör förvärv av hela 3D-sfäroider med möjlighet till encellskvantifiering av markörer. Här anpassade vi ett 3-dagars protokoll från CS-skörd till bildanalys, som är optimerad för 3D-avbildning med konfokalmikroskopi29 (figur 1C och figur 4D).

Slutligen, med ökningen av 3D-hjärtvävnadsapplikationer och kommersiella applikationer, ökar efterfrågan på långtidsförvaring och patientspecifik biobank från olika givare. Kryokonservering är en effektiv strategi för att generera HTS-plattor från flera satser över tid. Frysningen av hiPSC-CM har beskrivits tidigare och skiljer sig inte från andra odlade celltyper 10,35,36. Nyligen har metoder för frysning av plattor med 2D-celler beskrivits37. Här fann vi att PSC-kryokonserveringssatsen är det mest optimala tillståndet jämfört med tre andra (data visas inte) och använde detta medium för effektiv frysning av sfäroider. Efter kryokonservering förblir viabiliteten hög (figur 4B,C), men CSs elektrofysiologiska egenskaper påverkas och en inkubationsperiod efter upptining krävs. Faktum är att 1 vecka efter upptining visade CS spontan slagaktivitet och kalciumhantering. Det har dock beskrivits att färska och återvunna hiPSC-CM inte alltid uppvisar identiska molekylära och fysiologiska egenskaper38. Denna begränsning måste beaktas när kryokonserverade hiPSC-CM används för att bedöma läkemedelsinducerade hjärtavläsningar. Dessutom, även om vi effektivt modulerar antalet celler per sfäroid och den optimala tidpunkten för kalciumtransient avbildning, kan hjärtsfäroiderna förbättras genom att blanda hiPSC-härledda kardiomyocytceller med endotelceller, fibroblaster, cell-cellkorsningar och extracellulära matriser, såsom kitosan, kollagen IV, fibronektin, matrigel eller laminin, efterlikna in vivo hjärtmiljön39, 40. Sammantaget föreslår vi ett steg-för-steg-protokoll för att effektivt generera CS som är lämpliga för nedströmsapplikationer som sjukdomsmodellering och HT-läkemedelsscreening.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill uppmärksamma VALA-vetenskapen för Cyteseer-programvarupaketet och optimering av den automatiserade 3D-kalciumanalysen. Vi vill uppmärksamma bidragsstöd från PLN-stiftelsen (RM). P.A.D. och F.S. stöds av CUREPLaN Leducq. J.P.G.S. stöds av H2020-EVICARE (#725229) från Europeiska forskningsrådet (ERC). J.W.B. stöds av UMC Utrecht Clinical Fellowship, Netherlands Heart Institute Fellowship och CVON-Dosis young talent grant; Nederländska hjärtfonden (CVON-Dosis 2014-40). N.C. stöds av gravitationsprogrammet "Materials Driven Regeneration" av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (RegmedXB #024.003.013) och Marie Skłodowska-Curie-åtgärderna (bidragsavtal RESCUE #801540). V.S.-P. stöds av Alliansfonden (UMCU, UU, TU/e). A.v.M. stöds av det EU-finansierade projektet BRAVE (H2020, ID:874827)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 wells suspenion plate  Corning  3738
96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate Corning CLS3474-24EA
Albumax Thermo Fisher Scientific 11020021
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) antibody Sigma-Aldrich A7811 Dilution: 1:200
Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932) Abcam ab45932 Dilution: 1:200
Ascorbic acid  Sigma-Aldrich A8960
B-27 supplement  Thermo Fisher Scientific 17504-044
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Bovine serum albumin fraction V (BSA) Roche 10735086001
Cal-520, AM  Abcam ab171868
Confocal microscope Leica  DMi8 
Confocal microscope software  Leica  Las X
Conical tubes 15 mL Greiner Bio-One 5618-8271
Creatine monohydrate  Sigma-Aldrich C3630
DAPI  Thermo Fisher Scientific D3571 Concentration: 1 µg/mL
DMEM no glucose  Thermo Fisher Scientific 11966025
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020
Fructose  Sigma-Aldrich 76050771.05
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glycerol Boom 76050771.05
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029 Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A11011 Dilution: 1:500
Horizontal shaker IKA 4003000
Human induced pluripotent stem cell lines (Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank) CVI-273 (control 1)
Human induced pluripotent stem cell lines Germany  141 (control 2) 144 (control 3)
Hydrochloric acid (HCl)  Ajax Firechem 265.2.5L-PL 10 M stock solution, corrosive
Isotype control, FITC mouse IgM κ isotype BD 556652
KnockOut Serum Replacement  Thermo Fisher Scientific 10828 Protect from light
L-carnitine Sigma-Aldrich C0283
Myocyte calcium and contractility system Leica  Thunder, DMi8
Non essential amino acids (NEAA) Thermo Fisher Scientific 11140
Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0–7.6 Santa Cruz SC281692 Hazardous
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin/streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140
PES Membrane Vacuum Filter system Corning  431097
PI/RNase Staining Solution Invitrogen F10797 Dilution: 1:1000
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
PSC Cryopreservation Kit Thermo Fisher Scientific A2644601
RevitaCell Thermo Fisher Scientific A2644501
RPMI 1640 medium  Thermo Fisher Scientific 11875
Silicone Elastomer Kit SYLGARD 184
Sodium dodecyl sulfate solution (10%) Sigma-Aldrich 71736
Sodium L-Lactate Sigma-Aldrich 71718
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Tris Fisher  Scientific  11486631
Triton X-100 Merck X100-1L Hazardous
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
TrypLE Select Enzyme (10x) Thermo Fisher Scientific A1217701
Tween-20  Sigma-Aldrich P1379
Urea  Sigma-Aldrich 51456
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V6629
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) Tocris  1254 Protect from light

