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Cancer Research

एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिसिटी संशोधित यौगिकों की पहचान के लिए उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग परख

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/64485
Automatic Translation
*1,2, *1,3, *1,3, 1, 1,4, 1,4
1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, University of Debrecen, 4ELKH-DE Cell Biology and Signaling Research Group
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल एक चिकित्सीय एंटी-एचईआर -2 एंटीबॉडी की उपस्थिति में प्राकृतिक हत्यारा सेल-मध्यस्थता स्तन कैंसर सेल हत्या को संशोधित करने वाले यौगिकों की पहचान करने के लिए एक स्वचालित, छवि-आधारित उच्च-थ्रूपुट तकनीक प्रस्तुत करता है।

Abstract

एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी या प्रतिरक्षा चेकपॉइंट इनहिबिटर के साथ इम्यूनोथेरेपी ने स्तन कैंसर की चिकित्सा में क्रांति ला दी है। एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर एचईआर 2 को व्यक्त करने वाली स्तन कैंसर कोशिकाओं को एंटी-एचईआर -2 एंटीबॉडी ट्रास्टुज़ुमाब द्वारा लक्षित किया जा सकता है। एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिसिटी (एडीसीसी) एचईआर -2 की एंटीट्यूमर कार्रवाई में फंसा हुआ एक महत्वपूर्ण तंत्र है। कैंसर कोशिकाओं से बंधे ट्रास्टुज़ुमाब को एडीसीसी प्रभावक कोशिकाओं (जैसे, प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं, मैक्रोफेज और ग्रैनुलोसाइट्स) के एफसी रिसेप्टर्स द्वारा पहचाना जा सकता है, जिससे इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं की साइटोटोक्सिक गतिविधि शुरू होती है जिससे कैंसर कोशिका मृत्यु हो जाती है। हमने उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग द्वारा उपन्यास एडीसीसी मॉड्यूलेटर यौगिकों की पहचान करने के लिए एडीसीसी की मात्रा का ठहराव के लिए एक छवि-आधारित परख विकसित करने के लिए तैयार किया। परख में, एचईआर 2 ने जेआईएमटी -1 स्तन कैंसर कोशिकाओं को ट्रास्टुज़ुमाब की उपस्थिति में एनके -92 कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धित किया है, और लक्ष्य कोशिका मृत्यु को स्वचालित माइक्रोस्कोपी और मात्रात्मक छवि विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाता है। लक्ष्य कोशिकाओं को उनके ईजीएफपी प्रतिदीप्ति के आधार पर प्रभावक कोशिकाओं से अलग किया जाता है। हम दिखाते हैं कि एडीसीसी मॉड्यूलेटर दवाओं की पहचान करने के लिए परख में यौगिक पुस्तकालयों का परीक्षण कैसे किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए, लैब शेल्फ से यादृच्छिक रूप से चयनित ठीक रसायनों का उपयोग करके एक यौगिक पुस्तकालय परीक्षण प्लेट स्थापित की गई थी। एनके सेल माइग्रेशन और डिग्रैनुलेशन में हस्तक्षेप करने के लिए अपेक्षित तीन सूक्ष्मनलिकाएं अस्थिर यौगिकों (कोलचिसीन, विन्क्रिस्टिन, पोडोफिलोटॉक्सिन) को भी परीक्षण पुस्तकालय में शामिल किया गया था। परीक्षण स्क्रीन ने सभी तीन सकारात्मक नियंत्रण यौगिकों को एक रासायनिक पुस्तकालय में एडीसीसी-संशोधित दवाओं की पहचान करने के लिए विधि की उपयुक्तता साबित करने वाले हिट के रूप में पहचाना। इस परख के साथ, एडीसीसी-बढ़ाने वाले यौगिकों की पहचान करने के लिए यौगिक लाइब्रेरी स्क्रीन का प्रदर्शन किया जा सकता है जिनका उपयोग एंटीकैंसर इम्यूनोथेरेपी प्राप्त करने वाले रोगियों के उपचार के लिए सहायक चिकित्सीय एजेंटों के रूप में किया जा सकता है। इसके अलावा, विधि का उपयोग विभिन्न संकेतों के लिए कैंसर रोगियों द्वारा ली गई चिकित्सीय दवाओं के किसी भी अवांछनीय एडीसीसी-अवरोधक दुष्प्रभावों की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

एंटीकैंसर एंटीबॉडी, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट इनहिबिटर, या चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर-व्यक्त टी (सीएआर-टी) कोशिकाओं के साथ इम्यूनोथेरेपी कैंसर के उपचारके लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है। ट्रास्टुज़ुमाब एक मानवकृत मोनोक्लोनल एंटी-एचईआर -2 (मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2) एंटीबॉडी है जिसका उपयोग एचईआर -2 पॉजिटिव प्रारंभिक चरण या मेटास्टैटिक स्तन कैंसर के इलाज के लिए किया जाता है, साथ ही एचईआर -2 पॉजिटिव मेटास्टैटिक गैस्ट्रिक कैंसर 4,5,6। यह मुख्य रूप से एपिडर्मल विकास कारक4 के प्रसार उत्तेजक प्रभाव को रोककर कार्य करता है। हालांकि, यह बताया गया है कि ट्रास्टुज़ुमाब कुशलतापूर्वक कैंसर कोशिका मृत्यु को ट्रिगर करता है, भले ही कैंसर कोशिकाओं ने एचईआर -2 उत्तेजना7 के प्रति अपनी प्रतिक्रिया खो दी हो। एंटीबॉडी का यह विरोधाभासी प्रभाव एंटीबॉडी-निर्भर सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिसिटी (एडीसीसी) 7 के कारण है। एडीसीसी को प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं, ग्रैनुलोसाइट्स और मैक्रोफेज द्वारा मध्यस्थ किया जा सकता है जिन्हें सामूहिक रूप से एडीसीसी 8,9 के प्रभावक कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है। यदि एक एंटीबॉडी, जैसे कि ट्रास्टुज़ुमाब, ट्यूमर कोशिकाओं को बांधता है, तो ये प्रभावक कोशिकाएं एंटीबॉडी के निरंतर (एफसी) क्षेत्र को बांधने के लिए अपने एफसी रिसेप्टर्स का उपयोग करती हैं। एंटीबॉडी ट्यूमर कोशिकाओं और एफसी रिसेप्टर-असर प्रभावक कोशिकाओं को पुल करता है, जिससे उनके साइटोटोक्सिकमध्यस्थों की रिहाई शुरू होती है। प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाएं लक्ष्य कोशिका झिल्ली में छिद्र उत्पन्न करने के लिए पर्फोरिन युक्त अपने कणिकाओं के साइटोटोक्सिक कार्गो को छोड़ती हैं और प्रतिरक्षा सिनैप्स में ग्रैनजाइम (ट्रिगर सेल डेथ सिग्नलिंग मार्ग) जिससे कैंसर कोशिकाओं का एपोप्टोसिस होता है (चित्रा 1 देखें)।

Figure 1
चित्रा 1: एडीसीसी में प्रभावक और लक्ष्य सेल इंटरैक्शन। प्रभावक एनके सेल का सेल सतह एफसीओ रिसेप्टर ट्यूमर सेल की सतह पर व्यक्त एचईआर 2 अणु के लिए विशिष्ट एंटी-एचईआर 2 ट्रास्टुज़ुमाब एंटीबॉडी के एफसी क्षेत्र को पहचानता है। इस प्रकार, तथाकथित इम्यूनोलॉजिकल सिनैप्स दो कोशिकाओं के बीच स्थापित किया जाता है, जो प्रभावक कोशिका के साइटोटोक्सिक कणिकाओं के निर्देशित एक्सोसाइटोसिस को प्रेरित करता है। जारी किए गए पर्फोरिन और ग्रैनजाइम अणुओं के परिणामस्वरूप अंततः लक्ष्य कोशिका का एपोप्टोसिस होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एडीसीसी सहित साइटोटॉक्सिसिटी को मापने के लिए पहले कई परख विकसित किए गए हैं। सोने का मानक रेडियोधर्मी क्रोमियम रिलीज विधि है, जहां लक्ष्य कोशिकाओं को रेडियोधर्मी 51सीआर आइसोटोप के साथ लेबल किया जाता है, और एडीसीसी को लाइसेड लक्ष्य कोशिकाओं11 के सुपरनैटेंट से रेडियोधर्मिता को मापकर निर्धारित किया जाता है। रेडियोधर्मी फार्माकोन और कचरे के सख्ती से विनियमित हैंडलिंग, भंडारण और निपटान के कारण स्पष्ट समस्याओं के कारण, यह विधि जीवन वैज्ञानिकों के बीच तेजी से गैर-लोकप्रिय हो गई है। इसके अलावा, यह उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदायी नहीं है। मारे गए लक्ष्य कोशिकाओं से जारी एंजाइमों (जैसे, लैक्टेट-डिहाइड्रोजनेज) की गतिविधि को मापना 51सीआर परख12 के लिए एक गैर-रेडियोधर्मी विकल्प प्रदान कर सकता है। हालांकि, ये परख लक्ष्य और प्रभावक कोशिका मृत्यु के बीच अंतर करने में विफल रहते हैं। इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन (ईसीआईएस) एडीसीसी13 के परिमाणीकरण के लिए उपयुक्त साबित हुआ, लेकिन ईसीआईएस उपकरण अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं है, और तकनीक उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों / स्क्रीनिंग के साथ संगत नहीं है। फ्लोरोसेंटली लेबल वाली कोशिकाएं कई सेल जीव विज्ञान परखों में एक लोकप्रिय विकल्प का प्रतिनिधित्व करती हैं और अक्सर फ्लो साइटोमेट्री या प्लेट रीडर-आधारित अनुप्रयोगों 14,15,16 में उपयोग की जाती हैं। हालांकि, इन परखों में अक्सर धोने के चरण होते हैं या अन्यथा उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों (जैसे, फ्लो साइटोमेट्री-आधारित तकनीकों) के साथ असंगत होते हैं। कुछ लोकप्रिय साइटोटॉक्सिसिटी परख, जो सिद्धांत रूप में एडीसीसी परिमाणीकरण के लिए उपयुक्त होना चाहिए, एडीसीसी दक्षता13 को विश्वसनीय रूप से निर्धारित करने में विफल रहते हैं। हाल ही में, फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के प्रसार के साथ, छवि-आधारित, उच्च-सामग्री परख जीवन विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों में तेजी से लोकप्रिय हो रहेहैं। एक तरफ, सेल इमेजिंग उपकरण अब सर्वव्यापी हैं, जबकि दूसरी ओर, अधिग्रहित छवियों से लगभग अंतहीन रूपात्मक पैरामीटर एकत्र किए जा सकते हैं। इसलिए, हम एक उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग संगत एडीसीसी परख विकसित करने और यौगिक पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए इसकी उपयुक्तता का प्रदर्शन करने के लिए तैयार हैं।

यहां, हम एक छवि-आधारित एडीसीसी परख प्रस्तुत करते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि एडीसीसी मॉड्यूलेटिंग यौगिकों की पहचान करने के लिए इस परख का उपयोग उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) के लिए कैसे किया जा सकता है। मॉडल JIMT-1 स्तन कार्सिनोमा लक्ष्य कोशिकाओं, CD16.176V.NK-92 प्रभावक कोशिकाओं और मानवकृत मोनोक्लोनल एंटी-एचईआर 2 एंटीबॉडी ट्रास्टुज़ुमाब पर आधारित है। इस विधि के साथ, उन दवाओं की पहचान करना संभव है जो एनके कोशिकाओं की ट्यूमर-हत्या कार्रवाई को बढ़ा सकते हैं या एडीसीसी के साथ हस्तक्षेप करने वाले छोटे अणुओं की पहचान करके एनके सेल-मध्यस्थता एडीसीसी के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त कर सकते हैं। हम सुझाव देते हैं कि एडीसीसी के विशेष संबंध में सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिसिटी को निर्धारित करने का लक्ष्य रखने वाले जीवन वैज्ञानिकों को खोज विज्ञान या दवा विकास के लिए इस परख का उपयोग करने से लाभ हो सकता है। यह परख एक विकल्प हो सकता है यदि एक प्रयोगशाला के पास फ्लोरोसेंट इमेजिंग और मात्रात्मक छवि विश्लेषण में पहुंच और कुछ अनुभव है।

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Protocol

नोट: परख वर्कफ़्लो के मुख्य चरण चित्रा 2 में प्रस्तुत किए गए हैं।

Figure 2
चित्र 2: ADCC स्क्रीन का वर्कफ़्लो। 96 अच्छी तरह से एचसीएस प्लेटों में बीजित JIMT-1-ईजीएफपी लक्ष्य कोशिकाओं को यौगिक पुस्तकालय की दवाओं के साथ इलाज किया जाता है। बदले में, बिना दाग वाले एनके (प्रभावक) कोशिकाओं और ट्रास्टुज़ुमाब को जोड़ा जाता है, और प्लेट को 0 टाइमपॉइंट पर और इनक्यूबेशन के 3 घंटे के बाद चित्रित किया जाता है। एडीसीसी मूल्यांकन व्यवहार्य (सतह अनुयायी) लक्ष्य कोशिकाओं की संख्या में परिवर्तन पर आधारित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. एचसीएस प्लेट की कोटिंग

  1. 96 अच्छी तरह से उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (एचएससी) प्लेटों को 50 μL / वेल JIMT-1 माध्यम (DMEM / F-12 माध्यम 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 0.3 U / mL इंसुलिन (100 IU / mL, Humulin R, और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) के साथ कोट करें।
  2. प्लेट को 1 घंटे के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: प्लेट की कांच की सतह पर JIMT-1 कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए कोटिंग महत्वपूर्ण है।

2. जेआईएमटी -1 एन्हांस्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) कोशिकाओं की सीडिंग

नोट: ईजीएफपी-व्यक्त जेआईएमटी -1 कोशिकाएं हमारे पिछले काम18 में उत्पन्न हुई थीं, और कोशिकाओं को जेआईएमटी -1 मीडिया में टी 25 ऊतक संस्कृति फ्लास्क में सुसंस्कृत किया गया था (चरण 1.1 में संरचना देखें)।

  1. बाँझ पीबीएस के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  2. फ्लास्क में ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 1 एमएल जोड़ें और फ्लास्क को 10 मिनट के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, फ्लास्क को टैप करके देखें कि क्या JIMT-1 कोशिकाएं अलग हो गई हैं।
  4. 2 एमएल जेआईएमटी -1 मीडिया के साथ पाचन को रोकें और सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें।
  5. एक बुर्कर कक्ष में 0.4% ट्राइपैन ब्लू (डाई का 80 μL + सेल निलंबन का 20 μL) के साथ कोशिकाओं की गणना करें और सेल संख्या को 133, 000 कोशिकाओं / mL में समायोजित करें।
  6. 96 वेल प्लेट (चरण 1.2) से कोटिंग माध्यम को एस्पिरेट करें।
  7. एचसीएस प्लेटों के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन का पिपेट 75 μL ( सामग्री की तालिका देखें)।
  8. कोशिकाओं को सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेशन के दौरान संलग्न करने की अनुमति दें।

3. यौगिक पुस्तकालय के साथ JIMT-1 ईजीएफपी कोशिकाओं का पूर्व-उपचार

  1. JIMT-1 कोशिकाओं से माध्यम को अलग करें और कुओं में 50 μL / अच्छी तरह से ताजा JIMT-1 माध्यम जोड़ें। प्लेट को उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें।
    नोट: एक तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करने से यौगिक पुस्तकालयों को अधिक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाता है।
  2. परीक्षण यौगिकों को यौगिक लाइब्रेरी प्लेट से परख प्लेट में स्थानांतरित करें, जिसमें पिन टूल को 25 एनएल वॉल्यूम में कैलिब्रेट किया गया है। ऐसा चार बार करें। स्थानांतरण के चार दौर 100 nL (और 20 μM अंतिम एकाग्रता) की अंतिम मात्रा देते हैं।
  3. प्रत्येक चरण के बीच, पिन टूल को धोएं, पहले 50% डीएमएसओ के साथ और फिर 70% इथेनॉल के साथ।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ2 इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें।

4. प्रभावक कोशिकाओं को जोड़कर एडीसीसी परख शुरू करना

नोट: CD16.176V.NK92 कोशिकाओं (इसके बाद NK92 कोशिकाओं के रूप में संदर्भित) को α-MEM में 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-पाइरूवेट, 1% ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 100 IU / mL IL-2 के साथ संवर्धित किया गया था।

  1. ट्राइपैन ब्लू के साथ एनके 92 कोशिकाओं की गणना करें (डाई का 80 μL + सेल निलंबन का 20 μL)। सेल संख्या को 400,000 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें।
  2. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 150 x g पर सेल निलंबन के 4 एमएल सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. JIMT-1 माध्यम में 20 μg / mL एंटी-एचईआर 2 एंटीबॉडी (trastuzumab) जोड़कर ADCC माध्यम तैयार करें।
  4. एनके सेल गोली को 5 एमएल एडीसीसी माध्यम में पुन: निलंबित करें।
  5. लक्ष्य JIMT-1 कोशिकाओं के लिए ADCC माध्यम के 50 μL में 20,000 NK कोशिकाओं को पिपेट करें। अंतिम मात्रा 100 μL है, और अंतिम trastuzumab एकाग्रता 10 μg / mL है।
  6. परख प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतर्निहित इनक्यूबेटर सेट के साथ उच्च-सामग्री विश्लेषण उपकरण में रखें।

5. इमेजिंग

नोट: प्लेटों को दो समय बिंदुओं पर चित्रित किया जाना चाहिए, पहला, लक्ष्य कोशिकाओं में प्रभावक कोशिकाओं को जोड़ने के तुरंत बाद और दूसरा, एनके कोशिकाओं को जोड़ने के 3 घंटे बाद। इमेजिंग के लिए, उच्च-सामग्री विश्लेषक और इसके सॉफ़्टवेयर या उपयुक्त विकल्पों का उपयोग किया जा सकता है ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. प्लेटों की सूची से प्लेट प्रकार (96-वेल सेल वाहक अल्ट्रा) का चयन करें।
  2. यदि परख प्लेटों में की जाती है तो दो पीक ऑटोफोकस का चयन करें।
  3. गैर-कॉन्फोकल मोड में 10x उद्देश्य का उपयोग करें।
  4. सिग्नल से शोर अनुपात को दोगुना करने के लिए बिनिंग 2 का चयन करें।
  5. 650-760 एनएम पर ब्राइटफील्ड छवियां और 488 एनएम (उत्तेजना) और 500-550 एनएम (उत्सर्जन) तरंग दैर्ध्य पर ईजीएफपी-ट्रांसड्यूस्ड जेआईएमटी -1 कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियां लें।
  6. इमेजिंग के लिए फ़ील्ड ्स की संख्या और टाइमपॉइंट्स की संख्या का चयन करें.

6. छवि विश्लेषण

नोट: एडीसीसी दक्षता का विश्लेषण करने के लिए, व्यवहार्य JIMT-1 कोशिकाओं की गणना की जाती है। एडीसीसी द्वारा मारे गए लक्ष्य कोशिकाएं सतह से अलग हो जाती हैं और माइक्रोस्कोप के फोकल प्लेन से दूर चली जाती हैं। इसलिए, एडीसीसी प्रतिक्रिया की शुरुआत और अंत में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के बीच का अंतर एडीसीसी द्वारा समाप्त लक्ष्य कोशिकाओं से मेल खाता है। मूल्यांकन अनुक्रम का निर्माण करने का तरीका दिखाने के लिए, वीडियो में एक नियंत्रण एडीसीसी अच्छी तरह से दिखाया गया है।

  1. कक्षों से मेल खाने वाले छवि के क्षेत्रों का पता लगाने के लिए कक्ष ढूँढें मॉड्यूल का उपयोग करें.
    नोट: प्रत्येक कोशिका को छवि पर एक क्षेत्र के रूप में पाया जाता है जिसमें इसके आसपास की तुलना में उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता होती है।
  2. न्यूनतम 80 μm व्यास के साथ अंतर्निहित M एल्गोरिथ्म का उपयोग करके कोशिकाओं का चयन करें।
  3. विभाजन संवेदनशीलता, जो एक बड़ी वस्तु को छोटी वस्तुओं में पार्सल करती है, को 0.5 पर सेट करें।
  4. सामान्य सीमा (पिक्सेल तीव्रता का निम्नतम स्तर) को 0 पर सेट करें.
  5. दो चरणों में उच्च ईजीएफपी प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ पृष्ठभूमि क्षेत्र का पता लगाने को बाहर करें।
    1. सबसे पहले, पहले चयनित सेल क्षेत्र में ईजीएफपी प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित करने के लिए तीव्रता गुण की गणना फ़ंक्शन का उपयोग करें।
    2. जनसंख्या का चयन करें विकल्प का उपयोग करके न्यूनतम और अधिकतम तीव्रता सीमा सेट करें.

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Representative Results

यह प्रदर्शित करने के लिए कि परख वास्तविक जीवन में कैसे काम करती है, हमने प्रयोगशाला अलमारियों से यादृच्छिक रूप से चुने गए 16 यौगिकों की एक परीक्षण लाइब्रेरी बनाई (चित्रा 3)। इसके अलावा, डीएमएसओ को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में भी शामिल किया गया था, और तीन सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन अवरोधक यौगिक (कोलचिसीन, विन्क्रिस्टिन और पोडोफिलोटॉक्सिन) सकारात्मक नियंत्रण के रूप में। उत्तरार्द्ध से कैंसर कोशिकाओं में एनके सेल माइग्रेशन और एनके सेल डिग्रैनुलेशन में हस्तक्षेप करके एडीसीसी को रोकने की उम्मीद थी। सभी परीक्षण यौगिकों और डीएमएसओ को परीक्षण पुस्तकालय प्लेट पर चतुष्कोणीय रूप में रखा गया था, और डीएमएसओ को प्लेट के पहले और अंतिम कॉलम में भी जोड़ा गया था (चित्रा 3)।

Figure 3
चित्रा 3: एचसीएस एडीसीसी परख के परीक्षण के लिए उपयोग की जाने वाली यौगिक लाइब्रेरी । (ए) यौगिक पुस्तकालय का प्लेट मानचित्र दिखाया गया है। प्रत्येक यौगिक पुस्तकालय प्लेट पर चतुष्कोणीय रूप में मौजूद होता है। डीएमएसओ को प्लेट के पहले और अंतिम कॉलम में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में जोड़ा गया था। डीएमएसओ युक्त कुएं और तीन सूक्ष्मनलिका असेंबली इनहिबिटर (कोलचिसीन, विन्क्रिस्टिन और पोडोफिलोटॉक्सिन) रंग में हाइलाइट किए गए हैं। (बी) परीक्षण यौगिकों के नाम, प्लेट स्थिति और संक्षिप्त नाम प्रस्तुत किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हमारे परीक्षण पुस्तकालय का उपयोग करके, हमने परख चलाया और प्रोटोकॉल में वर्णित परिणामों का मूल्यांकन किया। चूंकि JIMT-1 कोशिकाएं ईजीएफपी व्यक्त करती हैं, इसलिए उन्हें आसानी से प्रभावक कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है जो गैर-फ्लोरोसेंट हैं। परख सतह अनुयायी (व्यवहार्य) लक्ष्य कोशिकाओं की संख्या में परिवर्तन का पता लगाने पर आधारित है। हमारी परख स्थितियों के तहत, एनके कोशिकाओं ने लगभग 50% जेआईएमटी -1 कोशिका मृत्यु (+ एनके समूह) का कारण बना, जबकि किसी भी परीक्षण यौगिक ने एनके कोशिकाओं (-एनके समूह) की अनुपस्थिति में कोई विषाक्तता पैदा नहीं की (चित्रा 4)। परख की स्थिति को पहले साइटोटॉक्सिसिटी18 के इस मध्यम स्तर को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था, यह मानते हुए कि यह एडीसीसी एक्टिवेटर और अवरोधक यौगिकों दोनों की पहचान की अनुमति देगा। सकारात्मक नियंत्रण सूक्ष्मनलिका असेंबली अवरोधक अपेक्षा के अनुसार सभी चतुष्कोणीय स्थितियों में "हिट" के रूप में दिखाई दिए, जो परख की उच्च विश्वसनीयता का संकेत देते हैं (चित्रा 4)।

Figure 4
चित्रा 4: एडीसीसी मॉडल में एक यौगिक पुस्तकालय का परीक्षण। (ए) एचसीएस इमेजर के 10 x उद्देश्य के साथ डीएमएसओ की उपस्थिति में एनके कोशिकाओं और जेआईएमटी -1 कोशिकाओं के सह-इनक्यूबेशन के 3 घंटे बाद एडीसीसी प्रतिक्रियाओं की छवियां ली गईं। (स्केल बार 200 μm है। छवि का एक हिस्सा आवर्धित है, जो बिना दाग वाले प्रभावक एनके कोशिकाओं और ईजीएफपी-ट्रांसड्यूटेड लक्ष्य जेआईएमटी -1 कोशिकाओं को दिखाता है। (मूल छवि का आवर्धन 4x है, स्केल बार 50 μm है। (बी) एडीसीसी परख ईजीएफपी-ट्रांसड्यूस्ड जेआईएमटी -1 स्तन कार्सिनोमा सेल लाइन और सीडी 16.176 वीएनके -92 सेल लाइन के साथ किया गया था। लक्ष्य (ई: टी) अनुपात के लिए लागू प्रभावक 2: 1 था। -एनके समूह के मामले में, जेआईएमटी -1 ईजीएफपी कोशिकाओं को एनके कोशिकाओं और एंटी-एचईआर 2 एंटीबॉडी के बिना इनक्यूबेट किया गया था, जबकि + एनके समूह (एडीसीसी) में 10 μg / mL trastuzumab को JIMT-1 और NK सेल सह-संस्कृतियों में जोड़ा गया था। एनके कोशिकाओं को जोड़ने के तुरंत बाद और 3 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद उच्च सामग्री विश्लेषण उपकरण का उपयोग करके व्यवहार्य JIMT-1-EGFP कोशिकाओं की संख्या का पता लगाया गया था। +एनके समूह में लक्ष्य सेल व्यवहार्यता -एनके समूह में 50% थी। लाल डैश्ड लाइन थ्रेशोल्ड मान को दर्शाती है, जो डीएमएसओ नियंत्रण (एन = 20) हत्या के औसत की तुलना में ≥70% व्यवहार्यता वाले नमूनों का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एडीसीसी प्रतिक्रिया को अपेक्षाकृत लंबे समय पहले वर्णित किया गया है। प्रक्रिया की प्रमुख आणविक घटनाओं का भी वर्णन किया गयाहै। एडीसीसी को मापने के तरीके सोने के मानक रेडियोधर्मी क्रोमियम रिलीज परख, साइटोप्लाज्मिक एंजाइम रिलीज परख से लेकर कई प्रतिदीप्ति-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री या माइक्रोप्लेट परख20 तक हैं। हालांकि, इन परखों की एक सामान्य सीमा यह है कि वे उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। इससे पहले, हमने एडीसीसी-संशोधित दवाओं18 के लिए यौगिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त एक छवि-आधारित एचसीएस परख विकसित की। हालांकि, पहले विकसित परख में एक बड़ी कमी थी यानी, इसे धोने के कदम की आवश्यकता थी क्योंकि लक्ष्य कोशिकाओं को कैल्केन-एसिटोक्सीमिथाइलएस्तेर के साथ पूर्व-दाग दिया जाना था, और एनके कोशिकाओं और ट्रास्टुज़ुमाब को जोड़ने से पहले अतिरिक्त डाई को हटाना था। वर्तमान विधि परख के एक उन्नत संस्करण का प्रतिनिधित्व करती है जिसमें ईजीएफपी-ट्रांसड्यूस्ड जेआईएमटी -1 कोशिकाओं का उपयोग एक धुंधला और धोने के चरण के बिना प्रभावक और लक्ष्य कोशिकाओं के बीच सीधे भेदभाव की अनुमति देता है। इसके अलावा, किसी को हमारे परख की विशेषता के बारे में भी पता होना चाहिए कि यह मृत और मरने वाली कोशिकाओं (अभी तक पूरी तरह से अलग नहीं) के बीच अंतर नहीं कर सकता है। इसके अलावा, यह संभव है कि परीक्षण यौगिक सेल आसंजन को बढ़ा सकते हैं, और, परिणामस्वरूप सेल मलबे फोकल प्लेन में रह सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप गलत सकारात्मक परिणाम हो सकता है। इसके अलावा, परीक्षण यौगिकों के फ्लोरोसेंट गुण हस्तक्षेप का कारण बन सकते हैं। इसलिए, हालांकि स्क्रीन आमतौर पर एक बार चलाए जाते हैं, अन्य प्रकार के परखों में भी हिट को मान्य करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। हमारे परख की अतिरिक्त सीमाओं में कोशिका मृत्यु की अप्रत्यक्ष पहचान शामिल है यानी, विधि मृत कोशिकाओं के बजाय व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में परिवर्तन की मात्रा का ठहराव पर आधारित है। हालांकि, यहां यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एक पिछले अध्ययन में पाया गया कि व्यवहार्य कोशिकाओं का ईसीआईएस-आधारित पता लगाना सीधे कोशिका मृत्युको मापने वाले कुछ तरीकों से बेहतर था। इसलिए, हमारी विधि की यह विशेषता आवश्यक रूप से एक दोष का प्रतिनिधित्व नहीं करती है। हालांकि, इस परख के आवेदन को वास्तव में सीमित कर सकता है, यह है कि इसे उन्नत छवि विश्लेषण में कम से कम एक बुनियादी ज्ञान की आवश्यकता होती है, एक कौशल जो आज तेजी से आम हो रहा है।

हालांकि अब तक, परख18 के मूल संस्करण के साथ एक छोटी लाइब्रेरी (1000 से कम यौगिकों) का परीक्षण किया गया है। हमने अभी तक एडीसीसी बूस्टर दवा की पहचान नहीं की है। इसका कारण यह हो सकता है कि एडीसीसी एक्टिवेटर्स दुर्लभ हो सकते हैं, और एक की पहचान करने के लिए बहुत बड़े पुस्तकालयों की जांच करने की आवश्यकता होती है। सैद्धांतिक रूप से, यह भी संभव है कि एक बार एडीसीसी प्रतिक्रिया शुरू होने के बाद, यह प्रमुख सीमित कदमों के बिना आगे बढ़ता है ताकि प्रक्रिया को फार्माकोन द्वारा आगे सुधारना मुश्किल हो। इस समस्या के आसपास एक संभावित तरीका एडीसीसी गतिविधि (जैसे, कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स के साथ) को दबाना और पूर्ण एडीसीसी गतिविधि को बहाल करने वाले यौगिकों की तलाश में स्क्रीन चलाना हो सकता है। फिर भी, हमें लगता है कि ज्ञात चिकित्सा दवाओं के एडीसीसी निरोधात्मक प्रभाव की पहचान करना भी महत्वपूर्ण हो सकता है ताकि विभिन्न संकेतों वाले रोगियों को इन दवाओं को निर्धारित करने वाले चिकित्सकों के बारे में जागरूकता बढ़ाई जा सके।

परख के तकनीकी विवरण के लिए, हम वैकल्पिक साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षण के साथ समानांतर में परख स्थापित करने की सलाह देते हैं। हमारे हाथ में, ईसीआईएस (इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन) एडीसीसी दक्षता13 की मात्रा का ठहराव के लिए सबसे विश्वसनीय प्रणाली साबित हुई। परियोजना की शुरुआत में, ईसीआईएस का उपयोग महत्वपूर्ण मापदंडों (समय, लक्ष्य सेल अनुपात, ट्रास्टुज़ुमाब एकाग्रता के प्रभावक) को समायोजित करने के लिए किया गया था और फिर परख को एचसीएस प्लेटफॉर्म18 में स्थानांतरित कर दिया गया था। हम इन मापदंडों को समान और ठीक करने की सलाह देते हैं, क्योंकि वे प्रयोगशाला से प्रयोगशाला में बदल सकते हैं। परख स्थापित करते समय, प्रक्रिया के कुछ महत्वपूर्ण चरणों पर विशेष ध्यान देना महत्वपूर्ण है। एनके कोशिकाओं और लक्ष्य कोशिकाओं दोनों के लिए संस्कृति स्थितियों (विभाजन आवृत्ति, सेल फीडिंग, प्लेटिंग स्थिरता) को मानकीकृत करने से एडीसीसी दक्षता की प्रजनन क्षमता बढ़ सकती है। इसके अलावा, एनके सेल संस्कृतियों को निलंबित करना देखभाल के साथ किया जाना चाहिए क्योंकि ये कोशिकाएं यांत्रिक तनाव के प्रति संवेदनशील होती हैं (गुटी एट अल। यौगिक पुस्तकालय के लिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सभी कुओं में परीक्षण यौगिकों की समान मात्रा होती है यदि पिन टूल का उपयोग लाइब्रेरी प्लेट से परख प्लेट में यौगिकों के हस्तांतरण के लिए किया जाता है। यह यौगिक समाधानों की अलग-अलग मात्रा को पिन के बाहरी हिस्से से चिपकने से रोक सकता है। इसके अलावा, एक स्क्रीन में पहचाने गए हिट यौगिकों को अधिमानतः एक अलग सिद्धांत के आधार पर एक विश्वसनीय परख में मान्य किया जाना चाहिए। इसके लिए, हम ECIS-आधारित विधि11 की सिफारिश करते हैं (परिचय में ऊपर देखें)।

अंत में, हमने स्वचालित छवि विश्लेषण के साथ यौगिक पुस्तकालयों के परीक्षण के लिए उपयुक्त एक JIMT-1 ईजीएफपी-आधारित इन विट्रो एडीसीसी परख प्रणाली स्थापित की। विधि ज्ञात एडीसीसी संशोधित प्रभावों के साथ फार्माकोन की पहचान के लिए उपयुक्त थी। विधि ट्रास्टुज़ुमाब दवा संयुग्म (उदाहरण के लिए, हाल ही में विकसित ट्रास्टुज़ुमाब-एम्टान्सिन21) के कारण कैंसर कोशिका मृत्यु के निर्धारण के लिए संभावित रूप से उपयुक्त है, जहां विषाक्तता का तंत्र अधिक जटिल है और केवल आंशिक रूप से एडीसीसी के कारण होता है और आंशिक रूप से ट्यूबुलिन अवरोधक मर्टेंसिन द्वारा होता है। भविष्य में, हम 3 डी स्फेरॉइड में एडीसीसी को मापने के लिए तकनीक को अपनाने की योजना बना रहे हैं, जो 2 डी मॉडल की तुलना में ट्यूमर व्यवहार के अधिक सटीक प्रतिबिंब का प्रतिनिधित्व करते हैं।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं दी है।

Acknowledgments

एलवी को राष्ट्रीय अनुसंधान, विकास और नवाचार कार्यालय अनुदान जीआईएनओपी-2.3.2-15-2016-00010 ट्यूमरडीएनएस", जीआईएनओपी-2.3.2-15-2016-00048-स्टेअलाइव और ओटीकेए के132193, के147482 से धन प्राप्त हुआ। सीडी 16.176वी.एनके -92 कोशिकाओं को ब्रिंक बायोलॉजिक्स, एलएनसी की ओर से डॉ केरी एस कैंपबेल (फॉक्स चेस सेंटर, फिलापेडल्फिया, पीए) से प्राप्त किया गया था। सैन डिएगो, सीए), दुनिया भर में पेटेंट द्वारा संरक्षित हैं, और नांटकवेस्ट, एलएनसी द्वारा लाइसेंस प्राप्त थे। लेखक एनके -92 सेल लाइन के उपयोग के साथ उनकी मदद और तकनीकी सलाह के लिए ग्योर्गी वेरेब और आर्पड स्ज़ोर के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluorouracil Applichem A7686 in compound library
96-well Cell Carrier Ultra plate PerkinElmer LLC 6055302
Betulin Sigma B9757 in compound library
CD16.176V.NK92 cells Nankwest Inc. 
Cerulenin ChemCruz sc-396822 in compound library
Cisplatin Santa Cruz Biotechnology sc-200896 in compound library
Colchicine Sigma C9754 in compound library
Concanavalin-A Calbiochem 234567 in compound library
Dexamethasone Sigma D4902 in compound library
DMEM/F-12 medium Sigma D8437 in JIMT-1 EGFP medium
DMSO Sigma D2650 in compound library
Etoposide Sigma E1383 E1383
Fetal bovine serum (FBS) Biosera FB-1090/500 JIMT-1 EGFP and NK medium
Fisetin Sigma F4043 in compound library
Freedom EVO liquid handling robot TECAN
Gallotannin Fluka Chemical Corp. 16201 in compound library
Glutamine Gibco 35,050–061 in NK medium
Harmony software  PerkinElmer
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary N/A
Humulin R (insulin) Eli Lilly HI0219 JIMT-1 EGFP medium
IL-2 Novartis Hungária Kft. PHC0026 in NK medium
Isatin Sigma 114618 in compound library
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) Gibco 11,140–050 in NK medium
Na-pyruvate Lonza BE13-115E in NK medium
Naringenin Sigma N5893 in compound library
NQDI-1 Sigma SML0185 in compound library
Opera Phenix High-Content Analysis equipment PerkinElmer
Penicillin–streptomycin Biosera LM-A4118 JIMT-1 EGFP and NK medium
Pentoxyfilline Sigma P1784 in compound library
Phosphate buffered saline (PBS) Lonza BE17-517Q to wash the cells
Podophyllotoxin Sigma P4405 in compound library
Quercetin Sigma Q4951 in compound library
Tannic acid Sigma T8406 in compound library
Temozolomide Sigma T2577 in compound library
Trypan blue 0.4% solution Sigma T8154 for cell counting
Vincristine sulfate Sigma V0400000 in compound library
α-MEM Sigma M8042 in NK medium

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References

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एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिसिटी संशोधित यौगिकों की पहचान के लिए उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग परख
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Guti, E., Bede, Á. M., Váróczy, C., Hegedűs, C., Demény, M. Á., Virág, L. High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds. J. Vis. Exp. (198), e64485, doi:10.3791/64485 (2023).

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