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burridge, P. W., et al. Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  2. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  3. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  4. Paige, S. L., et al. Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells. PLoS One. 5 (6), 11134 (2010).
  5. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  6. Ahmed, R. E., et al. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178 (2020).
  7. Liu, C., et al. Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells. EBioMedicine. 76, 103813 (2022).
  8. Musunuru, K., et al. Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043 (2018).
  9. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  10. Maas, R. G. C., et al. Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334 (2021).
  11. Tremblay, C., et al. A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).
  12. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12 (1), 5142 (2021).
  13. Goldfracht, I., et al. Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications. Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).
  14. Fleischer, S., et al. Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup. Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).
  15. Branco, M. A., et al. Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture. Science Reports. 9 (1), 9229 (2019).
  16. Ergir, E., et al. Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture. bioRxiv. , (2022).
  17. Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scienctific Reports. 7 (1), 5464 (2017).
  18. Kofron, C. M., et al. A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues. Science Reports. 11 (1), 10228 (2021).
  19. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  20. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  21. Tenreiro, M. F., et al. Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30 (2021).
  22. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).
  23. McDermott-Roe, C., et al. Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799 (2019).
  24. National Library of Medicine (U.S.). Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure. National Library of Medicine. , Identifier NCT04396899 (2020).
  25. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  26. Oh, J. G., et al. Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization. Journal of Visualized Experiments. 155, 60135 (2020).
  27. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  28. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  29. van Ineveld, R. L., et al. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
  30. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: New phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  31. Ding, B., et al. Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro. Cell Transplantation. 29, 963689719897066 (2020).
  32. Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).
  33. Amaral, R. L. F., et al. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).
  34. Daily, N. J., et al. Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture. Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168 (2015).
  35. Preininger, M. K., et al. Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).
  36. Kim, Y. Y., et al. Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition. Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).
  37. Daily, M. I., et al. Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation. Cryobiology. 93, 62-69 (2020).
  38. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  39. Yeh, H. -Y., et al. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  40. Scalise, M., et al. From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180 (2021).

Tags

Bioteknik nummer 193
Generering, screening med hög genomströmning och biobankning av humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda hjärtsfäroider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maas, R. G. C., Beekink, T.,… More

Maas, R. G. C., Beekink, T., Chirico, N., Snijders Blok, C. J. B., Dokter, I., Sampaio-Pinto, V., van Mil, A., Doevendans, P. A., Buikema, J. W., Sluijter, J. P. G., Stillitano, F. Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids. J. Vis. Exp. (193), e64365, doi:10.3791/64365 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter